Слушать (5 785 Кб): Характеристика различных типов поверхностных эпителиев, регенерация и возрастные изменения.Однослойные однорядные эпителииПо форме клеток могут быть плоскими, кубическими, призматическими. Однослойный плоский эпителий представлен в организме мезотелием и эндотелием. Мезотелий покрывает серозные оболочки (листки плевры, брюшины, околосердечной сумки). Клетки мезотелия плоские, имеют полигональную форму и неровные края. На свободной поверхности клетки имеются микроворсинки. Через мезотелий происходят выделение и всасывание серозной жидкости. Благодаря его гладкой поверхности легко осуществляется скольжение внутренних органов. Мезотелий препятствует образованию спаек между органами брюшной или грудной полостей, развитие которых возможно при нарушении его целостности. Эндотелий выстилает кровеносные и лимфатические сосуды, а также камеры сердца. Он представляет собой пласт плоских клеток — эндотелиоцитов, лежащих в один слой на базальной мембране. Эндотелий, располагаясь в сосудах на границе с лимфой или кровью, участвует в обмене веществ и газов между ними и другими тканями. При его повреждении возможны изменение кровотока в сосудах и образование в их просвете сгустков крови — тромбов. Однослойный кубический эпителий выстилает часть почечных канальцев. Эпителий почечных канальцев выполняет функцию обратного всасывания (или реабсорбции) ряда веществ из первичной мочи в кровь. Однослойный призматический эпителий характерен для среднего отдела пищеварительной системы. Он выстилает внутреннюю поверхность желудка, тонкой и толстой кишки, желчного пузыря, ряда протоков печени и поджелудочной железы. Эпителиальные клетки связаны между собой с помощью десмосом, щелевых коммуникационных соединений, по типу замка, плотных замыкающих соединений. Благодаря последним в межклеточные щели эпителия не может проникнуть содержимое полости желудка, кишки и других полых органов. В желудке в однослойном призматическом эпителии все клетки являются железистыми, продуцирующими слизь, которая защищает стенку желудка от грубого влияния комков пищи и переваривающего действия желудочного сока. Меньшая часть клеток эпителия представляет собой камбиальные эпителиоциты, способные делиться и дифференцироваться в железистые эпителиоциты. За счет этих клеток каждые 5 сут происходит полное обновление эпителия желудка — т.е. его физиологическая регенерация. В тонкой кишке эпителий однослойный призматический каемчатый, активно участвующий в пищеварении. Он покрывает в кишке поверхность ворсинок и, в основном, состоит из каемчатых эпителиоцитов, среди которых располагаются железистые бокаловидные клетки. Каемка эпителиоцитов образована многочисленными микроворсинками, покрытыми гликокаликсом. В нем и мембране микроворсинок находятся ансамбли ферментов, которые осуществляют мембранное пищеварение — расщепление (гидролиз) веществ пищи до конечных продуктов и всасывание их (транспорт через мембрану и цитоплазму эпителиоцитов) в кровеносные и лимфатические капилляры подлежащей соединительной ткани. Благодаря камбиальным (бескаемчатым) клеткам каемчатые эпителиоциты ворсинок полностью обновляются в течение 5—6 сут. Бокаловидные клетки выделяют слизь на поверхность эпителия. Слизь защищает его и подлежащие ткани от механических, химических и инфекционных воздействий. Эндокринные клетки нескольких видов, также входящие в состав эпителиальной выстилки кишечника, секретируют в кровь гормоны, которые осуществляют местную регуляцию функции органов пищеварительного аппарата. Однослойные многорядные эпителииМногорядные (псевдомногослойные) эпителии выстилают воздухоносные пути — носовую полость, трахею, бронхи, а также ряд других органов. В воздухоносных путях многорядный эпителий является реснитчатым, и содержит клетки, различные по форме и выполняемой функции. Базальные клетки низкие, лежат на базальной мембране в глубине эпителиального пласта. Они относятся к камбиальным клеткам, которые делятся и дифференцируются в реснитчатые и бокаловидные клетки, участвуя, таким образом, в регенерации эпителия. Реснитчатые (или мерцательные) клетки высокие, призматической формы. Их апикальная поверхность покрыта ресничками. В воздухоносных путях они с помощью сгибательных движений (т.н. «мерцаний») очищают вдыхаемый воздух от частиц пыли, выталкивая их в направлении носоглотки. Бокаловидные клетки секретируют на поверхность эпителия слизь. Все эти и другие виды клеток имеют разную форму и размеры, поэтому их ядра располагаются на разных уровнях эпителиального пласта: в верхнем ряду — ядра реснитчатых клеток, в нижнем — ядра базальных клеток, а в среднем — ядра вставочных, бокаловидных и эндокринных клеток. Многослойные эпителииМногослойный плоский неороговевающий эпителий Многослойный плоский ороговевающий эпителий покрывает поверхность кожи, образуя ее эпидермис, в котором происходит процесс ороговения, или кератинизации, связанный с дифференцировкой эпителиальных клеток — кератиноцитов в роговые чешуйки наружного слоя эпидермиса. В эпидермисе различают несколько слоев клеток — базальный, шиповатый, зернистый, блестящий и роговой. Последние три слоя особенно сильно выражены в коже ладоней и подошв. Основную часть клеток в слоях эпидермиса составляют кератиноциты, которые по мере дифференцировки перемещаются из базального слоя в вышележащие слои. Базальный слой эпидермиса состоит из призматических по форме кератиноцитов, в цитоплазме которых синтезируется кератиновый белок, формирующий тонофиламенты. Здесь же находятся стволовые клетки дифферона кератиноцитов. Поэтому базальный слой называют ростковым, или герминативным. Кроме кератиноцитов, в эпидермисе находятся другие диффероны клеток — меланоциты (или пигментные клетки), внутриэпидермальные макрофаги (или клетки Лангерганса), лимфоциты и некоторые другие. Меланоциты с помощью пигмента меланина создают барьер, препятствующий воздействию ультрафиолетовых лучей на ядра базальных кератиноцитов. Клетки Лангерганса являются разновидностью макрофагов, участвуют в защитных иммунных реакциях и регулируют размножение кератиноцитов, образуя вместе с ними «пролиферативные единицы». Роговой слой эпидермиса состоит из плоских многоугольной формы кератиноцитов — роговых чешуек, имеющих толстую оболочку с кератолинином и заполненных кератиновыми фибриллами, упакованными в аморфном матриксе. Между чешуйками находится цементирующее вещество — продукт кератиносом, богатый липидами и поэтому обладающий гидроизолирующим свойством. Самые наружные роговые чешуйки утрачивают связь друг с другом и постоянно отпадают с поверхности эпителия. На смену им приходят новые — вследствие размножения, дифференцировки и перемещения клеток из нижележащих слоев. Благодаря этим процессам, составляющим физиологическую регенерацию, в эпидермисе полностью обновляется состав кератиноцитов через каждые 3—4 нед. Значение процесса кератинизации (или ороговения) в эпидермисе заключается в том, что образующийся при этом роговой слой обладает устойчивостью к механическим и химическим воздействиям, плохой теплопроводностью и непроницаем для воды и многих водорастворимых ядовитых веществ. Переходный эпителийЭтот вид многослойного эпителия типичен для мочеотводящих органов — лоханок почек, мочеточников, мочевого пузыря, стенки которых подвержены значительному растяжению при заполнении мочой. В нем различают несколько слоев клеток — базальный, промежуточный, поверхностный. Базальный слой образован мелкими почти округлыми (темными) камбиальными клетками. В промежуточном слое располагаются клетки полигональной формы. Поверхностный слой состоит из очень крупных, нередко дву- и трехъядерных клеток, имеющих куполообразную или уплощенную форму в зависимости от состояния стенки органа. При растяжении стенки вследствие заполнения органа мочой эпителий становится более тонким и его поверхностные клетки уплощаются. Во время сокращения стенки органа толщина эпителиального пласта резко возрастает. При этом некоторые клетки в промежуточном слое какбы «выдавливаются» кверху и принимают грушевидную форму, а расположенные над ними поверхностные клетки — куполообразную форму. Между поверхностными клетками обнаружены плотные контакты, имеющие значение для предотвращения проникновения жидкости через стенку органа (например, мочевого пузыря). Регенерация покровных эпителиевПокровный эпителий, занимая пограничное положение, постоянно испытывает влияние внешней среды, поэтому эпителиальные клетки сравнительно быстро изнашиваются и погибают. Источником их восстановления являются стволовые клетки эпителия. Они сохраняют способность к делению в течение всей жизни организма. Размножаясь, часть вновь образованных клеток вступает в дифференцировку и превращается в эпителиоциты, подобные утраченным. Стволовые клетки в многослойных эпителиях находятся в базальном слое, в многорядных эпителиях к ним относятся базальные клетки, в однослойных эпителиях они располагаются в определенных участках: например, в тонкой кишке — в эпителии крипт, в желудке — в эпителии ямок, и шеек собственных желез. Высокая способность эпителия к физиологической регенерации служит основой для быстрого восстановления его в патологических условиях. С возрастом в покровном эпителии наблюдается ослабление процессов обновления. Эпителий хорошо иннервирован. В нем имеются многочисленные чувствительные нервные окончания — рецепторы. Некоторые термины из практической медицины:
|
| Поместите стрелку мыши или нажмите пальцем на фотографию и Вы сможете увидеть ее без обозначений (при медленной загрузке — не убирайте стрелку мыши или палец с картинки до тех пор пока не появится картинка без обозначений) |
МЕЗОТЕЛИЙ (ОДНОСЛОЙНЫЙ ПЛОСКИЙ ЭПИТЕЛИЙ) вид сверху Импрегнация нитратом серебра 1 — ядро клетки | |
ОДНОСЛОЙНЫЙ ПЛОСКИЙ ЭПИТЕЛИЙ Окраска гематоксилин-эозином Стрелкой показаны ядра эпителиоцитов | |
ОДНОСЛОЙНЫЙ КУБИЧЕСКИЙ ЭПИТЕЛИЙ Окраска гематоксилин-эозином
| |
ОДНОСЛОЙНЫЙ КУБИЧЕСКИЙ ЭПИТЕЛИЙ Окраска гематоксилин-эозином | |
ОДНОСЛОЙНЫЙ ПРИЗМАТИЧЕСКИЙ ОДНОРЯДНЫЙ ЭПИТЕЛИЙ Окраска гематоксилин-эозином | |
ОДНОСЛОЙНЫЙ ПРИЗМАТИЧЕСКИЙ МНОГОРЯДНЫЙ ЭПИТЕЛИЙ Окраска гематоксилин-эозином | |
ОДНОСЛОЙНЫЙ ПРИЗМАТИЧЕСКИЙ МНОГОРЯДНЫЙ РЕСНИТЧАТЫЙ (МЕРЦАТЕЛЬНЫЙ) ЭПИТЕЛИЙ Окраска гематоксилин-эозином | |
ОДНОСЛОЙНЫЙ ПРИЗМАТИЧЕСКИЙ МНОГОРЯДНЫЙ РЕСНИТЧАТЫЙ (МЕРЦАТЕЛЬНЫЙ) ЭПИТЕЛИЙ Окраска железным гематоксилином 1 — базальная мембрана | |
ДВУХСЛОЙНЫЙ ПРИЗМАТИЧЕСКИЙ ЭПИТЕЛИЙ Окраска гематоксилин-эозином | |
МНОГОСЛОЙНЫЙ ПЛОСКИЙ НЕОРОГОВЕВАЮЩИЙ ЭПИТЕЛИЙ Окраска гематоксилин-эозином 1 — базальный слой | |
МНОГОСЛОЙНЫЙ ПЛОСКИЙ НЕОРОГОВЕВАЮЩИЙ ЭПИТЕЛИЙ Окраска гематоксилин-эозином 1 — базальный слой | |
МНОГОСЛОЙНЫЙ ПЛОСКИЙ ОРОГОВЕВАЮЩИЙ ЭПИТЕЛИЙ (ЭПИДЕРМИС) Окраска гематоксилин-эозином 1 — базальный слой | |
МНОГОСЛОЙНЫЙ ПЛОСКИЙ ОРОГОВЕВАЮЩИЙ ЭПИТЕЛИЙ (ЭПИДЕРМИС) Окраска гематоксилин-эозином 1 — базальный слой | |
ПЕРЕХОДНЫЙ ЭПИТЕЛИЙ (УРОТЕЛИЙ) Окраска гематоксилин-эозином 1 — базальный слой |
ЭПИТЕЛИАЛЬНАЯ ТКАНЬ — ГИСТОЛОГИЯ
ЭПИТЕЛИАЛЬНАЯ ТКАНЬ — ГИСТОЛОГИЯ ГИСТОЛОГИЯ В ТАБЛИЦАХ И СХЕМАХЭПИТЕЛИАЛЬНАЯ ТКАНЬ
Эпителии покрывают поверхность тела, серозные полости тела, внутреннюю и наружную поверхности многих внутренних органов, образуют секреторные отделы и выводные протоки экзокринных желез.
Эпителий представляет собой пласт клеток, под которым есть базальная мембрана.
ПРИЗНАКИ ЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ ТКАНИ
- Клетки располагаются пластами
- Имеется базальная мембрана
- Клетки тесно связаны друг с другом
- Клетки обладают полярностью (апикальная и базальная части)
- Отсутствие кровеносных сосудов
- Отсутствие межклеточного вещества
- Высокая способность к регенерации
КЛАССИФИКАЦИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ ТКАНИ
по происхождению | по месторасположению и функции |
эктодермальные эпителии (эпидермальный) из нервной трубки (эпендимоглиальный) энтодермальные эпителии (энтеродермальный) мезодермальные эпителии (целонефродермальный) мезенхимальные эпителии (ангиодермальный) | покровные покрывают органы снаружи и изнутри железистые образуют секреторные отделы и выводные протоки экзокринных желез |
по строению основу этой классификации образует главный принцип — отношение клеток к базальной мембране | |
ОДНОСЛОЙНЫЕ ЭПИТЕЛИИ | МНОГОСЛОЙНЫЕ ЭПИТЕЛИИ |
все эпителиальные клетки соприкасаются с базальной мембраной | не все эпителиальные клетки соприкасаются с базальной мембраной |
однослойный плоский однослойный кубический (низкий призматический) однослойный призматический (цилиндрический): | двухслойный эпителий (может быть кубическим или призматическим) трехслойный эпителий (может быть кубическим или призматическим) многослойный плоский неороговевающий — различают три слоя: базальный, промежуточный (шиповатый) и поверхностный многослойный плоский ороговевающий — различают 5 слоев: базальный, шиповатый, зернистый, блестящий и роговой; базальный и шиповатый слои составляют ростковый слой эпителия, так как клетки этих слоев способны к делению многослойные плоские эпителии обладают полиморфизмом ядер: ядра базального слоя вытянутые, расположены перпендикулярно к базальной мембране, ядра промежуточного (шиповатого) слоя — округлые, я ядра поверхностного (зернистого) слоя вытянутые и расположены параллельно базальной мембране переходный эпителий (уротелий) образован базальными и поверхностными клетками полиморфизма ядер нет, ядра всех клеток имеют округлые формы |
А — однослойный плоский эпителий Б — однослойный кубический эпителий В — однослойный призматический однорядный эпителий Г — однослойный призматический многорядный эпителий: справа — каемчатый, в центре — обычный, слева — реснитчастый (мерцательный) Д — двухслойный кубический эпителий Е — двухслойный призматический эпителий Ж — многослойный плоский неороговевающий эпителий: 1 — базальный слой 2 — шиповатый (промежуточный) слой 3 — поверхностный слой З — многослойный плоский ороговевающий эпителий (эпидермис): 1 — базальный слой 2 — шиповатый слой 3 — зернистый слой 4 — блестящий слой 5 — роговой слой И — переходный эпителий (уротелий): 1 -базальные клетки 2 — покровные клетки |
ЭКЗОКРИННЫЕ ЖЕЛЕЗЫ
состоят из 2 частей: концевых (секреторных) отделов и выводных протоков
простые имеют неразветвленный выводной проток | сложные имеют разветвленный выводной проток |
разветвленные имеют неразветвленные концевые отделы | неразветвленные имеют разветвленные концевые отделы |
по типу концевых (секреторных) отделов: альвеолярные, трубчатые, альвеолярно-трубчатые | |
по типу секрета: например: белковые, слизистые, белково-слизистые(смешанные) |
ТИПЫ ВЫВЕДЕНИЯ СЕКРЕТА ИЗ КЛЕТОК (типы секреции)
- мерокриновый — клетка не разрушается в процессе секреции(слюнные железы, поджелудочная железа)
- апокриновый — апикальная часть клетки немного разрушается в процессе секреции (молочная железа)
- микро-апокриновый — в процессе выведения секрета разрушаются микроворсинки (потовые железы)
- макро-апокриновый — в процессе выведения секрета разрушается апикальная часть цитоплазмы (молочная железа)
- голокриновый — в процессе секреции клетка полностью разрушается (сальные железы)
© A Gunin; [email protected]
Биологические исследования с использованием цифрового микроскопа. Лабораторная работа «Строение эпителиальных тканей»
В условиях перехода общего образования к профильному обучению учащихся на старшей ступени школы повышение качества биологического образования, уровня биологических знаний учащихся и выпускников общеобразовательных школ может быть достигнуто при внедрении в практику школ использования цифрового микроскопа.
Цифровой микроскоп может быть использован при проведении лабораторных работ элективных курсов повышенного уровня в которых углубленно изучают отдельные разделы основного курса биологии. Такие работы выходят за рамки базового образования и включают практические и лабораторные работы, проведение которых с использованием цифрового микроскопа позволит учащимся почувствовать себя исследователями
при изучении тканей растений, животных, человека.
Использование на уроке биологии цифрового микроскопа совместно с компьютером позволяет получить увеличенное изображение изучаемого объекта (микропрепарата) на экране монитора (при работе в группе или в классах с малым числом учащихся) или на большом экране (при работе с целым классом) с помощью выносного проекционного устройства, подключаемого к компьютеру. Цифровой микроскоп позволяет
- изучать исследуемый объект не одному ученику, а группе учащихся одновременно;
- использовать изображения объектов в качестве демонстрационных таблиц для объяснения темы или при опросе учащихся;
- применять разноуровневые задания для учеников одного класса;
- создавать презентационные видеоматериалы по изучаемой теме;
- использовать изображения объектов на бумажных носителях в качестве раздаточного или отчетного материала.
Использование цифрового микроскопа при проведении школьных биологических исследований дает ощутимый дидактический эффект в плане мотивации, систематизации и углубления знаний учеников, то есть формирования так называемых обучающих возможностей, развития способностей учащихся к приобретению и усвоению знаний.
Ход урокаЛабораторная работа «Строение эпителиальных тканей».Цель:познакомиться с особенностями строения и классификацией эпителиев, примерами желез.
Объекты иизученя: готовые микропрепараты «Высокий призматический эпителий почки кролика», «Низкий призматический эпителий почки кролика», «Роговица глаза коровы», «Мерцательный эпителий кишечника беззубки», «Однослойный эпителий».
Оборудование: цифровой микроскоп.
Клетки микропрепарата окрашены розовым цветом, ядра сиреневым. При изучении микропрепарата обращают внимание на форму клеток, их тесное соприкосновение. Микропрепарат рассматривают под микроскопом при увеличении 80х и 200х.
При увеличении 80х наблюдают рыхлую соединительную ткань, состоящую из одноядерных округлых клеток и межклеточного вещества. На фоне соединительной ткани наблюдают срезы множества поперечных канальцев. В зависимости от диаметра просвета канальцев, они выстланы изнутри кубическими или призматическими клетками однослойного эпителия.
При увеличении 200х выбирают участок микропрепарата с хорошо различными клетками канальца. Ядра этих клеток крупные, расположены приблизительно в центре или ближе к базальной части клетки. Базальные концы эпителиальных клеток обращены к соединительной ткани и расположены на так называемой базальной мембране. Противоположные (апикальные) концы клеток, обращены в просвет канальца и скреплены замыкательными пластинками, которые препятствуют проникновению тканевой жидкости из канальцев в межклеточное пространство рыхлой соединительной ткани.
Препарат зарисовывают. После проведения наблюдений, используя материал учебника, заполняют таблицу «Эпителиальные ткани» по форме: начале урока учитель знакомлю учащихся с понятием ткани, основываясь на знаниях о
Микропрепарат «Высокий призматический эпителий почки кролика»
Микропрепарат «Низкий призматический эпителий почки кролика»
На микропрепарате «Высокий призматический эпителий почки кролика» при увеличении 200х наблюдают однослойный высокопризматический железистый эпителий. Обращают внимание на форму клеток и их тесное соприкосновение. Это высокие и узкие цилиндрические клетки. Благодаря такой форме на единицу площади эпителия приходится больше цитоплазмы. В каждой клетке наблюдают ядро, расположенное ближе к базальной части клеток. Базальные концы эпителиальных клеток обращены к соединительной ткани и расположены на базальной мембране. Противоположные (апикальные) концы клеток, обращены в просвет канала. Цилиндрический эпителий выстилает стенки желудка; слизь, выделяемая железистыми клетками, защищает слизистую желудка от воздействия его кислого содержимого и от переваривания ферментами.
Предлагаю ученикам зарисовать несколько клеток, обозначив клеточные границы, ядра и цитоплазму.
Микропрепарат «Роговица глаза коровы»
На микропрепарате «Роговица глаза коровы» при увеличении 80х наблюдают несколько слоев эпителиальных клеток. На базальной мембране лежит слой клеток, которые активно размножаются — базальный слой. Выше этого слоя, по мере продвижения к свободной поверхности ткани, они уплощаются. Такие клетки называют чешуйками. На микропрепарате они неороговевшие, защищают нижележащие ткани от
механических повреждений. Эпителий подстилает оболочка из соединительной ткани и строма.
Находят многослойный эпителий и перемещая микропрепарат, располагают его в верхней части поля зрения микроскопа. Находят строму, базальную мембрану, клетки базального, шиповатого и плоского слоев, обращая внимание на количество слоев клеток и форму ядер.
Препарат «Мерцательный эпителий кишечника беззубки».
Предлагаю ученикам зарисовать микропрепарат при увеличении 200х. На микропрепарате «Мерцательный эпителий кишечника беззубки» изучают однослойный многорядный мерцательный эпителий. Клетки разной высоты, все лежат на базальной мембране, ядра располагаются на разных уровнях. Клетки несут на своих свободных поверхностях многочисленные реснички.
