Код мкб синдром ускоренного соэ: Ошибка 404. Файл не найден

Вариация метилирования ДНК в зависимости от времени репродукции во всех образцах ( n = 55). Отображаются только гены с сайтами CpG, значимыми в обоих анализах, т.е. анализе дифференциального метилирования и кометилирования: (a) LOC107215054 ( MYLK -like), (b) NR5A1 , (c) DRC7 и LOC107209693 ( GP2 -подобный), (d) CFAP45 , (e) LOC107213450 , (f) SLC6A9 , (g) NUDC , (h) CLUH) и (DLG)

4 ОБСУЖДЕНИЕ

Геномный механизм, который опосредует определение фенологических признаков, остается в значительной степени неизвестным (Caro et al., 2013), но недавние исследования растений (Bastow et al., 2004; Wilschut et al., 2016; You et al., 2017), насекомых (Pegoraro et al., 2016) и млекопитающих (Stevenson, 2017; Stevenson & Prendergast, 2013) подчеркивают возможность участия эпигенетических модификаций, таких как метилирование ДНК (Stevenson & Lincoln, 2017). Здесь мы подкрепляем эту идею, демонстрируя, что быстрые и направленные изменения в метилировании ДНК связаны с временем размножения у дикого вида певчих птиц, большой синицы.Анализ дифференциального метилирования и анализ кометилирования выявили быстрые изменения в сайтах CpG в промоторной области нескольких генов (Таблица S19). Некоторые из этих генов имеют хорошо известную функцию опосредования репродукции, что предполагает, что метилирование ДНК может действовать как молекулярный механизм переключения репродуктивного каскада. Таким образом, наше исследование иллюстрирует потенциальную роль метилирования ДНК как геномного механизма, который определяет время репродукции.

4.1 Профили метилирования важных генов по результатам анализа дифференциального метилирования и кометилирования

Когда мы объединили результаты анализа дифференциального метилирования и анализа кометилирования, мы идентифицировали 10 генов, которые демонстрируют последовательное и воспроизводимое изменение метилирования ДНК в зависимости от репродуктивного статуса женщин. Некоторые из этих генов, как хорошо известно из более ранних исследований, участвуют в воспроизводстве, например, LOC107215054 ( MYLK -подобных) и NR5A1 .

LOC107215054 ( MYLK -подобный) предсказывается как киназа легкой цепи миозина, подобная гладкой мускулатуре и разделяет участки последовательности с фактической киназой легкой цепи миозина ( MYLK ), киназой, которая способствует фосфорилированию миозиновой легкой цепи. цепи, процесса, необходимого для сократительной активности скорлупки во время откладки яиц, то есть откладки яиц (Johnson, 2015; Kupittayanant et al., 2009). В куриных яичниках MYLK активируется во время кладки яиц (Liu et al., 2018), что соответствует наблюдаемому снижению метилирования в сайтах CpG в промоторной области LOC107215054 ( MYLK -like) за несколько недель до откладки. Недавнее исследование ландшафта метилирования цыплят показало, что метилирование ДНК MYLK предположительно контролирует экспрессию гена MYLK (Höglund et al., 2020), что дополнительно подтверждает идею, которая выявила изменения в метилировании ДНК в промоторной области этого гена. может выполнять регуляторную функцию, опосредуя экспрессию генов.Однако еще предстоит установить, функционируют ли оба гена как киназы легких цепей миозина.

LOC107213450 является кодирующим белок, но не охарактеризованным геном, что означает, что, в отличие от LOC107215054 ( MYLK -подобный), надежное предсказание гена недоступно. Поскольку генная сеть и ее отдельные гены, которые опосредуют время яйцекладки у самок большой синицы, в настоящее время неизвестны (Gienapp et al., 2017; Laine et al., 2019), ген еще не охарактеризованной биологической функции с гипометилированием CpG-сайта в недели до начала срока яйцекладки представляют собой интересный кандидат на включение в эту генную сеть.

LOC107209693 ( GP2 -подобный) предсказывается как главный гликопротеин мембраны секреторных гранул поджелудочной железы ( GP2 ), который является компонентом внутреннего перивителлинового слоя, окружающего яйцеклетку птицы во время овуляции, который помогает поддерживать структурную целостность яйцеклетки. желточная мембрана (Kido et al., 1977; Wishart & Horrocks, 2000). Внутренний перивителлиновый слой механически поддерживает яйцеклетку и опосредует начальное взаимодействие между яйцеклеткой и сперматозоидами, в котором гликопептиды, как предполагается, играют важную роль (Wishart & Horrocks, 2000) и, следовательно, GP2 может иметь функцию оплодотворения.Кроме того, GP2 описан как модулятор иммунного ответа (Werner et al., 2012), например, путем связывания патогенных энтеробактерий (Hase et al., 2009). Однако, разделяют ли LOC107209693 ( GP2 -подобный) и GP2 свою биологическую функцию, еще предстоит установить. Кроме того, промоторная область LOC107209693 ( GP2 -подобная) и DRC7 перекрываются, так что идентифицированные здесь сайты CpG расположены в промоторной области обоих генов, и, следовательно, наблюдаемое снижение метилирования ДНК может быть функциональным для обоих генов. , один или ни один из генов.

NR5A1 кодирует фактор транскрипции, который регулирует экспрессию многих важных генов на всех уровнях репродуктивной оси (Ingraham et al., 1994; Meinsohn et al., 2019) и большинства генов, участвующих в стероидогенезе гонад (Jameson, 2004 ). Например, NR5A1 модулирует экспрессию стероидогенного белка острого ответа ( STAR ), который переносит холестерин, чтобы инициировать ферментативный каскад, включающий синтез стероидов, необходимый для фолликулогенеза (Murayama et al., 2012). NR5A1 экспрессируется в основных стероидогенных тканях, таких как клетки тека и гранулезы в яичнике (Ikeda et al., 1994, 1996; Ingraham et al., 1994) или гипоталамусе (например, регулируя организацию и функцию гонадотрофов гипоталамуса и гипофиза; Шинода и др., 1995). Следовательно, NR5A1 играет ключевую роль в женском воспроизводстве, таком как функционирование яичников (Lourenço et al., 2009; Meinsohn et al., 2019) и стероидогенез (Parker, 2002). Исследования экспрессии NR5A1 у цыплят согласуются с наблюдаемым здесь гиперметилированием, поскольку NR5A1 активируется во время откладки яиц по сравнению с выращиванием (Shen et al., 2016). Наблюдаемый паттерн метилирования ДНК в сочетании с важной ролью NR5A1 в функционировании яичников и стероидогенезе предполагает, что метилирование ДНК может действовать как молекулярный механизм переключения репродуктивного каскада, опосредуя экспрессию ключевого фактора транскрипции, NR5A1.

Остальные гены связаны с общими биологическими процессами и функциями: двигательной активностью ресничек и жгутиков ( DRC7 и CFAP45 ; Li et al., 1999; Heuser et al., 2009; Fu et al., 2018), митоз, цитокинез, цилиогенез, миграция нейронов, продукция тромбоцитов и воспалительный ответ ( NUDC ; Aumais et al., 2003; Fu et al., 2016), нейротрансмиссия и гомеостаз клеток и всего тела ( SLC6A9 ; Bröer & Gether, 2012), синаптическая передача, развитие и пластичность ( DLG3 ; Tarpey et al., 2004; Qu et al., 2009) и контроль энергетического и метаболического статуса клеток ( CLUH ; Wakim et al., 2017). Более подробное описание этих функций и, если возможно, их потенциального участия в опосредовании воспроизводства дано в тексте S1.

Ранее мы продемонстрировали временные изменения метилирования ДНК в течение сезона размножения у больших синиц примерно на 40 000 CpG-сайтов (Viitaniemi et al., 2019), и несколько генов, которые мы здесь идентифицировали, были в списке генов, которые демонстрировали временные изменения в сезон размножения. Однако в исследовании Viitaniemi et al.(2019), мы не смогли связать изменения метилирования напрямую с репродуктивным статусом женщин, так как мы исследовали только внутри женское изменение метилирования ДНК с течением времени как таковое. Поскольку самки различаются по срокам репродукции, такие временные изменения в метилировании могут быть вызваны множеством факторов (изменение возраста, условий окружающей среды и т. Д.) И не обязательно связаны со сроками репродукции. Вместо этого сосредоточив внимание на связи между временем размножения самок и изменениями в метилировании ДНК, мы теперь можем продемонстрировать их потенциальное участие в инициации откладки яиц у этого вида.

4.2 Метилирование ДНК как общий механизм регуляции циркулярных фенотипов

В отличие от хорошо описанных генных путей циркадных часов, генные и регуляторные пути, лежащие в основе круглогодичного проявления признаков, менее хорошо описаны, а экспериментальные данные, подтверждающие функциональную роль метилирования ДНК в создании и поддержании циркулярных ритмов, ограничены (Stevenson, 2018 ). У сибирских хомяков экспрессия ферментов, опосредующих метилирование ДНК, ДНК-метилтрансфераз ( dnmts ), снижалась в ответ на короткий фотопериод и совпадала с уменьшением метилирования ДНК в промоторной области dio3 , гена, который, как известно, ингибирует репродуктивный каскад (Stevenson & Prendergast, 2013).Это снижение метилирования ДНК промотора dio3 , в свою очередь, сопровождалось увеличением экспрессии dio3 и регрессией гонад. Это исследование предоставило первые доказательства метилирования ДНК и ферментов, которые опосредуют метилирование ДНК, что лежит в основе индуцированного фотопериодом ответа на фенотипическом уровне. Кроме того, системы, не относящиеся к млекопитающим, предоставляют доказательства роли эпигенетики в опосредовании циркулярных фенотипов; у Arabidopsis время цветения характеризовалось вариацией метилирования гистонов локуса цветения C ( FLC ) (Bastow et al., 2004), а у паразитических ос фотопериодическая диапауза была связана с индуцированными фотопериодом вариациями метилирования ДНК (Pegoraro et al., 2016). В птичьих системах мало исследований изучали связь между паттернами метилирования ДНК и околгодовыми фенотипами, поэтому потенциальную общность наших открытий трудно оценить. В единственном известном нам исследовании использовался подход генов-кандидатов, чтобы продемонстрировать, что метилирование ДНК в гене CLOCK коррелирует с датой кладки и другими околгодовыми фенотипами у ласточек ( Hirundo rustica ) (Saino et al., 2017).

4.3 Предостережения и перспективы на будущее

Интерпретация наших результатов основана на предположении, что метилирование сайта CpG в промоторной области гена влияет на транскрипцию гена, что, в свою очередь, может изменять экспрессию фенотипов (Bossdorf et al., 2008; Rubenstein et al., 2016; Verhoeven et al., 2016). В целом это верно, а также в случае большой синицы, где метилирование ДНК в промоторной области отрицательно коррелирует с экспрессией гена, и особенно близко к сайту начала транскрипции, низкие уровни метилирования ДНК достаточны, чтобы остановить экспрессию соответствующего гена. (Laine et al., 2016). Поэтому мы ограничили наш анализ сайтами CpG в промоторной области генов, чтобы специально изучить сайты CpG, которые, как мы ожидаем, будут влиять на экспрессию генов. Однако это также означает, что мы упускаем из виду какое-либо влияние сайтов CpG в геномных местах за пределами этого региона, что также может влиять на экспрессию генов (Anastasiadi et al., 2018). Более того, недавние исследования показывают, что вариации в метилировании ДНК не могут действовать исключительно как причина экспрессии генов, но могут быть последствием экспрессии генов (Pacis et al., 2019). Мы признаем, что использованные здесь данные не позволяют проверить, действует ли метилирование ДНК причиной или следствием экспрессии генов. В равной степени важно помнить, что, как и в любом ассоциативном исследовании, мы, конечно, не можем продемонстрировать причинную связь между изменением метилирования ДНК и временем откладки яиц. Для этой экспериментальной проверки необходимо использование функциональных инструментов, и на данный момент это невозможно для немодельных организмов, таких как большая синица.

Вопрос также в том, в какой степени наблюдаемые изменения в метилировании ДНК зависят от последовательности ДНК.Недавние исследования показали, что генетические варианты могут лежать в основе локальных и отдаленных вариаций метилирования ДНК у различных видов: Arabidopsis thaliana, (Dubin et al., 2015), кукурузы (Xu et al., 2019), кораллов, строящих рифы ( Liew et al., 2020), скрещивания между дикими дикими птицами и домашними цыплятами (Höglund et al., 2020) и людьми (Heyn et al., 2013). В то время как мы контролировали родство между людьми в нашем анализе дифференциального метилирования с использованием данных генотипа однонуклеотидного полиморфизма (SNP), количество отобранных женщин слишком мало, чтобы обнаружить какие-либо значимые для всего генома эффекты SNP на локальные или отдаленные вариации метилирования ДНК.Следовательно, мы не знаем, зависят ли идентифицированные паттерны метилирования ДНК от локальной генетической изменчивости или генетической изменчивости в другом месте генома.

RRBS стал популярным подходом для профилирования метилирования, поскольку он обогащает CpG-богатые участки генома, такие как сайт начала транскрипции и область промотора, и таким образом сокращает количество считываний, необходимых для получения высокого покрытия воспроизводимой фракции. сайтов CpG на образец (Gu et al., 2011; Husby, 2020; Meissner et al., 2008). Обратной стороной RRBS, как и всех сокращенных подходов, является то, что он покрывает только небольшую часть генома, и поэтому мы можем пропустить изменения в метилировании в областях, не секвенированных.

Трудность со всеми экологическими эпигенетическими исследованиями состоит в том, чтобы определить, какой тип ткани отбирать, связывая метилирование ДНК с интересующим фенотипом (Derks et al., 2016; Husby, 2020; Verhulst et al., 2016). Мы неоднократно брали пробы крови самок больших синиц и использовали изолированные красные кровяные тельца для изучения паттернов метилирования сайтов CpG внутри самок.Сила этого подхода в том, что мы можем изучить, как метилирование ДНК зависит от времени репродукции у женщин. Образцы более информативных тканей, таких как гонады, гипоталамус или печень, не могут быть взяты повторно, и они не допускают прямой корреляции с репродуктивным сроком самок, поскольку у некоторых самок образцы отбираются до начала откладки яиц и, следовательно, они еще не выражают интересующий фенотип.

Многие экологические эпигенетические исследования измеряют метилирование ДНК в образцах крови (см. Таблицу 1 в Husby, 2020), но значимость метилирования в крови по сравнению с моделями метилирования в других тканях только начинает пониматься.Хорошо известно, что метилирование зависит от ткани и даже от типа клеток (Schilling & Rehli, 2007), но некоторые недавние исследования также продемонстрировали корреляции в уровнях метилирования во всех тканях (Tylee et al., 2013). Например, у людей было идентифицировано около 10 000 геномных областей с коррелированным паттерном метилирования между различными тканями, которые также различались у разных людей (Gunasekara et al., 2019). У больших синиц метилирование ДНК красных кровяных телец и печени предсказуемо изменяется как тканеспецифичным, так и тканевым образом (Derks et al., 2016; Lindner et al., 2021), предполагая, что общие тканевые изменения в метилировании ДНК могут выражаться тканеспецифичным образом (Lindner et al., 2021). Будущие исследования, изучающие тканеспецифические корреляции в метилировании ДНК и экспрессии РНК в экологических модельных организмах, будут очень ценными для этой области.

