Human Papillomavirus высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы), ДНК генотипирование [реал-тайм ПЦР]
Выявление возбудителя папиллома-вирусной инфекции (Human Papillomavirus), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) исследуется ДНК вирусов в образце биоматериала. При этом определяется наличие высококанцерогенных типов вируса (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 и/или 59), производится их типирование.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Соскоб из прямой кишки, соскоб урогенитальный.
Общая информация об исследовании
Вирусы папилломы человека (ВПЧ) широко распространены, поражают эпителий кожи и слизистых оболочек и обладают онкогенным потенциалом. ВПЧ передается при тесном контакте с инфицированным эпителием, поэтому основные пути заражения – половой и контактно-бытовой. Возможна передача ВПЧ от инфицированной матери к плоду. Человек может быть инфицирован несколькими типами ВПЧ.
К факторам, провоцирующим развитие ВПЧ-инфекции, относятся: ранее начало половой жизни, большое количество половых партнеров, сниженный иммунитет, применение оральных контрацептивов, авитаминозы, инфекции, передаваемые половым путем, курение и проживание в крупных городах.
Инкубационный период может длиться от 2 месяцев до 2-10 лет. Характерно скрытое течение заболевания, при котором отсутствуют клинические проявления, а при кольпоскопическом, цитологическом и гистологическом обследовании выявляется норма. В 30 % случаев в течение 6-12 месяцев может произойти избавление от вируса. Диагностика скрытой ВПЧ-инфекции осуществляется только методом ПЦР.
При острой инфекции возникают доброкачественные образования, такие как папилломы, бородавки, кондиломы. У детей папиллома-вирусы могут приводить к папилломатозу гортани. Поражение клеток трофобласта папиллома-вирусами чревато спонтанным абортом.
Объединение ДНК папиллома-вируса с геном клетки приводит к дисплазии/неоплазии (чаще всего в переходной зоне шейки матки). К папиллома-вирусам высокого онкогенного риска относятся ВПЧ типов 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68. Инфицирование ими приводит к относительно доброкачественному бовеноидному папулезу или плоскоклеточным интраэпителиальным неоплазиям шейки матки.
Для выявления ВПЧ высокого онкогенного риска используется в основном полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, которая позволяет найти ДНК ВПЧ в исследуемом биоматериале и идентифицировать его отдельные типы. Принцип метода основан на амплификации (многократном увеличении числа копий) специфичного для данного возбудителя участка ДНК.
Для чего используется исследование?
Для выявления папиллома-вирусной инфекции высокого онкогенного риска.
Для подтверждения/исключения персистирования определенного типа ВПЧ.
Чтобы оценить степень канцерогенного риска у женщин с дисплазией эпителия шейки матки.
Когда назначается исследование?
При первичном скрининге рака шейки матки (наряду с цитологическим исследованием) у женщин старше 30 лет.
После хирургического лечения цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN II) для выявления/исключения персистенции определенного типа ВПЧ высокого онкогенного риска (оценка в динамике).
При сомнительных результатах цитологического исследования гинекологических мазков.
Что означают результаты?
Референсные значения: отрицательно.
Причины положительного результата
Инфицирование папиллома-вирусом.
Причины отрицательного результата
Отсутствие папиллома-вирусной инфекции.
Низкое содержание ВПЧ в крови.
Выявление ДНК ВПЧ в исследуемом материале свидетельствует о наличии папиллома-вирусной инфекции. Если ДНК ВПЧ в исследуемом биоматериале не выявляется, то наличие папиллома-вирусной инфекции маловероятно.
ДНК папилломавирусов (Human Papillomavirus, ВПЧ), СКРИНИНГ РАСШИРЕННЫЙ с определением 14 типов (Контроль взятия материала, типы 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59), количественный, с пересчетом на у.е. Hybrid Capture по каждому типу
Вирус папилломы человека (ВПЧ) – широко распространенная инфекция, поражающая эпителий кожи и слизистых оболочек. Известно более 100 различных типов вируса папилломы. Вирус папилломы человека может стать причиной появления бородавок, папиллом и кондилом. ВПЧ передается при тесном контакте, поэтому основные пути заражения – половой и контактно-бытовой. Возможна передача ВПЧ от инфицированной матери к плоду. Человек может быть инфицирован несколькими типами ВПЧ одновременно. Наибольшую опасность вирус представляет для женщин, так как некоторые его типы провоцируют развитие рака шейки матки.
К факторам повышенного риска заражения ВПЧ относятся:
Раннее начало половой жизни
Большое количество сексуальных партнеров
Ослабление иммунитета
Наличие урогенитальных инфекций
Авитаминозы
Курение
Для ВПЧ характерно скрытое течение без клинических проявлений. В 30% случаев в течение 1 – 1,5лет происходит самоизлечение и элиминация вируса из организма. Выявить ВПЧ-инфекцию возможно с помощью ПЦР-анализа на ДНК папилломавирусов. Материал для исследования – соскоб эпителия шейки матки, соскоб цервикального канала, соскоб клеток уретры.
Долгое присутствие онкогенных типов вируса в организме женщины может приводить к изменению клеток, дисплазии тканей с последующей трансформацией в рак шейки матки. Изучено множество типов вируса, из них наиболее онкогенными являются типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68. Их еще называют ВПЧ высокого онкогенного риска. Для их выявления используется анализ методом ПЦР в режиме реального времени, который определяет не только наличие ДНК ВПЧ в исследуемом биоматериале, но и позволяет идентифицировать тип вируса и определить вирусную нагрузку – количество вируса, что важно для правильного лечения и предупреждения онкологического заболевания.
В каких случаях обычно назначают исследование?
Для выявления папилломавирусной инфекции высокого онкогенного риска.
При выявлении в цитологическом мазке изменений клеток, предположительно вызванных ВПЧ- инфекцией
Что именно определяется в процессе анализа?
Выявляется ДНК ВПЧ с определением типа вируса и количественным измерением его концентрации в биоматериале пациента методом ПЦР в реальном времени.
Что означают результаты теста?
Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии этих типов вируса ВПЧ. Результат «ОБНАРУЖЕНО» ответ позволяет диагностировать ВПЧ-инфекцию, связанную с выявленным типом вируса и определить вирусную нагрузку.
Сроки выполнения теста.
Результат исследования можно получить через 1-2 дня после сдачи анализа.
Как подготовиться к анализу?