Микропрепарат «Однослойный эпителий»
На микропрепарате «Железистый эпителий. Зеленая железа рака» (разветвленные альвеолярно-трубчатые железы) среди эпителиальных клеток могут находиться отдельные секреторные клетки, такие, как бокаловидные клетки, или скопления секреторных клеток, образующих многоклеточную железу. Существует два типа секреторных клеток — зкзокринные и эндокринные. Экзокринные клетки выделяют секрет на свободную поверхность эпителия. Продукты многоклеточных экзокринных желез выводятся на поверхность через протоки. Эндокринными называют железы, секрет которых выделяется непосредственно в кровоток. Эндокринные железы не имеют протоков; их называют также железами внутренней секреции.
На микропрепарате находят группы светло окрашенных секреторных отделов, имеющих форму округлых или вытянутых мешочков. От них в сторону просвета отходят узкие эпителиальные трубки — выводные протоки
После проведения наблюдений микропрепаратов ученикам заполняют таблицу «Эпителиальные ткани» следующего вида.
Страница не найдена |
Страница не найдена |404. Страница не найдена
Архив за месяц
ПнВтСрЧтПтСбВс
27282930
12
12
1
3031
12
15161718192021
25262728293031
123
45678910
12
17181920212223
31
2728293031
1
1234
567891011
12
891011121314
11121314151617
28293031
1234
12
12345
6789101112
567891011
12131415161718
19202122232425
3456789
17181920212223
24252627282930
12345
13141516171819
20212223242526
2728293031
15161718192021
22232425262728
2930
Архивы
Метки
Настройки
для слабовидящих
Анализ на цитологию
Даниил Давыдов
медицинский журналист
Профиль автораЦитологические анализы — это любые исследования образцов человеческих клеток под микроскопом. Они помогают выявить предраковые изменения, рак и иногда — вирусную инфекцию клеток.
В этой статье мы будем говорить о цитологических анализах клеток из биологического материала, полученного с поверхности шейки матки. Этот анализ помогает заподозрить рак шейки матки и принять меры до того, как болезнь станет неизлечимой. Это очень важно, потому что рак шейки матки — пятый по частоте встречаемости у жительниц России.
Почему развивается рак шейки матки
Нижняя часть шейки матки, которая открывается во влагалище, называется эктоцервикс. В нем есть отверстие, или наружный зев, который открывается в эндоцервикальный канал — внутреннюю часть шейки матки.
Где развивается рак шейки матки — учебник для лаборантовPDF, 17,7 МБ
Эктоцервикс покрывают несколько слоев клеток, которые называются плоским эпителием. Ключевая задача плоского эпителия — защищать шейку матки от механических повреждений во время занятия сексом, от потери влаги и болезнетворных микробов.
Внутренняя часть шейки матки, эндоцервикальный канал, выстлана призматическим эпителием. У некоторых призматических клеток есть реснички, а другие выделяют слизь. Реснички помогают сперматозоидам пройти по дорожке из слизи и попасть в пункт назначения — матку.
Место, где плоский эпителий встречается с призматическим эпителием, называется зоной трансформации. Здесь появляется большинство раковых клеток, способных вызвать опухоль шейки матки. Основная причина, по которой рак развивается именно здесь, связана с тем, что в плоских клетках из зоны трансформации предпочитают жить вирусы папилломы человека, или ВПЧ.
Рак развивается в зоне трансформации — на границе между призматическим и плоским эпителиемЕсли два человека, зараженные разными типами ВПЧ, займутся сексом, в итоге у каждого партнера может оказаться по два типа вируса. Если использовать презерватив, вероятность заразиться уменьшается, но все равно сохраняется.
Известно 14 типов ВПЧ, относящихся к группе высокого онкогенного риска. Эти вирусы могут отключать гены здоровых клеток-хозяев, которые не дают им превращаться в раковые. Среди вирусов папилломы человека наиболее опасны типы 16 и 18 — они вызывают рак чаще всего.
Примерно 10—20% случаев рака шейки матки связаны с измененными клетками призматического эпителия — его называют аденокарциномой. Этот тип рака связан с ВПЧ только в 15—38% случаев. Почему возникает не связанная с ВПЧ аденокарцинома, пока до конца непонятно.
Остальные формы рака шейки матки, например те, что связаны и с плоскоклеточным, и с призматическим эпителием, встречаются очень редко — примерно в 1% случаев.
УЧЕБНИК
Как победить выгорание
Курс для тех, кто много работает и устает. Цена открыта — назначаете ее сами
Начать учитьсяНасколько опасен рак шейки матки
В нашей стране в структуре смертности от онкологических заболеваний рак шейки матки занимает десятое место — это 4,7% смертей среди онкологических пациенток. В 2018 году от него умерли 6392 женщины.
Российские клинические рекомендации по профилактике и лечению рака шейки матки, 2020 годPDF, 731 КБ
Причем специалисты отмечают, что молодые женщины 35—59 лет стали умирать чаще. С 1997 по 2018 год показатели смертности в этой группе выросли на 85,2%. Сложно сказать, по каким причинам это произошло: возможно, врачи просто научились точнее ставить этот диагноз.
К счастью, клетки в зоне трансформации не сразу превращаются в раковые. Пораженные ВПЧ эпителиальные клетки начинают меняться примерно за 10—15 лет до развития рака. Эти изменения можно выявить и скорректировать — и тогда развития рака можно избежать.
Кто рискует заболеть раком шейки матки
Выяснить предрасположенность к раку шейки матки помогает процедура, называемая скринингом. Как правило, скрининг включает один или несколько анализов или обследований, которые делают большим группам людей без симптомов конкретной болезни. Это помогает понять, есть ли у этого человека риск заболеть и насколько он велик.
Скрининг рака шейки матки — бюллетень Американской коллегии акушеров и гинекологов
Скрининг на рак шейки матки работает — бюллетень международной пациентской организации «Раковые консультации»
Скрининг на рак шейки матки очень эффективен. С 1991 года, когда в Австралии ввели национальную программу скрининга на рак шейки матки, вдвое уменьшилось количество женщин, умерших от этой злокачественной опухоли.
До 2017 года австралийский скрининг включал только цитологический скрининговый тест, который предлагали пройти всем женщинам 18—70 лет. После 2017 года программу борьбы с раком шейки матки дополнили обязательной вакцинацией против ВПЧ и добавили к программе тестирование на ВПЧ. Комплексные меры так резко сократили заболеваемость, что теперь представители австралийского Минздрава надеются, что к 2068 году врачи будут ставить этот диагноз реже одного раза в год.
Какие анализы включает скрининг на рак шейки матки
Как правило, для скрининга на рак шейки матки используют два теста: это либо анализ на вирус папилломы человека, либо цитологическое исследование шейки матки, которое еще называют Пап-тестом или Пап-мазком, либо и то и другое сразу.
Анализ на ВПЧ высокого риска методом полимеразной цепной реакции, или ПЦР. Так как женщины, не зараженные ВПЧ, редко болеют раком шейки матки, анализ помогает понять, относится ли конкретная женщина к группе риска и насколько велик этот риск. Современные ПЦР-тесты позволяют отличить друг от друга все 14 типов наиболее опасных ВПЧ и определить, есть ли среди них самые опасные вирусы — типы 16 и 18.
Что делать? 11.11.20Опасны ли папилломы и как их можно подцепить?
Цитологическое исследование соскоба шейки матки и цервикального канала. В двадцатых годах прошлого века американский врач греческого происхождения Георгиос Папаниколау обнаружил, что превращение нормальных клеток плоского или призматического эпителия в раковые начинается с небольших, но заметных изменений в их строении, которые можно увидеть под микроскопом после специальной окраски. В честь Папаниколау это исследование назвали Пап-тестом.
Мазок по Папаниколау под микроскопом. Крупные розовые эпителиальные клетки нормальные, а мелкие сине-фиолетовые могут оказаться предраковыми. SciencelineСегодня вместо классического Пап-теста часто применяют его усовершенствованную версию, которая называется исследованием соскоба шейки матки и цервикального канала методом жидкостной цитологии или просто Пап-тестом по методу жидкостной цитологии.
Пап-тест и тестирование методом жидкостной цитологии хорошо дополняют анализ на ВПЧ, потому что позволяют выявить не только плоскоклеточный рак, но и аденокарциному, даже если она не связана с ВПЧ.
Кому и когда нужно проходить скрининг
Женщины моложе 25 лет раком шейки матки почти не болеют. Поэтому всем здоровым женщинам в большинстве стран мира советуют проходить скрининг на эту болезнь начиная с 25 и до 65 лет включительно.
Рекомендации по скринингу на рак по возрасту — бюллетень Американского онкологического общества
Как правило, за рубежом советуют начать с анализа на ВПЧ. Если он не выявил проблем, в будущем его нужно будет сдавать раз в пять лет. Но если он выявит ВПЧ типов 16 и 18, врач направит пациентку на цитологическое исследование. Поэтому некоторые женщины предпочитают сдавать материал сразу и на ВПЧ-тест, и на цитологическое исследование.
Если ограничиться только цитологическим исследованием, повторять анализ придется чаще — раз в три года.
Такой подход почти повторяет программу скрининга на рак шейки матки, принятую в других странах мира. Но есть один нюанс.
Исследование, которое проводят в государственных лабораториях в рамках диспансеризации, не такое точное, как методы, принятые за рубежом. В таких лабораториях мазок окрашивают по Романовскому-Гимза. Этот метод проще и дешевле, чем мазок с окраской по Папаниколау, но не позволяет выявить некоторых важных особенностях в строении клеток.
Какими бывают скрининговые тесты на рак шейки матки — Uptodate
Более точный результат дают классический мазок по Папаниколау и исследование соскоба шейки матки и цервикального канала методом жидкостной цитологии. Но эти анализы можно сдать только в частной лаборатории за деньги. Зато, если сдавать анализ методом жидкостной цитологии, один и тот же образей можно отправить и на цитологию, и на тестирование на ВПЧ. Когда анализы делают в одном месте, это позволяет быстрее получить результат. В среднем ждать результата придется одну-три недели.
Цена скрининга на рак шейки матки в Москве — от 4600 Р
Забор биоматериала с шейки матки
Исследование соскоба шейки матки и цервикального канала методом жидкостной цитологии
Анализ на ВПЧ высокого канцерогенного риска
Забор биоматериала с шейки матки
395 Р
Исследование соскоба шейки матки и цервикального канала методом жидкостной цитологии
Анализ на ВПЧ высокого канцерогенного риска
Забор биоматериала с шейки матки
440 Р
Исследование соскоба шейки матки и цервикального канала методом жидкостной цитологии
Анализ на ВПЧ высокого канцерогенного риска
Некоторые лаборатории предлагают пройти комплексное обследование на рак шейки матки, в которое входят все необходимые анализы. Комплекс может обойтись дешевле, чем если сдавать анализы по отдельности. Например, лаборатория «Хеликс» предлагает пройти скрининг за 6810 Р, включая забор биоматериала.
Как подготовиться к скринингу
И для анализа на ВПЧ, и для цитологического исследования требуется биологический материал, который собирают мягкой щеточкой и плоской дощечкой со скругленными краями — ее называют шпателем. Чтобы в образец попали клетки и плоского, и призматического эпителия, материал берут и с внутренней, и с внешней поверхности шейки матки. Процедура занимает несколько минут.
От качества материала во многом зависит результат анализа. Увеличить точность можно, если соблюдать простые правила:
- Не сдавайте биоматериал во время менструального цикла. Иначе в образец может попасть кровь, и тест придется пересдавать.
- За два дня до анализа не занимайтесь сексом, не спринцуйтесь и не пользуйтесь вагинальными лекарствами, спермицидными пенами или кремами. Все это может смыть или скрыть аномальные клетки.
Как подготовиться к сбору материала — Клиника Майо
Как разобраться с результатами цитологического анализа
Поставить диагноз «рак шейки матки» на основе скрининговых тестов нельзя. Все, что может цитологическое исследование, — показать, есть ли изменения в эпителиальных клетках и насколько они серьезны. ВОЗ рекомендует врачам описывать эти изменения в соответствии с международной классификацией Бетесда, или TBS.
Рак шейки матки развивается годами, и это отражает цитологический анализ. Источник: «Рак-инфо»NILM, или negative for intraepithelial lesion or malignancy, в переводе — отрицательный на интраэпителиальные поражения или злокачественные новообразования. Российские врачи обычно пишут в бланке результатов: «Цитограмма без особенностей». С клетками шейки матки все в порядке, ничего делать не нужно. Повторный цитологический анализ нужно будет пройти через три года. Если вы сдавали анализ вместе с тестом на ВПЧ, который не выявил опасных типов вируса, следующий анализ можно сдать через пять лет.
Классификация Бетесда третьего пересмотраPDF, 22,6 МБ
Что означают результаты цитологического исследования — рекомендации для врачейPDF, 321 КБ
ASC-US, или atypical squamous cells of undetermined significance, в переводе — атипичные плоскоклеточные клетки неопределенного значения. В образце есть измененные клетки плоского эпителия, но, скорее всего, они не опасны. В этой ситуации нужно повторить исследование через полгода.
LSIL, или low-grade squamous intraepithelial lesion, в переводе — плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени злокачественности. В образце есть измененные клетки плоского эпителия, но их мало. Появление таких клеток связано либо с воспалением, либо с ВПЧ. Это соответствует первой степени цервикальной интраэпителиальной неоплазии, или CIN 1: когда измененные клетки обнаруживаются менее чем в трети толщины оболочки шейки матки.
В этой ситуации нужно повторить исследование через полгода. Если повторное обследование подтвердит подозрения, измененные клетки можно будет удалить — это поможет предотвратить рак.
ASC-H, или atypical squamous cells cannot exclude HSIL, в переводе — атипичные плоскоклеточные клетки, нельзя исключить HSIL. В образце есть измененные клетки плоского эпителия, они могут оказаться опасными, и их может быть много.
В этой ситуации врач должен направить на дополнительные исследования. Это кольпоскопия, при которой врач осматривает влагалище и наружную часть шейки матки при помощи кольпоскопа, и биопсия — когда врач берет образец ткани из области шейки матки на исследование. Дальнейшие действия зависят от результатов этих анализов.
HSIL, или high-grade squamous intraepithelial lesion, в переводе — плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени. В образце есть измененные клетки плоского эпителия, и их довольно много. Это может соответствовать:
- CIN 2 — когда измененные клетки плоского эпителия обнаруживаются в трети — двух третях толщины оболочки шейки матки;
- CIN 3 — когда измененные клетки плоского эпителия есть по всей толщине оболочки шейки матки;
- CIS — вероятен внутриэпителиальный рак шейки матки без метастазов.
Врач должен направить пациентку на кольпоскопию и биопсию. Если диагноз подтвердится, потребуется лечение.
SCC, или squamous cell carcinoma, в переводе — плоскоклеточная карцинома. Скорее всего, это плоскоклеточный рак шейки матки. Врач должен направить пациентку на кольпоскопию и биопсию, чтобы уточнить стадию и подобрать подходящее лечение.
AGC, или atypical glandular cells, в переводе — атипичные железистые клетки. В образце есть измененные клетки призматического эпителия непонятного происхождения. Это может говорить и о доброкачественных новообразованиях вроде полипов, и о плоскоклеточном раке или аденокарциноме. Врач должен направить пациентку на кольпоскопию и биопсию. Если подозрение подтвердится, потребуется лечение.
Что в итоге
- Анализы на цитологию — это классический Пап-тест и Пап-тест методом жидкостной цитологии.
- Анализы на цитологию наряду с анализом на ВПЧ входят в программу скрининга рака шейки матки. Это программа массовых исследований, которая помогает вовремя обнаружить подозрительные клетки у женщин без особых симптомов и принять меры до того, как разовьется болезнь.
- Риск заболеть раком шейки матки есть у всех сексуально активных женщин старше 25 лет. Поэтому с этого возраста вплоть до 65 лет имеет смысл раз в 3—5 лет проходить скрининг.
- В России можно бесплатно сдать мазок по Романовскому-Гимза в рамках диспансеризации раз в три года. Но этот анализ не такой надежный, как классический Пап-тест или Пап-тест методом жидкостной цитологии. Более надежные результаты можно получить, если сдать Пап-тест в частной клинике за деньги.
N86 Эрозия шейки матки | Описание болезни, диагностика, лечение
жалобы по диагнозу
- Бели слизисто-гнойного характера
- Боли во влагалище во время полового акта
чрезмерные и необычные по характеру выделения из половых органов женщины (водянистые, молочно-белые, желто-зеленые, сукровичные, имеющие неприятный запах), вызывают зуд, жжение и постоянное ощущение влажности в области промежности
- Боли в области промежности
- Боль в области половых органов
интенсивные боли в наружных половых органах, усиливаются при движении и отдают в паховую и поясничную область, в тазовую область
- Дискомфорт в области промежности
- Жжение и зуд в области наружных половых органов
- Зуд влагалища
постоянный или приступообразный зуд, как правило, усиливается в ночное время, со следами выделения на нижнем белье с неприятным запахом, болевыми ощущениями внизу живота, половых органах, может сопровождаться их отеком и покраснением со следами расчесов, царапин и ссадин
- Неприятный запах из влагалища
чрезмерные и необычные по характеру выделения из половых органов женщины (водянистые, молочно-белые, желто-зеленые, сукровичные, имеющие неприятный запах), вызывают зуд, жжение и постоянное ощущение влажности в области промежности
- Рана с распадом тканей и зловонным запахом
избыточное разрастание соединительной ткани в коже после ее повреждения в результате механической, термической травмы или операции, которое часто приводит к нарушению подвижности части тела
- Снижение полового влечения
отсутствие или сниженная потребность в половых контактах
- Увеличение лимфатических узлов
симптомы по диагнозу
- Межменструальные кровотечения
- Выделения из влагалищаСлизистые или слизисто-гнойные выделения, могут быть с неприятным запахом.
- Изменения шейки матки при осмотре в зеркалах
- Обнаружение атипических клеток в гистологическом материалеВ эту группу входят атипичные клетки плоского эпителия неясного значения (ASC-US). Клетки выглядят необычно, но при изучении их образца под микроскопом точную причину изменений (инфекция, раздражение, предрак) выявить не представляется возможным. Чаще всего клетки, помеченные как ASC-US, не являются предопухолевыми. Для решения вопроса о кольпоскопии используется тест для выявления ДНК вируса папилломы человека. При обнаружении ВПЧ высокого онкогенного риска, назначается кольпоскопия.
- Ацетобелый эпителийАцетобелым (уксуснобелым) эпителием называют любой участок эпителия шейки матки или другой локализации гениталий, который приобретает белый цвет той или иной интенсивности в ответ на импрегнирование раствором уксусной кислоты.
- Шпигельберга симптомдифференциально-диагностический признак рака шейки матки и воспалительной гиперплазии ее слизистой: при вагинальном исследовании в случае рака слизистая оболочка шейки матки не оттягивается и не смещается по отношению к подлежащим тканям; при введении в канал шейки матки губки, способной к набуханию, раковая опухоль под давлением губки не меняет свою плотность, тогда как при воспалительной гиперплазии слизистая оболочка становится более мягкой, рыхлой и истончается
краткое описание диагноза
Эрозия шейки матки
Эрозия шейки матки — повреждение многослойного плоского эпителия на влагалищной части шейки матки. По своей сути эрозия является язвой, ранкой на поверхности шейки матки. Часто эрозия шейки матки может протекать бессимптомно и быть выявлена в ходе гинекологического осмотра. Эрозия шейки матки чаще всего выявляется у молодых женщин, а для женщин старше 40 лет это более редкое явление. Чаще всего эрозия возникает в результате воспалительных заболеваний шейки матки (цервицит), реже вследствие кольпита. Под влиянием раздражающего действия белей на шейке матки возникает дефект эпителия (истинная эрозия). Такая эрозия обычно существует не более 1 — 2 недель. Чаще наблюдается смешанный тип ложной эрозии. Для любого вида ложной эрозии характерно образование в толще мускулатуры шейки матки так называемых эрозионных желез, которые выделяют вязкий слизистый секрет. Секрет выделяется на поверхности эрозии, приводит к изъязвлению эпителизированной поверхности, что в свою очередь сопровождается новыми процессами нарастания высокого призматического эпителия. Этот патологический процесс лежит в основе частых рецидивов ложной эрозии. Псевдоэрозия может существовать в течение многих месяцев и даже лет. Иногда высокий призматический эпителий, покрывающий поверхность ложной эрозии, начинает вытесняться многослойным плоским эпителием, располагающимся вокруг эрозированной поверхности. Размножаясь, этот эпителий нарастает на устья эрозионных желез, но не может проникнуть в сами железы из-за непрерывно выделяющегося секрета. Так образуются ретенционные кисты (наботовы кисты). Существование наботовых кист приводит к рецидиву заболевания.
режим лечения
Лечение эрозии шейки матки в острой стадии сводится в основном к покою. Антибиотики и сульфаниламидные препараты показаны при эрозии гонорейного происхождения (см. Гонорея) или при наличии воспаления матки и придатков. Для очищения поверхности эрозии и влагалища от стекающих выделений назначают спринцевания влагалища под низким давлением раствором борной кислоты (1 столовую ложку на 1 л воды), лизоформа (1 чайную ложку на 1 л воды), фурацилина (1:10 000) и др. Всякие другие манипуляции на шейке матки противопоказаны. В хронической стадии эрозии главное внимание следует уделить лечению воспаления шейки матки — источника эрозии. Спринцевания влагалища, ванночки, влагалищные тампоны с различными лечебными веществами, как правило, дают временный успех. Наряду с лечением шейки матки, в частности ее канала, поверхность эрозии обрабатывают индифферентными веществами (рыбий жир, вазелиновое масло и др.).
средний срок выздоравления
Эпителий | Предметные стекла для микроскопов | Руководство по гистологии
Глава 2 — Эпителий
Эпителий образует непрерывные слои клеток, выстилающие внутренние поверхности и покрывающие внешнюю поверхность тела. Это избирательный барьер, который защищает ткани и часто участвует в абсорбции или секреции. Базальная мембрана отделяет эпителий от подлежащей соединительной ткани.
Эпителии классифицируются по трем критериям:
- Количество слоев ячеек ( простой или составной )
- Форма поверхностных ячеек ( плоскоклеточная , кубовидная или столбчатая )
- Специализации ( ресничек , кератиновых или бокаловидных клеток )
Эпителиальные клетки поляризованы:
- Апикальная поверхность — обращена к просвету или внешней среде
- Микроворсинки, реснички, стереоцилии
- Боковая поверхность — обращена в стороны соседних ячеек
- Плотные соединения (zonula occludens), стыки сращений (zonula adherens), десмосомы (macula adherens), щелевые соединения
- Базальная поверхность — крепится к базальной мембране
- Базальная мембрана, гемидесмосомы
Эпителий не содержит кровеносных сосудов и получает питание путем диффузии из подлежащей соединительной ткани.