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы демонстрируем, что метилирование сайта CpG в промоторной области генов совпадает с репродуктивным временем самок и что наблюдаемые паттерны метилирования ДНК соответствуют паттерну экспрессии соответствующих генов у кур.Это подчеркивает возможность эпигенетической модификации играть важную роль в геномном механизме, который опосредует фенологию у этого вида, хотя, как и в любом исследовании ассоциации, в конечном итоге необходима экспериментальная работа, чтобы проверить это.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Коэна Верховена за комментарии к более раннему проекту рукописи, Кристу Мэйтман и коллег из NIOO-KNAW за помощь в лаборатории, Барта ван Лит и Рубена де Вит за помощь во время экспериментов, Йеруна Лоренса и Жиля Вийлхёйзена за техническую помощь до и во время экспериментов и опекунов из NIOO-KNAW для ухода за птицами.Мы благодарим Тайлера Стивенсона, двух анонимных рецензентов и Викторию Сорк за конструктивные комментарии, улучшившие рукопись.

ВКЛАД АВТОРА

M.E.V., K.v.O. и А.Х. разработали эксперимент, И.В. проводил эксперименты, H.M.V. проводил расклады, М. провели статистический анализ с помощью V.N.L., M.L. и A.H. написали рукопись при участии всех авторов.

Лабораторные штаммы Aedes aegypti компетентны в отношении бразильского вируса Зика

Abstract

Вспышки вируса Зика представляют собой беспрецедентную угрозу для человека в отношении врожденных пороков развития и неврологических / аутоиммунных осложнений.Поскольку этот вирус имеет высокий потенциал распространения в регионах, где присутствуют переносчики, улучшение борьбы с комарами является главным приоритетом. Таким образом, лабораторных штаммов Aedes aegypti будут иметь фундаментальное значение для поддержки исследований в различных областях исследований, связанных с взаимодействием вируса Зика и комаров, которые являются основой для разработки инновационных методов борьбы. В этом смысле наша цель состояла в том, чтобы определить основные аспекты инфекции бразильского штамма вируса Зика у лабораторных комаров эталонного образца Aedes aegypti .Мы орально подвергали комаров Рокфеллера, Хиггса и Рексвилля воздействию бразильского ZIKV (ZIKV ^BR ), и кОТ-ПЦР применяли для определения инфицирования, распространения и уровня обнаружения ZIKV в собранной слюне, а также уровней вируса в тканях комаров. Эти три штамма поддерживают развитие вируса, но Хиггс показал значительно более низкую вирусную нагрузку в организме через 14 дней после заражения (dpi) и самую низкую распространенность в теле и голове. Штамм Рокфеллера был наиболее восприимчивым при 7 dpi, но аналогичные скорости распространения наблюдались при 14 dpi.Хотя существуют вариации, РНК ZIKV ^BR показывает определяемые уровни в слюне трех штаммов при 14 dpi, но обнаруживается только у Рокфеллера при 7 dpi. Более того, было подтверждено, что образцы слюны трех штаммов заразны при внутригрудном введении комарам. Кинетику ZIKV ^BR наблюдали у комаров Рокфеллера, и вирус можно было идентифицировать в головах с разрешением 4 dpi, но более стабильно обнаруживался на поздних этапах заражения. Наше исследование представляет собой первую оценку поведения бразильского вируса Зика в эталонных штаммах Aedes aegypti и проливает свет на то, как инфекция развивается с течением времени.Компетенция переносчиков и отличительные признаки разработки ZIKV ^BR были выявлены у лабораторных комаров, что предоставило дополнительную информацию для ускорения исследований, посвященных взаимодействию ZIKV и комаров.

Образец цитирования: Коста-да-Силва А.Л., Иошино Р.С., Араужо HRCd, Коджин Б.Б., Занотто PMdA, Оливейра DBL и др. (2017) Лабораторные штаммы Aedes aegypti компетентны в отношении бразильского вируса Зика. PLoS ONE 12 (2): e0171951. https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0171951

Редактор: Олле Терениус, Шведский университет сельскохозяйственных наук, ШВЕЦИЯ

Поступила: 20 августа 2016 г .; Принято к печати: 28 января 2017 г .; Опубликован: 10 февраля 2017 г.

Авторские права: © 2017 Costa-da-Silva et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файле вспомогательной информации.

Финансирование: Эта работа финансировалась грантами № 2013 / 19921-9 и № 2014 / 17766-9 Исследовательского фонда Сан-Паулу, www.fapesp.br, грантом 003/16 от Координационного центра по совершенствованию кадров высшего образования. , www.capes.gov.br, и Национальный институт науки и технологий, молекулярная энтомология, www.inctem.bioqmed.ufrj.br. ALCS и BBK были поддержаны стипендиями № 1252482 и № 1497027 из Национальной программы постдокторантуры по координации совершенствования кадров высшего образования — PNPD / CAPES.HRCA был поддержан стипендией № 2013 / 16609-4 Исследовательского фонда Сан-Паулу. DBLO был поддержан стипендией № 5126 / 2015-00 от CAPES. RSI и SRM были поддержаны стипендиями CAPES. MLC был поддержан стипендией № 303341 / 2012-2, «Продуктивность в исследованиях», Бразильским национальным исследовательским советом, cnpq.br. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

В настоящее время мир сталкивается с новой вспышкой появляющегося вируса Зика (ZIKV) [1]. Его связь с неврологическими и аутоиммунными осложнениями, а также с младенцами, рожденными с микроцефалией [2,3], вызвала глобальный кризис здравоохранения. В связи с тяжелой ситуацией был выпущен документ, содержащий оперативный план по оказанию помощи затронутым странам в разработке стратегии борьбы с болезнью, и улучшения в борьбе с переносчиками инфекции были выделены в качестве приоритетов [4].

Результат заражения переносчиками будет зависеть от конкретных взаимодействий между генотипами комаров и вирусов. Следовательно, лучшее понимание взаимодействий москитных переносчиков и ZIKV является основой для разработки инновационных стратегий, которые могут быть добавлены в арсенал борьбы с ZIKV. В недавних исследованиях сообщалось о значительных различиях в восприимчивости к инфекции ZIKV между популяциями диких комаров Aedes aegypti , Aedes albopictus и других видов Aedes [5–7].Эти исследования компетентности переносчиков, сфокусированные на основных видах переносчиков, а также на вариациях восприимчивости различных популяций одного и того же вида, имеют первостепенное значение для определения улучшенных программ борьбы с приоритетом компетентных популяций.

Хотя дикие популяции основного переносчика, Ae . aegypti , представляют естественную динамику процесса инфицирования ZIKV у беспозвоночных-хозяев, определение переносимости различных лабораторных штаммов, которые хорошо адаптированы в неволе и легко доступны для экспериментов, также важно для поддержки основных и прикладных исследования в различных областях, связанных с взаимодействием вектор-вирус.Более того, некоторые штаммы также известны как стандартные во многих лабораториях мира. Они используются в качестве эталонных штаммов комаров, потому что экспериментальная воспроизводимость более надежна, чем для полевых популяций [8].

Важные достижения в области иммунного ответа комаров на вирус денге (DENV) и другие патогены человека были выполнены на Ae . aegypti лабораторных штаммов и природных популяций комаров для целей сравнения [8–10], а также для оценки устойчивости к инсектицидам [11,12].Кроме того, характеристика векторной компетентности актуальна для более прикладных целей. При разработке трансгенных комаров в основном используются лабораторные эталонные штаммы для трансформации, а генетический фон, связанный с восприимчивостью к патогенам, включен в установленные линии. Таким образом, переносимость лабораторных штаммов ZIKV также должна рассматриваться в контексте продуцирования и выпуска трансгенных комаров [13].

Для получения основной информации о взаимодействии между бразильским штаммом вируса Зика (ZIKV ^BR ) и тремя важными лабораторными Ae .Были проанализированы штаммы aegypti , комаров Рокфеллера (ROCK), белых глаз Хиггса (HWE) и Рексвилля (RED). Штамм ROCK, чувствительный к инсектицидам штамм карибского происхождения, который был создан в 1930 году [14], обычно используется в качестве эталона для испытаний устойчивости к инсектицидам и в экспериментах по заражению DENV [15,16]. Штамм HWE представляет собой дефицитный по глазному пигменту Ae . aegypti , вариант штамма Rex-D, и он используется в качестве реципиента для трансформаций зародышевой линии комаров, поскольку отсутствие пигмента является желаемым фенотипом для визуального скрининга трансгенных индивидуумов, которые часто помечаются флуоресцентной меткой. белок экспрессируется в глазах [17].Штамм RED Ae . aegypti , также являющийся вариантом штамма Rex-D, широко используется для исследования чувствительности патоген-хозяин [18].

В этом отчете подробно описаны заражение ZIKV ^BR , распространение и частота обнаружения ZIKV в собранной слюне, а также подтверждена способность этих трех штаммов комаров к этому вирусу. Это исследование также показывает кинетику вируса в эталонном штамме ROCK.

Материалы и методы

Заявление об этике

Кровь человека или ее производные использовались в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации.Устаревшая консервированная человеческая кровь (анонимный пакет с кровью, истекший для использования человеком) была пожертвована Fundação Pró-Sangue Hemocentro de São Paulo. Никаких клинических исследований с этим материалом не проводилось, и любые излишки были выброшены как биологические отходы после эксперимента по кормлению комаров. Было получено разрешение банка крови, и протокол был утвержден Советом по надзору за исследованиями на людях (IRB) (Comissão de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do Instituto de Ciências Biomédicas / USP — CEPSH) и Национальным комитетом Этика в исследованиях (Comissão Nacional de Ética em Pesquisa – CONEP), протокол № 503.Номер сертификата: 914.876 (CAAE 38518114.0.0000.5467).

Бразильский штамм вируса Зика, названный ZIKV ^BR , был ранее выделен из бразильского клинического случая [2], а образец лиофилизированного вируса был осторожно предоставлен Институтом Эвандро Шагаса в Белене, штат Пара. Использование анонимных вирусных образцов было одобрено нашим институциональным наблюдательным советом (IRB). Исследование было одобрено Комитетом по этике исследований на людях (CEPSH — Off.011616) Института биологических наук Университета Сан-Паулу.

Доращивание комаров

Эксперименты проводились на трех Ae . aegypti лабораторных штамма: ROCK, HWE и RED. Этих комаров содержали в инкубатории BSL-2 Института биомедицинских наук Университета Сан-Паулу. Условия выращивания: 27 ± 1 ° C, относительная влажность 75–80%, фотопериод 12/12 часов (свет / темнота). Взрослых комаров содержали ad libitum на 10% растворе сахарозы (мас. / Об.).

Амплификация и титрование вирусов

Бразильский штамм вируса Зика, ранее называвшийся ZIKV ^BR , был выделен из бразильского клинического случая [2], а образец лиофилизированного вируса был осторожно предоставлен Институтом Эвандро Шагаса в Белене, штат Пара.ZIKV ^BR амплифицировали и титровали, как недавно описано [2]. Титрованные вирусом аликвоты (5,0 x 10 ⁶ бляшкообразующих единиц [БОЕ] / мл) четвертой субкультуры (Т4) были предоставлены целевой группой ZIKV в Сан-Паулу.

Инфекция комаров

Первоначальная вязка в возрасте 7–9 дней Ae . aegypti самок лишены 10% сахарозы в течение 24 часов до приема пищи с кровью. Голодные самки получали инфекционную кровяную муку ZIKV ^BR с использованием искусственной кормушки Glytube [19].Концентрированный эритроцит человека смешивали с супернатантом ZIKV ^BR и инактивированной сывороткой человека в соотношении 10: 10: 1, соответственно, и конечный титр ZIKV ^BR в этой смеси составлял 2,2 × 10 ⁶ БОЕ / мл. Зараженную кровь предлагали самкам комаров на 45 минут. Ненасыщенных самок удаляли, а налившихся содержали в пластиковых стаканчиках с 10% раствором сахарозы до времени сбора.

Образцы слюны и тканей комаров

Слюна, головы и тела 20 отдельных самок, подвергшихся пероральному воздействию ZIKV ^BR , собирали через 7 и 14 дней после инфицирования (dpi) для обнаружения вируса (по 10 комаров для каждого штамма, было проведено два независимых эксперимента).Для слюны — техника принудительного слюноотделения, как описано ранее [20,21], с модификациями. Комаров анестезировали CO ₂ , переносили в чашку Петри на льду, а ноги и крылья удаляли щипцами. Стеклянное предметное стекло с полоской пластилина использовали для поддержки наконечников микропипеток, заполненных 10 мкл среды Лейбовица L-15 (Gibco ^™ ), и в наконечник вставляли хоботок каждого живого комара. Насекомым давали возможность выделять слюну в течение 45 минут, и весь объем был выброшен в 1.Микропробирка 5 мл. После слюноотделения головы отделяли от остальных тел, используя ножницы McPherson-Vannas № 501234 (World Precision Instruments, Сарасота, Флорида), и каждую ткань переносили в микропробирку на 1,5 мл. Образцы тел, голов и слюны, собранные с разрешением 7 и 14 точек на дюйм, немедленно замораживали в сухом льду и хранили при -80 ° C.

Оценка инфекционности ZIKV

^BR из собранной слюны

Присутствие инфекционного ZIKV ^BR в собранной слюне от 3 различных штаммов комаров было подтверждено, как описано ранее [22], с модификациями.Слюну 10 комаров от каждого штамма ROCK, HWE и RED собирали (как описано выше) с разрешением 7 и 14 точек на дюйм. Немедленно готовили пул, содержащий 1 мкл каждой слюны комара, и вводили интраторакально самкам комаров из штамма HWE в возрасте 5-7 дней с помощью инжектора Nanoject II (Drummond Scientific Company, номер по каталогу 3-000-204). Для каждого пула слюны женщине вводили в среднем 276 нл. От 20 до 25 комаров были заражены каждым пулом слюны, и игла была заменена перед инъекцией другого образца слюны, чтобы предотвратить заражение.На 11 день после инъекции комаров собирали индивидуально, общую РНК экстрагировали из 5 комаров и проверяли положительность вируса с помощью qRT-PCR, как описано в следующих разделах.

Экстракция РНК из образцов комаров

Суммарную РНК

из отдельных голов, тел и слюны экстрагировали с использованием мини-набора для вирусной РНК QIAmp (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Полную РНК элюировали 60 мкл буфера для элюции и хранили при -80 ° C до анализа qRT-PCR.