Подготовка к анализу является важным этапом, от которого во многом зависит результат. Перед сдачей анализа нужно исключить применение местных средств (свечей или вагинальных таблеток), после проведения трансвагинального УЗИ или кольпоскопии должно пройти не менее 48 часов. В случае, если вы уже сдавали ранее соскоб на ВПЧ методом ПЦР, то между исследованиями должно пройти не менее месяца, так как раннее взятие материала на повторное исследование может быть неинформативно и привести к ложному результату.
Типирование папилломавирусов высокого онкогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы), определение ДНК) + КВМ в соскобе эпителиальных клеток урогенитального тракта
Метод определения
ПЦР в режиме реального времени.
Исследуемый материал
Смотрите в описании
Основная опасность, которую несет инфицирование вирусами данной группы, является риск развития рака шейки матки. Роль ВПЧ в развитии рака шейки матки на сегодняшний день доказана и подтверждена ВОЗ.
Особенности папилломавирусной инфекции.
С одной стороны:
При инфицировании в большинстве случаев (около 80%) происходит самоизлечение вследствие элиминации вируса из организма
Инфекция приводит к развитию предрака у малой части инфицированных женщин (около 0,5%)
От заражения до развития предрака и РШМ в среднем проходит 20лет.
С другой стороны:
ВПЧ является основной причиной РШМ.
Инфицированные женщины имеют в 300 раз более высокий риск развития рака.
Инфекция является коварной и довольно часто не вызывает никаких жалоб, вовремя не выявляется при осмотре.
Клинические проявления папилломавирусной инфекции высокого риска могут маскироваться другими заболеваниями УГТ, что не позволяет вовремя выявить их с использованием традиционных методов.
Как и любая инфекция, передаваемая половым путём, ВПЧ поражает и мужчин. Наличие аногенитальной инфекции, обусловленной ВПЧ, может привести к развитию генитальных кондилом, раку полового члена, раку прямой кишки и ануса.
Основной задачей диагностики папилломавирусной инфекции высокого канцерогенного риска является раннее выявление предраковых изменений. В настоящее время с этой целью используются цитологический, кольпоскопический, гистологический методы (выявляют наличие характерных для папилломавирусной инфекции изменений эпителия, дисплазий, рака).
Выявление ВПЧ высокого риска молекулярными методами (ПЦР диагностика) не позволяют установить стадию инфекции, однако однозначно указывают на наличие или отсутствие ВПЧ в организме. Это определяет принадлежность пациента к группе риска и позволяет сфокусировать более пристальное внимание с использованием клинических методов.
Дополнительные возможности определения прогноза заболевания даёт проведение генотипирования ВПЧ:
Выявление нескольких типов вируса ассоциировано с менее благоприятным прогнозом течения заболевания и более высоким риском персистенции.
Степень онкогенности различных генотипов высокого риска не одинакова. Наибольшей онкогенностью обладают 16 и 18 типы ВПЧ.
Проведение генотипирования позволяет отличить реинфицирование от персистентной инфекции при повторном визите пациента. Опасность представляет именно хроническая персистентная форма инфекции; недавнее же инфицирование наиболее вероятно спонтанно излечивается. О реинфицировании говорит изменение спектра генотипов, о персистентной инфекции — сохранение генотипа вируса через год после первого тестирования, повторное инфицирование тем же генотипом вируса после самоизлечения практически невозможно.
Важным условием корректного количественного анализа, является контроль качества взятия биоматериала. Для этого в тесте № 3111 — Типирование папилломавирусов высокого онкогенного риска количественное используется оценка содержания ДНК гена HMBS человека (источником этой ДНК являются эпителиальные клетки, попадающие в пробу при правильной технике взятия материала). Это позволит исключить ложноотрицательные результаты, связанные с недостаточностью взятия биоматериала.
Материалом для исследования у женщин служит соскоб из цервикального канала. Перед взятием материала тампоном удалить слизь с поверхности шейки матки, обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором. Зонд ввести в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см, вращать 3-5 сек. Извлечь зонд из цервикального канала, полностью исключив его касания стенок влагалища. Рабочую часть зонда поместить в эппендорф с транспортной средой, вращать 10-15 сек., избегая разбрызгивания раствора. Вынуть зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удалить зонд и закрыть пробирку.
Материалом для исследования у мужчин служит соскоб из уретры. Перед взятием материала необходимо обработать головку полового члена в области наружного отверстия уретры тампоном, смоченным стерильным физ. раствором. При наличии свободно стекающих из уретры выделений удалить их сухим тампоном. Ввести зонд в уретру на глубину 3-4 см. Несколькими вращательными движениями произвести соскоб эпителиальных клеток и перенести зонд в эппендорф с транспортной средой. В транспортной среде вращать зонд 10-15 сек., избегая разбрызгивания раствора. Вынуть зонд из раствора, прижимая его к стенке эппендорфа, и, отжав избыток жидкости, удалить зонд и закрыть пробирку.
ВПЧ — ГЕНОТИПИРОВАНИЕ – определение генотипов 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68
ВПЧ — ГЕНОТИПИРОВАНИЕ – определение генотипов 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68
Папилломавирусная инфекция относится к инфекциям, передаваемым половым путем. Вирус папилломы человека (ВПЧ) является эпителиотропным, он способен поражать клетки кожи, слизистых половых органов, ротовой полости. Инфицирование ВПЧ широко распространено и является важной проблемой здравоохранения.
По степени злокачественности папилломавирусы подразделяют на 2 группы:
— ВПЧ низкого онкогенного риска, к ним относятся 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 типы вируса, которые вызывают развитие кондилом гениталий, респираторного папилломатоза.
— ВПЧ высокого онкогенного риска, которые являются причиной развития интраэпителиальной дисплазии и рака шейки матки. На сегодняшний день охарактеризовано 15 генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 типы.
С ВПЧ высокого онкогенного риска связано 95,3% случаев заболеваний рака шейки матки. Рак шейки матки, по данным ВОЗ, занимает второе место в мире по распространенности среди злокачественных заболеваний женщин.
У инфицированной женщины вирус может в течение многих лет находится в латентной форме, не вызывая изменений в клетках. У большинства женщин инфицирование может пройти транзиторно, в течение 9-15 месяцев может произойти самоизлечение.
Длительное носительство ВПЧ приводит к дисплазии легкой степени, затем средней и тяжелой, которая заканчивается развитием инвазивного рака шейки матки. Вероятность развития интраэпителиальной дисплазии и рака шейки матки более чем в 300 раз выше у женщин с персистирующей инфекцией ВПЧ высокого онкогенного риска.
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВПЧ – методом ПЦР Real-time определяется, каким именно генотипом вируса инфицирована женщина. Исследование поможет отличить давнюю инфекцию от вновь приобретенной (менее 1 года). Для развития опухолевых изменений более опасно давнее инфицирование. Инфицирование двумя и более генотипами труднее поддается лечению.