Железы образуются в результате роста эпителия вниз в нижележащую соединительную ткань (обсуждается в главе 12 — Экзокринные железы).
Для этой главы не обязательно заучивать названия конкретных тканей, а лучше научиться распознавать вариации эпителия.
Простой плоский эпителий
Простой плоский эпителий состоит из одного слоя уплощенных клеток.Тонкость этих клеток облегчает перенос материалов (, например, , газов, жидкостей или питательных веществ) через эпителий.
Простой кубовидный эпителий
Простой кубовидный эпителий состоит из одного слоя кубовидных клеток. Этот эпителий часто связан с абсорбцией, секрецией или выделением отходов.
Простой столбчатый эпителий
Простой столбчатый эпителий состоит из одного слоя клеток, высота которых превышает ширину.Этот эпителий часто связан с абсорбцией или секрецией.
Псевдостратифицированный столбчатый эпителий
Псевдостратифицированный эпителий , по-видимому, стратифицирован, потому что ядра эпителиальных клеток находятся на разных уровнях. Однако каждая клетка контактирует с базальной мембраной, но не все клетки достигают просвета.
Многослойный плоский эпителий
Многослойный плоский эпителий имеет несколько слоев клеток, которые уплощаются по мере продвижения от базального слоя к апикальному.Обеспечивает защиту от истирания и имеет ороговевший на внешней стороне. поверхность тела.
Многослойный кубовидный эпителий
Многослойный кубовидный эпителий имеет несколько слоев клеток с внешним слоем кубовидных клеток. Ограниченное распространение — встречается в облицовке больших воздуховодов.
Переходный эпителий
Переходный эпителий (уротелий) адаптирован к растяжимости и ограничен мочевыводящими путями.Он состоит из нескольких слоев ячеек с внешним слоем из гораздо более крупных куполообразных ячеек ( зонтичных ячеек, ). которые меняют форму при сжатии и растяжении.
Простой эпителий: расположение, функция, строение
Автор:
Элис Фернг Б.С., д.м.н.
• Рецензент:
Урудж Зехра MBBS, MPhil, PhD
Последняя редакция: 23 сентября 2021 г.
Время чтения: 9 минут
Простой эпителий имеет только один клеточный слой, где каждая клетка находится в прямом контакте с подлежащей базальной мембраной. Как правило, этот тип эпителия находится внутри тела, вероятно, из-за его хрупкости и образует выстилку полостей тела, кровеносных и лимфатических сосудов, сердца и дыхательной системы.
Тонкий слой имеет физиологическое преимущество более быстрого всасывания и фильтрации, особенно когда он выстилает пищеварительный тракт и обменные поверхности легких.
Функции и классы | Функция: процессов абсорбции и фильтрации Классы: плоскоклеточный, кубовидный, столбчатый, псевдостратифицированный |
Простой плоскоклеточный | Расположение: кровеносные и лимфатические сосуды, воздушные мешки легких, слизистая оболочка сердца Функция: выделяет смазывающее вещество, обеспечивает диффузию и фильтрацию |
Простой кубовидный | Расположение: секреторные протоки малых желез, почечные канальцы Функция: обеспечивает секрецию и абсорбцию |
Простой столбчатый | Место нахождения: бронхов, маточных труб, матки — цилиарно столбчатых ; пищеварительный тракт, мочевой пузырь — столбчатый безрезистый эпителий Функция: обеспечивает всасывание, секретирует слизистые и ферменты |
Псевдостратифицированный столбчатый | Расположение: трахея и большая часть верхних дыхательных путей (ресничные клетки) Функция : выделяет слизь, которая перемещается с помощью ресничек |
Клинические отношения | Метаплазия, дисплазия, неоплазия |
В этой статье мы обсудим гистологию простого эпителия.
Простой плоскоклеточный
Клетки, обнаруженные в этом типе эпителия, представляют собой плоских и тонких , что делает простой плоский эпителий идеальным для выстилки областей, где происходит пассивная диффузия газов. Области, где он может быть обнаружен, включают: кожу, стенки капилляров, клубочки, слизистую оболочку перикарда, слизистую оболочку плевры, слизистую оболочку брюшной полости и слизистую оболочку альвеол.
- Пятна гематоксилином и эозином (H&E) являются одними из наиболее распространенных красителей, используемых в гистологии и просматриваемых под простой световой микроскопией. Как правило, гематоксилин представляет собой темно-синее или фиолетовое пятно, которое является основным / положительным и связывается с базофильными веществами , такими как нуклеиновые кислоты. Следовательно, ядер клеток будут иметь вид круглых синих структур, а эозин Y используется в качестве контрастного красителя. Эозин окрашивает эозинофильных структур в оттенки красного, розового или оранжевого цвета и выделяет другие структуры клетки.
- Эндотелий — это тип эпителия, обнаруживаемый на внутренней поверхности лимфатических и кровеносных сосудов. Эндотелиальные клетки, выстилающие сосуд, представляют собой простые плоские клетки.
- Мезотелий состоит из специализированных мезотелиальных клеток, которые находятся в виде монослоя плоских эпителиальных клеток, выстилающих базальную мембрану и поддерживаемых плотной нерегулярной соединительной тканью. Таким образом, мезотелий выстилает полости тела и органы (напр.g., плевру, брюшину, перикард, мужские и женские внутренние репродуктивные органы).
Простой кубовидный
Этот эпителий состоит из клеток, которые примерно равны по высоте и ширине со сферическими и центрально расположенными ядрами . В редких случаях микроворсинки обнаруживаются на свободной поверхности кубовидных клеток, которые лучше всего видны при электронной микроскопии. Цитоплазма имеет больше органелл, таких как эндоплазматический ретикулум и митохондрии, по сравнению с простой плоскоклеточной тканью, которые отвечают за несколько метаболических и функциональных активностей.
Эти клетки предлагают секреторных , поглощающих или экскреторных функций и поэтому часто обеспечивают защиту с помощью активных (перекачивание материала в просвет или из него) или пассивных механизмов в зависимости от физиологического местоположения и клеточной специализации. Благодаря своей функции простой кубовидный эпителий часто дифференцируется с образованием секреторных или протоковых частей из желез .
Области, где может быть обнаружен этот тип эпителия, включают: поверхность яичников, стенки почечных канальцев (напр.g., небольшие собирательные протоки почек или слизистая оболочка нефронов), внутренние стенки семенных канальцев мужских семенников, поджелудочная железа, слюнная железа, части глаза и фолликулы щитовидной железы.
Вам нужно вручную изучить различные типы эпителиальной ткани? Ознакомьтесь с нашими тестами на эпителиальной ткани и бесплатными рабочими листами.
Простой столбчатый
В этом типе эпителия высота клеток превышает ширину клетки и кажутся плотно упакованными узкими столбиками .Апикальные поверхности этих клеток обращены к просвету, а противоположная поверхность обращена к базальной мембране. Ядра овоида обычно располагаются ближе к базальной поверхности.
Этот тип эпителия обычно адаптирован для секреции, абсорбции и защиты. Как защитный эпителий , он выстилает второстепенные протоки многих экзокринных желез, а как секреторный эпителий он выстилает желудок и шейку матки. Как абсорбтивный столбчатый эпителий характеризуется наличием полосатой каймы на его апикальной поверхности.Полосатая граница клеток представляет собой модификацию поверхности абсорбирующих столбчатых клеток и состоит из множества неподвижных мельчайших микроворсинок, которые при световой микроскопии придают полосатую или щетинистую границу и увеличивают площадь поверхности для поглощения.
- Железистые бокаловидные клетки представляют собой тип простых столбчатых клеток, которые секретируют муцинов , основного компонента муцина. Как описано ранее, ядро бокаловидной клетки поляризовано в основании клетки (около базальной поверхности), а также в других клеточных органеллах.Остальная часть этого удлиненного типа клеток состоит из цитоплазмы, занятой мембраносвязанными секреторными гранулами , которые служат для секреции муцина и поляризованы по направлению к апикальной поверхности. Бокаловидные клетки выстилают кишечник, дыхательные пути и конъюнктиву глаза, где секретируемая слизь помогает защитить мембрану за счет образования защитного слизистого слоя, который обеспечивает смазку и защищает слизистую оболочку органа от посторонних раздражителей.
Некоторые из простых столбчатых клеток выстланы подвижными ресничками и поэтому называются мерцательным столбчатым эпителием. Из-за движения ресничек в мерцательном столбчатом эпителии этот тип обычно играет роль очищения или перемещения веществ или очень мелких инородных тел. Ресничный столбчатый эпителий, таким образом, находится в дыхательных путях , где слизь и воздух отталкиваются, чтобы очистить дыхательные пути. Другие области, где встречается мерцательный столбчатый эпителий, — это маточные трубы, матка и центральный канал спинного мозга. В женской репродуктивной системе мерцательный столбчатый эпителий выстилает просвет маточной трубы, и движения, производимые ресничками, продвигают яйцеклетку к матке.
Ознакомьтесь со следующим учебным блоком, чтобы получить структурированный способ узнать все о простом эпителии.
Псевдостратифицированный
Ядра клеток в этом типе простого эпителия появляются на разных уровнях и поэтому создают ложное впечатление, что клетки находятся во многих слоях. В псевдостратифицированном эпителии все клетки достигают базальной мембраны, даже если ядра лежат на разных уровнях ткани, что отражает неравномерное наслоение высоких и тонких клеток.Однако на свободную поверхность попадут только более высокие клетки. Псевдостратифицированный эпителий также иногда называют респираторным эпителием , поскольку мерцательный псевдостратифицированный столбчатый эпителий в основном обнаруживается в более крупных дыхательных путях носовой полости, трахеи и бронхов.
Псевдостратифицированный столбчатый эпителий со стереоцилиями , еще одна подклассификация, может быть обнаружен в придатке яичка, сильно скрученном половом протоке мужчины.Нереснитчатый псевдостратифицированный столбчатый эпителий можно обнаружить в перепончатой части семявыносящего протока у мужчин. Наконец, псевдостратифицированный столбчатый эпителий также может быть обнаружен, образуя прямые трубчатые железы эндометрия у женщин.
Подтвердите свои знания о простом эпителии с помощью следующей викторины!
Чтобы пойти еще дальше, вы можете проверить наши ресурсы о различных типах эпителиальной ткани!
Клиническая
Метаплазия
Метаплазия относится к изменению типа клеток и чаще всего включает изменение поверхностных эпителиальных клеток (плоских, столбчатых или уротелиальных) на другой тип клеток.Обычно это происходит из-за хронического стресса и является адаптацией, позволяющей лучше справляться со стрессом. Классическим примером метаплазии является пищевод Барретта . Это происходит во время длительной гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ), когда клетки плоского эпителия пищевода (идеально подходящие для борьбы с трением пищевого комка) заменяются типами клеток, обнаруженными в слизистой оболочке кишечника (столбчатые неморщинистые слизистые клетки и бокаловидные клетки) для защиты слизистой оболочки пищевода от рефлюкса.
Новообразования
Новообразования — это нерегулируемый, моноклональный и необратимый рост новой ткани. Доброкачественные новообразования , возникающие из эпителия, включают аденом и папиллом . Важно отметить, что рак начинается с единственной мутировавшей клетки. Аденомы и папилломы могут стать злокачественными после диспластических предраковых изменений, в результате которых эти новообразования становятся аденокарциномами и папиллярными карциномами.
Дисплазия
Дисплазия представляет собой нарушение клеточного роста и представляет собой термин, используемый для описания пролиферации предраковых клеток, которые обычно возникают в результате длительной патологической гиперплазии (например, при гиперплазии эндометрия). В предраковой стадии дисплазия теоретически обратима , но неспособность облегчить хронический стресс приведет к прогрессированию дисплазии до карциномы (необратимо). Например, интраэпителиальная неоплазия шейки матки (CIN) представляет собой предраковую дисплазию, которая может прогрессировать до рака шейки матки.
Источники
Артикул:
- Энн М. Гилрой, Брайан Р. Макферсон, Лоуренс М. Росс и Майкл Шуенке: Атлас анатомии, 2-е издание, Thieme.
- Эдвард Дж. Гольян: Rapid Review Pathology, 3-е издание, Elsevier Saunders.
- Кумар, Винай, Абул К. Аббас, Нельсон Фаусто, Стэнли Л. Роббинс и Рамзи С. Котран: Базовая патология Роббинса, 9-е издание, Elsevier Saunders.
Простой эпителий: хотите узнать о нем больше?
Наши увлекательные видео, интерактивные викторины, подробные статьи и HD-атлас помогут вам быстрее достичь лучших результатов.
С чем вы предпочитаете учиться?
«Я бы честно сказал, что Kenhub сократил мое учебное время вдвое». — Подробнее. Ким Бенгочеа, Университет Реджиса, Денвер
© Если не указано иное, все содержимое, включая иллюстрации, является исключительной собственностью Kenhub GmbH и защищено немецкими и международными законами об авторских правах.Все права защищены.Глава 4 — Примечания
Глава 4 — ПримечанияГистология: исследование салфетки
1. Определение
- ткань представляет собой группу аналогичных клеток с
межклеточный материал, которые вместе выполняют специфический функция. - Четыре основные ткани и зародышевый листок
производная
1.Эпителиальная ткань: эктодерма, энтодерма, мезодерма
2. Соединительная ткань: мезодерма
3. Мышечная ткань: мезодерма
4. Нервная ткань: эктодерма
Эпителиальный Ткань
2. Характеристики
- Функция — защита, поглощение, выделение
- Существуют в листах клеток (мембран)
- Нет кровоснабжения
- Содержат нижнюю базальную мембрану
— прикрепляет эпителиальную ткань к соединительная ткань ниже
— состоит из соединительной ткани волокна и
межклеточный вещество - Типы эпителиальных клеток
— Squamous — плоские неправильные клетки
— столбчатый — столбчатый с овалом ядро в основании клетки
— кубовидная — относительно квадратная; центральное ядро - Метод классификации эпителиальной ткани
— по типу ячейки
— по количеству ячеек
простой — однослойный
стратифицированный — несколько слоев ячеек - Эпителиальный ткань онлайн сравнение
3. Типы эпителиальной ткани
Простой плоский эпителий
ᙎ 矵 ݈ᙪ 矵 «/>
- Структура — однослойная плоские, плоскоклеточные клетки
- Функция — плоская клетки подчеркивают способность поглощать
- Расположение — воздух
мешок (альвеолы) легких , стенки капилляров,
покрытие органов, часть почек, фильтрующая кровь
Простой кубовидный эпителий
- Конструкция — однослойная кубовидная ячейка
- Функция — всасывание, секреция
- Расположение — почечных канальцев ,
линии роговицы и хрусталика глаза,
Щитовидная железа
Простой столбчатый эпителий
- Структура — однослойная столбчатая
ячейки
— может содержать следующие специализированные структуры
а.Бокаловидные клетки — специализируются на секреции слизи
б. Микроворсинки с перпендикулярными выступами для
абсорбция
c. Реснички дыхательных путей - Функция — защита, секреция, абсорбция
- Расположение — слизистая оболочка пищеварительного тракта, галл.
мочевой пузырь и часть
маточных труб и дыхательных путей
Кератинизированный многослойный чешуйчатый эпителий
- Структура — несколько слоев по три
эпителиальная клетка
типы, поверхностные клетки, обезвоживание, слияние и
заполнить кератином, желтым роговым материалом
— базальный слой подвергается митозу - Функция — защита живых клеток
ниже
— первая линия обороны - Местоположение — поверхности, постоянно подвергающиеся воздействию воздух; кожа
Многослойный плоский без ороговевшего слоя эпителий
- Структура — многослойная из трех
эпителиальная клетка
типы; содержит слизистые железы - Функция — защита от истирания
- Расположение — слизистая рта, пищевода , влагалище
Псевдостратифицированный столбчатый эпителий
- Структура — один слой столбчатых ячеек
с
появление нескольких слоев
— может содержать бокаловидные клетки и реснички - Функция — защита, улавливание частиц пыли
- Расположение — выстилка трахеи ,
мужской репродуктивный
протоки, протоки некоторых желез
Переходный эпителий
- Структура — все 3 типа ячеек с закругление внешнего слоя
- Функция — допускать растяжение (растяжение)
- Расположение — облицовка мочевыводящей мочевой пузырь и мочеточники
Железистый эпителий
- Определение — специализированная группа эпителиальные клетки, которые функционируют в секреции
- Формирование желез
— эпителиальные клетки врастают вниз в поддерживающую ткань
— клетки пролиферируют и дифференцируются
— эндокринный сальники
— клетки, которые отделяются от эпителия
— бесканальный
— выделения попадают в кровоток
— экзокринных желез
— клетки, сохраняют связь с эпителиальной поверхностью
— воздуховод подарок
— секреция высвобождается на поверхность эпителия
-типы экзокринные железы
1.Галокрин — клетка умирает и высвобождает содержимое
— сальная железа
2. Мерокрин — секреция высвобождается без какого-либо ущерба для ячейка
— потовая железа, поджелудочная железа, слюнная
3. Апокринный — секреция отщепляется от клетки
. — молочная железа
Гистология интернет сайты
Соединительная ткань
4.Характеристики
- Функция — опора и переплет
- Клетки разбросаны по волокнам и матрица
- Сосудистые
- Возникает из эмбриональной мезенхимы
- Матрица варьируется от жидкой до твердой, удерживает
волокна и клетки
на месте при определении функции ткани - Волокна состоят из трех белков
- Виды волокон
а.Коллагеновый — содержит белок коллаген,
— волокна прочные и гибкие
б. Ретикулярный волокна — тонкие ветвящиеся волокна формы
несущий каркас
c. Эластичный волокна — белок эластин, волокна
прочность и эластичность - Типы клеток соединительной ткани
а.Фибробласт — производит волокна & матрица
— самый многочисленный
— участвует в ремонте и росте
б. Фиброциты — зрелые фибробласт
— техническое обслуживание
c. Макрофаги — защита, фагоцитоз
d.Плазма клетки — источник циркулирующих антител
е. Тучная клетка — высвобождает гепарин, антикоагулянт
— высвобождает гистамин, расширяет мелкие кровеносные сосуды
f. Жировая клетка — хранит триглицериды
— перстень-печатка
5. Типы соединительной ткани
Ареолярная соединительная ткань (ареолярная)
- Структура — коллагеновая и
эластичные волокна
— все 6 типов клеток соединительной ткани
— жидкая матрица содержит гиалуроновая кислота
который способствует распространению - Функция — покрывает органы
— удерживает кровеносные сосуды и нервы на месте
— широко распространено
— питательная роль
— вторая линия обороны - Расположение — слизистых оболочек
— между тканями органов тела
— с жировой тканью образует подкожный слой
Плотная соединительная ткань
- Структура — коллагеновые волокна
преобладают
— клетки фибробласты и макрофаги
— плотная матрица - Функция — обеспечивает прочность
- Расположение — волокна расположены в
параллельные пучки на прочность
— сухожилий (прикрепляет мышцу к кости)
— связки (прикрепляют кости к суставам)
— волокна неправильной формы для растягивающихся апоневрозов (фасций)
и капсулы органов
Эластичная соединительная ткань
- Конструкция — эластичная со свободным ветвлением волокна, немного фибробластов
- Функция — позволяет расширение и отдача
- Расположение — легкие, трахея, артерии, аорта
Ретикулярная соединительная ткань
- Структура — преимущественно сетчатая волокна, тонкая матрица
- Функция — удерживает ячейки свободные органы вместе
- Расположение — печень, селезенка, , кость кабачок
Жировая соединительная ткань
- Структура — коллагеновая и эластичная
волокна
— все шесть клеток соединительной ткани
— фибробласты специализируются на жировых клетках
(центральная жировая вакуоль тонкая цитоплазма)
— связанные с ареолярной соединительной тканью - Функция — резерв питания на
энергия
— предотвращает потерю тепла телом - Расположение — около большинства органов
— под кожу
— костный мозг длинных костей
Хрящ
- Общие характеристики
1.клетки хондроциты
2. матрица полутвердая, содержащая хондроитин
3. лакуна — депрессия в матрице в котором находятся хондроциты
4. надхрящница — соединительная ткань мембрана вокруг хряща
5. нет кровоснабжения - Типы
Гиалиновый хрящ
- Структура — невидимая мелочь
коллагеновые волокна
— по два хондроцита в каждой лакуне
— густое студенистое основное вещество - Функция — действует как модель для
эмбриональная кость
формирование, предотвращает повреждение тканей
от трения.Придает форму носу
и дыхательные пути - Расположение — закрытие концов костей в суставах
— кончик носа
— между ребром и грудиной (реберная)
— эпифизарная пластина
Фиброхрящ
- Структура — коллагеновые волокна
расположены параллельно пучками
— хондроциты зажаты между пучками - Функция — обеспечивает прочность
- Расположение — межпозвонковое диски лобкового симфиза
Эластичный хрящ
- Структура — много эластичных волокон
- Функция — позволяет гибку вернуться к первоначальной форме
- Расположение — наружное ухо, гортань и евстахиевы трубы
Костная ткань
- Общие характеристики
— органический материя — 35% (клетки и волокна)
— неорганический материал — 65% (матрица и соли кальция) - Типы костных клеток
1.остеоциты — поддержание межклеточного материала (матрица)
2. остеобласты — клетки, образующие периферическую кость
3. остеокласты — внутренние, активно разрушающие костный матрикс - Классификация кости по в структуру
-
1. компактный кость
— расположены в концентрические кольца, называемые гаверсовыми системами
— обеспечивает прочность
— внешний цельный
— Гаверсова система состоит из: ламели — концентрическое кольцо матрицы
лакуна — отверстия между пластинками для остеоцитов
остеоциты — зрелая костная клетка
Гаверсов канал — в центре ламели; дома суда
Canaliculi — лучистые каналы между лакунами
и Гаверсов канал для питательных веществ и отходов
Канал Фолькмана — поперечные каналы от Гаверсовского канала
на внешнюю поверхность, содержащую кровеносные сосуды и нервы
2. Губчатая кость
— неправильная работа костной решетки, называемая трабекулой
— пустоты, заполненные красным костным мозгом
— остеоциты, заключенные в кальциевый матрикс
Лаборатория соединительной ткани
|
|
Ультраструктура и структура гликоконъюгатов эпителия стопы ушка Haliotis tuberculata (Linnaeus, 1758) (Gastropoda, Haliotidae)
Эпителий стопы брюхоногих моллюсков Haliotis tuberculata изучается с помощью световой и электронной микроскопии. понимание анатомии и функциональной морфологии покровов моллюсков.Изучение внешней поверхности с помощью сканирующей электронной микроскопии показывает, что боковой эпителий стопы характеризуется границей микроворсинок с очень скудным наличием небольших ресничек, но эпителий подошвы стопы несет плотное поле из длинных ресничек. Ультраструктурное исследование боковых эпителиальных клеток с помощью просвечивающей электронной микроскопии показывает глубоко пигментированные клетки с высоким содержанием электронно-плотных гранул, которые не наблюдаются в подошвенных эпителиальных клетках. Вдоль педального эпителия присутствуют семь типов секреторных клеток; кроме того, два типа субэпителиальных желез расположены только на подошве стопы.Присутствие и состав гликоконъюгатов в секреторных клетках и субэпителиальных железах анализируют с помощью стандартной и лектиновой гистохимии. Субэпителиальные железы содержат в основном N-гликопротеины, богатые фукозой и маннозой, тогда как секреторные клетки представляют в основном кислые сульфатированные гликоконъюгаты, такие как гликозаминогликаны и муцины, которые богаты галактозой, N-ацетил-галактозамином и N-ацетил-глюкозамином. В эпителии стопы сиаловая кислота отсутствует.