Одностадийный анализ qRT-PCR

Для обнаружения ZIKV и количественного определения количества копий вируса в qRT использовали набор Power SYBR ^® Green RNA-to-C _T ^™ 1-Step (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). -ПЦР реакции, как описано производителем. Каждый образец анализировали в технических дубликатах в реакциях конечного объема 20 мкл, содержащих 5 мкл общей РНК и 0,5 мкМ для каждого праймера ZIKV 835 и ZIKV 911c [23]. Отрицательный (вода без РНКаз) и положительный контроль (500 мкг общей РНК, экстрагированной из аликвоты супернатанта культуры клеток ZIKV) использовали в каждом анализе.Образцы считались положительными на ZIKV только при обнаружении в обоих анализах. Анализы выполняли в термоциклере Mastercycler Realplex 2 (Eppendorf) при следующих условиях: 48 ° C в течение 30 минут и 95 ° C в течение 10 минут с последующими 40 циклами при 95 ° C в течение 30 секунд, 60 ° C в течение 30 секунд и шаг кривой плавления: 95 ° C в течение 1 минуты, 60 ° C в течение 30 секунд и 95 ° C в течение 1 минуты, с линейным изменением температуры от 60 ° C до 95 ° C со скоростью 0,02 ° C / сек. Специфичность ампликона оценивали по пику кривой плавления (79 ± 1 ° C), а эффективность пары праймеров варьировалась от 1.01 до 1.02.

Для оценки количества копий ZIKV была построена стандартная кривая, как описано [24], с некоторыми изменениями. Вкратце, целевая плазмида, содержащая фрагмент ZIKV 76 п.н., амплифицированный с парами праймеров ZIKV 835 и ZIKV 911c, была линеаризована, и были использованы девять серийных разведений в диапазоне от 10 ^-9 до 10 ^-17 г для получения стандартной кривой. Предел обнаружения экспериментально установлен в 23 экземплярах (разведение 10 ⁻¹⁶ г). Абсолютное количество копий ZIKV было экстраполировано из стандартных кривых (R ² варьировалось от 0.От 990 до 0,996), скорректированный обратным вычислением до общего объема РНК (60 мкл) и выраженный в виде копий на ткань.

Анализ степени заражения, распространения и обнаружения ZIKV

^BR в собранной слюне

Уровень заражения (или распространенность) определяется как доля комаров с вирусом, обнаруженным в организме (брюшная полость и грудная клетка), среди протестированных. Скорость распространения соответствует количеству москитов с инфицированными головами среди инфицированных тел (положительный результат по брюшной полости и грудной клетке).Поскольку использовался метод обнаружения вирусной РНК в слюне, термин «скорость обнаружения ZIKV в собранной слюне» был применен вместо скорости передачи (которая относится к инфекционным частицам, присутствующим в слюне), но с эквивалентной оценкой. Уровень обнаружения ZIKV в собранной слюне оценивался как доля комаров с положительной слюной среди комаров с диссеминированной инфекцией (положительные головы) и выражалась в процентах. Принятые определения соответствуют результатам предыдущего исследования [5].

Анализ данных

Статистический анализ был выполнен в программном пакете GraphPad Prism5 (версия 5.00) для Windows (Сан-Диего, Калифорния, США), и для всех анализов были определены доверительные интервалы 95%. Точный тест Фишера применялся в соответствии с [22] для обнаружения значительных различий в долях положительных результатов ZIKV одних и тех же тканей (тела, головы или слюны) при 7 или 14 dpi у разных штаммов комаров и для сравнения пропорций инфекции во время кинетики ZIKV у штамма ROCK. .Уровни вируса между различными Ae . линий aegypti сравнивали с использованием двустороннего дисперсионного анализа и посттестов Бонферрони.

Результаты

ZIKV

^BR Скорость заражения и распространения у перорально зараженных штаммов комаров

Для анализа и сравнения восприимчивости к инфекции Ae . aegypti лабораторных штаммов вируса ZIKV, выделенного в Бразилии, мы перорально подвергали воздействию комаров ROCK, HWE и RED с малым пассажем штамма ZIKV ^BR .Уровни вирусной РНК определяли количественно с помощью анализа qRT-PCR в отдельных телах и головах комаров при 7 и 14 dpi. Эти интервалы являются хорошо охарактеризованными индикаторами установления инфекции в брюшной полости и распространения вируса в голову, соответственно, во время прогрессирования репликации флавивируса в Ae . aegypti комаров [25].

Три штамма показали высокие уровни вируса в организме при 7 и 14 dpi, при этом среднее число вирусных копий колебалось от 10 ⁷ при 7 dpi до 10 ⁸ при 14 dpi (рис. 1A).При 7 dpi штаммы ROCK и RED показали самые высокие и значительно различающиеся уровни инфицирования организма (количество положительных тел / общее количество протестированных комаров) (95%) по сравнению с самками HWE (60%) (точный тест Фишера, HWE x ROCK и HWE). x КРАСНЫЙ, p = 0,0197). При 14 dpi частота инфицирования организма увеличивалась в образцах HWE (65%), но наблюдалась значительно более низкая распространенность (HWE x ROCK и HWE x RED, p = 0,0436), а уровни вирусов наблюдались по отношению к штаммам ROCK и RED (двусторонний ANOVA с последующими пост-тестами Бонферрони, HWE x ROCK, p <0.001 и HWE x RED, p <0,01), которые в это время оставались на том же уровне (95%) (рис. 1A). Однако частота инфицирования головок показывала различия в количестве положительных образцов среди штаммов при 7 dpi, с ROCK на 95%, HWE на 50% и RED на 70%. При 14 dpi штамм ROCK оставался инфицированным 95% протестированных голов, а у штаммов HWE и RED процент инфицированных голов увеличивался до 65% и 95% соответственно (рис. 1 и 2). Распространенность ZIKV в головах комаров HWE была значительно ниже, чем ROCK на уровне 7 (HWE x ROCK, p = 0.0033), а также ROCK и RED с разрешением 14 dpi (HWE x ROCK и HWE x RED, p = 0,0033) (рис. 1B). Что касается средних уровней вируса в голове, мы наблюдали, что штамм RED имел 10 ⁵ копий ZIKV при 7 dpi, и это число увеличилось до 10 ⁷ при 14 dpi, что указывает на увеличение на 2 log через 7 дней, в то время как у штаммов ROCK и HWE уровень инфицирования увеличивался только на 1 log (рис. 1B). При анализе скорости распространения (количество инфицированных голов / количество инфицированных тел) штамм ROCK имел наивысший индекс (100%) при 7 dpi по сравнению с HWE (83%) и RED (74%) (самый низкий). , и все штаммы достигли одинаковой 100% скорости распространения при 14 dpi (рис. 2).

Рис. 1. Частота инфицирования ZIKV ^BR и вирусные уровни в теле и голове из Ae . aegypti лабораторных штамма.

Скорость инфицирования и уровни вируса в тканях регистрировали индивидуально у самок ROCK, HWE и RED через 7 и 14 дней после приема пищи с кровью, инфицированной ZIKV (dpi). ( A) Распространенность вирусов и уровни инфицирования в организме. Каждый образец тела представлен сплошным кружком. Распространенность инфекции между HWE x ROCK и HWE x RED составляет 7 (* p = 0.0197) и 14 точек на дюйм (* p = 0,0436) достоверно различались по точному критерию Фишера. Уровни вирусной инфекции HWE были значительно ниже в организме при 14 dpi по сравнению с ROCK (*** p <0,001) или RED (** p <0,01) по двустороннему ANOVA с пост-тестами Бонферрони. ( B) Распространенность вирусов и уровни инфицирования в головах. Отдельные головы обозначены открытыми треугольниками. Распространенность инфекции между HWE x ROCK (** p = 0,0033) при 7 dpi и HWE x ROCK и HWE x RED (** p = 0,0033) при 14 dpi значительно различалась по точному критерию Фишера.Черные полосы указывают среднее количество вирусных копий, а пунктирная серая линия показывает предел обнаружения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171951.g001

Рис. 2. Инфекция ZIKV ^BR , частота распространения и обнаружения ZIKV в собранной слюне Ae . aegypti лабораторных штамма.

Скорость инфицирования (количество инфицированных тел / общее количество проанализированных тел), скорость распространения (количество инфицированных голов / количество инфицированных тел) и скорость обнаружения ZIKV в собранной слюне (количество инфицированных образцов слюны / количество инфицированных голов ) были оценены у самок штаммов ROCK, HWE и RED через 7 и 14 дней после приема пищи с кровью, инфицированной ZIKV (dpi).Полоски представляют собой процентные значения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171951.g002

Распространенность и частота обнаружения ZIKV

^BR в слюне комаров

Присутствие ZIKV ^BR и количественный анализ уровня вируса оценивали непосредственно для каждого собранного образца слюны с использованием того же анализа qRT-PCR. Самки штамма ROCK показали два положительных образца слюны (10%) с разрешением 7 dpi. Однако ни одна из копий ZIKV ^BR не превышала предела обнаружения в слюне комаров HWE и RED в этот момент времени.Напротив, образцы слюны трех штаммов показали определяемые уровни вируса при 14 dpi. Образцы HWE были 20% положительными для ZIKV ^BR , в то время как образцы ROCK и RED были 35% и 5% соответственно (рис. 3). Соответственно, самый высокий уровень обнаружения ZIKV в собранной слюне (количество положительных образцов слюны / общее количество инфицированных голов) наблюдался у штамма ROCK (36,8%), за которым следуют HWE (30,8%) и RED (5,3%) при 14 dpi (рис. 2).

Рис. 3. Распространенность ZIKV ^BR и уровни вируса в собранной слюне из Ae . aegypti лабораторных штамма.

Распространенность и уровни вируса в образце слюны были индивидуально зарегистрированы в штаммах ROCK, HWE и RED через 7 и 14 дней после приема пищи с кровью, инфицированной ZIKV (dpi). Каждый образец слюны обозначен сплошной звездочкой. Распространенность положительной слюны между ROCK x RED статистически различалась при 14 dpi (* p = 0,0436). Черные полосы указывают среднее количество вирусных копий, а пунктирная серая линия показывает предел обнаружения.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0171951.g003

Средние уровни вируса в слюне ROCK увеличились на 1 log (с 10 ² до 10 ³ ) между 7 и 14 dpi. Однако, по сравнению с ROCK, наблюдались аналогичные средние уровни ZIKV в образцах слюны RED и HWE (варьирующиеся от 9,38 x 10 ² до 1,88 x 10 ³ ) при разрешении 14 dpi (рис. 3).

Как видно на теле и голове, образцы слюны показали вариации деформации, связанные с частотой обнаружения и распространенностью ZIKV ^BR (рис. 2 и 3, соответственно).Распространенность вируса между ROCK и RED значительно различалась при разрешении 14 dpi (точный тест Фишера, p = 0,0436). Однако не было обнаружено статистически значимых различий в вирусных уровнях слюны (двухфакторный дисперсионный анализ с последующими пост-тестами Бонферрони, p> 0,05) между штаммами ROCK, HWE и RED при 7 и 14 dpi (рис. 3).

Подтверждение инфекционности ZIKV в собранной слюне

Жизнеспособность частиц ZIKV ^BR в собранной слюне оценивали путем внутригрудной инъекции в Ae . aegypti комаров. Пулы слюны штаммов ROCK, HWE и RED, собранные при 7 или 14 dpi, были способны инфицировать комаров через 11 дней после инокуляции, что подтверждает присутствие инфекционных частиц ZIKV (Таблица 1).

Анализ qRT-PCR индивидов, которым вводили инъекцию, показал, что пулы слюны штамма ROCK были инфекционными для Ae . aegypti комаров (100% протестированных комаров) при сборе с разрешением 7 и 14 точек на дюйм. Тот же результат наблюдался для пула HWE слюны, собранной с разрешением 14 точек на дюйм, но не было обнаружено инфицированных комаров, когда слюна была собрана с разрешением 7 точек на дюйм.Иными словами, пул слюны штамма RED был заразным только при сборе с разрешением 7 точек на дюйм (таблица 1), даже если отдельные образцы слюны не достигли предела обнаружения ZIKV (рис. 3), но только 40% инокулированных комаров были положительными на ZIKV ( Таблица 1). Более того, у положительных комаров был высокий уровень инфекции через 11 дней после инокуляции (от 10 ⁷ до 10 ⁸ ) (S1 фиг.), Что указывает на репликацию ZIKV. Эти результаты подтверждают, что штаммы ROCK, HWE и RED соответствуют ZIKV ^BR .

ZIKV

^BR Кинетика инвазии и установления в штамме ROCK

ZIKV ^BR Уровень инфицирования, распространения и обнаружения ZIKV в собранной слюне был выше у штамма ROCK, чем у других протестированных штаммов (рис. 2). Более того, пулы слюны этого штамма были заразными при сборе с разрешением 7 и 14 точек на дюйм. Этот результат побудил нас провести независимый эксперимент для определения кинетики ZIKV ^BR во время установления и распространения инфекции у самок из штамма ROCK.Пять временных точек после заражения кровью (1, 4, 7, 11 и 14 точек на дюйм) были использованы для количественного анализа вирусных уровней в отдельных телах и головах (рис. 4).

Рис. 4. Кинетика ЗИКВ ^БР в телах и головках Ае . aegypti из штамма ROCK.

Скорость инфицирования и уровни вируса в тканях регистрировали индивидуально через 1, 4, 7, 11 и 14 дней после приема пищи с кровью, инфицированной ZIKV (dpi). Сплошные кружки и светлые треугольники представляют каждый образец тела и головы, соответственно, от самок ROCK.Сплошные (тело) и пунктирные (голова) синие линии показывают прогрессирование вирусной инфекции (средние уровни) во время эксперимента с течением времени. Пунктирные синие полосы указывают на раннюю (от 1 до 4 точек на дюйм) и позднюю (от 7 до 14 точек на дюйм) стадии заражения голов, на которых наблюдалась значительная разница в распространенности инфекции между двумя стадиями с использованием точного критерия Фишера (*, 1 dpi x 7 dpi — p = 0,0031; 1 dpi x 11 dpi — p = 0,0007; 1 dpi x 14 dpi — p <0,0001; 4 dpi x 7 dpi - p = 0,0198; 4 dpi x 11 dpi - p = 0,0055; 4 dpi x 14 dpi - p = 0.0001). Пунктирная серая линия показывает предел обнаружения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171951.g004

Как и ожидалось, все проанализированные образцы тела оказались положительными на ZIKV ^BR при 1 dpi, а средний уровень вируса составил 7,68 x 10 ⁴ копий. . Эти результаты, вероятно, отражают вирусную нагрузку, полученную во время перорального инфицирования самок ROCK, и частицы ZIKV ^BR , все еще присутствующие в инфекционной крови, остающейся в болюсе крови внутри средней кишки.Неудивительно, что ни одна из голов не показала определяемых уровней ZIKV в этот период.

Количество обнаруженных вирусных копий постепенно увеличивалось в телах и головах за время эксперимента. При 4 dpi, когда кровь была полностью переварена, распространенность составила 70% в организме и 10% в голове, что указывает на то, что у некоторых самок ROCK инфекция ZIKV ^BR может развиваться быстрее, достигая головы и вызывая высокий уровень инфекции. интенсивность инфекции в нервных тканях (10 ⁵ ) в течение короткого периода после заражения (рис. 4).

Количество инфицированных тел осталось на том же уровне (70%) при разрешении 7 dpi, однако количество инфицированных вирусом голов увеличилось до 70%, а средний уровень вируса увеличился примерно на 2 log. ZIKV ^BR был обнаружен в телах всех проанализированных образцов комаров с разрешением 11 и 14 dpi. Кроме того, пик вирусного уровня был достигнут при 11 dpi, и инфекционное плато поддерживалось в тканях тела между двумя последними периодами отбора проб (рис. 4).