В случае получения неудовлетворительных результатов обследования необходима консультация врача-гинеколога, который выберет оптимальную тактику дальнейшего обследования, наблюдения и лечения.
Papillomavirus низкого и высокого канцерогенного риска (6, 11, 44, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82), ДНК генотипирование [реал-тайм ПЦР]: исследования в лаборатории KDLmed
Молекулярно-генетическое исследование, которое позволяет определить и дифференцировать 21 генотип вируса папилломы человека в исследуемом материале, что дает возможность охарактеризовать онкогенный потенциал инфекции и спланировать тактику лечения.
Синонимы русские
Вирус папилломы человека (ВПЧ) с определением генотипа.
Синонимы английские
Human Papillomavirus (HPV), DNA, Genotyping.
Метод исследования
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Мазок из зева (ротоглотки), мазок урогенитальный, мазок урогенитальный (с секретом простаты), ректальный мазок.
Как правильно подготовиться к исследованию?
Подготовки не требуется.
Общая информация об исследовании
Вирус папилломы человека – ДНК-содержащий вирус из семейства паповавирусов, ассоциированный с развитием остроконечных кондилом, бородавок, предраковых изменений аногенитальной области, рака шейки матки. Существует более 100 типов ВГЧ, около 30 из них могут инфицировать половые пути, и около 14 генотипов связаны с развитием рака шейки матки, прямой кишки, полового члена и новообразований других локализаций (например, орофарингеальной плоскоклеточной карциномы).
Онкогенные папиллома-вирусы имеют в составе ДНК белки Е6/Е7, которые способны супрессировать процессы апоптоза (запрограммированной гибели) в клетках с измененным генетическим материалом. Генотипы 1, 2, 3, 5 считаются неонкогенными, а генотипы 6, 11, 42, 43, 44 относятся к папиллома-вирусам низкого онкогенного риска. ВПЧ высокого онкогенного риска – это генотипы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68.
Основной путь распространения вируса – половой. Возможна вертикальная (от матери к ребенку) и контактно-бытовая передача инфекции. В организм человека может попасть несколько типов ВПЧ одновременно. Заражаются обычно после начала половой жизни в возрасте 16-25 лет. При инфицировании онкогенными генотипами вируса между 25 и 35 годами вероятны интраэпителиальные поражения и через несколько лет развитие рака. В 70 % случаев в течение первого года и в 90 % случаев через 2 года после инфицирования возможно самоизлечение.
Инфицирование различными путями, а также разными типами вируса обуславливает особенности течения заболевания, локализацию эпителиальных изменений и риск развития неопластических процессов в местах поражения кожи и слизистых. Подошвенные бородавки вызываются генотипами 1, 2, 4, 63, а обычные бородавки – 2-м и 7-м типом ВПЧ. Папиллома-вирус 6-го, 7-го, 11-го, 16-го и 32-го типов может стать причиной папиллом ротовой полости и гортани, а ВПЧ 6-го, 11-го, 42-го, 44-го типов – аногенитальных бородавок. Папилломы, вызванные даже неонкогенными или низкоонкогенными папиллома-вирусами, рекомендовано удалять. Следует также отметить, что риск возникновения новообразований выше у людей с иммуннодефицитами.
Инфицирование онкогенными вирусами не означает, что у пациента будет раковое заболевание, однако требует дальнейшего тщательного регулярного наблюдения за инфицированным. При выявлении изменений кожи и слизистой с образованием кондилом, бородавок или внутриэпителиальной дисплазии рекомендовано исключение папиллома-вирусной инфекции и определение генотипа вируса, что позволяет оценить риск развития рака и определить тактику лечения.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) выявляет ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) с высокой специфичностью и чувствительностью. Определение ДНК различных генотипов вируса должно обязательно проводиться с учетом результатов цитологического и гистологического исследований биоптата, удаленной папилломы, бородавки, мазка из шейки матки или участка с дисплазией, метаплазией или признаками малигнизации.
Для чего используется исследование?
Для подтверждения наличия папиллома-вирусной инфекции.
Для диагностики одновременного инфицирования несколькими типами ВПЧ.
Для дифференциальной диагностики генотипов ВПЧ.
Для того чтобы оценить риск развития новообразований, ассоциированных с ВПЧ (рак шейки матки, рак прямой кишки, рак аногенитальной области, орофарингеальная карцинома).
Когда назначается исследование?
При выявлении цитологических изменений в мазке на атипию, в мазке по Папаниколау.
При наличии кондилом, бородавок и других морфологических изменений эпителия различных локализаций.
При выявлении вируса папилломы человека неуточненного типа (по данным лабораторного анализа).
Отсутствие генетического материала вируса папилломы человека в исследуемом материале
Низкое содержание вируса в материале
Что может влиять на результат?
Ложноотрицательный результат может быть получен при неправильном взятии и хранении материала, а также при содержании вируса в материале ниже детектируемого уровня.
Ложноположительный результат возможен при загрязнении материала.
Важные замечания
Инфицирование онкогенными типами ВПЧ не всегда приводит к раку.
Вероятно одновременное заражение несколькими генотипами ВПЧ.
Результат анализа должен интерпретироваться с учетом заключений цитологического и гистологического исследований.
Также рекомендуется
Human Papillomavirus 16/18 (HPV 16/18), ДНК [реал-тайм ПЦР]
Human Papillomavirus 6/11 (HPV 6/11), ДНК [реал-тайм ПЦР]
Human Papillomavirus высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы), ДНК без определения типа [ПЦР]
Human Papillomavirus высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы), ДНК генотипирование [реал-тайм ПЦР]
Human Papillomavirus, ДНК количественно [реал-тайм ПЦР]
Цитологическое исследование мазков (соскобов) с поверхности шейки матки (наружного маточного зева) и цервикального канала на атипию (три точки)
Arbyn M. et al. (2010). «European Guidelines for Quality Assurance in Cervical Cancer Screening. Second Edition–Summary Document». Annals of Oncology 21 (3): 448–458.
Saslow D, Solomon D, Lawson HW, et al. American Cancer Society, American Society for Colposcopy and Cervical Pathology, and American Society for Clinical Pathology Screening Guidelines for the Prevention and Early Detection of Cervical Cancer. Am J Clin Pathol. 2012;137:516-542.
«Genital HPV Infection – CDC Fact Sheet». Centers for Disease Control and Prevention (CDC). April 10, 2008. Retrieved 13 November 2009.