1. Введение
Эпителий моллюсков обычно состоит из призматического однослойного слоя трех основных типов клеток: микроворсинок, ресничек и железистых клеток.Эта общая общая структура диверсифицируется и обогащается разными типами клеток в зависимости от специализации эпителия для выполнения определенных функций. Вариации в структуре и функциях покровов моллюсков хорошо обобщены Бубелем [1] и Симкиссом [2], которые описывают, как разные функции соответствуют разным типам клеток, различным секрециям железистых клеток и существованию реснитчатых или микроворсинок. эпителиальные клетки.
Исследования структуры и функции эпителия брюхоногих моллюсков были выполнены в отношении эпителия специализированных органов, таких как мантия [3–5], щупальца [6] и защитные железы [7].Что касается стопы брюхоногих моллюсков, некоторые исследования были сосредоточены на гистологических исследованиях мышечной [8–11] и соединительной ткани [12]. Однако, хотя эпителию стопы уделяется гораздо больше внимания [13–18], гистохимические и ультраструктурные исследования педального эпителия рудебатропод немногочисленны [19, 20].
Обычно лапа брюхоногого моллюска покрыта слоем слизи, важной для ряда функций, включая смазку, движение, защиту и адгезию к субстрату [21].Было показано, что вязкоупругие свойства слизи лимфы могут быть изменены по-разному, когда требуется определенная функция [22, 23]. Более того, слизистый слой играет важную экологическую роль в поведении сообщества [24] и в экосистеме как защита или притяжение. Он также обеспечивает среду обитания для микроорганизмов, как описано в Haliotis diversicolor [25].
Слой слизи, покрывающий стопу брюхоногих, продуцируется секреторными клетками эпителия и субэпителиальными железами.Разнообразие этих типов клеток, их состав и распространение варьируются от вида к виду. Напр., Grenon и Walker [14] выделили девять типов секреторных клеток в эпителии стопы морских брюхоногих моллюсков, Patella vulgata , но другое распределение секреторных клеток было обнаружено теми же авторами в другом блюде Acmaea tessulata . Однако Shirbhate и Cook [18] описали десять типов секреторных клеток у другого морского брюхоногого моллюска Littorina littorea .Традиционные гистохимические методы, использованные в этих исследованиях, выявили различные типы секреторных клеток, содержащие кислотные и нейтральные гликоконъюгаты, но они не дают полной информации о структурных деталях гликанов. Присутствие гликозаминогликанов и гликопротеинов было продемонстрировано с помощью лектинов в эпителии некоторых моллюсков [26, 27], но в литературе нет данных о природе и распределении гликоконъюгатов в ногах видов Haliotis . .
В дополнение к секреторной системе, брюхоногие моллюски были описаны как содержащие множество пигментов в своих эпителиальных клетках, включая каротиноид, меланин и билихромы [28]. В предыдущем исследовании с использованием световой микроскопии Bravo et al. [29] охарактеризовали два типа пигментированных клеток, расположенных в гребнях и бороздках развернутой боковой стопы Haliotis tuberculata (Linnaeus, 1758). Эти клетки содержали соответственно меланин и фикобилипротеиноподобный пигмент, которые придают этому покрову его внешний вид и характерный цвет.
Целью данной работы является ультраструктурная характеристика различных типов клеток, обнаруживаемых как в боковом, так и в подошвенном эпителии стопы Haliotis tuberculata . Кроме того, мы анализируем с использованием традиционных методов и методов гистохимии лектинов распределение и состав гликоконъюгатов в этом эпителии, чтобы внести свой вклад в понимание анатомии и функциональной морфологии покровов моллюсков.
2. Материалы и методы
2.1. Животные
Семь взрослых особей Haliotis tuberculata длиной около 12 см были собраны в разное время года в течение 2009 г. в разных местах в Риа-де-Виго (северо-запад Испании).Среда обитания Haliotis является инфралиторальной, поэтому дайвер собирал их с подводных камней, стараясь не повредить животных, и помещали в морскую воду с аэрацией до тех пор, пока они не были обработаны за несколько часов. После анестезии путем погружения в 5% -ный раствор MgCl 2 в морской воде [30] из средней краевой части тела животного вырезали небольшие кусочки стопы, одновременно беря боковую и вентральную части стопы. показано в нашей предыдущей работе [29].В этом же разделе мы проанализировали боковую часть покровов стопы, названную боковой стопой, и подошву стопы, которая представляет собой поверхность передвижения, контактирующую с субстратом. Все процедуры для экспериментов на животных были одобрены комитетом по уходу за животными и их использованию при региональном правительстве Галисии (Xunta de Galicia) и соответствовали руководящим принципам Европейского сообщества.
2.2. Световая микроскопия
Образцы фиксировали в формоле Baker (Prolabo) в течение 24–48 ч при комнатной температуре, промывали водопроводной водой и заливали парафином.Срезы (8 мкм толщиной мкм) депарафинизировали в ксилоле, регидратировали градуированным этанолом и подвергали следующим гистохимическим процедурам для идентификации гликоконъюгатов.
2.2.1. Обычные гистохимические методы
Срезы окрашивали альциановым синим (AB, pH 1 или 2,5, Sigma) для демонстрации кислых гликоконъюгатов и диамина с высоким содержанием железа (HID) в сочетании с альциановым синим (HID / AB) для разделения сульфатированных и карбоксилированных гликоконъюгатов. В качестве контроля некоторые срезы были десульфатированы перед окрашиванием AB или HID.Десульфатация — это последовательный процесс метилирования и омыления, специально применяемый для удаления сульфатно-сложноэфирных групп [31].
Образцы также подвергали химическому методу с использованием периодической кислоты — реактивности Шиффа (PAS, Merck), что положительно для гликоконъюгатов, содержащих нейтральные сахара и / или сиаловую кислоту. В гистохимии присутствие нейтральных моносахаридных остатков означает, что они не имеют сульфатных эфиров, карбоновой кислоты или азотсодержащих функциональных групп. Чтобы узнать, являются ли PAS-положительные соединения гликогеном, проводили тест на амилазу с использованием срезов печени крысы в качестве положительного контроля.Все протоколы окрашивания были выполнены в соответствии с Kiernan [31] и Molist et al. [32].
2.2.2. Lectin Histochemistry
Лектины, меченные дигоксигенином (DIG) от Boehringer Mannheim Biochemica и биотином (Sigma), использовали для идентификации специфических остатков сахара в гликоконъюгатах. Лектины, конъюгированные с DIG, использовали в соответствии с методом, ранее описанным Fernández-Rodríguez et al. [33], но с небольшими изменениями. Вкратце, срезы предварительно инкубировали в течение ночи во влажной камере с блокирующим раствором и дважды промывали трис-буферным солевым раствором (TBS).Затем срезы инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре со следующими DIG-конъюгированными лектинами: ( Galanthus nivalis ) GNA, специфичными для маннозы, ( Sambucus nigra ) SNA и (Maackia amurensis) MAA, оба специфичны для сиаловой кислоты , PNA ( Arachis hypogaea ), которая распознает последовательность Галактоза (бета 1-3) N-ацетилгалактозамин или ( Aleuria aurantia ) AAA, специфичная для фукозы, разведенная в TBS, содержащем различные соли (1 мМ MgCl 2 , 1 мМ MnCl 2 и 1 мМ CaCl 2 ).После этого срезы промывали трижды в TBS и инкубировали в течение 2 ч с анти-дигоксигенин-щелочной фосфатазой (анти-DIG-AP), разведенным 1: 1000 с TBS. Наконец, после трех промывок TBS активность АР была визуализирована с помощью 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP) / 4-нитросинего хлорида тетразолия (NBT), оба от Boehringer Mannheim Biochemica. Реакцию останавливали дистиллированной водой, а затем срезы обезвоживали, закрывали и анализировали с помощью микроскопа BX51 Olympus.
Лектины, конъюгированные с биотином, использовали следующим образом: после инактивации эндогенной пероксидазной активности 3% H 2 O 2 в метаноле в течение 30 минут срезы промывали в TBS и предварительно инкубировали с 1% бычьим сывороточным альбумином в TBS для минимизации неспецифического связывания. Затем срезы инкубировали в течение ночи при 4 ° C со следующими лектинами: WGA ( Triticum vulgare ), специфичным для N-ацетилглюкозамина, DBA ( Dolichos biflorus ), специфичным для N-ацетилгалактозамина, UEA I ( Ulex). europaeus ) и LTA ( Lotus tetragonolobus ), специфичные для фукозы, или ConA ( Canavalia ensiformis ), специфичные для маннозы.Затем срезы промывали в TBS и инкубировали в течение 1 ч с реагентом авидин-биотинпероксидазы (ABC Kit Vector Laboratories), разведенным 1: 100 в том же буфере. Этот комплекс был разработан с тетрагидрохлоридом 3,3’диаминобензидина (DAB, таблетки 0,7 мг / мл, Sigma) и 0,03% H 2 O 2 в TBS в течение 5–10 мин. Наконец, срезы промывали TBS, обезвоживали и устанавливали. Некоторые срезы контрастировали гематоксилином Майера (Montplet & Esteban SA).
Все лектины использовались в концентрации 10 мкМ г / мл, за исключением MAA и SNA, которые применялись в трех различных концентрациях (10, 25 и 50 мкл г / мл).Для проверки специфичности лектинов были выполнены два типа контролей: общий контроль, в котором конъюгированный лектин был заменен буфером, и конкретный контроль путем предварительной инкубации в течение 1 часа каждого лектина с его специфическим моно / олигосахаридом (сигма) в соответствующем концентрации. В любом случае в контрольных срезах маркировки не обнаружено.
Кроме того, перед инкубацией с лектинами использовали десульфатационную обработку.
2.3. Сканирующая электронная микроскопия (SEM)
Кусочки размером примерно 3-4 мм 3 фиксировали в течение 4 часов за 2 штуки.5% глутарового альдегида (Merck) в фильтрованной морской воде. Затем образцы промывали в какодилатном буфере, дегидратировали в градуированной серии этанола и изоамилацетата (по 10 минут при комнатной температуре), сушили до критической точки в CO 2 , покрывали золотом и исследовали с помощью Philips XL30 SEM.
2.4. Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)
Небольшие кусочки покровов фиксировали в 2% параформальдегиде (Scharlau) и 2% глутаральдегиде в какодилатном буфере в течение приблизительно 3 часов при 4 ° C.Затем ткани промывали трижды (по 1 ч каждый) в том же буфере и постфиксировали в 1% тетроксиде осмия в какодилатном буфере в течение 2 ч при 4 ° C. После промывки тканей в буфере их затем дегидратировали в ацетоне с определенным содержанием и затем заливали смолой Спурра. Полутонкие срезы, окрашенные толуидиновым синим (сигма), использовали для определения области исследования. Ультратонкие срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали с помощью ТЕМ Philips CM20 или Jeol JEM1010.
3. Результаты
3.1. Общие характеристики и сканирующая электронная микроскопия
Ультраструктура эпителия стопы Haliotis tuberculata схематически представлена на рисунках, показанных на рисунках 1 (а) и 1 (b). Боковая стопа выстлана двумя типами столбчатых эпителиальных клеток, показывающих заметную щеточную кайму, перемежающуюся с ресничными клетками и четырьмя различными типами эпителиальных секреторных клеток (Рисунок 1 (а)). Напротив, подошва стопы характеризуется более высокими столбчатыми ресничными клетками с тремя типами эпителиальных секреторных клеток среди них.Более того, скопления секреторных клеток встроены в субэпителиальное пространство подошвы стопы, и из-за их расположения в железистых комплексах мы называем их субэпителиальными железами (Рисунок 1 (b)).
Внешняя поверхность боковой ножки относительно шероховатая, с множеством вертикальных складок, образующих гребни и канавки (рис. 2 (а)). На SEM наблюдаются эпителиальные клетки микроворсинок, чередующиеся с отверстиями секреторных клеток (рис. 2 (b)). Более того, клетки с небольшими пучками ресничек встречаются с очень низкой плотностью, отделенные друг от друга более чем на 100 мкм мкм.Диаметр пучков ресничек составляет около 4 мкм м, и они состоят приблизительно из 30 ресничек, окруженных микроворсинками (Рис. 2 (b) и 2 (c)). Однако внешняя поверхность подошвы стопы покрыта плотным полем из длинных ресничек, которые обычно покрыты толстым слоем слизи (рис. 2 (г)). Этот слой слизи важен для защиты стопы во время движения, а также для сцепления с поверхностью камня.
3.2. Световая микроскопия
Результаты гистохимического анализа показывают наличие различных типов гликоконъюгатов в секреторных клетках боковых и подошвенных эпителия, а также в субэпителиальных железах подошвы стопы.
3.2.1. Обычная гистохимия
Вдоль эпителия стопы довольно многочисленные эпителиальные секреторные клетки окрашиваются альциановым синим (AB). Однако субэпителиальные железы проявляют слабую положительность. После десульфатации АБ-положительность исчезает, указывая на то, что большинство АБ-положительных эпителиальных секреторных клеток содержат в основном гликоконъюгаты с О-сульфатированными группами. Техника с высоким содержанием диамина железа / альцианового синего также подтверждает этот результат (Рисунки 3 (a) и 3 (b)). Кроме того, с помощью этого метода некоторые субэпителиальные железы (рис. 3 (а)) и боковые секреторные клетки (рис. 3 (b)) окрашиваются в синий цвет, что указывает на то, что они содержат карбоксилированные гликоконъюгаты.Более того, на границе между боковой стороной и подошвой стопы в одной секреторной клетке обнаруживаются два типа кислых гликоконъюгатов (рис. 3 (б)). При использовании метода периодической кислоты-Шиффа (PAS) сильная реакция обнаруживается в субэпителиальных железах (рис. 3 (c)). Количество положительных эпителиальных секреторных клеток варьирует от небольшого количества в подошве стопы (Рисунок 3 (c)) до умеренного в боковой части стопы (Рисунок 3 (d)). Поскольку срезы, обработанные методом альфа-амилазы-PAS, исключают присутствие гликогена в этих клетках, положительный результат PAS обусловлен нейтральными сахарами и / или сиаловой кислотой.
3.2.2. Lectin Histochemistry
Результаты были организованы путем группирования лектинов с аналогичной углеводной специфичностью. Что касается лектинов, связывающих L-фукозу, остатки L-фукозы обнаруживаются в субэпителиальных железах и единственных секреторных клетках (рис. 3 (e)) с помощью трех исследуемых лектинов (AAA, LTA и UEA-I). В боковой части стопы только лектин AAA умеренно связывается с некоторыми секреторными клетками эпителия (рис. 3 (f)), но увеличивает количество положительных клеток и интенсивность окрашивания после обработки десульфатацией (рис. 3 (g)).В случае лектинов, связывающих маннозу (ConA и GNA), сильное положительное мечение обоими лектинами обнаруживается в апикальном крае всех единственных эпителиальных клеток. Более того, эти два лектина связываются с субэпителиальными железами (рис. 3 (h)). Напротив, единственные секреторные клетки не реагируют с ними обоими даже после десульфатации, тогда как боковые секреторные клетки реагируют с GNA только после такой обработки (рис. 3 (i)). С лектином ПНК не обнаруживается связывания в подошве стопы, тогда как редкие боковые секреторные клетки являются положительными.После десульфатации количество положительных боковых секреторных клеток увеличивается, и несколько единственных секреторных клеток также являются положительными (Рисунки 3 (j) и 3 (k)). Лектин, связывающий N-ацетил-глюкозамин (WGA), слабо связывается с некоторыми секреторными клетками. Однако картина окрашивания полностью изменяется при обработке десульфатацией, которая демонстрирует сильную реактивность этого лектина в единственных и боковых секреторных клетках (Фигуры 3 (l) и 3 (m)). Более того, небольшое количество клеток также слабо окрашивается в субэпителиальных железах после этого лечения (рис. 3 (l)).Что касается лектинового DBA, который распознает терминальный N-ацетилгалактозамин, не обнаружено мечения ни в субэпителиальных железах, ни в единственных секреторных клетках. Однако некоторые секреторные клетки боковой стопы реагируют с DBA, и количество положительных клеток увеличивается после десульфатации (рис. 3 (n)). При таком лечении большое количество положительных эпителиальных секреторных клеток обнаруживается в подошве стопы (рис. 3 (о)), тогда как субэпителиальные железы остаются инертными.
Лектины, специфичные для сиаловой кислоты (SNA и MAA), не связываются ни с одним типом клеток эпителия стопы Haliotis tuberculata , что позволяет предположить, что сиаловая кислота в этой ткани отсутствует.В этом случае были проанализированы три различных концентрации (10, 25 и 50 мкл г / мл) для проверки результатов. Тем не менее, окрашивание этими лектинами обнаруживается в соединительной ткани, что подтверждает правильность выполнения техники.
3.3. Просвечивающая электронная микроскопия
Под электронной микроскопией обнаруживаются различные типы эпителиальных и секреторных клеток между боковой стороной и подошвой стопы. Вариабельность этих типов клеток указывает на различия на функциональном уровне.
3.3.1. Типы эпителиальных клеток
Боковые эпителиальные клетки обычно столбчатые, а боковая мембрана сильно вздута (Рисунки 4 (a) и 4 (b)). Соседние клетки соединяются вместе в своих апикальных областях клеточными соединениями с появлением слипшихся зонул; кроме того, под соединительным комплексом возникает высокая степень перекрестной перемычки (рис. 4 (б)). Небольшие пучки ресничек, вероятно, происходящие из одной клетки, редко распределены среди микроворсинок (рис. 4 (а)).Связки микрофиламентов пересекают цитоплазму клетки и составляют ядро микроворсинок (рис. 4 (с)). Кроме того, комплекс Гольджи и митохондрии в основном распределены в апикальной части цитоплазмы (Рисунки 1 (a), 4 (c) и 4 (d)). Ядра расположены либо в центре, либо в основании эпителиальных клеток. Небольшие скопления электронно-плотного хроматина распределены по всей нуклеоплазме, особенно связанные с внутренней ядерной мембраной (рис. 4 (а)). Более того, он выделил две разные боковые эпителиальные клетки, которые содержат два типа пигментов.На бороздках обнаруживаются глубоко пигментированные меланиновые клетки, содержащие большое количество цитоплазматических меланосом (Рисунки 4 (a), 4 (c) и 4 (d)), которые вызывают коричневый цвет этих областей, наблюдаемых при световой микроскопии или даже макроскопически. Помимо округлых меланосом, существует множество частично меланизированных органелл, которые содержат два разных электронно-плотных компонента и могут соответствовать ранней стадии развития меланосом (Рисунок 4 (d)). Пигментированные клетки меланина также демонстрируют множество микрофиламентов, а также обширный комплекс Гольджи с многочисленными пузырьками, смешанными с меланосомами (рис. 4 (d)).На гребнях наиболее распространенной особенностью эпителиальных клеток является различное зернистое содержание, от электронно-плотного до полностью электронно-прозрачного. Эти клетки имеют пониженное содержание меланосом, и большинство из них частично меланизированы (рис. 4 (е)). Из-за своего расположения на гребнях другие везикулы, содержащие гранулированный или более тонкий материал, могут соответствовать везикулам, содержащим фикобилин-подобный пигмент (Рисунок 4 (e)), как ранее наблюдалось с помощью флуоресцентной микроскопии [29].
Единственные эпителиальные клетки показывают различия в морфологии и пигментации по сравнению с боковым эпителием стопы.Наиболее примечательными особенностями единичных эпителиальных клеток являются отсутствие пигментированных клеток и обилие ресничек на их апикальном домене (Рис. 4 (g) и 4 (h)). Также можно наблюдать слой слизи, образующий покров над ресничными клетками (рис. 4 (g)).
3.3.2. Типы секреторных клеток
Вдоль боковой стопы эпителиальные секреторные клетки разбросаны среди эпителиальных клеток. Они похожи по форме и внешнему виду на бокаловидные клетки и характеризуются набухшей апикальной поверхностью с секреторными гранулами и узкой базальной областью с ядром (рис. 1 (а)).С помощью ПЭМ обнаруживаются четыре различных типа секреторных клеток (A, B, C и D), которые в основном различаются по внешнему виду и электронной плотности секреторных гранул. Секреторные гранулы клеток, обозначенные здесь как тип «А», полностью электроннопрозрачны, очень плотно упакованы и занимают всю цитоплазму (рисунки 4 (а), 5 (а) и 5 (г)). Секреторная клетка типа «B» имеет электронно-просвечивающие гранулы с мелкозернистым материалом и небольшое ядро, расположенное базолатерально (рис. 4 (а)). Тип «C» содержит секреторные гранулы с неравномерным распределением электронно-плотного и электронно-просвечивающего материала (рис. 5 (а)).Их ядра маленькие и кажутся сжатыми в базальной части клетки, где можно наблюдать тела с плотно упакованной мембраной (рис. 5 (b)). Кроме того, рядом с ядром находится заметная грубая эндоплазматическая сеть (рис. 5 (c)). Часто наблюдается экструзия секреторного материала из клетки, и иногда ряд гранул остаются видимыми снаружи (рис. 5 (а)). Клетки типа «D» обладают атипичными секреторными гранулами, состоящими из очень большого количества плотно упакованных и закрученных мембран, которые могут соответствовать остаточному материалу (рис. 5 (d)).
В эпителии подошвы стопы также наблюдаются три типа секреторных клеток. Один из них аналогичен типу B, описанному в боковом эпителии стопы (рис. 4 (h)). Второй из них более многочислен и представляет собой секреторный продукт, аналогичный продукту типа В-клеток, но сконцентрирован в более плотных гранулах. Мы идентифицируем эту новую секреторную клетку как тип E (Рисунки 4 (g) и 4 (h)). Третий тип (тип F) имеет мелкие и плотные зерна (рис. 4 (h)) с более высокой электронной плотностью в центре, чем на периферии.