Распространенность ZIKV ^BR составляла 80% при разрешении 11 dpi и 100% при 14 dpi.Средние уровни вируса увеличились в течение 14 дней заражения с 0,0 до 3,13 × 10 ⁷ копий в головах комаров, получавших вирусный титр 2,27 × 10 ⁶ БОЕ / мл (конечная концентрация). Частота заражения образцов ROCK head значительно различалась между ранним (1 и 4 dpi) и поздним временными точками заражения (7, 11 и 14 dpi) (точный критерий Фишера, p <0,05).

Обсуждение

Базовые знания о взаимодействии ZIKV с его векторами являются одним из приоритетов для создания прочной научной основы, поддерживающей традиционные и инновационные методы решения проблемы вируса Зика [26].Литература в этой области расширяется за счет недавних исследований, раскрывающих основные виды, естественно инфицированные ZIKV [27–29], и характеристики вирусной восприимчивости естественных популяций в регионах с потенциалом передачи в городах [5,30]. Какими бы важными ни были эти исследования с участием диких или недавно колонизированных комаров, хорошо адаптированные лабораторные штаммы переносчиков обеспечат прочную основу для надежных клеточных и молекулярных исследований взаимодействия вируса и комаров, в которых важны осуществимость и воспроизводимость.

Недавно адаптированные в лаборатории штаммы комаров, HWE и Orlando (ORL), были использованы для описания характера заражения вирусом чикунгунья (CHIKV). Оба штамма комаров были восприимчивы к CHIKV, а вирусные частицы были обнаружены в слюне только через два дня после заражения кровью. Характер инфекции CHIKV в средней кишке и скорость распространения были значительно ниже для ORL по сравнению со штаммом HWE до 3 точек на дюйм, хотя комары HWE и ORL показали одинаковую частоту заражения вирусом в слюне (60 и 65% соответственно) при 7 точках на дюйм. [31].

Наше исследование также обнаружило различия между лабораторно адаптированными штаммами во время инфекции ZIKV. Хотя Ae . aegypti динамика инфекции более быстрая для CHIKV (член альфавируса из семейства Togaviridae), чем для ZIKV (флавивирус из семейства Flaviviridae), штамм HWE демонстрирует более низкую распространенность слюны по сравнению со штаммом ROCK на ранних этапах отбора проб во время ЗИКВ ^BR инфекция. Такая же картина наблюдалась у комаров HWE в отношении штамма ORL при воздействии CHIKV [31].

Распространенность CHIKV в слюне HWE увеличивается с 20% при 2 dpi до 60% при 7 dpi, в отличие от штамма ORL (от 55% при 2 dpi до 65% при 7 dpi) [31]. Наше исследование также демонстрирует, что увеличение частоты обнаружения ZIKV ^BR в собранной слюне было более выражено у инфицированных HWE комаров (от 0% при 7 dpi до 20% при 14 dpi) по сравнению с RED (0% при 14 dpi). От 7 dpi до 5% при 14 dpi) и аналогично ROCK (от 10% при 7 dpi до 35% при 14 dpi). Этот результат удивителен, поскольку HWE имеет самый низкий уровень инфицирования среди штаммов при 7 dpi, в то время как комары ROCK показали чувствительность к ZIKV ^BR , что приводит к более быстрому установлению и распространению инфекции.Что еще более интересно, штамм HWE показал самую высокую нагрузку ZIKV ^BR в слюне на поздней стадии инфекции, и аналогичный результат был продемонстрирован для комаров HWE, инфицированных CHIKV [31].

Американская популяция Ae . aegypti перорально подвергались воздействию азиатского генотипа ZIKV, и вирусная инфекция и распространение наблюдались в первые дни после инфицирования. Хотя уровень инфицирования был высоким, темпы распространения и передачи были сравнительно низкими [5].Уровни инфицирования и обнаружения ZIKV в собранной слюне были аналогичны нашим результатам, но мы обнаружили высокие показатели диссеминации во всех Ae . протестированных штаммов aegypti .

В соответствии с нашими выводами о заражении ZIKV ^BR в Ae . aegypti лабораторных штаммов, в других исследованиях была обнаружена такая же высокая восприимчивость популяций диких комаров, инфицированных различными штаммами ZIKV, что подчеркивает, что эталонные штаммы могут имитировать паттерн заражения дикой популяции [5,32].

В настоящей работе кОТ-ПЦР используется как быстрый и эффективный метод для характеристики компетентности переносчиков [7] и точного измерения вирусных уровней во время процесса инфицирования [22,33]. Исследования показали устойчивую корреляцию между уровнями вирусной РНК и инфекционными вирусными частицами различных флавивирусов [34,35]. Основываясь на амплификации генома ZIKV ^BR , мы измерили уровни обнаружения ZIKV в собранной слюне, чтобы проверить компетентность ZIKV ^BR трех Ae . aegypti лабораторных штамма. Обнаружение вирусной РНК в слюне комаров показало, что инфекция слюнных желез и препятствия для побега были преодолены. Эти результаты были подтверждены инокуляцией слюны штаммов ROCK, HWE и RED на комаров, вызывая позднюю и стойкую инфекцию ZIKV ^BR у зараженных самок и обнаруживая, что Ae . aegypti комаров штаммов ROCK, HWE и RED соответствуют ZIKV ^BR .

Выводы

Результаты нашего исследования подтверждают, что лабораторные штаммы ROCK, HWE и RED не только поддерживают развитие бразильского вируса Зика, но также способны передавать вирус. Более того, мы продемонстрировали, что штамм ROCK обладает высочайшей квалификацией к ZIKV ^BR . Эти результаты предоставят полезные сравнения для будущих исследований и позволят определить штаммы, которые лучше всего подходят для желаемых экспериментов. В этом смысле эти знания являются фундаментальными для исследований-хозяев беспозвоночных вируса Зика, особенно потому, что мы определили основные аспекты инфекции штамма ZIKV ^BR у лабораторных комаров справочного материала Aedes aegypti .Эти знания являются первым шагом в поддержку исследований, направленных на понимание биологии ZIKV-векторов с упором на инновационные решения по борьбе с переносчиками.

Дополнительная информация

S1 Рис. Распространенность ZIKV

^BR и вирусные уровни у комаров, которым вводили пулы собранной слюны лабораторных штаммов.

Распространенность и уровни вируса на комара были зарегистрированы через 11 дней после инъекции пулов слюны, собранных из ROCK, HWE и RED, при 7 и 14 dpi.Каждый комар изображен сплошным ромбом. Черные полосы указывают среднее количество вирусных копий, а пунктирная серая линия показывает предел обнаружения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171951.s001

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим доктора Педро Васконселоса из IEC Института Эвандро Шагаса в Белене за предоставление лиофилизированного изолята ZIKV, Карлу Торрес Бракони за технические советы и Изабель Кристину душ Сантуш Маркес и Эдиан Сараива Фернандес за техническую помощь.

Вклад авторов

1. Концептуализация: ALCS RSI HRCA.
2. Обработка данных: ALCS.
3. Формальный анализ: ALCS.
4. Финансирование: MLC.
5. Расследование: ALCS RSI HRCA BBK DBLO SRM.
6. Методология: ALCS RSI HRCA BBK.
7. Администрация проекта: ALCS RSI.
8. Ресурсы: MLC PMAZ ELD.
9. Контроль: ALCS RSI MLC.
10. Проверка: ALCS.
11. Визуализация: ALCS.
12. Написание — первоначальный черновик: ALCS RSI HRCA BBK MLC.
13. Написание — просмотр и редактирование: ПМАЗ.

Ссылки

1. 1. Муссо Д., Габлер DJ. Зика Вирус. Clin Microbiol Rev.2016; 29: 487–524. pmid: 27029595
2. 2. Cugola FR, Fernandes IR, Russo FB, Freitas BC, Dias JLM, Guimarães KP и др.Бразильский штамм вируса Зика вызывает врожденные дефекты в экспериментальных моделях. Природа. Издательская группа «Природа»; 2016; 534: 267–271.
3. 3. Млакар Дж., Корва М., Тул Н., Попович М., Польшак-Приатель М., Мраз Дж. И др. Вирус Зика, связанный с микроцефалией. N Engl J Med. 2016; 374: 951–958. pmid: 26862926
4. 4. КТО. ВОЗ, Программа стратегического реагирования на вирус Зика и План совместных операций. 2016.
5. 5. Chouin-Carneiro T, Vega-Rua A, Vazeille M, Yebakima A, Girod R, Goindin D и др.Различная восприимчивость Aedes aegypti и Aedes albopictus из Америки к вирусу Зика. Турелл MJ, редактор. PLoS Negl Trop Dis. 2016; 10: e0004543. pmid: 26938868
6. 6. Ди Лука М., Северини Ф., Тома Л., Бокколини Д., Роми Р., Ремоли М.Э. и др. Экспериментальные исследования чувствительности итальянского Aedes albopictus к вирусу Зика. Евронаблюдение. 2016; 21: 30223.
7. 7. Diagne CT, Diallo D, Faye O, Ba Y, Faye O, Gaye A, et al. Потенциал отобранных сенегальских видов Aedes spp.комары (Diptera: Culicidae) переносят вирус Зика. BMC Infect Dis. BMC Инфекционные заболевания; 2015; 15: 492. Pmid: 26527535
8. 8. Бониццони М., Данн В.А., Кэмпбелл К.Л., Олсон К.Е., Маринотти О., Джеймс А.А. Комплексная модуляция транскриптома Aedes aegypti в ответ на инфекцию вирусом денге. PLoS One. 2012; 7.
9. 9. Sim S, Jupatanakul N, Ramirez JL, Kang S, Romero-Vivas CM, Mohammed H, et al. Транскриптомное профилирование различных штаммов Aedes aegypti выявляет повышенную иммунную активацию на базальном уровне в популяциях, резистентных к вирусу денге, и выявляет новые молекулярные взаимодействия вирус-вектор.Рибейро JMC, редактор. PLoS Negl Trop Dis. 2013; 7: e2295. pmid: 23861987
10. 10. Colpitts TM, Cox J, Vanlandingham DL, Feitosa FM, Cheng G, Kurscheid S, et al. Изменения транскриптома aedes aegypti при инфицировании вирусами западного нила, денге и желтой лихорадки. PLoS Pathog. 2011; 7.
11. 11. Биссет Дж. А., Марин Р., Родригес М. М., Северсон Д. В., Рикардо И., Френч Л. и др. Устойчивость к инсектицидам у двух штаммов Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) из Коста-Рики.J Med Entomol. 2013; 50: 352–61. pmid: 23540124
12. 12. Brito LP, Linss JGB, Lima-Camara TN, Belinato TA, Peixoto AA, Lima JBP и др. Оценка влияния мутаций Aedes aegypti kdr на резистентность к пиретроидам и стоимость ее пригодности. Кумар Н., редактор. PLoS One. 2013; 8: e60878. pmid: 235
13. 13. Бирнтсен Б.Т., Джеймс А.А., Кристенсен Б.М. Генетика компетентности переносчиков комаров. Microbiol Mol Biol Rev.2000; 64: 115–137. pmid: 10704476
14. 14. Куно Г.Ранняя история лабораторного разведения Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) с упором на происхождение и использование отобранных штаммов. J Med Entomol. 2010; 47: 957–971. pmid: 21175042
15. 15. Араужо А., Араухо Диниз Д., Хельвесио Э., де Баррос Р., де Оливейра С.М., Эйрес К.Ф. и др. Восприимчивость популяций Aedes aegypti, демонстрирующих устойчивость темефоса к Bacillus thuringiensis israelensis: основа для управления. Векторы паразитов. 2013; 6: 297. pmid: 24499507
16. 16. Londono-Renteria B, Troupin A, Conway MJ, Vesely D, Ledizet M, Roundy CM и др.Для заражения вирусом денге Aedes aegypti требуется предполагаемый белок яда, богатый цистеином. Брасс А.Л., редактор. PLOS Pathog. 2015; 11: e1005202. pmid: 264

17. 17. Коджин Б.Б., Коста-да-Силва А.Л., Масиэль С., Энрикес Д.А., Карвалью Д.О., Мартин К. и др. Эндогенно экспрессируемый Nh3-конец белка циркумспорозоита препятствует инвазии спорозоитов в слюнные железы комаров. Малар Дж. БиоМед Централ; 2016; 15: 153.
18. 18. Thathy V, Severson DW, Christensen BM.Переосмысление генетики восприимчивости Aedes aegypti к P. gallinaceum. J Parasitol. 1994; 80: 705–712. pmid: 7
19. 5
20. 19. Коста-да-Силва, А.Л., Наваррете, Франция, Сальвадор, Ф.С., Карина-Коста, М., Иошино, Р.С., Азеведо, Д.С. и др. Glytube: метод на основе конической трубки и парафильма M в качестве упрощенного устройства для искусственного кровоснабжения комара-переносчика денге Aedes aegypti. PLoS One. 2013; 8: e53816. pmid: 23342010
21. 20. Андерсон С.Л., Ричардс С.Л., Smartt CT.Простой метод определения передачи арбовируса у комаров. J Am Mosq Control Assoc. 2010; 26: 108–111. pmid: 20402359
22. 21. Wong P-SJ, Li MI, Chong C-S, Ng L-C, Tan C-H. Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse): потенциальный переносчик вируса Зика в Сингапуре. Турелл MJ, редактор. PLoS Negl Trop Dis. 2013; 7: e2348. pmid: 23936579
23. 22. Dutra HLC, Rocha MN, Dias FBS, Mansur SB, Caragata EP, Moreira LA. Wolbachia блокирует циркулирующие в настоящее время изоляты вируса Зика у бразильских комаров Aedes aegypti.Клеточный микроб-хозяин. 2016; 19: 1–4.
24. 23. Ланчотти Р.С., Косой О.Л., Лавен Дж. Дж., Велес Дж. О., Ламберт А. Дж., Джонсон А. Дж. И др. Генетические и серологические свойства вируса Зика, связанного с эпидемией, штат Яп, Микронезия, 2007. Emerg Infect Dis. 2008; 14: 1232–1239. pmid: 18680646
25. 24. Коста-да-Силва А.Л., Кожин Б.Б., Маринотти О., Джеймс А.А., Капурро М.Л. Экспрессия и накопление двухдоменного одорант-связывающего белка AaegOBP45 в яичниках Aedes aegypti, получавших кровяное питание.Векторы паразитов. 2013; 6: 364. pmid: 24367904
26. 25. Салазар М.И., Ричардсон Дж. Х., Санчес-Варгас И., Олсон К. Э., Бити Б. Дж.. Вирус денге типа 2: репликация и тропизмы у орально инфицированных комаров Aedes aegypti. BMC Microbiol. 2007; 7: 9. pmid: 17263893
27. 26. Араужо Х., Карвалью Д., Иошино Р., Коста-да-Силва А., Капурро М. Стратегии борьбы с Aedes aegypti в Бразилии: внедрение новых технологий для преодоления продолжающихся эпидемий денге. Насекомые. 2015; 6: 576–594.pmid: 26463204
28. 27. Grard G, Caron M, Mombo IM, Nkoghe D, Mboui Ondo S, Jiolle D, et al. Вирус Зика в Габоне (Центральная Африка) — 2007: новая угроза от Aedes albopictus? Чаррел Р., редактор. PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8: e2681. pmid: 24516683
29. 28. Маркетт Н.Дж., Гарсия Р., Рудник А. Изоляция вируса Зика от комаров Aedes aegypti в Малайзии. Am J Trop Med Hyg. 1969; 18: 411–5. pmid: 4976739
30. 29. Дик Г.В., Китчен С., Хаддов А.Вирус Зика (I). Выделения и серологическая специфичность. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1952; 46: 509–520. pmid: 12995440
31. 30. Ли МИ, Вонг PSJ, Нг ЛК, Тан Ч. Оральная восприимчивость сингапурских Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus) к вирусу Зика. Турелл MJ, редактор. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6: e1792. pmid: 22953014
32. 31. Донг С., Кантор А.М., Лин Дж., Пассарелли А.Л., Клем Р.Дж., Франц AWE. Характер заражения и потенциал передачи вируса чикунгунья у двух адаптированных в лаборатории штаммов Aedes aegypti в Новом Свете.Издательская группа «Научная публика»; 2016; 6: 24729.
33. 32. Ли МИ, Вонг PSJ, Нг ЛК, Тан Ч. Оральная восприимчивость сингапурских Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus) к вирусу Зика. Турелл MJ, редактор. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6: e1792.
34. 33. Frentiu FD, Zakir T., Walker T., Popovici J, Pyke AT, van den Hurk A, et al. Ограниченная репликация вируса денге у собранных в полевых условиях комаров Aedes aegypti, инфицированных Wolbachia. Турелл MJ, редактор. PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8: e2688.pmid: 24587459
35. 34. Ричардсон Дж., Молина-Круз А., Салазар М. И., Блэк В. Количественный анализ РНК вируса денге-2 во время внешнего инкубационного периода у отдельных Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 2006; 74: 132–41. pmid: 16407358
36. 35. Фэй О, Фэй О, Диалло Д., Диалло М., Вайдманн М., Салл А. Количественное определение вируса Зика с помощью ПЦР в реальном времени и оценка с помощью пойманных в полевых условиях комаров. Virol J. 2013; 10: 311. pmid: 24148652