Chaturvedi, Anil; Maura L. Gillison (March 4, 2010).»Human Papillomavirus and Head and Neck Cancer». In Andrew F. Olshan. Epidemiology, Pathogenesis, and Prevention of Head and Neck Cancer (1st ed.). New York: Springer.
Анализ на папилломавирус (HPV) 16,18,31,33,35,39,45,52,56,58,59,66 типы ➤ сдать анализ на высокоонкогенные типы папилломавируса
Описание анализа:
Папилломавирус, высокоонкогенные штаммы (генотипирование) – анализ, позволяющий выявить штаммы вируса папилломы человека, создающие условия для развития злокачественных новообразований, в первую очередь, — рака шейки матки. К ним относятся 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59 и 66 типы вируса.
К папилломавирусам человека на данный момент причисляют несколько десятков видов и сотни типов вируса. Все они очень распространены, легко передаются от человека к человеку, а часть из них способствует появлению злокачественных новообразований, в большей или меньшей мере.
Вирус передается при непосредственном контакте, чаще всего половым или бытовым путем, возможно также заражение ребенка от матери. Раннее начало половой жизни, частая смена партнеров, длительное применение комбинированных оральных контрацептивов увеличивают вероятность заражения. Один человек может являться носителем сразу нескольких типов папилломавирусной инфекции.
Заболевание может не проявляться в течение нескольких лет после заражения или протекать в скрытой форме. Основной симптом – появление доброкачественных новообразований (бородавок, папиллом, кондилом) на коже и слизистых оболочках половых органов или рта. В ряде случаев инфекция подавляется иммунитетом самостоятельно, но это происходит не всегда. Лечения, уничтожающего папилломавирус в человеческом организме, на данный момент не разработано.
Высокоонкогенные штаммы ВПЧ способны объединять собственную ДНК с геномом клеток кожи или слизистой, приводя к появлению дисплазии – предракового состояния.
Самым надежным способом диагностики вируса папилломы человека, позволяющим обнаруживать вирус даже в скрытой форме, является анализ образца путем метода полимеразной цепной реакции. При этом возможно проводить генотипирование – определение конкретных штаммов, присутствующих у пациента.
Показания к назначению исследования
Генотипирование штаммов папилломавирусной инфекции высокого риска чаще всего необходимо гинекологам, однако может назначаться урологами, дерматовенерологами и инфекционистами.
Показанием к назначению являются:
подозрение на наличие ВПЧ высокоонкогенного риска;
оценка риска развития рака у женщин с дисплазией шейки матки;
сомнительные результаты цитологических исследований.
Интерпретация результатов
Если ДНК ни одного из высокоонкогенных типов папилломавируса не выявлено, значит результат анализа отрицательный – этих штаммов в организме пациента нет. Положительный результат означает, что пациент инфицирован одним из высокоонкогенных штаммов вируса папилломы человека.
Подготовка к обследованию
Специальная подготовка требуется только в том случае, если материал для обследования – урогенитальный мазок. Мужчинам перед его взятием нельзя мочиться в течение нескольких часов, а женщинам нельзя сдавать мазок в период месячных (нужно успеть до их начала или выждать несколько дней после окончания).
Материал для исследования: моча, биоптат, урогенитальный мазок.
Метод исследования: полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Срок проведения: 2 рабочих дня.
Запись на анализы
Сдать анализ на ВПЧ в сети медицинских центров MedSwiss
Папилломавирус человека признан одной из наиболее часто встречаемых инфекций, передающихся половым путем. В соответствии с данными ВОЗ среди людей в возрасте от 18 до 40 лет им заражены порядка 80 %. Сдав анализ на ВПЧ, можно выявить заболевание или убедиться в его отсутствии, а также установить разновидность вируса.
Почему важно своевременно сдать анализ на ВПЧ?
На первый взгляд, папилломавирус кажется безвредным, только неприятным, так как приводит к появлению папиллом и бородавок на слизистых и коже. Многие предполагают, что достаточно косметического решения проблемы. Однако такой подход таит в себе опасность.
Дело в том, что косметически можно удалить лишь внешнее проявление, в то время как сам вирус останется в организме, представляя потенциальную угрозу развития раковых клеток. Доказано непосредственное участие папилломавируса в формировании злокачественных образований.
Стоимость услуги сравнительно невысока, однако дело даже не в цене —здесь важнее результаты исследования.
Ученые классифицируют папилломавирусы по трем основным типам:
неонкогенные;
обладающие низким канцерогенным риском;
с высоким канцерогенным риском.
Исследование позволяет установить наличие одного из них в организме и обратиться к специалисту, чтобы предпринять правильные меры для предупреждения более серьезных проблем.
Когда нужно сдать анализ на ВПЧ?
Проведение исследований на наличие папилломавируса необходимо в следующих ситуациях:
развился нарост на коже или слизистой;
появились необычные выделения из половых органов;
возникли ощущения жжения, зуда, болевого синдрома, диагностирована эрозия;
установлено бесплодие;
возбудителя выявили у полового партнера;
выявлена дисплазия тканей;
во время профосмотра появились подозрения на наличие инфекции;
ведение беспорядочной половой жизни.
Как правильно сдать анализ на ВПЧ?
Если для анализа берется материал (мазок) из влагалища или уретры, необходима следующая подготовка:
за два часа перед тем, как сдать анализ на ВПЧ, не следует опорожнять мочевой пузырь;
откажитесь от средств гигиены и антисептиков за сутки до процедуры;
не используйте тампоны за два дня до биопсии;
за трое суток необходимо воздержаться от приема алкоголя и половых актов;
за две недели до процедуры отмените прием антибактериальных, противовирусных, противогрибковых средств. В противном случае результат может оказаться необъективным.
Женщинам не стоит сдавать анализ на ВПЧ в течение пяти суток до и после начала менструации. В этот период микрофлора половых органов изменяется, что может стать причиной искажения результата.
Забор биоматериала для исследования на ВПЧ проводит врач акушер-гинеколог на приёме, определяя нужный тип ВПЧ и оптимальный метод диагностики.
Записаться на приём специалиста для сдачи мазка на ВПЧ в MedSwiss Вы можете по единому номеру сети или через форму обратной связи на сайте.