В дополнение к этим трем типам эпителиальных секреторных клеток скопления секреторных клеток, локализованные в субэпителиальном положении, образуют многоклеточные железы на подошве стопы (Рисунок 5 (e)). Под TEM-микроскопией эти многоклеточные железы содержат очень плотный гранулированный материал, который может выходить на подошву через шейные отверстия, расположенные между эпителиальными клетками (Рисунки 1 (b) и 4 (i)). Эти секреторные клетки характеризуются очень хорошо развитым комплексом Гольджи, расположенным по кругу (Рисунки 5 (e) и 5 (f)).Иногда обнаруживаются субэпителиальные одноклеточные секреторные железы с гранулами, напоминающими гранулы эпителиальных секреторных B-клеток типа (рис. 5 (g)).
4. Обсуждение
4.1. Эпителиальные клетки
Эпителий стопы Haliotis tuberculata имеет уникальные особенности как бокового, так и подошвенного эпителия стопы. Боковые эпителиальные клетки сильно пигментированы гранулами меланина и фикобилина и имеют заметную границу микроворсинок.Похожий эпителий был описан в боковой лапе другого брюхоногого моллюска, Patella vulgata [14], но в этом случае наблюдались только гранулы меланина. Пигментированные клетки, содержащие зрелые и незрелые меланосомы, подобные тем, которые наблюдаются в эпителии морского ушка (настоящие результаты), описаны в Sepia officinalis [34]. Однако в случае аналогичных пигментированных клеток, которые придали красно-пурпурный цвет коже Aplysia californica [35], не было описано гранул меланина.Более того, в боковых эпителиальных клетках, расположенных на гребнях складок, наблюдалось высокое содержание голубовато-зеленого пигмента, который имеет характеристики фикобилипротеина, ранее обнаруженные с помощью флуоресцентной микроскопии [29]. Этот тип пигментированных гранул содержит электроннопрозрачный мелкозернистый материал, который ранее не описывался ни у одного другого брюхоногого моллюска. В обзоре биохромии моллюсков Фокс [36] описал в Haliotis билихромный пигмент, известный как халиотисрубин, который накапливается в результате потребления красных водорослей.Следовательно, возможно также диетическое происхождение пигмента, обнаруженного нами в эпителии Haliotis tuberculata .
Более того, боковая стопа Haliotis tuberculata также характеризуется наличием токсинов в одном из типов секреторных клеток [29]. Возможно, пигментация вместе с токсичностью играют важную экологическую роль в защите от хищников.
Наличие щеточной каймы в клетках бокового эпителия, как правило, указывает на абсорбционную функцию, даже если клетка выполняет другую функцию.Было продемонстрировано, что покровы моллюсков могут действовать как место активного обмена ионов и метаболитов [2]. Процессы эндоцитоза описаны также в эпителии стопы наземных брюхоногих моллюсков [37] и в стопе блюдца [38]. Тем не менее, несмотря на наличие выступающих микроворсинок, в этом исследовании не было обнаружено доказательств эндоцитоза через апикальный край в эпителиальных клетках Haliotis tuberculata . Однако присутствие митохондрий, в основном распределенных на поверхности эпителиальных клеток, может свидетельствовать о высокой метаболической активности.
Подошвенный эпителий стопы Haliotis tuberculata (настоящие результаты) и других водных брюхоногих моллюсков [см. [28] для обзора] характеризуется обилием реснитчатых клеток, которые, вероятно, используются для распределения слизи для скольжения по слизи [21]. ]. Некоторые похожие разбросанные клетки были обнаружены в боковой части стопы, но значение их функции в этой части тела не совсем понятно. В Haliotis сенсорные функции и функции рециркуляции потока воды были описаны для реснитчатых клеток щупалец [6, 28].Другой особенностью подошвенной стопы является наличие более заметного слоя слизи, чем на боковой поверхности стопы, что также важно для передвижения и адгезии к основанию.
4.2. Эпителиальные секреторные клетки и субэпителиальные железы
Гистохимические исследования выявили присутствие эпителиальных секреторных и субэпителиальных железистых клеток в стопе брюхоногих моллюсков, но их количество и химический состав сильно различались у разных изученных видов [28]. Вероятно, это связано со значительным разнообразием мест обитания, которые они занимают, и с их различным образом жизни.Было высказано предположение, что блюдца могут секретировать различные формы слизи для подвижности или прилипания к камням [23] в ответ на их циклы приливной активности. Однако мы не можем ожидать того же от Haliotis , который живет в инфралиторальной зоне, никогда не подвергавшейся приливным циклам [39].
Что касается стопы Haliotis tuberculata , представленные результаты подтверждают наличие нейтральных и кислых (в основном сульфатированных) гликоконъюгатов, которые мы описали ранее [29]; Кроме того, в этой работе с помощью специфических лектинов исследовали наличие и распределение остатков сахара в олигосахаридных боковых цепях гликоконъюгатов в его педальном эпителии.
Согласно классическим углеводным гистохимическим методам, большинство эпителиальных секреторных клеток вдоль стопы Haliotis богато кислыми сульфатированными гликоконъюгатами (настоящие результаты), что полностью согласуется с предыдущими исследованиями, описывающими, что сульфат является основным компонентом слизи брюхоногих моллюсков [ 14, 15, 18, 40]. С другой стороны, субэпителиальные железы показали интенсивное окрашивание PAS и слабое сродство к AB, что указывает на то, что эти клетки продуцируют смесь гликоконъюгатов с преобладанием нейтральных гликопротеинов над кислыми гликоконъюгатами.В отличие от эпителия стопы некоторых голожаберников, субэпителиальные железы, называемые клетками с длинной шеей, были источником кислых гликоконъюгатов [17], тогда как эпителиальные секреторные клетки были PAS-положительными как на легком, так и на ультраструктурном уровне [41]. Различная гистохимическая картина этих исследований могла быть вызвана разнообразием типов секреторных клеток, распределенных по ноге брюхоногих моллюсков.
В Haliotis субэпителиальные железы вместе с единственными секреторными клетками показали реактивность с тремя исследованными фукозоспецифичными лектинами; кроме того, связывание ААА также было обнаружено в боковых секреторных клетках.Лектины UEA I и LTA метят преимущественно остатки фукозы, расположенные во внешней области олигосахаридных цепей [42], тогда как AAA может также связываться с этими остатками фукозы альфа (1–6), связанными с самым внутренним N-ацетил-глюкозамином ядра. N-связанных олигосахаридов [43]. Таким образом, наши результаты предполагают, что остатки фукозы, присутствующие в боковой части стопы и распознаваемые AAA, связаны с основной областью N-связанных олигосахаридов. Такой вид фукозилирования описан в N-гликопротеинах различных водных и наземных видов брюхоногих моллюсков [44].
Маннозоспецифические лектины (ConA и GNA) связываются с апикальной частью единственных мерцательных эпителиальных клеток, а также с субэпителиальными железами. Умеренное связывание этих лектинов с апикальной частью клеток ресничных протоков описано в пищеварительных канальцах Mytilus [26]. Лектин ConA связывается с некоторыми специфическими классами N-гликанов и, как известно, не связывает O-гликаны с гликопротеинами клеток животных [45]. Наши результаты показывают, что субэпителиальные железы содержат в основном N-гликопротеины.В боковых секреторных клетках остатки маннозы обнаруживаются только с помощью GNA после обработки десульфатацией, демонстрируя, что сульфатированная манноза присутствует в концевом положении.
Маркировка лектинов WGA и DBA указывает на присутствие сульфатированных остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилгалактозамина, соответственно, как в единственных, так и в боковых секреторных клетках, но не в субэпителиальных железах. Эти моносахариды являются основными составляющими сульфатированных гликозаминогликанов, таких как гепарансульфат, гепарин и хондроитинсульфат, а также сульфатированных муцинов.Сульфатированные гликозаминогликаны и муцины были описаны у других брюхоногих моллюсков [46–48] и могут быть ответственны за повышенную вязкость секрета [21, 48]. Наличие кислых сульфатированных гликоконъюгатов в секреторных клетках эпителия, но не в субэпителиальных железах, обнаруженных с лектинами, согласуется с нашими результатами с классической гистохимией.
Гликаны, оканчивающиеся последовательностью галактозы (бета1-3) N-ацетилгалактозамин (реактивность PNA), были обнаружены в боковых секреторных клетках только после обработки десульфатацией.Аналогичный результат был описан Robledo et al. [26] в пищеварительной железе Mytilus galloprovincialis , что указывает на присутствие терминальной сульфатированной галактозы в О-связанных олигосахаридах [49], скорее всего, в сульфатированных муцинах. Если слизь, выделяемая боковой стороной стопы, имеет некоторые характеристики, сходные с характеристиками слизи, выделяемой пищеварительной железой, это означает, что можно указать, что она участвует в защитных и смазывающих функциях.
Наши результаты с лектинами SNA и MAA демонстрируют, что сиаловая кислота не присутствует ни в боковом, ни в эпителиальном эпителии стопы, а также в субэпителиальных железах Haliotis tuberculata ; однако он был обнаружен в соединительной ткани этого брюхоногого моллюска.Давно утверждалось, что сиаловая кислота отсутствует у брюхоногих моллюсков, она заменена N-ацетилмурамовой кислотой [5, 50]; однако позже он был обнаружен у различных моллюсков с помощью биохимических [51, 52] и гистохимических (настоящие результаты) методов.
В целом наши данные позволяют предположить, что единственные субэпителиальные железы содержат в основном N-гликопротеины. Напротив, единственные секреторные клетки характеризуются присутствием сульфатированных гликозаминогликанов, которые могут быть составными частями протеогликанов, а боковые секреторные клетки богаты муцинами, в основном сульфатированными.Единственная слизь представляет собой смесь N-гликопротеинов и протеогликанов, которую Haliotis , вероятно, использует для повышения защиты и адгезии к сустрату. Однако боковая слизь, богатая сульфатными муцинами, обычно увеличивает вязкость слизи и очень важна для защиты.
Чтобы лучше понять различия, наблюдаемые в составе гликоконъюгатов между секреторными клетками эпителия стопы Haliotis tuberculata , мы обратились к ультраструктурному исследованию.Полученные результаты позволили идентифицировать семь типов секреторных интраэпителиальных клеток и два типа субэпителиальных желез, причем последние присутствуют только на подошве стопы. Секреторные клетки содержат пузырьки, которые весьма различны по внешнему виду и электронной плотности. Структура этих клеток аналогична описанной ранее для других секреторных клеток [6, 53], за исключением типов C и D, характерных для боковой стопы. Гранулы секреции с ультраструктурой, подобной гранулам, присутствующим в клетках типа C и D, ранее не сообщались.
В заключение, различия между боковым и подошвенным эпителием стопы Haliotis tuberculata в отношении ультраструктуры эпителиальных и секреторных клеток, вместе с различными типами гликоконъюгатов, обнаруженных на обеих частях, указывают на возможные функциональные различия между обеими областями морского ушка. кожный покров.
Конфликт интерстов
Авторы подтверждают, что эксперименты проводятся в соответствии с действующим законодательством Европейского Союза. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Авторы благодарят Кармен Альварес (Университет Виго) за техническую помощь и Инес Пазос и Сусо Мендес (Подразделение электронной микроскопии CACTI, Университет Виго) за оборудование для SEM и TEM. Они также благодарны доктору М.А. Помбалу Диего за критическое прочтение рукописи. Это исследование было поддержано Министерством науки и инноваций-Feder (BF 2009-13369) и Университетом Виго (10VIB 10).
Границы | Разбавление морской воды влияет на транспорт Ca2 + в эпителии внешней мантии Crassostrea gigas
Введение
Приливные организмы сталкиваются с колеблющейся средой, где соленость может резко меняться в течение одного дня (Geng et al., 2016). Эти естественные колебания солености могут еще больше усугубляться изменениями, происходящими в океанах из-за изменения климата, которое, как ожидается, изменит характер испарения воды и осадков в ближайшем будущем (Ipcc, 2014). Многие морские осмоконформеры не обладают способностью регулировать осмолярность и ионное содержание своих внутренних жидкостей, особенно внеклеточных жидкостей, которые находятся в равновесии с окружающей средой, что делает их очень восприимчивыми к колебаниям солености. Морским кальцификаторам необходимы ионы Ca 2+ и CO 3 2– для создания своей оболочки.Часть необходимого CO 3 2– вырабатывается метаболически, а Ca 2+ поступает из окружающей среды или из пищи (Sillanpää et al., 2016; Zhao et al., 2018b). Следовательно, изменения солености морской воды и, следовательно, концентрации ионов, вероятно, повлияют на физиологию морских кальцифицирующих организмов. Было показано, что соленый стресс вызывает множественные физиологические реакции у морских кальцифицирующих беспозвоночных, включая изменения экспрессии белков и мРНК, метаболизма ферментов, клеточной передачи сигналов, содержания аминокислот и ионной регуляции (Shumway, 1977a; Berger and Kharazova, 1997; Zhao et al., 2012; Meng et al., 2013). Было показано, что уменьшение солености воды в окружающей среде снижает кальцификацию раковин и / или влияет на свойства раковин у таких видов, как Crassostrea virginica и Mytilus edulis (Malone and Dodd, 1967; Dickinson et al., 2012; Sanders et al., 2018) и изменяют экспрессию и функцию накреина, фермента карбоангидразы, играющего ключевую роль в формировании раковины двустворчатых моллюсков у Mytilus galloprovincialis (Cardoso et al., 2019). Тем не менее, остается неясным, как взаимосвязаны соленость окружающей среды, механизмы ионной регуляции и кальцификация.
Двустворчатые моллюски — это класс моллюсков, которые имеют сжатые с боков тела, заключенные в оболочку из карбоната кальция (CaCO 3 ), которая обеспечивает защиту от окружающей среды и поддерживает тело животного. Ткань мантии, которая покрывает соматическую массу и выстилает раковину, является основным производящим раковину органом у двустворчатых моллюсков (Marin et al., 2012; Xiang et al., 2014). Тканевая организация мантии двустворчатых моллюсков сохранена. Он состоит из внутреннего слоя мышц, нервных волокон и соединительной ткани, покрытых с обеих сторон эпителиальными клетками (Marin et al., 2012). Внешний мантийный эпителий (OME) представляет собой обращенный к оболочке эпителиальный слой, который транспортирует и секретирует компоненты оболочки. Кальцификация раковины происходит во внепаллиальном пространстве (EPS) между OME и раковиной (Wheeler, Sikes, 1984; Marin et al., 2012).
Мантия — неоднородный орган, и различные зоны мантии различаются по морфологии и функциям (Gardner et al., 2011; Bjärnmark et al., 2016). Традиционно мантия двустворчатых моллюсков делится на три зоны: центральную, мантийную и краевую (Kádár, 2008; Bjärnmark et al., 2016). Было высказано предположение, что различия в морфологии между различными зонами мантии отражают их функции, такие как способность переносить ионы. Предполагается, что край мантии, состоящий из трех отдельных складок, внутренней, средней и внешней, особенно активен в кальцификации (Kádár, 2008). Однако было показано, что мантийная зона мантии активно переносит Ca 2+ (Sillanpää et al., 2018). В дополнение к транспорту Ca 2+ , культивируемые клетки мантии наблюдали внутриклеточное осаждение CaCO 3 (Xiang et al., 2014). Мантия также является основным органом, ответственным за секрецию органического матрикса, на который осаждается CaCO 3 (Wheeler, Sikes, 1984; Wang et al., 2013). Белки, составляющие матрицу оболочки, контролируют расположение и время процесса биоминерализации, а также форму и ориентацию минералов (Marin and Luquet, 2004; Takeuchi and Endo, 2006; Gardner et al., 2011).
Постоянное поступление ионов кальция и карбоната необходимо двустворчатым моллюскам для создания и поддержания своей раковины.Кальций в основном поступает через жабры, ткань мантии и кишечник в виде ионного кальция (Ca 2+ ), а затем переносится через гемолимфу в EPS (Rousseau et al., 2003; Fan et al., 2007b; Sillanpää). и др., 2016). Концентрация гемолимф-ионов у морских двустворчатых моллюсков лишь незначительно отклоняется от концентрации ионов окружающей среды (Shumway, 1977a; Knowles et al., 2014; Thomsen et al., 2015; Sillanpää et al., 2016). Было предложено несколько путей и механизмов передачи кальция через OME.Движение ионного Ca 2+ через OME может быть пассивным или через Ca 2+ , транспортирующий мембранные белки и каналы (Ip et al., 2017; Sillanpää et al., 2018). Альтернативно, Ca 2+ может передаваться связанным с Ca-связывающими белками через эпителиальные клетки мантии (Nair and Robinson, 1998; Xue et al., 2012). Предполагается, что специализированные гемоциты или внутриклеточные везикулы, содержащие кристаллы CaCO 3 , участвуют в переносе кальция в EPS (Mount et al., 2004; Чо и Чон, 2011; Ли и др., 2016).
Перенос Ca 2+ через OME тихоокеанской устрицы Crassostrea gigas включает Ca 2+ -АТФазы плазматической мембраны (PMCA), потенциал-зависимые каналы Ca (VGCC) и потенциально Na + / Ca 2+ -обменники (NCX) вместе с пассивным межклеточным переносом ионов между клетками OME (Sillanpää et al., 2018). PMCA и NCX, по-видимому, имеют почти равное значение в переносе Ca 2+ через OME, и каждый вносит примерно 30% в общий перенос (Sillanpää et al., 2018). Секвенирование генома C. gigas выявило множество PMCA, сарко (эндо) плазматического ретикулума Ca 2+ -АТФазы (SERCA) или транскриптов кальциевых каналов L-типа (Zhang et al., 2012), тогда как генов не было. с пометкой NCX. Транскрипты для каналов PMCA, NCX и / или Ca также были идентифицированы у других видов двустворчатых моллюсков, таких как Pinctada fucata , M. edulis и Tridacna squamosa (Fan et al., 2007b; Wang et al., 2008; Ip et al., 2017, Ramesh et al., 2019), предполагая, что общие транспортные системы сохраняются у разных видов. Аналогичным образом, карбонат в форме HCO 3 — или CO 3 2– предлагается транспортировать с помощью активных транспортеров, таких как Cl — / HCO 3 — обменник в зону роста раковины (Zhao et al., 2018a; Ramesh et al., 2019).
В настоящем исследовании мы стремились изучить ранее предложенную нами функциональную модель, в которой PMCA, NCX и VGCC в OME тихоокеанских устриц, скорее всего, участвуют в переносе Ca 2+ в зону роста раковины (Sillanpää et al., 2018). Кроме того, в настоящем исследовании модель расширена для изучения того, как снижение солености окружающей среды может повлиять на механизмы транспорта Са в OME C. gigas .
Материалы и методы
Экспериментальная установка
Взрослые тихоокеанские устрицы, C. gigas со средним весом 111,9 ± 2,07 г (среднее ± SEM) и длиной 10,8 ± 0,14 см были приобретены у Huîtres Baudit (Charente Maritime, Франция). Они были переведены в аквариумы Департамента биологических и экологических наук Университета Гетеборга, Швеция, и адаптированы к рециркуляции искусственной морской воды (Aquaforest, Польша) при 10 ° C в течение как минимум 1 недели до начала экспериментов.Устрицы были случайным образом разделены на восемь идентичных пластиковых контейнеров емкостью 15 л, по 5 устриц на контейнер, заполненных 10 л воды из рециркуляционной системы, используемой для акклиматизации. Половина контейнеров была заполнена морской водой с соленостью 28 (осмоляльность 805 ± 16 мОсм ⋅ кг –1 и [Ca] 6,06 ± 0,22 мМ), а другие контейнеры были заполнены морской водой, разбавленной до 50% водопроводной водой, чтобы получить конечная соленость 14 (осмоляльность 362 ± 11 мОсм ⋅ кг –1 и [Ca] 3,17 ± 0,10 мМ). Воду насыщали кислородом с помощью сжатого воздуха, который также поддерживал рН воды на уровне 8.11 ± 0,03 за время (14 дней) эксперимента. Устриц не кормили во время эксперимента, а воду меняли через день, чтобы избежать накопления метаболических отходов и фекалий. После 14 дней воздействия полной морской воды (28) или 50% SW (14) из каждого экспериментального аквариума были взяты образцы 4 устриц для экспериментов в камере Уссинга, и два куска мантии были удалены для количественного анализа ПЦР (qPCR) (Рисунок 1 см. разделы «Анализ In silico » и «Анализ количественной ПЦР»).Поскольку только восемь образцов могут быть проанализированы одновременно с доступной установкой камеры Уссинга, начало эксперимента и отбор образцов проводились в два последовательных дня (16 устриц в день). Летальность во время эксперимента составила 10% (соленость 28: 5%, 14: 15%).
Рис. 1. C. gigas интерьер с двумя открытыми половинами мантии. Образцы для экспериментов в камере Уссинга брали из области A (мантийная паллиальная оболочка), а для количественной ПЦР-анализа — из областей B и D (край мантии).
Отбор проб
Устрицы были извлечены из резервуаров, высушены бумагой, а затем открыты клапаны из умбо. Гемолимфу извлекали из приводящей мышцы с помощью иглы диаметром 60 мм 23 калибра, прикрепленной к стерильному пластиковому шприцу на 1 мл. После отбора пробы гемолимфы оболочка была полностью открыта, и около 20-25 мг ткани было собрано с левого и правого края мантии для экстракции РНК (рис. 1). Образцы мантийной ткани промывали свежим раствором Рингера и быстро замораживали в жидком азоте.Для физиологического измерения транспорта Ca 2+ и электрических характеристик OME был вырезан кусок левой вентральной мантии, размером примерно 2 × 4 см (рис. 1). Эпителий внутренней мантии и соединительная ткань были осторожно удалены тупым рассечением, а оставшийся OME был помещен в модифицированные камеры Уссинга (Sundell et al., 2003; Sillanpää et al., 2018). Образцы гемолимфы анализировали на [Ca 2+ ], [Na + ], [K + ] и [Cl — ] с помощью анализатора ионных электролитов (Convergys ISE Comfort, Convergent Technologies, Германия). .