Профиль Майкла Снайдера | Стэнфордские профили

Текущие исследования и научные интересы

---

В настоящее время мы находимся в процессе омической революции, когда геномы и другие омы можно легко охарактеризовать.Наша лаборатория использует различные подходы к анализу геномов и регуляторных сетей. Наше исследование сосредоточено на дрожжах, идеальном модельном организме, идеально подходящем для генетического анализа, и на людях.

1) Транскриптомы
Для аннотирования геномов мы разработали секвенирование РНК для аннотации дрожжевых и человеческих транскриптомов. Мы обнаружили, что эукариотический транскриптом намного сложнее, чем считалось ранее, и что эмбриональные стволовые клетки имеют больше изоформ транскрипта, чем дифференцированные клетки.

2) Сети связывания факторов транскрипции
Мы также разработали способы картирования сайтов связывания факторов транскрипции через геном. Мы использовали это для разработки регуляторных карт и использовали это, чтобы помочь расшифровать комбинаторный регуляторный код — какие факторы работают вместе, чтобы регулировать какие гены. Используя этот подход, мы наметили пути, важные для метаболизма и воспаления.

3) Интегрированные регуляторные сети
В дополнение к сетям связывания транскрипционных факторов мы также картировали сети фосфорилирования и взаимодействия метаболитов с белками.Эти исследования выявили новые глобальные регуляторы и ключевые точки в интегрированных регуляторных сетях.

4) Вариация
Мы анализировали различия между людьми и видами на двух уровнях: вариации последовательности ДНК и вариации регуляторной информации. Мы разработали парное секвенирование концов для людей и обнаружили, что у людей есть обширные структурные вариации (SV), то есть делеции, вставки и инверсии. Вероятно, это основная причина фенотипической изменчивости и болезней человека.Кроме того, картируя различия сайтов связывания между разными штаммами дрожжей и людьми, мы обнаружили, что люди различаются гораздо больше по своей регуляторной информации, чем по различиям в кодирующих последовательностях. Мы можем соотнести эти различия с различиями в SNPS и SV, тем самым связав различия некодирующей ДНК с регуляторной информацией.

5) Болезни человека
Наконец, мы применяем омические подходы к секвенированию генома, транскриптомике, протеомике, метаболомике, метилированию ДНК и анализу микробиома для анализа болезней человека.Эти интегративные омические подходы применяются, чтобы помочь понять молекулярную основу болезни и разработать диагностику и терапию.

RBC_BC

% PDF-1.6 % 735 0 объект > эндобдж 732 0 объект > эндобдж 734 0 объект > поток Acrobat Distiller 7.0.5 (Windows) False2011-12-01T23: 07: 07-05: 002011-12-01T23: 14: 02-05: 002011-12-01T23: 14: 02-05: 00Adobe Illustrator CS5