Вирус папилломы человека (ВПЧ), типы 16, 31, 35, 39, 59
1620 руб
Вирус папилломы человека (HPV)Типы 31,33
390 руб
Вирус папилломы человека (ВПЧ), типы 51,26
390 руб
Вирус папилломы человека (HPV), типы 6,11
390 руб
Вирус папилломы человека (HPV) Тип 35, 45
390 руб
Вирус папилломы человека (HPV) Тип 18, 45, 39, 59
1650 руб
Вирус папилломы человека (HPV) Тип 16, 31, 35
390 руб
Вирус папилломы человека (HPV) Тип 33, 52,58
390 руб
Вирус папилломы человека (HPV) Тип 45, 52
390 руб
Вирус папилломы человека тип (ВПЧ) 56, 58
390 руб
Определение генотипов ВПЧ высокого онкогенного риска методом ВПЧ Digene-Тест (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68)
3740 руб
Определение генотипов ВПЧ низкого онкогенного риска методом ВПЧ Digene-Тест (6, 11, 42, 43, 44)
3740 руб
ВПЧ-Генотипирование
2650 руб
Показать еще
Отзывы
Василиса
Я сдавала тут анализ на ПВЧ по подозрению на бесплодие. Конечно, я была расстроена. Но врач клиники – очень отзывчивый человек. Она меня успокоила, все обстоятельно рассказала. По сути, утешила лучше других. про подготовку очень подробно разъяснила, потому что в моем случае нарушения в ней недопустимы. И хоть я и боялась, но сам забор прошел так гладко, что я даже и не почувствовала. Очень благодарна этой клинике за внимание и хорошую работу!
Елена Антоновна
Я очень педантична в вопросах личного здоровья, поэтому регулярно прохожу осмотры врачей и сдачу анализов. А поскольку рак шейки матки сейчас повальный, я поговорила с гинекологом, и она дала мне направление. Анализ этот непростой, поэтому в поликлинике его не делают. После изучения всех отзывов, я решила, что лучше, чем в этой клинике, нигде не сделают. Очень понравился персонал: добрый, отзывчивый и внимательный. Никакого дискомфорта при заборе я не испытывала. И результаты были готовы быстро.
Аля
Анализ на ВПЧ мне назначила гинеколог после планового осмотра. Хорошо, что в этой клинике можно сразу все и сдать. Мне все очень подробно рассказали тут о подготовке, дали памятку. Результатов тут ждать тоже недолго. Сразу видно, что работают профессионалы и у них своя база.
Фото кабинета
Полезные статьи
Регулярное генотипирование вируса папилломы человека путем секвенирования ДНК в лабораториях общественных больниц
Инфекционный агент Рак. 2007; 2: 11.
, 1 , 1 , 1 и 1
Sin Hang Lee
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Veronica S Vigliotti
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Джессика С. Виглиотти
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Сури Паппу
1 Отделение патологии , Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Автор, отвечающий за переписку.
Поступило 15 февраля 2007 г .; Принято 5 июня 2007 г.
Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе. при условии правильного цитирования оригинала.
Эта статья цитируется в других статьях в PMC.
Abstract
Предпосылки
Генотипирование вируса папилломы человека (ВПЧ) важно для последующего наблюдения за пациентами с персистирующей инфекцией ВПЧ и для оценки стратегии профилактики для отдельных пациентов, которые должны быть иммунизированы типоспецифическими вакцинами против ВПЧ.Целью этого исследования была оптимизация надежной «низкотемпературной» (LoTemp ™) системы ПЦР для оптимизации протоколов исследования вложенной ПЦР-амплификации ДНК ВПЧ с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК. Оптимизация протокола облегчает перенос этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику. В частности, снижение температуры на 10 ° C на каждом этапе термоциклирования во время in vitro амплификации ДНК дает более однородные продукты ПЦР. С помощью этого протокола очистка матрицы перед удлинением праймера ферментативного цикла больше не требуется.
Результаты
Геномную ДНК ВПЧ, экстрагированную из консервированных спиртом цервиковагинальных клеток на жидкой основе, сначала амплифицировали консенсусной парой праймеров MY09 / MY11 с последующей вложенной ПЦР с праймерами GP5 + / GP6 +. Гнездовые продукты ПЦР размером 150 п.н. подвергали прямому секвенированию ДНК. Гипервариабельную последовательность ДНК размером 34–50 п.н. ниже праймерного сайта GP5 + сравнивали с известными последовательностями ДНК ВПЧ, хранящимися в GenBank, с использованием онлайн-BLAST для генотипирования. Готовые к использованию реагенты для ПЦР-полимеразы LoTemp ™ оказались стабильными при комнатной температуре в течение как минимум 6 недель.Вложенная ПЦР выявила 107 изолятов ВПЧ в 513 цервиковагинальных клинических образцах, все подтвержденные секвенированием ДНК. ВПЧ-16 был наиболее распространенным генотипом, составляющим 29 из 107 положительных случаев (27,2%), за ним следует ВПЧ-56 (8,5%). Для сравнения: тест Digene HC2 обнаружил 62,6% из 107 изолятов ВПЧ и дал 11 (37,9%) из 29 положительных случаев ВПЧ-16 как «положительные для ВПЧ высокого риска».
Заключение
Готовая к использованию полимеразная система для ПЦР LoTemp ™, которая допускает термоциклирование при 85 ° C для денатурирования, 40 ° C для отжига и 65 ° C для удлинения праймера, может быть адаптирована для амплификации целевой ДНК HPV с помощью вложенной ПЦР и для подготовки клинических материалов для генотипирования методом прямого секвенирования ДНК.Генотипирование ВПЧ выполняется онлайн-алгоритмом BLAST гипервариабельной области L1. Последовательность ДНК включается в каждый отчет, направляемый врачу для сравнения при наблюдении за пациентами с персистирующей инфекцией ВПЧ, признанным промотором опухоли в индукции рака.
Предпосылки
Тестирование на вирус папилломы человека (ВПЧ) было введено, чтобы компенсировать низкую чувствительность и специфичность цитологического исследования мазка Папаниколау, часто используемого в качестве диагностического инструмента для пограничных предраковых поражений [1].Тест Digene Hybrid Capture 2 (HC2), единственный тест, одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), обычно используется для определения того, содержит ли суспензия цервиковагинальных клеток онкогенные ВПЧ «высокого риска» [2], часто действующие как сортировка для кольпоскопической оценки цитологически пограничных случаев [3-5]. Однако в настоящее время признано, что стойкая инфекция ВПЧ «высокого риска», а не простое присутствие самого вируса ВПЧ, является основным промотором, вызывающим предраковые поражения шейки матки и рак [6-9].Большинство инфекций ВПЧ, даже вызванных генотипами «высокого риска», являются временными при нормальной цитологии Папаниколау у сексуально активных молодых женщин [10-13]. У 93% первоначально инфицированных женщин тот же вирусный тип не обнаруживается при повторном обследовании через четыре менструальных цикла [14]. Средняя продолжительность положительной реакции, определяемой с помощью ПЦР для конкретного типа ВПЧ у этих молодых женщин, составляет 168 дней [15]. Множественные инфекции ВПЧ «высокого риска» не представляют более высокого риска развития неоплазии шейки матки по сравнению с единичной стойкой инфекцией ВПЧ высокого риска [16].Для развития и поддержания плоского интраэпителиального поражения высокой степени (SIL) риск наиболее высок у женщин, положительных на тот же генотип ВПЧ при повторном тестировании [6-8]. Вирусная нагрузка не является полезным параметром для прогнозирования высокого уровня SIL [17]. SIL высокого уровня часто ассоциируется с более низкой вирусной нагрузкой ДНК, чем это наблюдается в менее серьезно пораженных клетках [18].