Функциональный анализ с использованием методологии камеры Уссинга
Методологию камеры Уссинга использовали для изучения переноса Ca 2+ через OME и электрофизиологии OME C. gigas . Скорости переноса через OME радиоактивно меченных молекул маркеров, 45 Ca и 3 H-маннита, оценивали в специально изготовленных модифицированных камерах Уссинга типа Grass / Sweetana (Grass and Sweetana, 1988) с отверстием 0,75 см. 2 (Sundell et al., 2003). Для оценки электрических параметров, трансэпителиального сопротивления (TER), трансэпителиального потенциала (TEP) и тока короткого замыкания (SCC) использовалась электронная система контроля и измерения камеры Уссинга, UCC-401 (UCC-Labs Ltd., Гётеборг, Швеция). , как ранее описано в Sundell and Sundh (2012) и Sillanpää et al. (2018). Значения TEP относятся к стороне гемолимфы препарата OME.
После установки OME в камеры Уссинга обе половины камеры были заполнены 4 мл охлажденного льдом раствора Рингера устриц (NaCl 447 мМ, KCl 14.5 мМ, MgSO 4 12,9 мМ, MgCl 2 10,6 мМ, CaCl 2 10 мМ, NaHCO 3 3,6 мМ, NaHPO 4 0,3 мМ, глюкоза 0,3 мг / мл, 811 ± 41 мОсм ⋅ кг –1 ). Перемешивание раствора Рингера в половинных камерах и поддержание постоянных уровней кислорода и pH (7,33 ± 0,03; pH-метр Metrohm 744, Швейцария) достигалось путем постоянного барботирования газо-воздушной смесью, содержащей 0,3% CO 2 . Тканям мантии давали стабилизироваться в течение 60 мин, после чего раствор Рингера заменяли.4 мл свежего раствора Рингера добавляли в правую половину камеры (со стороны оболочки OME), в то время как 4 мл раствора Рингера, содержащего 0,015 МБк, радиоактивно меченного 45 Ca (удельная активность 458,65 МБк / мг PerkinElmer, MA, США) и 0,56 МБк 3 H-меченный маннит вводили в левую половину камеры (сторона «гемолимфа» ОМЕ). Образцы по 50 мкл были немедленно взяты из обеих половин камеры для оценки количества 45 Ca в начальной точке эксперимента.Для оценки скорости передачи 45 Ca, а также скорости появления 3 H-маннита (инертная гидрофильная молекула, используемая для оценки параклеточной проницаемости OME), 50 мкл образцов были взяты со стороны «оболочки». половина камеры через 10, 15, 20, 60, 80, 85 и 90 мин после замены раствора Рингера. Радиоактивность образцов подсчитывали после добавления 4,5 мл сцинтилляционной жидкости Ultima Gold (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США) с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика (жидкостный сцинтилляционный β-счетчик Wallac 1409, Турку, Финляндия) с протоколом двойной метки для 3 H и 45 Ca.TER, TEP и SCC определялись на протяжении эксперимента (150 мин) для мониторинга жизнеспособности тканей, а также электрической проницаемости OME (TER) и активного ионного транспорта (SCC).
Расчеты
Half-Life Corrections
Распад в минуту (DPM) для 45 Ca, был скорректирован на радиоактивный распад путем расчета доли остаточной активности с использованием уравнения. 1 (Kahl et al., 2012).
ДробьОставшаяся = e (-0.693 / t1 / 2) × время (1)
, где t 1 / 2 — период полураспада изотопа (162.7 дней для 45 Ca) и время (количество дней после даты ссылки производителя).
Скорость передачи Ca
2+ через OMEНачальная концентрация радиоизотопа в полукамере гемолимфы (DPM l –1 ) была разделена на концентрацию Ca 2+ (10 мМ) в растворе Рингера, чтобы получить удельную активность в DPM (ммоль Ca 2+ ) –1 .
Количество DPM из 45 Ca, накопленного в половинной камере оболочки в каждый момент времени, было умножено на 80 для достижения общего DPM в объеме 4 мл.Общее количество Ca 2+ (мМ), перенесенное через OME, затем рассчитывали из общего DPM, используя удельную активность в соответствии с уравнением. 2.
Ca (мМ) = общее количество DPM наполовину камеры (4ml) DPM × (ммольCa2 +) — 1 (2)
Был определен наклон накопления Ca 2+ за 90 минут, и скорость переноса была выражена как нМ мин –1 .
Проницаемость параклеточных путей описывалась кажущейся проницаемостью ( P app ) 3 H-маннита через OME, которая была рассчитана с использованием уравнения.3
Papp = dQ × dt-1Ac × C0 (3)
, в котором dQ ⋅ dt –1 описывает появление 3 H-маннита на стороне оболочки (моль ⋅ s –1 ), A c площадь поверхности отверстия камеры ( 0,75 см 2 ) и C 0 начальная концентрация 3 H-маннита на стороне гемолимфы (моль ⋅ мл –1 ).
In silico АнализируетПоиск последовательностей в базе данных
Предполагаемые гены-переносчики ионов были получены из аннотированного генома C.gigas (Zhang et al., 2012): субъединица NKA альфа (K1R0L4), три Ca 2+ -АТФазы (K1QA13, K1PY00, K1QZU8) и три разных потенциал-зависимых кальциевых канала: L-тип (K1Q7D2, K1QEL8) , Субъединица Т-типа (K1RRY9) и типа А α-1 (K1R285). NXC (A0A0L8HMV4) из Octopus bimaculoides был извлечен, поскольку он не был идентифицирован в аннотированном геноме C. gigas . Последовательности, извлеченные из генома C. gigas , а также O. bimaculoides NCX, были использованы для поиска собранных C.gigas , доступный от Ensembl Metazoan Genomes для идентификации дополнительных членов семьи. Для целей сравнения и изучения эволюции семейства генов гомологи предполагаемых генов-переносчиков ионов из C. gigas были приобретены у других моллюсков (двустворчатых моллюсков, брюхоногих и головоногих), а также у кольчатых червей и брахиопод, панциря лампы ( Lingula anatina ). Алгоритм BLAST из баз данных Ensembl Metazoan Genomes и NCBI (февраль 2018 г.) использовался для поиска гомологов последовательностей.Поиски в NCBI были выполнены в дополнительном наборе данных по двустворчатым моллюскам (taxid: 6544). Гомологичные последовательности из средиземноморской мидии ( M. galloprovincialis ) были получены путем поиска доступных транскриптомов мантии (SRP063654) (Bjärnmark et al., 2016) с использованием той же стратегии, что описана выше. Данные генома брюхоногих моллюсков, блюдечка совы ( Lottia gigantea ), головоногих моллюсков, калифорнийского двухточечного осьминога ( O. bimaculoides ), двух кольчатых червей, пиявки ( Helobdella robusta ) и червя (). Capitella teleta ), а для брахиопода — оболочка лампы ( L.anatina ) были получены из Ensembl Metazoan Genomes. Для сравнительных целей гомологи от двух других протостомов, плодовой мухи ( Drosophila melanogaster ) и нематоды ( Caenorhabditis elegans ), из дейтеростома беспозвоночных, асцидии ( Ciona Кишечник ) и от двух позвоночных, человека (). Homo sapiens ) и костистых рыбок данио ( Danio rerio ) также были получены и извлечены из Ensembl с помощью поиска по сходству последовательностей или аннотаций генома.Чтобы лучше понять эволюцию генов, два книдария (базальные многоклеточные), доступные в NCBI (см. Текстовую сноску 2, книдарии: taxid: 6073) и в базах данных JGI, также были исследованы на предмет гомологов предполагаемых генов-переносчиков ионов с использованием алгоритма BLASTP. Идентичность полученных последовательностей подтверждали поиском в базе данных поднабора белков человека, доступной в NCBI (taxid: 9606).
Выравнивание последовательностей и филогенетический анализ
Множественное выравнивание последовательностей (MSA) выведенных белков SERCA, PMCA, NKA и NCX было выполнено с использованием алгоритма MUSCLE (Edgar, 2004), доступного на платформе Aliview 1.18 (Ларссон, 2014). Частичные последовательности были получены от некоторых видов и были объединены и выровнены с гомологами полной длины от родственных видов. Окончательный набор данных MSA для каждого семейства генов был использован для построения филогенетических деревьев с использованием методов ML и BI. Деревья ML были выполнены с использованием PhyML 3.0 (Guindon et al., 2010) на платформе биоинформатики ATGC с автоматическим выбором модели SMS (Lefort et al., 2017) на основе AIC (информационный критерий Akaike) для лучшего изучения эволюции белков.ML-деревья были построены с использованием модели замещения LG (Le and Gascuel, 2008) для SERCA, PMCA, NCX и NKA и модели VT (Müller and Vingron, 2000) для Са-канала L-типа и T-типа. Надежность внутреннего ветвления в филогенетических деревьях оценивалась с использованием 100 бутстреп-повторов. Дерево BI было выполнено в MrBayes 3.2 (Ronquist et al., 2012) с использованием соответствующих моделей замещения LG или VT (Aamodel = LG или Aamodel = VT) и значений вероятности выборки 1 000 000 поколений для поддержки ветвления дерева.Деревья ML и BI отображались с помощью FigTree 1.4.2 и редактировались в Inkscape.
Экстракция РНК и синтез кДНК
Образцы ткани мантии для анализа экспрессии генов гомогенизировали с использованием Tissuelyser II (Qiagen, Германия), а суммарную РНК экстрагировали с помощью набора Qiagen RNeasy Plus Mini (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Полную РНК элюировали 30 мкл воды, свободной от РНКазы. Качество и количество выделенной РНК оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), а качество 10% образцов также проверяли с помощью набора Agilent RNA 6000 Nano Kit в Agilent 2100 Bioanalyzer. (Калифорния, США).КДНК устрицы синтезировали с использованием набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad). Конечный реакционный объем составлял 20 мкл, и в соответствии с выходом экстракций РНК использовали 500 нг или 1000 нг общей РНК и добавляли обратную транскриптазу iScript, смесь iScript Reaction Mix и воду, свободную от нуклеаз, в соответствии с инструкциями производителя. кДНК синтезировали в течение 5 мин при 25 ° C, 30 мин при 42 ° C и 5 мин при 85 ° C.
Анализ КПЦР
Анализ кПЦР в реальном времени использовался для оценки того, влияет ли воздействие пониженной солености окружающей среды (14) на экспрессию мРНК переносчиков и каналов ионов Ca 2+ устрицы.Эти гены были отобраны на основе результатов Sillanpää et al. (2018) и с использованием последовательностей, извлеченных из генома C. gigas (см. Раздел «Анализ In silico »). Для каждого гена были разработаны специфические праймеры (таблица 1; Untergasser et al., 2012), а анализ количественной ПЦР и реакции количественной ПЦР были выполнены в двух экземплярах (разница между повторами <5%) с использованием системы реального времени Bio-Rad CFX Connect и SSO Advanced Universal. Комплект SYBR Green (Bio-Rad). Реакции ПЦР проводили в 96-луночных микропланшетах малого объема (Thermo Scientific, Дания), конечный объем которых составлял 10 мкл, и они содержали 5 нг кДНК, 0.5 мкМ прямого и обратного праймеров и 5 мкл супермикса SSO Advanced SYBR Green. Оптимальные условия циклирования включали начальные 3 мин при 95 ° C, затем 40 циклов по 10 с при 95 ° C и 30 с при оптимизированной температуре отжига для праймеров (таблица 1). Кривые плавления были выполнены для обнаружения неспецифических продуктов, а димеры праймеров и контрольные реакции были включены во все опыты для подтверждения отсутствия загрязнения геномной ДНК. Фактор элонгации 1-альфа (Ef1α) и GADPH использовали в качестве эталонных генов и были отобраны на основе их стабильной экспрессии в проанализированных образцах.Значения транскрипта были нормализованы относительно среднего геометрического двух эталонных генов.
Таблица 1. Последовательности праймеров, температуры отжига, R 2 значения и эффективности реакций qPCR, используемые для измерений qPCR генов-кандидатов и референсных генов.
Статистический анализ
Нормальность и однородность дисперсии были проверены для остатков и прогнозируемых значений для всех данных. Для получения стабильных значений параметров рассчитывались средние значения из последних временных точек (130–150 мин) для TER, TEP и SCC.Влияние солености на TER, TEP и перенос радиоактивно меченного Ca 2+ , а также на концентрацию ионов гемолимфы оценивали с помощью теста Independent Samples t . Влияние солености на SCC оценивали с помощью непараметрического теста Манна-Уитни U . Статистический анализ данных электрофизиологии проводили с использованием IBM SPSS 22 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Значение P ≤0,05 считалось значимым. Статистические различия в экспрессии мРНК между соленостью (14 vs.28) были проанализированы с использованием непарного t -теста (двусторонний). P значения <0,001 ( ∗∗∗ ), 0,01 ( ∗∗ ) и 0,05 ( ∗ ) считались значимыми. Статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism версии 7.0a для MacOSX (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США). Все данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего.
Результаты
Электрофизиология, Ca
2+ Перенос и концентрация ионов гемолимфыЭлектрические параметры TER, TEP и SCC отслеживались на протяжении всего эксперимента для измерения сопротивления параклеточного шунта (TER), общего ионного распределения (TEP) и активного ионного транспорта (SCC) C.gigas OME. TER показал тенденцию к увеличению значений, 28,1 ± 4,80 Ом см 2 (среднее значение для временных точек 130–150 мин, N = 10) при воздействии солености 14 по сравнению с устрицами в 28 (20,1 ± 3,87 Ом ⋅ см 2 ; N = 9, P = 0,071, рисунок 2A). SCC показал тенденцию к снижению значений при воздействии солености 14 (10,6 ± 10,9 мкА см –2 , N = 10, по сравнению с 41,7 ± 22,2 мкА см –2 , N = 9; P = 0.315, рис. 2Б). TEP поддерживался на одном уровне независимо от солености внешней среды (рис. 2C). Кажущаяся проницаемость ( P app ) для гидрофильного маркера маннита, который был заместителем пассивного параклеточного пути, была выше при солености 28 (9,58 ⋅ 10 –6 ± 1,06 ⋅ 10 –6 , N = 9) по сравнению с 14 (5,41 ⋅ 10 –6 ± 8,59 ⋅ 10 –7 , N = 10) ( P = 0,003) (рисунок 2D).Перенос Ca 2+ через ОМЭ был выше при солености 28, 498 ± 37,1 нМ / мин ( N = 9), по сравнению с 14, 393 ± 36,1 нМ / мин ( N = 10) на 21%. ( P = 0,021) (Рисунок 3).
Рис. 2. Электрические параметры и кажущаяся проницаемость 3 H-маннита OME из C. gigas , подвергнутого воздействию морской воды (28) и морской воды, разбавленной до 50% (14). Электрические параметры TER (A) , SCC (B) и TEP (C) измерялись на протяжении всего эксперимента (60 мин для стабилизации + 90 мин для экспериментов), тогда как DPM для 3 H-маннитол (D) измеряли в нескольких временных точках в течение 90-минутного экспериментального периода.Во вставке описаны различия между значениями P app в двух вариантах обработки. Значения показаны как среднее ± SEM. Размеры выборки, N 28 = 9, N 14 = 10. Существенные различия, обнаруженные с помощью t -теста, обозначены ( ∗ ) P <0,01.
Рис. 3. 45 Перенос Са через OME из C. gigas , подвергшихся воздействию морской воды (28) и морской воды, разбавленной до 50% (14) в течение 90-минутного экспериментального периода.Вставка описывает различия между наклонами переноса (нМ ⋅ мин — 1 ) в двух вариантах обработки. Значения показаны как среднее ± SEM. Размеры выборки, N 28 = 9, N 14 = 10. Существенные различия, обнаруженные с помощью t -теста, обозначены ( ∗ ) P <0,05.
Hemolymph Ca 2+ концентрации снизились с 5,87 ± 0,19 мМ до 3,91 ± 0,17 ( P <0,001), a 33.4% -ное снижение у устриц, сохраняющих соленость 14 по сравнению с 28. Аналогичным образом, концентрации Na + , K + и Cl — снизились на 46,5% (28: 529,6 ± 24,3; 14: 283,6 ± 21,6) , 22,3% (28: 11,6 ± 0,39; 14: 9,01 ± 0,62) и 54,3% (28: 421,7 ± 16,5; 14: 192,6 ± 19,8) соответственно.
Ca
2+ Транспортеры и каналы у устриц и других моллюсковПоиск в геноме C. gigas выявил три типа Ca 2+ -АТФаз: PMCA, SERCA и секреторный путь Ca 2+ -ATPase (SPCA).Также были получены три совпадения последовательности для VGCC, и идентифицированные гены имели наибольшее сходство последовательностей с потенциалозависимым кальциевым каналом L-типа, потенциал-управляемым каналом P-типа и потенциал-управляемым каналом T-типа. Идентифицированы единственный α-ген субъединицы NKA C. gigas и пять предполагаемых генов NCX.
Сравнительный анализ генов C. gigas с другими моллюсками выявил отдельные гены для разных семейств Ca 2+ -АТФазы у двух других устриц, P.fucata и C. virginica , а также у других моллюсков M. galloprovincialis , T. squamosa , Mizuhopecten yessoensis , Hyriopsis cutingii , L. gigantea и O. bimaculoides а также у представителей кольчатых червей и брахиопод. Исключением была SERCA, для которой были получены три разные последовательности в P. fucata и четыре предполагаемых гена были извлечены из генома пиявки. Члены SPCA были менее представлены у двустворчатых моллюсков и были идентифицированы только у C.virginica , а в гребешке — M. yessoensis . Отдельные гены для NKA были также получены от других моллюсков, в то время как кольчатые червяки и брахиопод, по-видимому, имели несколько членов. Множественные гены NCX были обнаружены в транскриптоме мантии M. galloprovincialis , а также у других видов, что свидетельствует о существовании множества членов этого семейства у моллюсков. У кольчатых червей не было выявлено ни одного представителя NCX, но в геноме брахиопод обнаружен ген. Для VGCC такое же количество генов было обнаружено у C.gigas и других моллюсков, но у кольчатых червей, по-видимому, существует несколько дополнительных членов.
Филогения Mollusca Ca
2+ Транспортеры и каналыФилогенетический анализ (с использованием методов ML и BI) транспортеров и каналов Ca 2+ от C. gigas и других видов моллюсков и лофотрокозойных животных подтвердил их идентичность и показал, что каждое семейство белков имеет общее предковое происхождение с гомологами позвоночных. В общем, когда у вида было идентифицировано несколько генов, казалось, что они возникли в результате родословной или видоспецифичных событий дупликации.Последовательности C. gigas имели тенденцию к кластеризации с гомологами из C. virginica и P. fucata (эволюционно близкие виды) и других двустворчатых моллюсков (виды гребешков и мидий).
Филогенетический анализ Ca 2+ -АТФаз из C. gigas вместе с другими Ca 2+ -АТФаз моллюсков подтвердил, что существует единственный ген и транскрипт для трех различных членов (Рисунки 4A – C). Кластеризация трех последовательностей P. fucata SERCA (рис. 4В) показала, что они очень похожи по последовательности и различаются только на С-конце и, вероятно, являются альтернативными транскриптами одного гена.Группирование генов от кольчатых червей и брахиопод предполагает, что множественные идентифицированные члены возникли в результате видоспецифичных событий (Рис. 4A – C).
Рис. 4. Филогенетический анализ SERCA (A) , PMCA (B) и SPCA (C) из C. gigas и других многоклеточных животных. Дерево построено с использованием метода BI, показаны значения апостериорной вероятности ветвей. Семейные деревья генов, построенные с помощью метода машинного обучения, представлены на дополнительном рисунке S1.Описание сокращений последовательностей и регистрационных номеров представлено в дополнительной таблице S1. Кластеры, содержащие последовательности C. gigas , выделены серым цветом, а последовательности C. gigas (Cgi) выделены жирным шрифтом. Деревья были укоренены с помощью последовательностей книдарий.
Кластеризация C. gigas и других членов гена NKA моллюсков предполагает, что единственный ген NKA существует у C. gigas и других двустворчатых моллюсков, но что у кольчатых червей и брахиопод существует несколько генов (рис. 5A).Точно так же три дерева VGCC также указывают на то, что отдельные копии генов для Са-каналов присутствуют у C. gigas и других lophotrochozoans (Рисунок 6). Для дерева NCX кластеризация последовательностей указывает на то, что это семейство генов очень разнообразно и что существуют три основных кластера NCX, а в устрице существуют пять предполагаемых членов этого семейства генов (рис. 5B). Они включают подсемейство, которое имеет большое сходство последовательностей с NCXs позвоночных и включает Cgi5 ; второе подсемейство объединяет Cgi1 , Cgi2 и Cgi4 , что характерно для большинства моллюсков и других лофотрохозойных; и третья клада содержала Cgi3 и последовательность брахиопод.Точно так же в Ciona были обнаружены три гена NCX, которые были распределены между тремя подсемейством . Это предполагает, что члены NCX многоклеточных животных возникли в результате более раннего события дупликации генов, которое, вероятно, произошло до деления протостома-дейтеростома, и что моллюски сохранили членов трех подсемейств, тогда как у позвоночных остались только члены одного подсемейства. У позвоночных, человека и рыбок данио существуют множественные члены генов для Ca 2+ -АТФаз, NKA, NCX и VGCC, и кластеризация последовательностей указывает на то, что они возникли в результате событий дупликации генов, которые произошли в основе излучения позвоночных.
Рис. 5. Филогенетический анализ NKA (A) и NCX (B) из C. gigas и других многоклеточных животных. Дерево построено с использованием метода BI, показаны значения апостериорной вероятности ветвей. Семейные деревья генов, построенные с помощью метода машинного обучения, представлены на дополнительном рисунке S2. Описание сокращений последовательностей и номеров доступа находится в дополнительной таблице S1. Последовательности C. gigas выделены жирным шрифтом.Дерево NKA имело корни с последовательностями книдарий, а дерево NCX — с последовательностью растения ( Arabidopsis thaliana ).
Рисунок 6. Филогенетический анализ потенциалозависимых кальциевых каналов L-тип (A) , P-тип (B) и T-тип (C) у C. gigas и других многоклеточных животных. . Дерево построено с использованием метода BI, показаны значения апостериорной вероятности ветвей. Семейные деревья генов, построенные с помощью метода машинного обучения, представлены на дополнительном рисунке S3.Описание сокращений последовательностей и номеров доступа находится в дополнительной таблице S1. Кластеры, содержащие последовательности C. gigas , выделены серым цветом, а последовательности C. gigas (Cgi) выделены жирным шрифтом. Деревья были укоренены с помощью последовательностей книдарий.