1. 1JPEG256256 / 9j / 4AAQSkZJRgABAgEASABIAAD / 7QAsUGhvdG9zaG9wIDMuMAA4QklNA + 0AAAAAABAASAAAAAEA AQBIAAAAAQAB / + 4AE0Fkb2JlAGSAAAAAAQUAAgAD / 9sAhAAKBwcHBwcKBwcKDgkJCQ4RDAsLDBEU EBAQEBAUEQ8RERERDxERFxoaGhcRHyEhISEfKy0tLSsyMjIyMjIyMjIyAQsJCQ4MDh8XFx8rIx0j KzIrKysrMjIyMjIyMjIyMjIyMjIyMjI + Pj4 + PjJAQEBAQEBAQEBAQEBAQEBAQEBAQED / wAARCACj AQADAREAAhEBAxEB / 8QBogAAAAcBAQEBAQAAAAAAAAAABAUDAgYBAAcICQoLAQACAgMBAQEBAQAA AAAAAAABAAIDBAUGBwgJCgsQAAIBAwMCBAIGBwMEAgYCcwECAxEEAAUhEjFBUQYTYSJxgRQykaEH FbFCI8FS0eEzFmLwJHKC8SVDNFOSorJjc8I1RCeTo7M2F1RkdMPS4ggmgwkKGBmElEVGpLRW01Uo GvLj88TU5PRldYWVpbXF1eX1ZnaGlqa2xtbm9jdHV2d3h5ent8fX5 / c4SFhoeIiYqLjI2Oj4KTlJ WWl5iZmpucnZ6fkqOkpaanqKmqq6ytrq + hEAAgIBAgMFBQQFBgQIAwNtAQACEQMEIRIxQQVRE2Ei BnGBkTKhsfAUwdHhI0IVUmJy8TMkNEOCFpJTJaJjssIHc9I14kSDF1STCAkKGBkmNkUaJ2R0VTfy o7PDKCnT4 / OElKS0xNTk9GV1hZWltcXV5fVGVmZ2hpamtsbW5vZHV2d3h5ent8fX5 / c4SFhoeIiY qLjI2Oj4OUlZaXmJmam5ydnp + So6SlpqeoqaqrrK2ur6 / 9oADAMBAAIRAxEAPwCC2dnZtZwM0ETM 0SEkopJJUe2b7BgxnHEmI5Do6PPnyDJICR5nqrfUbL / lni / 4Bf6ZZ + XxfzR8mv8AMZf5x + bvqNl / yzxf8Av9Mfy + L + aPkv5jL / OPzd9Rsv8Alni / 4Bf6Y / l8X80fJfzGX + cfm76jZf8ALPF / wC / 0x / L4 v5o + S / mMv84 / N31Gy / 5Z4v8AgF / pj + XxfzR8l / MZf5x + bvqNl / yzxf8AAL / TH8vi / mj5L + Yy / wA4 / N31Gy / 5Z4v + AX ​​+ mP5fF / NHyX8xl / nH5u + o2X / LPF / wC / wBMfy + L + aPkv5jL / OPzd9Rsv + WeL / gF / pj + XxfzR8l / MZf5x + bvqNl / yzxf8Av9Mfy + L + aPkv5jL / OPzd9Rsv8Alni / 4Bf6Y / l8X80fJfzG X + cfm76jZf8ALPF / wC / 0x / L4v5o + S / mMv84 / N31Gy / 5Z4v8AgF / pj + XxfzR8l / MZf5x + bvqNl / yz xf8AAL / TH8vi / mj5L + Yy / wA4 / NsWFjX / AHmi6H9hfD5YnT4v5o + SY58l / Ufm42FjX / eaLoP2F8Pl iNPi / mj5LLPkv6j82vqNl / yzxf8AAL / TH8vi / mj5I / MZf5x + bvqNl / yzxf8AAL / TH8vi / mj5L + Yy / wA4 / N31Gy / 5Z4v + AX ​​+ mP5fF / NHyX8xl / nH5u + o2X / LPF / wC / wBMfy + L + aPkv5jL / OPzd9Rsv + We L / gF / pj + XxfzR8l / MZf5x + bvqNl / yzxf8Av9Mfy + L + aPkv5jL / OPzd9Rsv8Alni / 4Bf6Y / l8X80f JfzGX + cfm76jZf8ALPF / wC / 0x / L4v5o + S / mMv84 / N31Gy / 5Z4v8AgF / pj + XxfzR8l / MZf5x + bvqN l / yzxf8AAL / TH8vi / mj5L + Yy / wA4 / N31Gy / 5Z4v + AX ​​+ mP5fF / NHyX8xl / nH5u + o2X / LPF / wC / wBM fy + L + aPkv5jL / OPzd9Rsv + WeL / gF / pj + XxfzR8l / MZf5x + bvqNl / yzxf8Av9Mfy + L + aPkv5jL / OP zd9Rsv8Alni / 4Bf6Y / l8X80fJfzGX + cfm6x / 3it / + MSf8RGOn / uo + 4LqP72XvKvlrU7FXYq7FXYq 7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FV8KhpVU9CaH6cjkNRJbMERKYDc6hJnQdFNB8hgxSMoAp1ERHIQEVpM Mc9yyyxiVVQtwNd6FelMp1uU48dg026HHGeSiL2Tm50SI28E1pApectWMyBqAUGx + GtT0pXNXh7V l4kozO0etH9rsJ6GHCCBzSC / iEN00YT0 + KpVd9iUUt1983OGfHAG3VaiIjkIQ + WNTsVdirsVdirs VdirsVdirsVdirsVULH / AHit / wDjEn / ERlWn / uo + 4Nuo / vZe8q + WtTsVdirsVdirsVdirsVdirsV dirsVdirsVVLf ++ T5jIZvoLbpv70N3X + 9En + scGD + 7HuTqv72SM0NJpL30oCod1oOdeJ + JTvSpyr WxEse7boCfE27mVMl9b852ZY0jcmbixahRplPMBR1MRoQK7b165pToYyFc / x + P0U7YZSN2I6u4l1 CWRej8WG1OqKc3mkjwYYjudNrDeYlBZe47sVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVULH / eK3 / wCMSf8A ERlWn / uo + 4Nuo / vZe8q + WtTsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVVLf8Avk + YyGb6C3ab + 9Dd 1 / vRJ / rHBg / ux7l1X97JqGeW3fnCxRiKGnceBycoiQ3a4TlA2ER + ldQqG9Y1G42XYnw2yHgQ7mz8 1l70NLNLM3OZ2kYCgLGu3hkxEDk1SmZHdZhQ7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FVCx / 3it / + MSf8 RGVaf + 6j7g26j + 9l7yr5a1OxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxVUt / 79PmMhm + gt2m / vQ3df 70S / 6xwYP7se5dV / eyUssaXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FVCx / wB4rf8A4xJ / xEZV p / 7qPuDbqP72XvKvlrU7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FVS3 / vk + YyGb6C3ab + 9Dd1 / vRJ / rHBg / ux7l1X97JSyxpdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVULH / eK3 / 4xJ / xEZVp / 7qPu DbqP72XvKvlrU7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FVS3 / vk + YyGb6C26b + 9Dd1 / vRJ / rHBg / ux7k6r + 9kpZY0uxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KqFj / ALxW / wDxiT / iIyrT / wB1h4Bt 1H97L3lXy1qdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdira9foP6sSyhzc3X6B + rELPm1ixdirsVdi rsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVULH / AHit / wDjEn / ERlWn / uo + 4Nuo / vZe8q + WtTsVdirsVdir sVbAJNAKn2xUC22RkNHBUkVocQQUyiY81uKHYq7FXYq7FXYq2vX6D + rEsoc0Hcah6UrR + ny4035U 7D2yiWfhNU3jT8QBtT / Sn / FX / Df824PzPkn8p5u / Sn / FX / Df824 / mfJfynm79Kf8Vf8ADf8ANuP5 nyX8p5u / Sn / FX / Df824 / mfJfynm79Kf8Vf8ADf8ANuP5nyX8p5u / Sn / FX / Df824 / mfJfynm79Kf8 Vf8ADf8ANuP5nyX8p5u / Sn / FX / Df824 / mfJfynm79Kf8Vf8ADf8ANuP5nyX8p5u / Sn / FX / Df824 / mfJfynm79Kf8Vf8ADf8ANuP5nyX8p5u / Sn / FX / Df824 / mfJfynm79Kf8Vf8ADf8ANuP5nyX8p5u / Sn / FX / Df824 / mfJfynm79Kf8Vf8ADf8ANuP5nyX8p5oix / 3it / 8AjEn / ABEZPT / 3UfcGrUf3sveV fLWp2KuxV2KuxVkflHTrHUJJ47tlkYKOMJG / X7YP4ZzvtP2ln0cInHtvuf0O57F0mLNxcW / kyCx8 tW1lqs94VBiZaRRncKTSuc9rPaXNqNHHGNp / xF2mDsvHizmY5dAkXmy1ln1JUs7aqxpV5I13Y / 5R 9hm99ltSI6Y8c + u1l1 / beCU8g4YsaZWRirgqw6g7HOmBBGzo5RMTRaxQ7FXYq7FXYq2vX6D + rEso c0nvv96n + j9QzCy / UXPx / QEz8n2NlqOvwWmooklsYrmR1lZ0SsVvNKpdoSh5hkBNMpykiOzbjAMt 2R3PkOxvdYe3tbpNNhZkiFFaWASJbLd3EgklkVxBwqY3avL5b5WMxEWw4QSgofy8vG1VNHuLkQ3J QvN8C8YQbg2sPNnlT + 8PxADehFA1cJzjhtAwm6U7Xy / p41 / yzp88XqRajHG14vJgHY3NzA1CCCvw xDphMzwyPcogOIBGS + RY9V1v6ppjLZ2z21tMJAWe39W4BHGNrh55eBdGCggvsdjTB43DHdJxWdlP TPI9tI1rLcXQmWeEPLCymIRtPp89 / bn1eZqFMPxbD8dmWY / j30iOIbIG08m / WtWvNM + uFFs54bQS + iSXnuG9OMiP1ARFyG7 / AMtDTemSOWo3SBiskItPLmjyX3lzS6uJb + CS4vnWoMjK86rFE3qOtWMB RfgHY1NaCPiSqRTwCwEJb + W312zv9XtoF0mGyikdICWZZGt4zNIqtPMZC3Eb8Q1O9Bkjk4SBzRwc QJ5Ipfy / eRrYR3vNZRW4b0lQQD0LW5DFpJkUjjdqKlhvtkfH8k + D5rl8jrBp2p / WJDcX8Uot7RIF LLyS + isHYnkPiYseKcelDj41kd37F8LYpJ5k8vyeXbuC2edbgXEC3CsnHaryRFT6byrUNEejHJ45 8YYThwlKMmxdirsVTex / 3it / + MSf8RGZen / uo + 4OBqP72XvKvlrU7FXYq7FXYqyLyxeaTaT + rLI1 tcgcQ7kcHU0qvzzm / abT6vNiEYgSh9rvOxcunhLnUmYLrmnzXP1KKQSTBTIygj4VHjv45xc + zc + P HxyFB3vixMqB3SrzFrS6YiNbj1JZSQOvHbrvmy7E7JlrZkHYBo12uGlhfVgXidzXckmp + k56LGPC KePnLikS7CxdirsVdirsVbXr9B / ViWUOaT33 + 9T / AEfqGYWX6i5 + P6Ai9Cs57y9ZLe5e0kSJz6sd eXFqRMvwsuzK5B9sozZOCN03YocR5p + NC1II0R1edonRIXiPPg8Uf2I2Am3Udh3zH / ND + a3eAe9W uNL1ae + k1FdVkgnmQQsYFaP90qrGsfwzV48VA3PzwDUiq4UnCSbtDDy7frLDMurTCW2JaBwG5Rks XJQ + rVfiNdu + H80P5qPy571X9Dax9Ylu / wBN3P1icBZZqvzcAggO / rVIBA64 / mY19K + Af5y0aHqo FBrNwBQLQc + ixtAo / vu0blB / kkjpj + aH81fAPe0mg6nHKZo9YnWUxC3LrzDGIAIIqiavDiKcemP5 ofzV8A96S63Y3Gmvao929xwQrCWqPSVWLBU + NqDkxO3fL8OUZL2asuMwrdDPrWsyCQSahcuJwBKG mkPMAMoD1bfZiN / HLOCPcw45d7S6xq6MGW / uVZa8SJnBFUWE0 + L / Ah3ir / qgDpjwR7l4j3rDqepG N4TdzmOV / VkQyPxZ6hubDlQtVRvjwheIrLu9vL + T1r64lupOnOZ2kbclurknqcQAOSCSVotrgtGo iesxAjFD8RPTj49cTIDqvCV93ZXVhN6F5E0MlA3FhTYiuRxZYZY3E2GU8coGiFDJsU3sf94rf / jE n / ERmXp / 7qPuDgaj + 9l7yr5a1OxV2KuxV2KuxUGl0ZeMO0TcGINWBoxDAod / 9llGXBjnQI2 / BcnF nnEEg7tvcXUqhJZ5JFFKKzErt7dMGHRYcMrjEAoy6zLlFSOyzMhx3Yq7FXYq7FXYq2vX6D + rEsoc 0pvY5DcuQpI23A9hmHkieIudjkBEbqcYuYjyi5oSKVWoNPoyBgT0ZDIB1X + vqH + / Jv8AgmweF5Mv G83evqH + / Jv + CbHwvJfG83evqH + / Jv8Agmx8LyXxvN3r6h / vyb / gmx8LyXxvN3r6h / vyb / gmx8Ly XxvN3r6h / vyb / gmx8LyXxvNZJ9aloZfUkp05VNPvwjGRyCDkB6rPSl / kb7jh5T3I4497vSl / kb7j jwnuXjj3u9KX + RvuOPCe5eOPe2sMrMFCGpNN9h9JODhI6Lxx73selWlnLpmnteRwia0CtGVIKB6U BU1zgO0dTmhqcggZcMudvR4ccTjjYGzGvP2m2bsdSuJ39cIEggUD4qHfr865t / ZvU5DEY4w26ycT tLFCuMy9wYB6Uv8AI33HOp4T3On4496a2P8AvFb / APGJP + IjMnT / AN1h4BwtR / ey95V8tanYq7FX Yq7FXYq2CR02rscaUEhrFXYq7FXYq7FXYq7FW16 / Qf1YllDm5uv0D9WIWfNrFi7FXYq7FXYq7FXY q7FXYq7FXYq7FURBd3EJUJKyhDyQV2DDocx82kxZLJjbk4NVlhQEtnXd9dX / AAa6f1GStGI3365H SaDDpb4BVrqdbkzj1IfMpxlCx / 3it / 8AjEn / ABEZVp / 7qPuDbqP72XvKvlrU7FXYq7FXYq7FXYq7 FXYq7FXYq7FXYq7FW16 / Qf1YllDm5uv0D9WIWfNrFi7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXY qoWP + 8Vv / wAYk ​​/ 4iMq0 / 91h4Bt1H97L3lXy1qdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdira9foP6 sSyhzc3X6B + rELPm1ixdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVULH / eK3 / 4xJ / xEZVp / 7qPu DbqP72XvKvlrU7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FW16 / Qf1YllDm5uv0D9WIWfNrFi7FXYq 7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYqoWP + 8Vv / xiT / iIyrT / AN1h4Bt1H97L3lXy1qdirsVdirsV dirsVdirsVdirsVdirsVdira9foP6sSyhzc3X6B + rELPm1ixdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdir sVdirsVWaTBJc2tvHFu3oof + FXMaGaOLBEnuDkywyy5pAd5 + 9MP0Tefyj8f6ZH + UMTP + Tsvk79E3 n8o / H + mP8oYl / k7L5O / RV3 / KPx / pj / KGJf5Oy + Tv0TeeA / H + mP8AKGJf5Oy + Tv0Vd + A / H + mP8oYl / k7L5O / RN5 / KPx / pj / KGJf5Oy + Tv0VdjsPx / pj / KGJf5Oy + Tv0Tefyj8f6Y / yhiX + Tsvkg2UoxQ9 VJB + jMqMhIW4komJIawodirsVdirsVbXr9B / ViWUObm6 / QP1YhZ82sWLsVdirsVdirsVdirsVdir sVdirsVdirsVdiq / QRyhtxUj9wnQqP2V / nBGYWQ1p4 / D7vJz8IJ1Et + / 7059M / zt / wAHF / zRmJxj u + yX63N8M / zj / sf1O9M / zt / wcX / NGPGO77JfrXwz / OP + x / U70z / O3 / Bxf80Y8Y7vsl + tfDP84 / 7H 9SyS2WSnN326UkjH6kGThnMOQHyP62E9Px85H5j9S36jF / NJ / wAjk / 5pyX5uXcP9KWP5SP8AOl83 fUYv5pP + Ryf804 / m5dw / 0pX8pH + dL5u + oRfzP / yOT / mnH83LuH + lKPyce + XzWtaW6fakZa + MyD / j XJDUZJcgP9KUS0 + OPOR / 0wW6GiNrUKfA6hpKeoglU0RyKoSob5VzI1MiMBPI04mmiPzAHMbs4spd LTSZHGmW4ubq4aGJZ7Vn9LhHEoP7r124v9qpZaE5pvHyfzj83ceFDuCWatJp48tTWa2lsLlFSaO5 jt5Yn4eqqFS80QqeRP7VadqZkaLLOWYAkuPrMcRhOzH7eLTmtB6hRR6fNnJBcvUAoF41961 + g5fl nqRn25NOLHpzg3rkp6XBpssbG9ZVYMB8T8fh5R1pRq1oW7ZnZZTB2cTTwxmPqQiJbPLIQ37sE + mG + AkE7GnNqbdqnJEyAa4RgSVFgokYIar8XH5b5LoxFcRrzWt1 + gfqwhE + bWLF2KuxV2KuxV2KuxV2 KuxV2KuxV2KuxV2KuxVZpcphtLdwob9ygo1afZH8pGY + PGJ4YjyDkSynHmkR3lHfpB / 99J97 / wDV TB + THefs / Uz / AD0 + 4fb + t36Qf / fSfe // AFUx / JjvP2fqX89Puh3 / rd9ff / fSfe // ADXj + Uj3n7P1 L + en3D7f1u / SD / 76T73 / AOqmP5Md5 + z9S / np9w + 39bv0g / 8AvpPvf / qpj + THefs / Uv56fcPt / W79 IP8A76T73 / 6qY / kx3n7P1L + en3D7f1u / SD / 76T73 / wCqmP5Md5 + z9S / np9w + 39a1rzn9qCJqePM / 8b5Iabh5SP2fqYy1ZlziPt / WhyasWHw1NaDtl4FBxybNu5N4nGgvEXciepONLZaxQ7FXYq2vX6D + rEsoc3N1 + gfqxCz5tYsXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FVCx / 3it / 8AjEn / ABEZVp / 7 qPuDbqP72XvKvlrU7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FW16 / Qf1YllDm5uv0D9WIWfNrFi7F XYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq // Z
2. 196256JPEG / 9j / 4AAQSkZJRgABAgEASABIAAD / 7QAsUGhvdG9zaG9wIDMuMAA4QklNA + 0AAAAAABAASAAAAAEA AQBIAAAAAQAB / + 4ADkFkb2JlAGTAAAAAAf / bAIQABgQEBAUEBgUFBgkGBQYJCwgGBggLDAoKCwoK DBAMDAwMDAwQDA4PEA8ODBMTFBQTExwbGxscHx8fHx8fHx8fHwEHBwcNDA0YEBAYGhURFRofHx8f Hx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8f / 8AAEQgBAADEAwER AAIRAQMRAf / EAaIAAAHAQEBAQEAAAAAAAAAAAQFAwIGAQAHCAkKCwEAAgIDAQEBAQEAAAAAAAAA AQACAwQFBgcICQoLEAACAQMDAgQCBgcDBAIGAnMBAgMRBAAFIRIxQVEGE2EicYEUMpGhBxWxQiPB UtHhMxZi8CRygvElQzRTkqKyY3PCNUQnk6OzNhdUZHTD0uIIJoMJChgZhJRFRqS0VtNVKBry4 / PE 1OT0ZXWFlaW1xdXl9WZ2hpamtsbW5vY3R1dnd4eXp7fh2 + f3OEhYaHiImKi4yNjo + Ck5SVlpeYmZ qbnJ2en5KjpKWmp6ipqqusra6voRAAICAQIDBQUEBQYECAMDbQEAAhEDBCESMUEFURNhIgZxgZEy obHwFMHR4SNCFVJicvEzJDRDghaSUyWiY7LCB3PSNeJEgxdUkwgJChgZJjZFGidkdFU38qOzwygp 0 + PzhJSktMTU5PRldYWVpbXF1eX1RlZmdoaWprbG1ub2R1dnd4eXp7fh2 + f3OEhYaHiImKi4yNjo + DlJWWl5iZmpucnZ6fkqOkpaanqKmqq6ytrq + v / aAAwDAQACEQMRAD8A5vnfvBuxV2KuxV2KuxV2 KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV7N / 67P8A9Hv / AGN5pP8Akd8P0O7 / AOQP x / 3zxnN26R2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KvZv8A12f / AKPf + xvNJ / yO + H6Hd / 8AIh5 / 754zm7dI7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXY q7FXYq7FXYq7FXs3 / rs // R7 / ANjeaT / kd8P0O7 / 5A / H / AHzxnN26R2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2Ku xV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KvZv / XZ / wDo9 / 7G80n / ACO + H6Hd / wDIh5 / 754zm7dI7 FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXs3 / AK7P / wBHv / Y3mk / 5 HfD9Du / + QPx / 3zxnN26R2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2 KvZv / XZ / + j3 / ALG80n / I74fod3 / yB + P ++ eM5u3SOxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2Kux V2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV7N / 67P / ANHv / Y3mk / 5HfD9Du / 8AkD8f988ZzdukdirsVdirsVdirsVd irsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdir2b / wBdn / 6Pf + xvNJ / yO + H6Hd / 8gfj / AL54 zm7dI7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXs3 / rs / wD0e / 8A Y3mk / wCR3w / Q7v8A5A / H / fPGc3bpHYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq 7FXYq7FXYq9m / wDXZ / 8Ao9 / 7G80n / I74fod3 / wAgfj / vnjObt0jsVdirsVdirsVdirsVdirsVdir sVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVezf + uz / 9Hv8A2N5pP + R3w / Q7v / kD8f8AfPGc3bpHYq7F XYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq9m / 9dn / AOj3 / sbzSf8AI74f od3 / AMgfj / vnjObt0jsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVe zf8Ars // AEe / 9jeaT / kd8P0O7 / 5A / H / fPGc3bpHYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq 7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq9m / 9dn / 6Pf8AsbzSf8jvh + h4f / Ih5 / 754zm7dI7FXYq7FXYq7FXYq7FX Yq7FUfo + h6lrNw9tpsYnuUX1DDyCMUBCswL8UopZR9qu + wO9NZ2l2tg0MRPOeGBNXRO / OtrPK + фунт e5zNHoMupJGMXIb1y2 + Ozd5oGr2eqx6VcW5S / lMaxRVWjNKQFCvXgfiPGtaVqO2Om7Y02fTnUQne KN2d9uHnY58t + XKj1Tm7PzY8oxSjU5VXnfLfkzC + / KTUrTS5Zo7iO7vgqn0h + 7jUDd + DsaMewLcR Sv0cVpP + CHhzaiMZQljxb7 / VIn + G4gbf5vEbrpd9Hl9lJQwkiQlk225Ad + 97 / GhzefjcZ6O8e7Cr sVdirsVdirsVdirsVdirsVezf + uz / wDR7 / 2N5pP + R3w / Q7v / AJA / H / fPGc3bpHYq7FXYq7FXYq7F XYq7FXYq9J / J7UbAXN5pzW3C7kjEpukdwXiRuPAgmisGlFCpFa + I38r / AOCRpc3Djzcd4ga4a5SO 9 + YqPW69x27f2Rz4 / Xj4ayVd94 / RV9Ofw36LqWh3F3qNpeyI8k1lzSEKWqpnCq7AdCAre4H0beZ6 XtLLiwzxRNRyVxct + GyPt932vWTwwlOMyPVC68r2QvmhLq78vX9tZATm9t5UjAfkhEsZjTgdhQij eHzzI7FljxavHkybCE4k7b + mVm / u / Uw1UJZMM4x5yiR8w8b1nyPrmkaWNSuhE0I4erHG / J4 + dAOQ oB1YD4Sfuz3Hs72t0erz + Bj4 + LerG0qvl8BfqA + b51q / Z / UYMXiy4eHrvy / B7rY / nTOkdhV2KuxV 2KuxV2KuxV2KuxV7N / 67P / 0e / wDY3mk / 5HfD9Du / + QPx / wB88ZzdukdirsVdirsVdirsVdirsVdg V6H + X2seUYYVSZBpmrxGMNdGWv1leQ5cWdkVfi + 1EBuOnI9PLvbTQdoylxX42mN1ED6DXUAEnyn0 N3wjn3Hs3qtIBwgCGbvJ + r3f8T9 / Sd3HmrRbWa2pOGvL5FtYY7Z1fm3qBYvR5gKxRpqnZV4klj8I GecR7JzzjL0ngxniNg7berirldeZsbDcvVZMsQRuLly35 + 7vTSe6hCvG4SN19RYhUqzcWK8lBVD3 G / ie4oxw8eKRIIs3V / t3 + z9OwsiXiXnPzTearcPp7IFtLOc8GdeMhaNTH9kcVUAs1Phr8ume4eyn s7HSxGoJ9c48huKlR59TsOte / m8F7Q9s + OThiPTGXPrY2Y1navLOxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV7N / wCuz / 8AR7 / 2N5pP + R3w / Q7v / kD8f988ZzdukdirsVdirsVdirsVdirsVdiriK4FbleSUqZZWPBQ qMSTxValUX + VR2A2GYw02OESIxFSNnbme8958 + bk / mckpAmRsCh5eQ8uidjzt5m9WWVrvnJLxNXU MEZV4lo0PwJy6sAtK9s54 + xuhqI4SBG + R5736jzNcgbuuZLth7S6rfcHi8uW1be / n3Wk00808zzT MHlkJZ3CqlSepogVfuGdJp8EcMBCP0xFDrt8XS580sszOX1Hmsy9qdirsVdirsVdirsVdirsVdir 2b / 12f8A6Pf + xvNJ / wAjvh + h4f8AyB + P ++ eM5u3SOxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KtMvJSPHITgJ RMTyLKEzGQkOYbNK7dO1dz / DJC63QavZ2FDsVdirsVdirsVdirsVdirsVdir2b / 12f8A6Pf + xvNJ / wAjvh + h4f8AyB + P ++ eM5u3SOxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2Kux V2KuxV7N / wCuz / 8AR7 / 2N5pP + R3w / Q7v / kD8f988ZzdukdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVd irsVdirsVdirsVdirsVdirsVdir2b / 12f / o9 / wCxvNJ / yO + H6Hd / 8gfj / vnjObt0jsVdirsVdirs VdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVdirsVezf + uz / wDR7 / 2N5pP + R3w / Q7v / AJA / H / fPGc3bpHYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq9m / 8AXZ / + j3 / sbzSf8jvh + h4f / Ih5 / wC + eM5u3SOxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2Ku xV2KuxV2KuxV7N / 67P8A9Hv / AGN5pP8Akd8P0O7 / AOQPx / 3zxnN26R2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2K uxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KvZv8A12f / AKPf + xvNJ / yO + H6Hd / 8AIh5 / 754zm7dI 7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXs3 / rs // R7 / ANjeaT / k d8P0O7 / 5A / H / AHzxnN26R2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV 2KvZv / XZ / wDo9 / 7G80n / ACO + H6Hd / wDIh5 / 754zm7dI7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FX Yq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXs3 / AK7P / wBHv / Y3mk / 5HfD9Du / + QPx / 3zxnN26R2Kq1pdT2l1Dd QECeB1liLKrgMhqCVcMrbjoRTIyiCKKYyMSCOYT28 / MDzTdqUluIhEW9QRLbwBVfiqllHD4T8A6d O1Mx46TGOn2lypa / Kev2BQtvOmv2ps2tmtYXsH9W0kjsrNXRyKcuYh5Mf9Ynt4DJS00Dd3v5n9bC OrmKqtv6Mf1Kk3nzzNLbm2aa3S3aT1mhisrOJDIVdS5WOFRyKysK / wBmAaXGDe9 + 8 / rZfnMlVY + Q / Uh5 / NmtzzCWV4GdYjbr / otsAIiSeAUR8QvxHYDJDTwHf8z + tidVM93KuQ5fJJ8ucd2FXYq7FXYq 7FXYq7FXYq7FXYq7FU30LzZr + grKulXQtxM8cslY4pKvDyEZ / eK9Kc2ynLp4ZPqFt2HUzx / SatN1 / NTzqkbpFdxRGQsZHS3gqxkr6mxQqOfLeg + VN60 / kMXd9pcj + Uc1c / sDGdRvp7 + / uL2fj61zI0sn AcV5OamgzJhERAA6OHkmZyMj1Q + TYuxV7N / 67P8A9Hv / AGN5pP8Akd8P0O7 / AOQPx / 3zxnN26R2K uxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KvZv8A12f / AKPf + xvNJ / yO + H6Hd / 8AIh5 / 754zm7dI7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7FXYq7 FXs3 / RS // R7 / ANjeaT / kd8P0O7 / 5A / H / AHzxnN26R2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV 2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KvZv / XZ / wDo9 / 7G80n / ACO + H6Hd / wDIh5 / 75 // Z
uuid: 2995630d-515f-455a-a55c-8250432adf7dxmp.сделал: 1202C860DC16E111A3D5F1AB12FE8A46defaultadobe: DocId: INDD: 05dc3642-fa3d-11df-a057-8df29abuuid: 71c81e8a-6187-404e-a84d-c965217efca8xmp.did: 243F69DBB216E1118C9396A0A3B189D9adobe: DocId: INDD: 05dc3642-fa3d-11df-a057-8df29abdefault
3. savedxmp.iid: 5B1B341D242068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T13: 50: 43-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
4. savedxmp.iid: 5C1B341D242068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T13: 50: 43-04: 00 Adobe InDesign 7.0 / метаданные
5. сохраненныйxmp.iid: 9350D7AA242068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T13: 54: 41-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
6. savedxmp.iid: 9650D7AA242068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T13: 59: 32-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
7. savedxmp.iid: 68207C8D252068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 01: 01-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
8. savedxmp.iid: 6B207C8D252068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 03: 01-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
9. сохраненныйxmp.iid: 70207C8D252068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 10: 39-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
10. savedxmp.iid: 22DE3F07272068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 11: 35-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
11. savedxmp.iid: 29DE3F07272068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 22: 31-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
12. savedxmp.iid: ED819A9E282068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 22: 59-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
13. сохраненныйxmp.iid: 0F45EA282118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 26: 51-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
14. savedxmp.iid: 1045EA282118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 28: 12-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
15. savedxmp.iid: 72093B172B2068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 40: 40-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
16. savedxmp.iid: 7B093B172B2068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 52: 21-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
17. сохраненныйxmp.iid: 2BE2E9E02C2068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 53: 28-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
18. savedxmp.iid: 2CE2E9E02C2068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T14: 54: 20-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
19. savedxmp.iid: F28B09302E2068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T15: 02: 50-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
20. savedxmp.iid: F38B09302E2068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T15: 04: 55-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
21. сохраненныйxmp.iid: F48B09302E2068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T15: 05: 36-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
22. savedxmp.iid: E3655F2E312068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T15: 24: 16-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
23. savedxmp.iid: E4655F2E312068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T15: 25: 14-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
24. savedxmp.iid: E5655F2E312068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T15: 26: 37-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
25. сохраненныйxmp.iid: 4472A7BC332068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T15: 42: 33-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
26. savedxmp.iid: 4D72A7BC332068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T15: 44: 52-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
27. savedxmp.iid: 456E6332342068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T15: 45: 51-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
28. savedxmp.iid: 215D2F35352068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T15: 53: 05-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
29. сохраненныйxmp.iid: 6EB525493D2068118C14A7D91AD6B1072011-08-30T16: 50: 55-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
30. savedxmp.iid: 90A22174072068118C14F0FB478C4E5-08-31T09: 43: 03-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
31. savedxmp.iid: CF5BB3CA072068118C14F0FB478C4E5-08-31T09: 45: 28-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
32. savedxmp.iid: FE7A52BE082068118C14F0FB478C4E5-08-31T09: 52: 17-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
33. сохраненныйxmp.iid: CE893DFD082068118C14F0FB478C4E5-08-31T09: 54: 03-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
34. savedxmp.iid: 314C3B0B0A2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 01: 36-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
35. savedxmp.iid: 324C3B0B0A2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 02: 32-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
36. savedxmp.iid: 32CC9C3C0A2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 02: 58-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
37. сохраненныйxmp.iid: 33CC9C3C0A2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 05: 05-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
38. savedxmp.iid: 3203DD0A0B2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 08: 44-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
39. savedxmp.iid: 112461440B2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 10: 21-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
40. savedxmp.iid: 122461440B2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 12: 04-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
41. сохраненныйxmp.iid: EB6D7F690D2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 25: 42-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
42. savedxmp.iid: 7895B8A20D2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 27: 18-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
43. savedxmp.iid: 7F4C94E00D2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 29: 02-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
44. savedxmp.iid: B831FC770E2068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 33: 16-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
45. сохраненныйxmp.iid: C6DD61B6102068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 49: 20-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
46. savedxmp.iid: 685C2BDC102068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 50: 23-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
47. savedxmp.iid: CD32FB5
    68118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 53: 54-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
48. savedxmp.iid: 9E056376112068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 54: 42-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
49. сохраненныйxmp.iid: 9F056376112068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 57: 08-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
50. savedxmp.iid: C7D9B4FB112068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 58: 25-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
51. savedxmp.iid: C8D9B4FB112068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 58: 43-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
52. savedxmp.iid: C9D9B4FB112068118C14F0FB478C4E5-08-31T10: 59: 34-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
53. сохраненныйxmp.iid: ADD58876122068118C14F0FB478C4E5-08-31T11: 01: 52-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
54. savedxmp.iid: 1A76F1E4142068118C14F0FB478C4E5-08-31T11: 19: 16-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
55. savedxmp.iid: D76547D
    68118C14F0FB478C4E5-08-31T11: 26: 06-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
56. savedxmp.iid: A0C1BCF0152068118C14F0FB478C4E5-08-31T11: 26: 45-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
57. сохраненныйxmp.iid: A1C1BCF0152068118C14F0FB478C4E5-08-31T11: 27: 05-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
58. savedxmp.iid: B25ABAE31A2068118C14F0FB478C4E5-08-31T12: 09: 52-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
59. savedxmp.iid: B35ABAE31A2068118C14F0FB478C4E5-08-31T12: 11: 46-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
60. savedxmp.iid: 2837E4731B2068118C14F0FB478C4E5-08-31T12: 13: 54-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
61. сохраненныйxmp.iid: BB4172DF0B2068118C14F516CB1BEFB32011-09-01T09: 45: 32-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
62. savedxmp.iid: 307B23FA0C2068118C14F516CB1BEFB32011-09-01T09: 53: 26-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
63. savedxmp.iid: ACE48E190D2068118C14F516CB1BEFB32011-09-01T09: 54: 19-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
64. savedxmp.iid: ADE48E190D2068118C14F516CB1BEFB32011-09-01T09: 55: 22-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
65. сохраненныйxmp.iid: AEE48E190D2068118C14F516CB1BEFB32011-09-01T09: 55: 50-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
66. savedxmp.iid: 5B970A940A2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 19: 39-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