Принимая во внимание недавний прогресс в понимании взаимосвязи между стойкой инфекцией ВПЧ и неоплазией шейки матки, для клинического ведения стойких инфекций необходима чувствительная и специфическая технология для обнаружения и точного определения генотипа ВПЧ.Тест HC2 не может быть преобразован в анализ генотипирования и связан со значительным количеством ложноотрицательных и ложноположительных результатов по сравнению с другими более строгими анализами генотипирования ВПЧ на основе ПЦР [19–23]. Сообщается, что он дает 25% ложноотрицательных результатов в случаях с подтвержденным биопсией высоким уровнем SIL, даже если все эти биопсии содержат ДНК ВПЧ высокого риска с помощью ПЦР [24]. «Отсутствие множества конкурентных, хорошо проверенных тестов» для анализа на ВПЧ цитируется как «проблема» при формулировании новых руководящих принципов лечения аномалий шейки матки [25].
Введение типоспецифических вакцин Gardasil ™ HPV в сексуально активное женское население также требует мониторинга генотипа HPV-инфекций до и после иммунизации для разработки стратегии профилактики для отдельных пациентов. Согласно «Справочному документу», представленному в FDA [26], введение вакцин против ВПЧ женщинам, у которых есть сопутствующие вакцино-релевантные инфекции ВПЧ, может увеличить риск на 44,6% развития предраковых поражений шейки матки высокой степени.Следовательно, было бы разумно выполнить анализ на ВПЧ, специфичный для генотипа, если есть подозрение на предшествующую инфекцию ВПЧ.
Целевая вложенная ПЦР-амплификация консервативной области ДНК гена L1 ВПЧ с консенсусными праймерами MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + или их эквивалентами с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК является общепринятым научным инструментом в исследованиях [21, 22,27]. Однако он не использовался в клинических лабораториях, потому что обращение с чувствительными к температуре реагентами ПЦР и требование очистки матрицы в протоколах ПЦР слишком трудоемко для рутинных применений.В этой статье отражен наш опыт использования высокопроизводительной, устойчивой к комнатной температуре надежной системы ДНК-полимеразы для облегчения переноса этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику. Каждый положительный результат на ВПЧ подтверждается генотипированием с прямым секвенированием ДНК гипервариабельной области гена L1. Информация о секвенировании ДНК ВПЧ может быть включена в лабораторный отчет для будущего клинического наблюдения за стойкими инфекциями.
Методы
Поскольку условия ПЦР, адаптированные для этого протокола, зависели от использования новой низкотемпературной, готовой к использованию умеренно термостабильной системы ДНК-полимеразы, чувствительности и специфичности ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® при амплификации ДНК ВПЧ были сначала проверены и сравнены с ДНК, полученной с помощью стандартных термостойких полимераз Taq , доступных на рынке.
Очищенные полноразмерные плазмидные ДНК типов -16, -18 и -6В ВПЧ, приобретенные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), использовали в качестве стандартов для разработки метода. Затем ДНК ВПЧ типа 16 использовали в качестве обычного положительного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали чистую воду молекулярной степени чистоты вместо экстракта ДНК.
Теоретическая чувствительность системы ПЦР, выбранной для этого исследования, была определена с использованием серийных 10-кратных разведений ATCC-сертифицированного стандарта HPV, содержащего 200 нг плазмидной ДНК HPV-16, -18 и -6B, с буфером TE для получения единственной копии. геномной ДНК на мкл в качестве матрицы для проведения первичной и вложенной ПЦР для каждого разведения в двух экземплярах.Теоретическое количество копий ДНК ВПЧ в матрице, используемой для каждой ПЦР MY09 / MY11, рассчитывалось в соответствии с общепринятой формулой пересчета [28]. Посредством секвенирования ДНК было подтверждено, что все вложенные продукты ПЦР соответствуют ожидаемым генотипам ВПЧ.
Для амплификаций ПЦР Taq реакционная смесь из 25 мкл содержала 100 мМ KCl, 20 мМ Трис-HCl pH 8,0, 25 мМ MgCl 2 , 2,5 мМ каждого дНТФ, 2,5 единицы полимеразы Takara Taq (Takara Bio Inc., Шига, Япония), 100 пмоль каждого консенсусного праймера (MY09 / MY11 или GP5 + / GP6 +) и 1 мкл ДНК ВПЧ при различных разведениях в буфере TE (или, если для вложенной ПЦР, 1 мкл ПЦР MY09 / MY11 продукты).Реакционную смесь подвергали 35 циклам амплификации в термоциклере MJ Research (Waltham, MA). Каждый цикл состоял из стадии денатурации при 94 ° C в течение 0,5 мин, стадии отжига при 55 ° C в течение 1 минуты и стадии удлинения цепи при 72 ° C в течение 1 минуты.
При проведении ПЦР ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® применялся протокол, описанный ниже для клинических образцов, за исключением того, что для сравнения с амплификацией ПЦР Taq использовали 35-цикловую амплификацию.
Клинические образцы, использованные для этого исследования, представляли собой 515 образцов цервиковагинальной цитологии на жидкой основе на спиртовой основе (Cytyc или Surepath), представленные врачами в Нью-Хейвене, штат Коннектикут, в рамках рутинных гинекологических осмотров.Возрастное распределение пациентов и патологические состояния шейки матки не были предметом данного исследования. Тест Digene HC2 на ВПЧ высокого риска, заказанный врачами, выполнялся в обычном порядке для каждого образца в одной из двух независимых клинических лабораторий (Quest Diagnostics Laboratory, Wallingford или Pathology & Laboratory Services, LLC, Woodbridge, CT) в соответствии с инструкциями, предоставленными Digene. Корпорация (Гейтерсбург, Мэриленд). Как правило, это были женщины моложе 30 лет, которым был поставлен Пап-цитологический диагноз атипичных плоскоклеточных клеток пониженной значимости (ASCUS), или женщины 30 лет и старше, независимо от результатов цитологического исследования Папаниколау [4].