Экспрессия гена
Уровни экспрессии мРНК четырех различных переносчиков ионов, NKA, PMCA, SERCA, NCX, и двух кальциевых каналов, Са-каналов L-типа и T-типа были проанализированы с помощью кПЦР (рис. 7).Уровни экспрессии как NKA, так и SERCA значительно снизились в мантии группы солености 14 по сравнению с мантией группы солености 28. Экспрессия VGCC Т-типа значительно увеличилась в мантии группы солености 14 по сравнению с 28 как в левом, так и в правом крае мантии (рис. 7). Экспрессия NCX не была существенно изменена соленостью в левой мантии, но в правой мантии ее экспрессия значительно увеличилась в C. gigas , сохраненном в 14 (фиг. 7).На экспрессию PMCA и VGCC L-типа не влияла соленость, и не было никаких различий между двумя проанализированными участками мантии (данные не показаны).
Рисунок 7. Экспрессия генов переносчиков ионов (NKA, PMCA, SERCA, NCX) и кальциевых каналов (VGCC L-типа и T-типа) в нижней мантии (B) и верхней мантии (D) C gigas подвергался воздействию морской воды (28) или морской воды, разбавленной до 50% (14), в течение 2 недель. Результаты были нормализованы с использованием среднего геометрического двух эталонных генов, Ef1α и GADPH.Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Размеры выборки N b 14, b 28 = 10, N d 14 = 9, N d 28 = 7. Существенные различия, обнаруженные непарным тестом t нижней (B) или верхней (D) мантии из C. gigas , подвергшихся воздействию морской воды при 28 или 14, обозначены следующим образом: ( ∗∗∗ ) P <0,001, ( ∗∗ ) P <0,01 и ( ∗ ) P <0.05. Кратковременные изменения мРНК описаны в дополнительной таблице S2.
Обсуждение
Это исследование выявило присутствие изоформ генов VGCCs, PMCA и NCX в ткани мантии C. gigas , что дополнительно предполагает их участие в передаче Ca 2+ через OME в EPS. Взрослый особь C. gigas , подвергшийся воздействию разбавленной соленой окружающей среды в течение 2 недель, снизил перенос Ca 2+ через OME, а также общее снижение активного транспорта ионов и проницаемости эпителия.Экспрессия мРНК ионных переносчиков, NKA и SERCA снижалась в мантии C. gigas , подвергшейся воздействию более низкой солености (14), в то время как экспрессия VGCC и NCX Т-типа увеличивалась. Изменения в экспрессии ионных переносчиков и каналов, на которые влияет снижение солености окружающей среды, позволяют предположить, что клетки OME стремятся поддерживать достаточно высокую внутриклеточную концентрацию Ca 2+ для достаточного потока Ca 2+ в области образования раковины. . Однако, как показывает снижение передачи Ca 2+ через OME, компенсаторных механизмов было недостаточно.Хотя физиологические функции устриц, такие как осморегуляция, могут адаптироваться к изменениям солености, в долгосрочной перспективе результирующие изменения в переносе ионов могут привести к снижению минерализации раковины.
Уменьшение переноса Ca 2+ через OME C. gigas при низкой солености может быть вызвано либо снижением трансцеллюлярного переноса Ca 2+ , либо снижением параклеточного переноса между OME клетки. Активный транспорт ионов, измеренный как SCC, также уменьшился при солености 14, что могло быть связано с уменьшением активного транспорта Ca 2+ через e.g., PMCA и / или NCX. Однако изменений в экспрессии мРНК PMCA при засолении 14 не наблюдалось. Экспрессия мРНК другого потенциально активного переносчика Ca 2+ , NCX, увеличилась в правой мантии от C. gigas , подвергшихся воздействию низкой солености, что позволяет предположить, что снижение переноса Ca 2+ было маловероятным. из-за изменений в выражении NCX. Снижение активного транспорта ионов также может быть связано со снижением активности NKA, поскольку NKA поддерживает потенциал клеточной мембраны и устанавливает электрохимический градиент для Na + , направленный в клетку.Снижение экспрессии мРНК α-субъединицы NKA в мантии от C. gigas , подвергшихся пониженной солености до 14, подтверждает это мнение. Однако изменения в экспрессии мРНК не всегда отражают изменения в экспрессии белка, поскольку посттрансляционные модификации, а также скорость деградации и синтеза белка могут влиять на экспрессию белка после транскрипции гена (Greenbaum et al., 2003). Кроме того, была измерена единственная временная точка в конце двухнедельного экспериментального периода, и, хотя уровни экспрессии мРНК были изменены, это не дает информации об изменениях, происходящих в активности белка.
Двустворчатые моллюски являются осмоконформаторами, осмолярность гемолимфы которых соответствует осмоляльности окружающей среды (McFarland et al., 2013; Lin et al., 2016). Столкнувшись с гипоосмотическими условиями, эпителий сжимается, чтобы уменьшить утечку воды в ткани (Shumway, 1977b; Fuhrmann et al., 2018). Это может привести к снижению проницаемости для ионов и заряженных молекул, что может быть измерено как повышенное электрическое сопротивление эпителия, TER. Снижение проницаемости эпителия для воды могло бы дополнительно привести к снижению параклеточного переноса гидрофильных и малых молекул через OME, что можно измерить с помощью 3 H-маннита ( P приложение ).Настоящее исследование показывает, что, как и у других двустворчатых моллюсков C. gigas , эпителий стягивается после воздействия среды с низкой соленостью, поскольку TER увеличивается, а P app уменьшается после акклиматизации к пониженной солености (14). Возвращаясь к передаче Ca 2+ через OME, примерно 40% этого происходит через параклеточный путь (Sillanpää et al., 2018), предполагая, что снижение проницаемости также может способствовать снижению общего количества Ca . 2+ перенос в устрицах, подвергшихся засолению 14.
У человека существует четыре изоформы α-субъединицы NKA, но у C. gigas и других двустворчатых моллюсков была идентифицирована только одна копия. В целом морские беспозвоночные имеют только одну или две изоформы NKA-α, что позволяет предположить, что множественные изоформы позвоночных возникли в результате более позднего события дупликации генов (Sáez et al., 2009; Lind et al., 2013; Thabet et al., 2016) . В дополнение к своей роли АТФазы во всех клетках, NKA участвует в осморегуляции морских организмов. Было показано, что снижение солености окружающей среды снижает активность NKA мантии у нескольких видов двустворчатых моллюсков, таких как Meretrix lusoria и M.galloprovincialis , а также у морского ушка Haliotis Discus hannai (Borgatti et al., 2003; Lin et al., 2016; Jia, Liu, 2018). Однако у некоторых видов гипоосмотические условия не влияли на экспрессию мРНК NKA в мантии (Paganini et al., 2010), жабрах (Lin et al., 2016) или во всем теле (Willmer, 1978; Peng et al., 2019), а в других случаях — увеличили. Интересно, что при повышении или понижении регуляции необходимость поддержания электрохимического градиента через клеточную мембрану предполагается для объяснения наблюдаемых изменений в экспрессии NKA.Экспрессия мРНК NKA в настоящем исследовании может быть подавлена как прямое следствие снижения концентрации Na + в гемолимфе, так как это уменьшило бы пассивный градиент обоих ионов через мембрану и, следовательно, меньшее количество белков NKA было бы необходимо для поддерживать внутриклеточные концентрации Na + . Однако эффекты, по-видимому, зависят от вида и / или ткани, используемой для экстракции, или от экспериментальной установки.
Согласно Sillanpää et al. (2018) предполагается, что Ca 2+ проникает в клетки OME через VGCC.В геноме C. gigas были обнаружены множественные гены VGCC, которые были гомологами Са-каналов L-, P- и T-типа человека. В то время как VGCC L-типа и P-типа относятся к каналам, активируемым высоким напряжением, каналы T-типа (переходные) характеризуются своей быстрой инактивацией и низким порогом напряжения (Snutch et al., 2000–2013). Все типы ранее были идентифицированы у других моллюсков, хотя их точная функция остается неизвестной (Kits and Mansvelder, 1996). У двустворчатого моллюска P.fucata , каналы L-типа присутствуют в эпителиальных клетках жабр и мантийных складок, что указывает на их роль в захвате Ca 2+ из окружающей среды (Fan et al., 2007b). Это дополнительно подтверждается наблюдениями, что во время развития личиночной раковины в M. edulis экспрессия Са-канала и экспрессия SERCA активируются, что позволяет предположить, что они отвечают на повышенную потребность в Ca 2+ для минерализации раковины (Ramesh et al., 2019). Изменения в экспрессии ионных каналов и переносчиков также могут быть связаны с адаптацией к новой солености окружающей среды.Когда клетки подвергаются воздействию гипоосмотической среды, они набухают из-за притока воды через клеточную мембрану. Чтобы противодействовать этому набуханию и вернуться к исходному объему, клетки должны выделять органические и / или неорганические осмолиты, чтобы достичь равновесия с осмоляльностью окружающей среды (Pierce and Greenberg, 1973). Было высказано предположение, что экструзия ионов является частью регуляции объема и предшествует выведению органических осмолитов, которые составляют основную часть регуляции объема у беспозвоночных (McCarty and O’Neil, 1992; Silva and Wright, 1994).Как было отмечено в настоящем исследовании, активность VGCCs была повышена у C. gigas и C. virginica , выращенных в условиях низкой солености, возможно, из-за их функции в регуляции объема клеток (Meng et al., 2013; Eierman and Hare, 2014 ).
Несмотря на то, что модель Силланпяя и др. (2018) не включили SERCA, настоящее исследование предполагает, что они играют важную роль в метаболизме Ca 2+ клеток мантии. Люди обладают тремя изоформами SERCA, но только один ген SERCA был обнаружен у большинства беспозвоночных, хотя этот ген может подвергаться альтернативному сплайсингу с образованием множества тканеспецифичных белков (Altshuler et al., 2012). В P. fucata , например, три изоформы SERCA, которые имеют высокое сходство последовательностей (97–99%) и отличаются только на С-конце, представляют собой альтернативно сплайсированные транскрипты одного гена (Fan et al., 2007a). P. fucata SERCA обладает тканеспецифическим паттерном экспрессии с одной изоформой, экспрессирующейся преимущественно в тканях мантии и жабр (Fan et al., 2007a). Только одна изоформа SERCA экспрессировалась в мантии C. gigas , и она реагировала на изменения концентрации ионов окружающей среды, предполагая, что она играет важную роль в метаболизме Ca 2+ и, возможно, минерализации оболочки.
Перенос Ca 2+ из клеток OME в EPS было предложено осуществлять через апикальный PMCA и, возможно, апикальный NCX (Sillanpää et al., 2018). У C. gigas , как и у других двустворчатых моллюсков, существует единственный ген PMCA, который может генерировать несколько изоформ. PMCA является переносчиком с высокой аффинностью и низкой емкостью в отличие от NCX, который является переносчиком с низким сродством и высокой емкостью (Blaustein et al., 2002). PMCA может быстро реагировать на изменения внутриклеточных концентраций Ca 2+ и, таким образом, тонко регулировать внутриклеточные уровни Ca 2+ .Однако он может стать насыщенным, когда высокие уровни Ca 2+ должны быть доставлены в EPS (Blaustein and Lederer, 1999). Это говорит о том, что PMCA, вероятно, важен для непрерывного переноса Ca 2+ в экстрапалиальную жидкость (EPF). Напротив, NCX вместе с ER и другими компартментами, хранящими Ca, могут быть важны в периоды массового переноса Ca 2+ , например, во время биоминерализации скорлупы, особенно при изменении притока или оттока Ca 2+ .Субклеточное расположение PMCA и его вероятная функция могут быть выведены из его аминокислотной последовательности и вариантов сплайсинга белка. Вставка более чем на 30 аминокислот в сайте сплайсинга A по сравнению с PMCA 2 человека, как предполагается, подразумевает апикальное расположение (Enyedi and Strehler, 2011). C. gigas PMCA, обнаруженная в геноме, содержала вставку из 39 аминокислот в области гомолога сайта сплайсинга A человеческого PMCA, что означает, что она может иметь апикальное расположение (дополнительный рисунок S4, Enyedi and Strehler, 2011; Zhang и другие., 2012). Вставка из 39 аминокислот в C. gigas PMCA аналогична таковой, описанной в T. squamosa (Asp285-Asn320), которая, как показала иммунофлуоресцентная микроскопия, имеет апликальное расположение (Ip et al., 2017). Эти данные подтверждают модель Sillanpää et al. (2018), где функциональные исследования показали апикальную локализацию PMCA.
Множественные гены NCX были обнаружены в геноме C. gigas , хотя только один похож на изоформы позвоночных.Некоторые беспозвоночные содержат несколько генов, сходных с NCX, но только один генный продукт функционирует как истинный Na + / Ca 2+ -обменник, то есть мембранный белок, выполняющий обмен Ca 2+ на Na +. и управляется электрохимическим градиентом через клеточную мембрану (On et al., 2008). Другие гены, аннотированные как NCX, имеют сходные мотивы с функциональным NCX, но не имеют некоторых критических аминокислотных последовательностей для функции обмена Na + / Ca 2+ .Ранее присутствие NCX в C. gigas нельзя было напрямую проверить с использованием ингибиторов против NCX позвоночных, но снижение передачи Ca 2+ после ингибирования NKA предоставило косвенные доказательства участия NCX в перенос Ca 2+ через OME (Sillanpää et al., 2018). В этом исследовании мы показываем, что NCX экспрессируется в ткани мантии C. gigas и, таким образом, потенциально может участвовать в механизмах транспорта Ca 2+ , необходимых для кальцификации раковины.Предполагается, что NCX вместе с PMCA участвуют в кальцификации у личинок M. edulis (Ramesh et al., 2019) и кораллов Acropora yongei (Barron et al., 2018).
Взятые вместе, результаты электрофизиологических измерений и измерений проницаемости показывают, что как активный, так и пассивный перенос ионов через OME уменьшается у C. gigas , поддерживаемых в разбавленной морской воде, по сравнению с соленостью 28. Однако данные экспрессии мРНК показывают, что реакция отдельных перевозчиков и каналов неоднородна.Несмотря на то, что экспрессия мРНК переносчиков измерялась во всей ткани мантии, а не только в OME, результаты показывают, что при воздействии пониженной солености устрицы стремятся поддерживать стабильный метаболизм Ca 2+ , несмотря на более низкую концентрацию воды и ионов гемолимфы. Внутриклеточная концентрация Ca 2+ в клетках физиологически хорошо регулируется и поддерживается на постоянном уровне. Ca 2+ попадает в клетки мантии через VGCC вниз по своему электрохимическому градиенту пассивным и зависимым от концентрации образом.Следовательно, если концентрация внеклеточного Ca 2+ изменяется, необходимо соответствующим образом регулировать поглощение, высвобождение и секвестрацию Ca 2+ клетками. В текущем исследовании увеличение экспрессии мРНК VGCC Т-типа в группе солености 14 предполагает, что клетки мантии приспосабливаются к пониженным внеклеточным концентрациям Ca 2+ за счет активирующих систем, которые способствуют проникновению Ca 2+ . в клетки. Снижение экспрессии мРНК SERCA при низкой солености может отражать дополнительный компенсаторный механизм для поддержания уровней Ca 2+ в цитозоле за счет меньшей секвестрации Ca 2+ в эндоплазматический ретикулум (ER).С точки зрения биоминерализации скорлупы, увеличение экспрессии или активности транспортеров и каналов Ca 2+ в разбавленной морской воде будет способствовать поддержанию стабильной скорости переноса Ca 2+ в зону строительства раковины. Другими словами, устрицы могут компенсировать пониженные концентрации Ca 2+ в окружающей среде за счет уменьшения секвестрации Ca 2+ в ER и сохранения количества доступного Ca 2+ в цитозоле, готового к транспортировке в EPF, стабильным.Поскольку NCX часто реагирует на изменения клеточного поступления / оттока Ca, увеличение его экспрессии может быть связано с изменением внутриклеточного захвата и секвестрации Ca 2+ (Ottolia et al., 2013; Seth et al., 2013). Функциональная значимость изменений экспрессии VGCC и SERCA в мантии C. gigas , поддерживаемых в условиях пониженной солености (14), может быть связана со сдвигом во внутриклеточном балансе Ca 2+ , что способствует усилению экструзии Ca 2+ из мантийных клеток.Однако нельзя исключить, что повышенная регуляция NCX у устриц, акклиматизированных к солености 14, может быть результатом снижения концентрации Na + в гемолимфе. Повышающая регуляция NCX в среде с низким содержанием Na + может быть средством, с помощью которого можно поддерживать ту же скорость обмена Na + / Ca 2+ . Подводя итог, обнаруженное снижение общего переноса Ca 2+ через OME означает, что клетки OME не были способны поддерживать стабильную скорость переноса Ca 2+ через клеточные мембраны, несмотря на повышающую регуляцию Т-образные VGCC и NCX.
Хотя это не рассматривалось в данном исследовании, ранее было показано, что гипоосмотические условия влияют на многие Са-связывающие и регулирующие белки в C. gigas (Zhao et al., 2012) и, вероятно, играют важную роль в регуляция внутриклеточных концентраций Ca 2+ . Длительный солевой стресс может привести к активации иммунной системы, которая также имеет тенденцию к увеличению цитозольных концентраций Ca 2+ (Zhao et al., 2012) и, таким образом, может влиять на секвестрацию и экструзию Ca 2+ .Стресс от воздействия субоптимальной солености может также подавлять биоминерализацию, чтобы сэкономить энергию для других важных физиологических процессов. Значительное подавление общего переноса Ca 2+ через OME C. gigas , поддерживаемого в разбавленной морской воде в настоящем исследовании, указывает на то, что длительные периоды низкой солености могут изменить кальцификацию и поддержание раковины. Изменения солености окружающей среды и концентрации ионов также потенциально могут повлиять на карбонатный метаболизм в кальцифицирующих организмах.Экспрессия предполагаемого переносчика HCO 3 — была повышена у личинок M. edulis , повышенных при предельных концентрациях карбонатов (Ramesh et al., 2019), что позволяет предположить, что доступность карбонатов также зависит от условий окружающей среды. В сочетании с другими факторами стресса окружающей среды, такими как повышение pCO 2 , температура или снижение pH, влияние солености на метаболизм карбонатов может быть еще более выраженным (Waldbusser et al., 2011; Dickinson et al., 2012). Поглощение, транспорт и метаболическое производство HCO 3 — / CO 3 2–, а также взаимодействия с транспортом Ca 2+ , следовательно, требуют дальнейшего внимания для выяснения полной картины того, как перенос ионов для На рост скорлупы влияют условия окружающей среды.
Заключение
В заключение, результаты настоящего исследования подтверждают модель, ранее предложенную Sillanpää et al. (2018), обнаружив, что VGCC, PMCA и NCX экспрессируются и регулируются в ткани мантии C.gigas и могут играть потенциальную роль в переносе Ca 2+ для биоминерализации. Кроме того, было продемонстрировано, что воздействие на C. gigas пониженной солености окружающей среды (14) снижает активный перенос ионов и перенос Ca 2+ через OME. Связанное с этим изменение в экспрессии мРНК VGCC, SERCA и NCX Т-типа в мантии C. gigas , акклиматизировавшихся к солености 14, предполагает, что они обладают способностью регулировать ионную регуляцию при изменении условий окружающей среды, но что Ca 2 + доступно для снаряда прирост уменьшен.Взятые вместе, результаты показывают, что экологические колебания солености прибрежной воды, возможно, подчеркнутые как следствие изменения климата, могут влиять на перенос ионов мантией и, таким образом, на кальцификацию раковин у C. gigas .
Заявление о доступности данных
Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.
Авторские взносы
JS был ведущим автором, проводил физиологические эксперименты, анализ данных и интерпретацию данных, а также участвовал в разработке исследования.JC провела филогенетический анализ и внесла свой вклад с идеями и планированием эксперимента. RF и LA провели анализ данных экспрессии генов, а также внесли свой вклад в разработку идей и планирование эксперимента. DP и KS разработали и координировали исследование, а также внесли свой вклад в обсуждение и интерпретацию данных. Все авторы участвовали в подготовке рукописи.
Финансирование
Это исследование финансировалось Сетью начального обучения Марии Кюри (ITN), CACHE — «Кальций в меняющейся окружающей среде», соглашением о гранте 605051, Шведским исследовательским центром марикультуры, SWEMARC, Университетом Гетеборга, а также фондами Herbert & Karin Jacobssons Stiftelse (15 / h27) и Helge Axe: сын Johnsons Stiftelse (F18-0128) JS.CCMAR получил поддержку от FCT (Фонд науки и технологий, Португалия) в рамках проекта UID / Multi / 04326/2019. JC поддерживался FCT (проект UID / Multi / 04326/2019). РФ и Лос-Анджелес финансировались национальными фондами через FCT в рамках «Norma Transitória» — DL57 / 2016 / CP1361 / CT0020 и DL57 / 2016 / CP1361 / CT0011, соответственно.
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2020.00001/full#supplementary-material
РИСУНОК S1 | Филогенетический анализ SERCA (A) , PMCA (B) и SPCA (C) из C. gigas и других многоклеточных животных. Дерево было построено с использованием программного обеспечения PhyML на платформе ATGC. Отображаются только значения начальной загрузки поддержки ветви> 50%.Описание сокращений последовательностей и номеров доступа находится в дополнительной таблице S1. Кластеры, содержащие последовательности C. gigas , выделены серым цветом, а последовательности C. gigas (Cgi) выделены жирным шрифтом. Деревья были укоренены с помощью последовательностей книдарий.
РИСУНОК S2 | Филогенетический анализ NCX (A) и NKA (B) из C. gigas и других многоклеточных животных. Дерево было построено с использованием программного обеспечения PhyML на платформе ATGC.Отображаются только значения начальной загрузки поддержки ветви> 50%. Описание сокращений последовательностей и номеров доступа находится в дополнительной таблице S1. Кластеры, содержащие последовательности C. gigas , выделены серым цветом, а последовательности C. gigas (Cgi) выделены жирным шрифтом. Дерево NKA имело корни с последовательностями книдарий, а дерево NCX — с растением , последовательность Arabidopsis thaliana .
РИСУНОК S3 | Филогенетический анализ L-типа (A) , P-типа (B) и T-типа (C) потенциалзависимых кальциевых каналов от C.gigas и другие многоклеточные. Дерево было построено с использованием программного обеспечения PhyML на платформе ATGC. Отображаются только значения начальной загрузки поддержки ветви> 50%. Описание сокращений последовательностей и номеров доступа находится в дополнительной таблице S1. Кластеры, содержащие последовательности C. gigas , выделены серым цветом, а последовательности C. gigas (Cgi) выделены жирным шрифтом. Деревья были укоренены с помощью последовательностей книдарий (Nve, Spi).
РИСУНОК S4 | С.gigas и последовательность PMCA человека.