67. savedxmp.iid: 42851F710C2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 32: 59-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

68. savedxmp.iid: 4E8E5FC90C2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 35: 28-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

69. сохраненныйxmp.iid: 757897440D2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 38: 54-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

70. savedxmp.iid: 767897440D2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 39: 40-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

71. savedxmp.iid: 946134C10D2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 42: 23-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

72. savedxmp.iid: 31FC5EFC0D2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 44: 03-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

73. сохраненныйxmp.iid: A9F330570E2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 46: 35-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

74. savedxmp.iid: 5C6EE55D0E2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 46: 46-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

75. savedxmp.iid: 340E22770E2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 47: 29-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

76. savedxmp.iid: 0F3145850E2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 47: 52-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

77. сохраненныйxmp.iid: 09DC07F10E2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 50: 53-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

78. savedxmp.iid: 0ADC07F10E2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T10: 56: 32-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

79. savedxmp.iid: F803F3A2102068118C14A7B04284D4

    1-09-23T11: 03: 01-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

80. savedxmp.iid: C675D8D2102068118C14A7B04284D4

    1-09-23T11: 04: 21-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

81. сохраненныйxmp.iid: 965944F4102068118C14A7B04284D4

    1-09-23T11: 05: 17-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

82. savedxmp.iid: 975944F4102068118C14A7B04284D4

    1-09-23T11: 06: 30-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

83. savedxmp.iid: 985944F4102068118C14A7B04284D4

    1-09-23T11: 06: 58-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

84. savedxmp.iid: BBEC9703122068118C14A7B04284D4

    1-09-23T11: 12: 53-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

85. сохраненныйxmp.iid: BB50A11C1B2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T13: 42: 30-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

86. savedxmp.iid: BC50A11C1B2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T13: 48: 40-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

87. savedxmp.iid: F1EA1C0E1C2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T13: 49: 15-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

88. savedxmp.iid: 2E66A1ED1D2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T14: 02: 39-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

89. сохраненныйxmp.iid: 248D8D031E2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T14: 03: 16-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