После того, как материал был взят из каждого образца для рутинного цитологического исследования и анализа HCl, около 1 мл клеточных суспензий было помещено в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл, закодировано вслепую с номером случая и передано в лабораторию Милфордского госпиталя для лечения ВПЧ. ПЦР / секвенирование ДНК.
Экстракция ДНК из фиксированных спиртом клеток была выполнена в соответствии с протоколом Национального института рака (NCI) [29] с небольшими изменениями. Вкратце, суспензию клеток сначала центрифугировали в микроцентрифуге Eppendorf (модель 5424), оснащенной ротором (модель FA45-24-11), в течение 5 минут при 13000 об / мин.Клетки в осадке промывали 1 мл воды для реагентов, а затем 1 мл буфера, состоящего из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20, pH 8,1. Осадок промытых клеток ресуспендировали и расщепляли при 45–55 ° C в течение ночи в 100 мкл 0,1 мг / мл протеиназы K (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, штат Миссури), растворенных в том же буфере для промывки. После денатурирования белков в дигестате клеток в металлическом блоке, нагретом до 95 ° C в течение 10 мин, и заключительном центрифугировании дигестата при 13000 об / мин в течение 5 мин, супернатант осторожно пипетировали и помещали в чистую микроцентрифужную пробирку для использования. для ПЦР без дополнительной очистки или хранения при -20 ° C.
Для получения ДНК HPV использовали общую методологию первичной ПЦР-амплификации сегмента 450 п.н. гена L1 HPV с парой консенсусных праймеров MY09 / MY11 с последующей вложенной ПЦР с парой общих праймеров GP5 + / GP6 +. Вложенные продукты ПЦР размером 150 п.н. в положительных образцах были генотипированы прямым секвенированием ДНК [21,22] с небольшими модификациями, кратко изложенными ниже.
Для первичной ПЦР-амплификации в пробирку для ПЦР, содержащую 20 мкл LoTemp ™ HiFi ® , добавляли 1 мкл экстракта ДНК, 1 мкл 10-молярного праймера MY09, 1 мкл 10-молярного праймера MY11 и 2 мкл воды. Готовая к использованию смесь ДНК-полимеразы (HiFi DNA Tech, LLC, Trumbull, CT), которая содержит все компоненты, необходимые для низкотемпературной ПЦР, включая dNTP, Mg ++ , буфер, ДНК-полимеразы HiFi ® , запатентованную dsDNA плавящие агенты и консерванты dNTP, чтобы достичь конечного реакционного объема 25 мкл.Для термоциклирования температурные шаги термоциклера TC-412 (Techne Incorporated, Берлингтон, Нью-Джерси) были запрограммированы на начальный нагрев при 85 ° C в течение 2 минут с последующими 30 циклами при 85 ° C в течение 30 секунд, 40 ° C. в течение 30 секунд и 65 ° C в течение 1 мин. Окончательное удлинение составляло 65 ° C в течение 10 мин.
Для вложенной ПЦР «след» продуктов ПЦР MY09 / MY11 переносили стеклянной палочкой с чистой смачиваемой поверхностью диаметром около 1,5 мм во вторую пробирку для ПЦР, содержащую 25 мкл полной реакционной смеси вложенной ПЦР, состоящей из 20 мкл готовой к использованию смеси ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® , 1 мкл 10 мкмолярного праймера GP5 +, 1 мкл 10 мкмоль праймера GP6 + и 3 мкл воды, используя ту же программу термоциклирования, как описано выше.
После завершения первичной и вложенной ПЦР из каждой пробирки пипеткой отбирали 5 мкл продуктов ПЦР и смешивали с 2 мкл загрузочной жидкости для электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Гель исследовали в УФ-свете. Визуализация полосы продукта ПЦР 450 п.н. на дорожке MY09 / MY11 и / или полосы 150 п.н. на вложенной дорожке ПЦР на агарозном геле предоставила доказательства наличия ДНК ВПЧ в образце, ожидающего генотипирования с прямым секвенированием ДНК в качестве окончательного Проверка.
Для секвенирования ДНК, 1 мкл вложенных продуктов ПЦР, если они положительные, отбирали пипеткой из вложенной пробирки для ПЦР для прямого секвенирования ДНК, используя 1 мкл 5 мкмолярного праймера GP6 + в качестве праймера для секвенирования, 1 мкл BigDye ® Terminator (версия 1.1 / стандартный набор для секвенирования), 3,5 мкл 5-кратного буфера и 13,5 мкл воды в общем объеме 20 мкл для 20 циклов ферментативных реакций удлинения / прекращения праймера в термоцилиндре ABI модели 9600 в соответствии с протоколом, предоставленным производитель (Applied Biosystems).После очистки от красителя-терминатора с помощью колонки Centri-Sep (Princeton Separations, Adelphia, NJ) реакционную смесь загружали в автоматический четырехкапиллярный генетический анализатор ABI 3130 для анализа последовательности. Выравнивание последовательностей выполняли против различных стандартных последовательностей генотипов HPV, хранящихся в базе данных GenBank, с помощью онлайн-анализа BLAST, чтобы прийти к конкретному генотипированию.
Один мкл каждого экстракта ДНК помещали в отдельную пробирку для ПЦР с парой праймеров β-глобина [30] для амплификации геномной ДНК человека в качестве контроля адекватности образца.Праймеры для амплификации гена β-глобина представляли собой 1 мкл 80 мкмоль 5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC и 1 мкл 80 мкмоль 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC в 20 мкл готовой к использованию смеси ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® с 2 мкл добавлена вода. Использовалась упомянутая выше программа термоциклирования LoTemp ™.
Три (3) пробирки для ПЦР на образец обычно использовали для гена β-глобина, праймера MY09 / MY11 и вложенной амплификации GP5 + / GP6 +, соответственно.
Для проверки воспроизводимости этой процедуры ПЦР / ДНК-секвенирования аликвоты гидролизата 30 отдельных клинических образцов были протестированы в параллельных дублирующих сериях.Сравнивались повторяющиеся результаты трех ПЦР в каждом случае и результаты генотипирования положительных случаев путем секвенирования ДНК.
Образцы, которые не показали полосы ПЦР MY09 / MY11 или GP5 + / GP6 +, но показали доказательства положительной амплификации гена β-глобина, были интерпретированы как HPV-отрицательные. Образцы, которые не показали продуктов ПЦР на всех трех дорожках, были признаны неудовлетворительными для оценки из-за низкой экстракции ДНК или присутствия ингибитора ПЦР. Было два (2) неудовлетворительных дела из 515 обработанных.Остальные 513 случаев были признаны удовлетворительными для анализа. Из этих 513 случаев 107 были положительными на вложенные продукты ПЦР, все они оказались ДНК ВПЧ прямым секвенированием ДНК с использованием GP6 + в качестве праймера для секвенирования.