ТАБЛИЦА S1 | Номера доступа и полное описание сокращений последовательностей, используемых в филогенетическом анализе.
ТАБЛИЦА S2 | Кратковременные изменения измерений экспрессии мРНК.
Сноски
Список литературы
Альтшулер И., Вайллант Дж. Дж., Сюй С. и Кристеску М. (2012). Эволюционная история сарко (эндо) плазматической кальциевой АТФазы (SERCA). PLoS One 7: e52617. DOI: 10.1371 / journal.pone.0052617
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бэррон М. Э., Тис А. Б., Эспиноза Дж. А., Баротт К. Л., Хамдун А. и Тресгеррес М. (2018). Везикулярный обменник Na + / Ca 2 + в кальцифицирующих клетках кораллов. PLoS One 13: e0205367. DOI: 10.1371 / journal.pone.0205367
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бергер, В.Дж., Харазова А. Д. (1997). Механизмы засоления морских моллюсков. Hydrobiologia 355, 115–126. DOI: 10.1023 / A: 1003023322263
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бьярнмарк, Н. А., Ярра, Т., Черчер, А. М., Феликс, Р. К., Кларк, М. С., и Пауэр, Д. М. (2016). Транскриптомика дает представление о функции мантии Mytilus galloprovincialis ( Mollusca: Bivalvia ) и ее роли в биоминерализации. Mar. Genomics 27, 37–45.DOI: 10.1016 / j.margen.2016.03.004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Блауштайн, М. П., Юхашова, М., Головина, В. А., Черч, П. Дж., И Стэнли, Э. Ф. (2002). Обменник Na / Ca и локализация PMCA в нейронах и астроцитах. Ann. Акад. Sci. 976, 356–366. DOI: 10.1111 / j.1749-6632.2002.tb04762.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Боргатти, А. Р., Пальярани, А., Вентрелла, В., Мануцци, М.П., Тромбетти, Ф., Пирини, М. и др. (2003). Na, K-АТФаза и другие параметры двустворчатых моллюсков Адриатического моря в различных условиях окружающей среды. Вет. Res. Commun. 27, 207–210. DOI: 10.1023 / b: verc.0000014141.63067.6b
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кардосо, Дж. К. Р., Феррейра, В., Чжан, X., Аньос, Л., Феликс, Р. К., Батиста, Ф. М. и др. (2019). Эволюция и разнообразие альфа-карбоновых ангидраз в мантии средиземноморской мидии ( Mytilus galloprovincialis ). Sci. Реп. 9: 10400. DOI: 10.1030 / s41598-019-46913-46912
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чо, С. М., и Чон, В. Г. (2011). Призматический ремонт раковины гемоктрием в экстрапалиальной жидкости Pacific Oyster. Crassostrea gigas . Korean J. Malacol. 27, 223–228. DOI: 10.9710 / kjm.2011.27.3.223
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дикинсон, Г. Х., Иванина, А. В., Матоо, О. Б., Пёртнер, Х.О., Ланниг, Г., Бок, К. и др. (2012). Интерактивное воздействие солености и повышенного уровня СО2 на молодь восточных устриц . Crassostrea virginica . J. Exp. Биол. 215, 29–43. DOI: 10.1242 / jeb.061481
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Эйерман, Л. Э., и Хейр, М. П. (2014). Транскриптомный анализ кандидатов осморегуляторных генов у восточной устрицы Crassostrea virginica . BMC Genomics 15: 503.DOI: 10.1186 / 1471-2164-15-503
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Эниеди, Б, и Стрелер, Э. Э. (2011). Регуляция обогащения апикальной мембраны и удержания плазматической мембраны Ca 2+ вариантов сплайсинга АТФазы с помощью PDZ-домена белка NHERF2. Commun. Интегр. Биол. 4, 340–343. DOI: 10.4161 / cib.4.3.15040
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фан, В., Ли, К., Ли, С., Фэн, К., Се, Л., и Чжан Р. (2007a). Клонирование, характеристика и паттерны экспрессии трех изоформ Са2 + -АТФазы сарко / эндоплазматического ретикулума из Pearl oyster ( Pinctada fucata ). Acta Biochem. Биофиз. Грех. 39, 722–730. DOI: 10.1111 / j.1745-7270.2007.00330.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фань, В., Ли, К., Ван, X., Гонг, Н., Се, Л., и Чжан, Р. (2007b). Клонирование, характеристика и анализ экспрессии бета-субъединицы кальциевого канала из Pearl oyster ( Pinctada fucata ). J. Biosci. Bioeng. 104, 47–54. DOI: 10.1263 / jbb.104.47
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Fuhrmann, M., Delisle, L., Petton, B., Corporeau, C., and Pernet, F. (2018). Метаболизм тихоокеанской устрицы, Crassostrea gigas , зависит от солености и влияет на выживаемость острейдного герпесвируса OsHV-1. Biol. Откройте 7: bio028134. DOI: 10.1242 / bio.028134
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гарднер, Л.Д., Миллс Д., Виганд А., Ливсли Д. и Элизур А. (2011). Пространственный анализ экспрессии генов, связанных с биоминерализацией, из мантийного органа жемчужницы Pinctada maxima . BMC Genom. 12: 455. DOI: 10.1186 / 1471-2164-12-455
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Грасс, Г. М., Свитана, С. А. (1988). In vitro Измерение проницаемости тканей желудочно-кишечного тракта с использованием новой диффузионной ячейки. Pharm.Res. 5, 372–376. DOI: 10.1023 / A: 10152079
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гринбаум, Д., Коланджело, К., Уильямс, К., и Герштейн, М. (2003). Сравнение обилия белка и уровней экспрессии мРНК в геномном масштабе. Gen. Biol. 4, 117–117. DOI: 10.1186 / GB-2003-4-9-117
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гиндон, С., Дюфаярд, Дж. Ф., Лефорт, В., Анисимова, М., Хордейк, В., и Гаскуэль, О.(2010). Новые алгоритмы и методы для оценки филогении максимального правдоподобия: оценка производительности PhyML 3.0. Syst. Биол. 59, 307–321. DOI: 10.1093 / sysbio / syq010
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ip, Y.K., Hiong, K.C., Goh, E.J.K., Boo, M.V., Choo, C.Y.L., Ching, B., et al. (2017). Беловатая внутренняя мантия гигантского моллюска, Tridacna squamosa , экспрессирует Ca (2 +) — АТФазу (PMCA) апикальной плазматической мембраны, которая проявляет светозависимую экспрессию генов и белков. Фронт. Physiol. 8: 781. DOI: 10.3389 / fphys.2017.00781
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
IPCC (2014). «Изменение климата 2014: сводный отчет» в Вклад рабочих групп I, II и III в Пятый оценочный отчет Межправительственной группы экспертов по изменению климата , редакторы Core Writing Team, Р. К. Пачаури и Л. А. Мейер (Женева: МГЭИК) , 151.
Google Scholar
Цзя, Ю., и Лю, X. (2018). На экспрессию Na (+) / K (+) — АТФазы влияло изменение солености в тихоокеанском морском ушке Haliotis Disc hannai. Фронт. Physiol. 9: 1244. DOI: 10.3389 / fphys.2018.01244
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Kádár, E. (2008). Ответ гемоцитов, связанный с индукцией регенерации раковины у глубоководной мидии Bathymodiolus azoricus ( Bivalvia: Mytilidae ). J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 362, 71–78. DOI: 10.1016 / j.jembe.2008.05.014
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Каль, С. Д., Ситтампалам, Г.С., Вайднер Дж. (2012). «Расчеты и приборы, используемые для анализов связывания радиолигандов», в Руководстве по анализу [Интернет] , ред. Г. С. Ситтампалам, А. Гроссман, К. Бримакомб и др. (Bethesda, MD: Eli Lilly & Company и Национальный центр развития переводческих наук), 1149–1166. Доступно на: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK/.
Google Scholar
Kits, К. С. и Мансвелдер, Х. Д. (1996). Напряжение управляемых кальциевых каналов у моллюсков: классификация, Са2 + -зависимая инактивация, модуляция и функциональные роли. Инверт. Neurosci. 2, 9–34. DOI: 10.1007 / bf02336657
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ноулз Г., Хэндлингер Дж., Джонс Б. и Молчанивский Н. (2014). Химический состав гемолимфы и гистопатологические изменения у тихоокеанских устриц ( Crassostrea gigas ) в ответ на стресс низкой солености. J. Invertebr. Патол. 121, 78–84. DOI: 10.1016 / j.jip.2014.06.013
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ли, С.Г., Лю, Ю. Дж., Лю, К., Хуанг, Дж. Л., Чжэн, Г. Л., Се, Л. П. и др. (2016). Гемоциты участвуют в образовании кристаллов карбоната кальция, транспортировке и регенерации раковины у Pearl oyster Pinctada fucata . Fish Shellfish Immun. 51, 263–270. DOI: 10.1016 / j.fsi.2016.02.027
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Lin, C.-H., Yeh, P.-L., and Lee, T.-H. (2016). Ионная и аминокислотная регуляция у твердого моллюска ( Meretrix lusoria ) в ответ на проблемы засоления. Фронт. Physiol. 7: 368. DOI: 10.3389 / fphys.2016.00368
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Линд, У., Альм Розенблад, М., Рэндж, А.-Л., Санделл, К.С., Йонссон, П.Р., Андре, К. и др. (2013). Молекулярная характеристика α-субъединицы Na + / K + АТФазы эвригалинного ракушка Balanus implvisus выявляет множественные гены и дифференциальную экспрессию альтернативных вариантов сплайсинга. PLoS One 8: e77069. DOI: 10.1371 / journal.pone.0077069
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мэлоун П. Г. и Додд Дж. Р. (1967). Влияние температуры и солености на скорость кальцификации Mytilus edulis и его палеоэкологические последствия. Лимнол. Oceanogr. 12, 432–436. DOI: 10.4319 / lo.1967.12.3.0432
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Марин Ф. и Люке Г. (2004). Белки раковины моллюсков. Счет. Рендус. Palevol. 3, 469–492.DOI: 10.1016 / j.crpv.2004.07.009
CrossRef Полный текст | Google Scholar
МакФарланд К., Донахи Л. и Волети А. К. (2013). Влияние резких изменений солености на осмоляльность гемолимфы и скорость клиренса неместной мидии Perna viridis и местной устрицы, Crassostrea virginica , на юго-западе Флориды. Aquat. Вторжения 8, 299–310. DOI: 10.3391 / ai.2013.8.3.06
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мэн, Дж., Чжу, К., Zhang, L., Li, C., Li, L., She, Z., et al. (2013). Анализ генома и транскриптома дает представление об эвригалинном механизме адаптации Crassostrea gigas . PLoS One. 8: e58563. DOI: 10.1371 / journal.pone.0058563
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Маунт, А. С., Уилер, А. П., Парадкар, Р. П., и Снайдер, Д. (2004). Минерализация раковины восточной устрицы, опосредованная гемоцитами. Наука 304, 297–300. DOI: 10.1126 / наука.10
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Наир, П. С., и Робинсон, В. Е. (1998). Видообразование кальция и обмен между кровью и экстрапалиальной жидкостью quahog Mercenaria mercenaria (L.). Biol. Бык. 195, 43–51. DOI: 10.2307 / 1542774
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Он, К., Маршалл, К. Р., Чен, Н., Мойес, К. Д., и Тиббитс, Г. Ф. (2008). Эволюция генной структуры семейства Na + -Ca2 + обменников (NCX). BMC Evol. Биол. 8: 127. DOI: 10.1186 / 1471-2148-8-127
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Оттолия, М., Торрес, Н., Бридж, Дж. Х. Б., Филипсон, К. Д., и Голдхабер, Дж. И. (2013). Обмен Na / Ca и сокращение сердца. J. Mol. Клетка. Кардиол. 61, 28–33. DOI: 10.1016 / j.yjmcc.2013.06.001
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Паганини А., Киммерер В. Дж. И Стиллман Дж. Х.(2010). Метаболические реакции на соленость окружающей среды у инвазивных моллюсков Corbula amurensis . Aquat. Биол. 11, 139–147. DOI: 10.3354 / ab00304
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пэн, М., Лю, М., Ниу, Д., Бо, Й., Лан, Т., Донг, З. и др. (2019). Выживание, рост и физиология морских двустворчатых моллюсков ( Sinonovacula constricta ) в условиях длительного малосолевого культивирования. Sci. Отчет 9: 2819. DOI: 10.1038 / s41598-019-39205-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пирс, С.К. и Гринберг М. Дж. (1973). Инициирование и контроль регуляции объема клеток свободными аминокислотами у морских двустворчатых моллюсков, подвергшихся воздействию солености. J. Exp. Биол. 59, 435–446.
Google Scholar
Рамеш К., Ярра Т., Кларк М. С., Джон У. и Мельзнер Ф. (2019). Экспрессия переносчиков ионов, связанных с кальцификацией, во время развития личинок синей мидии. Ecol. Evol. 1, 7157–7172. DOI: 10.1002 / ece3.5287
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ронквист, Ф., Тесленко, М., ван дер Марк, П., Эйрес, Д. Л., Дарлинг, А., Хона, С. и др. (2012). MrBayes 3.2: эффективный байесовский филогенетический вывод и выбор модели в большом модельном пространстве. Syst. Биол. 61, 539–542. DOI: 10.1093 / sysbio / sys029
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Руссо М., Плугерн Э., Ван Г., Ван Р., Лопес Э. и Фушеро-Перон М. (2003). Маркеры биоминерализации во время фазы активного роста у Pinctada margaritifera . Комп. Biochem. Physiol. Мол. Интегр. Physiol. 135, 271–278. DOI: 10,1016 / s1095-6433 (03) 00070-9
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Саез, А. Г., Лозано, Э., и Залдивар-Риверон, А. (2009). История эволюции Na, K-АТФаз и их осморегулоторная роль. Genetica 136, 479–490. DOI: 10.1007 / s10709-009-9356-0
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сандерс, Т., Шмиттманн, Л., Насименто-Шульце, Дж.К., и Мельцнер, Ф. (2018). Высокие затраты на кальцификацию ограничивают рост мидий при низкой солености. Фронт. Mar. Sci. 5: 352. DOI: 10.3389 / fmars.2018.00352
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сет М., Сумбилла К., Маллен С. П., Льюис Д., Кляйн М. Г., Хуссейн А. и др. (2013). Sarco (эндо) плазматический ретикулум Са 2+ гена АТФазы (SERCA) сайленсинг и ремоделирование сигнального механизма Са 2+ в сердечных миоцитах. PNAS 101, 16683–16688.DOI: 10.1073 / pnas.0407537101
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шамуэй, С. Э. (1977a). Влияние колебаний солености на осмотическое давление и концентрацию ионов Na +, Ca2 + и Mg2 + в гемолимфе двустворчатых моллюсков. Mar. Biol. 41, 153–177. DOI: 10.1007 / bf00394023
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шамуэй, С. Э. (1977b). Влияние колебания солености на влажность тканей восьми видов двустворчатых моллюсков. J. Comp. Physiol. Б. 116, 269–285. DOI: 10.1007 / bf00689036
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Силланпяя, Дж. К., Рамеш, К., Мельзнер, Ф., Сунд, Х. и Санделл, К. (2016). Мобилизация кальция после повреждения раковины у Pacific oyster , Crassostrea gigas . Mar. Genomics 27, 75–83. DOI: 10.1016 / j.margen.2016.03.001
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Силланпяя, J.К., Сундх, Х., Санделл, К. (2018). Перенос кальция через внешний эпителий мантии у тихоокеанских устриц , Crassostrea gigas . Proc. R. Soc. Б. 285: 20181676. DOI: 10.1098 / rspb.2018.1676
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сильва, А. Л., и Райт, С. Х. (1994). Кратковременное регулирование объема клеток жабры Mytilus californicus . J. Exp. Биол. 194, 47–68.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Снатч, Т.П., Пелокин, Дж., Мэтьюз, Э. и МакРори, Дж. Э. (2000–2013 гг.). «Молекулярные свойства потенциалзависимых кальциевых каналов», в Madame Curie Bioscience Database [Интернет] (Остин, Техас: Landes Bioscience). Доступно по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6181/.
Google Scholar
Sundell, K., Jutfelt, F., Agustsson, T., Olsen, R.E., Sandblom, E., Hansen, T., et al. (2003). Механизмы кишечного транспорта и уровни кортизола в плазме во время нормальной и межсезонной трансформации парня-смолта атлантического лосося. Salmo salar. Аквакультура 321, 85–92. DOI: 10.1016 / S0044-8486 (03) 00127-3
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Sundell, K., and Sundh, H. (2012). Абсорбция кишечной жидкости у проходных лососевых: важность плотных контактов и аквапоринов. Фронт. Physiol. 3: 338. DOI: 10.3389 / fphys.2012.00388
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Такеучи, Т., и Эндо, К. (2006). Двухфазная и двойственно скоординированная экспрессия генов, кодирующих основные белки матрикса раковины у жемчужниц Pinctada fucata . Март Biotech. 8, 52–61. DOI: 10.1007 / s10126-005-5037-x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Табет Р., Руо Дж. Д., Аяди Х. и Лейнель В. (2016). Структурный анализ α-субъединицы генов Na + / K + АТФазы у беспозвоночных. Комп. Biochem. Physiol. B 19, 11–18. DOI: 10.1016 / j.cbpb.2016.01.007
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Томсен, Дж., Хайнерт, К., Вегнер, К. М., и Мельцнер, Ф. (2015). Влияние карбонатного химического состава морской воды на кальцификацию морских двустворчатых моллюсков. Biogeoscience 12, 4209–4220. DOI: 10.5194 / bg-12-4209-2015
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Untergasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B.C, Remm, M., et al. (2012). Primer3 — новые возможности и интерфейсы. Nucleic Acids Res. 40: e115. DOI: 10.1093 / nar / gks596
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Вальдбюссер, Г.Г., Фойгт, Э. П., Бергшнайдер, Х., Грин, М. А., и Ньюэлл, Р. И. Э. (2011). Биокальцификация восточной устрицы ( Crassostrea virginica ) в связи с долгосрочными тенденциями изменения pH в заливе Чесапик. Estuar. Побережья 34, 221–231. DOI: 10.1007 / s12237-010-9307-0
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ван, X., Фань, W., Xie, L., и Zhang, R. (2008). Молекулярное клонирование и распределение гомолога кальциевой АТФазы плазматической мембраны из устрицы Pearl Pinctada fucata . Tsinghua Sci. Tech. 13, 439–446. DOI: 10.1016 / s1007-0214 (08) 70071-3
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ван, X., Ли, Л., Чжу, Ю., Ду, Ю., Сонг, X., Чен, Ю., и др. (2013). Белки раковины устриц происходят из множества органов и их вероятный транспортный путь к фронту образования раковины. PLoS One 8: e66522. DOI: 10.1371 / journal.pone.0066522
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Уилер, А.П., и Сайкс, С. С. (1984). Регулирование карбонатной кальцификации органической матрицей. Am. Zool. 24, 933–944. DOI: 10.1093 / icb / 24.4.933
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Уилмер, П. Г. (1978). Потоки натрия и обменные насосы: дополнительные корреляты осмотического соответствия нервов устьевого двустворчатого моллюска ( Mytilus edulis ). J. Exp. Биол. 77, 207–223.
Google Scholar
Сян, Л., Конг, В., Су, Дж. Т., Лян, Дж., Zhang, G.Y., Xie, L.P. и др. (2014). Осаждение аморфного карбоната кальция путем клеточной биоминерализации в культурах клеток мантии Pinctada fucata . PLoS One 9: e113150. DOI: 10.1371 / journal.pone.0113150
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Xue, Q., Gauthier, J., Schey, K., Li, Y., Cooper, R., Anderson, R., et al. (2012). Идентификация нового металлсвязывающего белка segon в плазме восточной устрицы, Crassostrea virginica . Комп. Biochem. Physiol. В 163, 74–85. DOI: 10.1016 / j.cbpb.2012.05.002
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Zhang, G., Fang, X., Guo, X., Li, L., Luo, R., Xu, F., et al. (2012). Геном устриц выявляет стрессовую адаптацию и сложность формирования раковины. Природа 490, 49–54. DOI: 10.1038 / природа11413
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Zhao, L., Milano, S., Walliser, E.O., and Schöne, B.Р. (2018а). Формирование раковины двустворчатых моллюсков в естественной среде обитания, обогащенной CO2: раскрытие механизма устойчивости на основе элементарных сигнатур. Химия 203, 132–138. DOI: 10.1016 / j.chemosphere.2018.03.180
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Zhao, L., Yang, F., Milano, S., Han, T., Walliser, E.O., and Schöne, B.R. (2018b). Трансгендерная акклиматизация к подкислению морской воды у манильского моллюска Ruditapes philippinarum : предпочтительное поглощение метаболического углерода. Sci. Tot. Env. 67, 95–103. DOI: 10.1016 / j.scitotenv.2018.01.225
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чжао, Х., Ю, Х., Конг, Л., и Ли, К. (2012). Транскриптомные ответы на стресс солености в Pacific Oyster Crassostrea gigas . PLoS One 7: e46244. DOI: 10.1371 / journal.pone.0046244
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
% PDF-1.3 % 760 0 объект > эндобдж xref 760 89 0000000016 00000 н. 0000002832 00000 н. 0000002931 00000 н. 0000002967 00000 н. 0000003358 00000 п. 0000003497 00000 н. 0000003633 00000 н. 0000003770 00000 н. 0000003909 00000 н. 0000004048 00000 н. 0000004185 00000 п. 0000004322 00000 н. 0000004460 00000 н. 0000004598 00000 н. 0000004736 00000 н. 0000004872 00000 н. 0000005011 00000 н. 0000005149 00000 п. 0000005287 00000 н. 0000005426 00000 п. 0000005562 00000 н. 0000005699 00000 н. 0000005836 00000 н. 0000005977 00000 н. 0000006118 00000 п. 0000006267 00000 н. 0000006417 00000 н. 0000006566 00000 н. 0000006714 00000 н. 0000006988 00000 н. 0000007069 00000 н. 0000007359 00000 н. 0000007437 00000 н. 0000008137 00000 н. 0000008705 00000 н. 0000008877 00000 н. 0000009069 00000 н. 0000009452 00000 н. 0000010072 00000 п. 0000010786 00000 п. 0000011228 00000 п. 0000011445 00000 п. 0000011904 00000 п. 0000012373 00000 п. 0000012717 00000 п. 0000013126 00000 п. 0000013349 00000 п. 0000013648 00000 п. 0000016149 00000 п. 0000016356 00000 п. 0000016587 00000 п. 0000019061 00000 п. 0000021194 00000 п. 0000021364 00000 н. 0000021646 00000 н.