90. savedxmp.iid: AB041F631F2068118C14A7B04284D4

    1-09-23T14: 13: 06-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

91. savedxmp.iid: 99D1A2F68118C14A7B04284D4

    1-09-23T14: 24: 28-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

92. savedxmp.iid: A54A3E28212068118C14A7B04284D4

    1-09-23T14: 25: 46-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

93. сохраненныйxmp.iid: EA66E344212068118C14A7B04284D4

    1-09-23T14: 26: 34-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

94. savedxmp.iid: EB66E344212068118C14A7B04284D4

    1-09-23T14: 27: 27-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

95. savedxmp.iid: 90B2330A222068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T12: 38: 38-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
96. savedxmp.iid: 91B2330A222068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T12: 41: 51-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
97. сохраненныйxmp.iid: BC773C
98. 068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T12: 42: 28-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
99. savedxmp.iid: 6366F72D262068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T14: 30: 30-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
100. savedxmp.iid: DE1
     262068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T14: 30: 37-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
101. savedxmp.iid: DF1
     262068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T14: 31: 25-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
102. сохраненныйxmp.iid: E01
     262068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T14: 32: 51-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
103. savedxmp.iid: E11
     262068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T14: 40: 18-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
104. savedxmp.iid: 240262492118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T14: 52: 44-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
105. savedxmp.iid: ABCCD1FA2118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T14: 57: 42-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
106. сохраненныйxmp.iid: 15AA239C2A2068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T15: 02: 13-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
107. savedxmp.iid: 02C33435352068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T16: 27: 43-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
108. savedxmp.iid: AFFC7F44352068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T16: 28: 09-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
109. savedxmp.iid: B0FC7F44352068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T16: 33: 11-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
110. сохраненныйxmp.iid: C7C3F5FE352068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T16: 33: 22-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
111. savedxmp.iid: C8C3F5FE352068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T16: 34: 46-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
112. savedxmp.iid: 9038D34E362068118C14CCF623EBC7DA2011-09-26T16: 35: 36-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
113. savedxmp.iid: 6E44EE83082068118C14ECCBCA07
     011-09-27T09: 51: 17-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
114. сохраненныйxmp.iid: 6F44EE83082068118C14ECCBCA07
     011-09-27T09: 52: 15-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
115. savedxmp.iid: 7044EE83082068118C14ECCBCA07
     011-09-27T09: 53: 29-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
116. savedxmp.iid: 7144EE83082068118C14ECCBCA07
     011-09-27T09: 53: 59-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
117. savedxmp.iid: 7244EE83082068118C14ECCBCA07
     011-09-27T09: 54: 40-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
118. сохраненныйxmp.iid: 7344EE83082068118C14ECCBCA07
     011-09-27T09: 55: 54-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
119. savedxmp.iid: 685D16B10118C14ECCBCA07
     011-09-27T09: 59: 42-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
120. savedxmp.iid: 1A9D546
     68118C14ECCBCA07
     011-09-27T10: 47: 48-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
121. savedxmp.iid: DA8F9782102068118C14ECCBCA07
     011-09-27T10: 48: 30-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
122. сохраненныйxmp.iid: A988AAFD102068118C14ECCBCA07
     011-09-27T10: 51: 57-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
123. savedxmp.iid: 5C4FC42
     68118C14ECCBCA07
     011-09-27T10: 53: 11-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
124. savedxmp.iid: 77F12ED5112068118C14ECCBCA07
     011-09-27T10: 57: 58-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
125. savedxmp.iid: 7D5D1C80122068118C14ECCBCA07
     011-09-27T11: 02: 45-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
126. сохраненныйxmp.iid: 70DB5783122068118C14ECCBCA07
     011-09-27T11: 02: 51-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
127. savedxmp.iid: 9359C80F162068118C14ECCBCA07
     011-09-27T11: 28: 15-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
128. savedxmp.iid: 08F9A2568118C14ECCBCA07
     011-09-27T11: 44: 38-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
129. savedxmp.iid: 8AAB97CE232068118C14ECCBCA07
     011-09-27T13: 26: 05-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
130. сохраненныйxmp.iid: 8BAB97CE232068118C14ECCBCA07
     011-09-27T13: 36: 44-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
131. savedxmp.iid: 8CAB97CE232068118C14ECCBCA07
     011-09-27T13: 38: 11-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
132. savedxmp.iid: BC55519C322068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 12: 03-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
133. savedxmp.iid: 9260B4FD322068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 14: 46-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
134. сохраненныйxmp.iid: BEE6C147332068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 16: 51-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
135. savedxmp.iid: BFE6C147332068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 20: 35-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
136. savedxmp.iid: AEAC761E342068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 22: 51-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
137. savedxmp.iid: AFAC761E342068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 23: 55-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
138. сохраненныйxmp.iid: 8F148C8
139. 68118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 25: 50-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
140. savedxmp.iid: 2A99499D342068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 26: 24-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
141. savedxmp.iid: 2B99499D342068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 27: 57-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
142. savedxmp.iid: 4534A120362068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 37: 13-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
143. сохраненныйxmp.iid: 09D20D2F362068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 37: 38-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
144. savedxmp.iid: 0AD20D2F362068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 38: 02-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
145. savedxmp.iid: 0BD20D2F362068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 39: 48-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
146. savedxmp.iid: 0CD20D2F362068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 40: 22-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
147. сохраненныйxmp.iid: B915B2AE362068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 41: 12-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
148. savedxmp.iid: BA15B2AE362068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 42: 11-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
149. savedxmp.iid: AC6E1DF3362068118C14ECCBCA07
     011-09-27T15: 43: 07-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
150. savedxmp.iid: 09801174072068118C14C83F2A4638D02011-09-30T14: 34: 01-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
151. сохраненныйxmp.iid: 2BFD1777072068118C14C83F2A4638D02011-09-30T14: 34: 06-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
152. savedxmp.iid: A16ED4C6072068118C14C83F2A4638D02011-09-30T14: 36: 20-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
153. savedxmp.iid: 215B4C21082068118C14C83F2A4638D02011-09-30T14: 38: 52-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
154. savedxmp.iid: 749D7FC
     68118C14C83F2A4638D02011-09-30T14: 50: 43-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
155. сохраненныйxmp.iid: 3

     9B0A2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T14: 56: 35-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

156. savedxmp.iid:

     5C10A2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T14: 57: 39-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные

157. savedxmp.iid: 9A3535C10A2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 02: 30-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
158. savedxmp.iid: 9B5A0BA50B2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 04: 01-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
159. сохраненныйxmp.iid: 7A1E58B90B2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 04: 35-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
160. savedxmp.iid: 61863ECE0B2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 05: 10-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
161. savedxmp.iid: 62863ECE0B2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 05: 58-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
162. savedxmp.iid: C65E4A800C2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 10: 09-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
163. сохраненныйxmp.iid: 3ABC5B980C2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 10: 49-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
164. savedxmp.iid: C8D58FE90C2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 13: 06-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
165. savedxmp.iid: 44E9BBFB0C2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 13: 36-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
166. savedxmp.iid: 700D58430D2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 15: 36-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
167. сохраненныйxmp.iid: A7566B530D2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 16: 03-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
168. savedxmp.iid: A8566B530D2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 16: 41-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
169. savedxmp.iid: B281A5360E2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 22: 24-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
170. savedxmp.iid: 0ECFA13E0E2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 22: 38-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
171. сохраненныйxmp.iid: 0FCFA13E0E2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 24: 34-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
172. savedxmp.iid: FF9D32150F2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 28: 38-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
173. savedxmp.iid: 009E32150F2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 30: 25-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
174. savedxmp.iid: 9A98026E0F2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 31: 07-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
175. сохраненныйxmp.iid: 37A121930F2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 32: 09-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
176. savedxmp.iid: D9352BDE0F2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 34: 15-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
177. savedxmp.iid: DA352BDE0F2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 35: 47-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
178. savedxmp.iid: DB352BDE0F2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 36-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
179. сохраненныйxmp.iid: DC352BDE0F2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 37: 02-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
180. savedxmp.iid: D4570F58102068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 37: 40-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
181. savedxmp.iid: 86856167102068118C14C83F2A4638D02011-09-30T15: 38: 05-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
182. savedxmp.iid: 63908AF6142068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 10: 43-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
183. сохраненныйxmp.iid: 17D0A20D152068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 11: 22-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
184. savedxmp.iid: 036A773A152068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 12: 37-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
185. savedxmp.iid: B522524A152068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 13: 04-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
186. savedxmp.iid: B622524A152068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 13: 33-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
187. сохраненныйxmp.iid: 446E1471162068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 21: 19-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
188. savedxmp.iid: C0C56EA7162068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 22: 50-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
189. savedxmp.iid: 64C535BA162068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 23: 21-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
190. savedxmp.iid: 1E9B8BD4162068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 24: 05-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
191. сохраненныйxmp.iid: 16FCA3FE162068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 25: 16-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
192. savedxmp.iid: B67B2067172068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 28: 11-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
193. savedxmp.iid: 36BAAC76172068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 28: 37-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
194. savedxmp.iid: 37BAAC76172068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 29: 25-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
195. сохраненныйxmp.iid: 2B039FC68118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 30: 57-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
196. savedxmp.iid: AB405E01182068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 32: 30-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
197. savedxmp.iid: AC405E01182068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 36: 16-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
198. savedxmp.iid: 0717ADD71B2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T16: 59: 58-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
199. сохраненныйxmp.iid: 474180EE1B2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T17: 00: 36-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
200. savedxmp.iid: 484180EE1B2068118C14C83F2A4638D02011-09-30T17: 00: 44-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
201. savedxmp.iid: 84831BB2162068118C14C44A0F2F6D182011-10-03T11: 29: 44-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
202. savedxmp.iid: 85831BB2162068118C14C44A0F2F6D182011-10-03T11: 30: 43-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
203. сохраненныйxmp.iid: 86831BB2162068118C14C44A0F2F6D182011-10-03T11: 33: 39-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
204. savedxmp.iid: 87831BB2162068118C14C44A0F2F6D182011-10-03T11: 34: 02-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
205. savedxmp.iid: 88831BB2162068118C14C44A0F2F6D182011-10-03T11: 34: 18-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
206. savedxmp.iid: 1059490C1320681188C6DC17821322402011-10-04T11: 41: 03-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
207. сохраненныйxmp.iid: 57FE4C3F1320681188C6DC17821322402011-10-04T11: 42: 28-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
208. savedxmp.iid: 58FE4C3F1320681188C6DC17821322402011-10-04T11: 42: 41-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
209. savedxmp.iid: 59FE4C3F1320681188C6DC17821322402011-10-04T11: 45: 57-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
210. savedxmp.iid: 86A81C251420681188C6DC17821322402011-10-04T11: 48: 54-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
211. сохраненныйxmp.iid: 87A81C251420681188C6DC17821322402011-10-04T11: 49: 15-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
212. savedxmp.iid: E74E71DA1E206811808387722E03EEF32011-10-06T13: 46: 07-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
213. savedxmp.iid: E84E71DA1E206811808387722E03EEF32011-10-06T13: 47: 25-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
214. savedxmp.iid: FC58831821206811808387722E03EEF32011-10-06T13: 51: 59-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
215. сохраненныйxmp.iid: 7B97592B21206811808387722E03EEF32011-10-06T13: 52: 30-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
216. savedxmp.iid: 5AD3326421206811808387722E03EEF32011-10-06T13: 54: 06-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
217. savedxmp.iid: 5BD3326421206811808387722E03EEF32011-10-06T13: 54: 57-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
218. savedxmp.iid: 5CD3326421206811808387722E03EEF32011-10-06T13: 55: 28-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
219. сохраненныйxmp.iid: 46EB9DF821206811808387722E03EEF32011-10-06T13: 58: 15-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
220. savedxmp.iid: 0378251422206811808387722E03EEF32011-10-06T13: 59: 01-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
221. savedxmp.iid: 0478251422206811808387722E03EEF32011-10-06T14: 14: 15-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
222. savedxmp.iid: A7BA02BB24206811808387722E03EEF32011-10-06T14: 18-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
223. сохраненныйxmp.iid: A8BA02BB24206811808387722E03EEF32011-10-06T14: 19: 17-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
224. savedxmp.iid: E42D782625206811808387722E03EEF32011-10-06T14: 21-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
225. savedxmp.iid: D89FF94325206811808387722E03EEF32011-10-06T14: 21: 50-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
226. savedxmp.iid: B13B956F25206811808387722E03EEF32011-10-06T14: 23: 03-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
227. сохраненныйxmp.iid: 4C0F01D50D2068118083C4F278FDFF1F2011-10-06T15: 35: 56-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
228. savedxmp.iid: E6BC354E0E2068118083C4F278FDFF1F2011-10-06T15: 39: 19-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
229. savedxmp.iid: 71DCA9620C2068118C14F83CC50B2A512011-10-17T09: 51: 30-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
230. savedxmp.iid: B02821770C2068118C14F83CC50B2A512011-10-17T09: 52: 05-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
231. сохраненныйxmp.iid: 841014900C2068118C14F83CC50B2A512011-10-17T09: 52: 46-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
232. savedxmp.iid: D1D082980C2068118C14F83CC50B2A512011-10-17T09: 53: 01-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
233. savedxmp.iid: 12A7D4580D2068118C14F83CC50B2A512011-10-17T09: 58: 23-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
234. savedxmp.iid: 22B69689372068118C14F83CC50B2A512011-10-17T15: 00: 24-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
235. сохраненныйxmp.iid: 2AB69689372068118C14F83CC50B2A512011-10-17T15: 09: 59-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
236. savedxmp.iid: 2DDDFCA60E2068118C14F24E466A2EBF2011-10-18T11: 19: 43-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
237. savedxmp.iid: C413DA5F082068118083BF9F3FE8E9DD2011-10-27T16: 06: 22-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
238. savedxmp.iid: C513DA5F082068118083BF9F3FE8E9DD2011-10-27T16: 07: 41-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
239. сохраненныйxmp.iid: DC250731272068118083D3970C6F21132011-10-31T15: 09: 22-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
240. savedxmp.iid: 461E0FAB272068118083D3970C6F21132011-10-31T15: 12: 47-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
241. savedxmp.iid: D1B89E2B282068118083D3970C6F21132011-10-31T15: 16: 22-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
242. savedxmp.iid: DAB89E2B282068118083D3970C6F21132011-10-31T15: 16: 57-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
243. сохраненныйxmp.iid: 60BA62C02118083D3970C6F21132011-10-31T15: 28: 07-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
244. savedxmp.iid: CACEB4332A2068118083D3970C6F21132011-10-31T15: 30: 55-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
245. savedxmp.iid: EC9763302D2068118083D3970C6F21132011-10-31T15: 52: 18-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
246. savedxmp.iid: 8B8A56A3312068118083D3970C6F21132011-10-31T16: 24: 09-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
247. сохраненныйxmp.iid: F3458B6A112068118083EE660A3C36222011-11-02T10: 53: 56-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
248. savedxmp.iid: A46E8AD82D2068118083EE660A3C36222011-11-02T15: 54: 19-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
249. savedxmp.iid: 5C9664572F2068118083EE660A3C36222011-11-02T15: 54: 42-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
250. savedxmp.iid: 09801174072068118C14871DC4F2CFE32011-11-03T09: 45: 48-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
251. сохраненныйxmp.iid: 6D11781D0A2068118C14871DC4F2CFE32011-11-03T10: 04: 51-04: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
252. savedxmp.iid: 926C8ADB1E2068118C14871DC4F2CFE32011-11-03T12: 33: 20-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
253. savedxmp.iid: F2C8F0091F2068118C14871DC4F2CFE32011-11-03T12: 34: 38-04: 00Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
254. savedxmp.iid: 5EFF3E060A2068118083932A86D5811-11-10T13: 54: 40-05: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
255. сохраненныйxmp.iid: 09801174072068118C148BB5B1C1F5B42011-11-14T09: 06: 48-05: 00 Adobe InDesign 7.0 /; / метаданные
256. savedxmp.iid: 243F69DBB216E1118C9396A0A3B189D-11-24T21: 29: 20 + 05: 30 Adobe Illustrator CS5.1 /
257. savedxmp.iid: 1202C860DC16E111A3D5F1AB12FE8A462011-11-25T03: 30: 54 + 05: 30 Adobe Illustrator CS5 /
1TrueFalse17.00000010.824999Inches
258. MetaNormalLF-RomanMeta Normal LFRomanType 1004.450FalseMtNoLfRo.PFB; MtNoLfRo.pfm
259. Голубой
260. пурпурный
261. Желтый
262. Черный
263. PANTONE 286 C
264. Группа образцов по умолчанию 0
265. PANTONE 286 CSPOT100.000000CMYK100.00000066.0004020.0000002.000400
266. PANTONE 116 CVCSPOT100.000000CMYK0.00000016.000400100.0000000.000000
1686application / pdf
267. RBC_BC
конечный поток эндобдж 434 0 объект > эндобдж 729 0 объект > эндобдж 728 0 объект > эндобдж 82 0 объект > эндобдж 476 0 объект > эндобдж 435 0 объект > эндобдж 477 0 объект > эндобдж 515 0 объект > эндобдж 549 0 объект > эндобдж 581 0 объект > эндобдж 620 0 объект > эндобдж 658 0 объект > эндобдж 655 0 объект > эндобдж 659 0 объект > эндобдж 662 0 объект > эндобдж 665 0 объект > эндобдж 668 0 объект > эндобдж 671 0 объект > эндобдж 674 0 объект > эндобдж 677 0 объект > эндобдж 680 0 объект > эндобдж 685 0 объект > / ColorSpace> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / ExtGState >>> / Type / Page >> эндобдж 889 0 объект > поток HW [c4w! {(Q ۘ x ֐59 glx, | U]] S ՗ O; uѹ7 @ ~ v \ p1zqr *> Bm | \> 裏? ~ Ɵ8 {ǿA ۿ Bukj91 曋 g6w 鞥 6֋ my5%> ٦p = G? O ^ 6} m # h == ghcenW>: q? W.