Образцы, инфицированные более чем одним генотипом ВПЧ, были обозначены появлением множества неоднозначных или перекрывающихся пиков в записях секвенирования ДНК. Для каждой из этих смешанных инфекций вложенные продукты ПЦР были подвергнуты дополнительным четырем индивидуальным реакциям удлинения / завершения праймера, чтобы исключить инфицирование вакциной Гардасил ™ ВПЧ, а именно ВПЧ типов -16, -18, -6 или -11, с использованием следующих типоспецифичных праймеров [31].
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-16 5′-GCTGCCATATCTACTTCAGA-3 ‘
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-18 5′-GCTTCTACACAGTCTCCTGT-3′
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-6 3′-GTGCATCTCCG ‘
Праймер для секвенирования, специфичный для типа HPV-11 5′-GTGCATCTGTGTCTAAATCTG-3′
Все олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров для этого исследования, были синтезированы и очищены с помощью картриджа для очистки олигонуклеотидов (OPC) лабораторией синтеза ДНК отделения патологии Университет (Нью-Хейвен, Коннектикут).
Чтобы избежать перекрестного заражения, для тестов амплификации нуклеиновых кислот были выделены три отдельные комнаты без рециркуляции воздуха. Каждая из двух комнат была оборудована 32-дюймовой рабочей станцией ПЦР (AirClean Systems, Роли, Северная Каролина). Все процедуры предварительной амплификации выполнялись на станции ПЦР I. Все процедуры после ПЦР выполнялись на станции ПЦР II, включая подготовку к вложенная ПЦР и реакция секвенирования.Гель-электрофорез и секвенирование ДНК проводили в третьей комнате для изоляции.Никакие материалы после ПЦР или любые предметы, загрязненные ампликонами, или оборудование, используемое в комнатах после ПЦР, не допускались в рабочее пространство до ПЦР.
Результаты
ДНК-полимераза LoTemp ™ HiFi ® была примерно в 10 раз эффективнее ДНК-полимеразы Taq при амплификации плазмидной ДНК ВПЧ с помощью ПЦР MY09 / MY11 и примерно в 100–1000 раз эффективнее при первой амплификации с помощью вложенной ПЦР GP5 + / GP6 + в тандеме. Технология вложенной ПЦР, описанная в этой статье, оказалась чувствительным методом для обнаружения 1–10 копий очищенной геномной ДНК типов HPV -16, -18 или -6B.Но 10 4 -10 5 копий геномной ДНК были необходимы в качестве ПЦР-матриц для УФ-визуализации положительной полосы ампликона праймера MY09 / MY11 после электрофореза (рис.). Специфичность всех вложенных продуктов ПЦР была подтверждена генотипированием ВПЧ с прямым секвенированием ДНК.
Сравнительная амплификация ДНК HPV-16 с помощью ДНК-полимеразы Taq и ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® ДНК-полимеразы . Дорожки 1–8: матрица плазмидной ДНК ВПЧ-16 при 85 × 10 1 , 85 × 10 2 , 85 × 10 3 , 85 × 10 4 , 85 × 10 5 , 85 × 10 6 , 85 × 10 7 и 85 × 10 8 копий на миллилитр.NC: отрицательный контроль. M: молекулярный маркер. Стрелки указывают нижний предел обнаружения вложенной ПЦР (A) и первичной ПЦР 1 st (B) с ДНК-полимеразой Takara Taq и ДНК-полимеразой LoTemp ™ HiFi ® соответственно.
Воспроизводимость этого вложенного ПЦР-анализа при обнаружении ДНК ВПЧ в клинических образцах была подтверждена запуском двух параллельных наборов ПЦР с расщепленным дигестатом одного образца в качестве парных матриц, включая ген β-глобина, праймер MY и GP амплификации вложенных праймеров в каждом наборе для 30 HPV-положительных случаев.Пара идентичных результатов на геле электрофореза была получена во всех трех амплификациях для 30 разделенных образцов (рис.). Вложенные продукты ПЦР, полученные на наборах дубликатов, были подтверждены секвенированием ДНК как принадлежащие к одному и тому же генотипу HPV.
Вложенная ПЦР HPV в клинических образцах и воспроизводимость . В агарозном геле показаны продукты ПЦР целевых ДНК, экстрагированных из двух клинических образцов в двух экземплярах. Ампликон ДНК-мишени β-глобина имеет длину 110 п.н., что ясно видно на дорожках 25 и 26 (№ 1210), но почти не видно на дорожках 31 и 32 (№ 1211).Совместная амплификация других фрагментов геномной ДНК человека и положительный вложенный ампликон ПЦР обеспечивают адекватность образцов в обоих образцах. Молекулярная линейка = 100–1000 п.н. (крайняя слева). Дорожки 25/26, 27/28, 29/30 = ген β-глобина, MY09 / MY11, GP5 + / GP6 + ПЦР, соответственно — образец № 1210. Дорожки 31/32, 33/34, 35/36 = ген β-глобина, MY09 / MY11, GP5 + / GP6 + ПЦР, соответственно — образец № 1211
Для клинических образцов первичная ПЦР MY09 / MY11 генерировала отдельный продукт размером 450 п.н. полоса после 30 повторных циклов амплификации только в 37 из 107 HPV-положительных случаев, обнаруженных с помощью вложенной ПЦР.Более 65% клинических ВПЧ-положительных ампликонов полагались на вложенную ПЦР для УФ-визуализации. Без вложенной ПЦР ампликон ПЦР MY09 / MY11 часто был замаскирован из-за совместной амплификации других молекул ДНК в клинических образцах (рис.).
Для некоторых изолятов, особенно изолятов HPV-39 и HPV-73, стандартная вложенная ПЦР GP5 + / GP6 + не смогла амплифицировать целевой фрагмент ДНК, даже если ПЦР-амплификация праймера MY09 / MY11 была успешной. Эти случаи были выявлены при гель-электрофорезе, показав положительный ПЦР-ампликон MY09 / MY11 450 п.н. в отсутствие ожидаемого сопутствующего вложенного продукта ПЦР размером 150 п.н.Для этих штаммов HPV с помощью геминизированной ПЦР с праймерами MY11 / GP6 + был получен гомогенный ампликон (рис.) Для прямого секвенирования ДНК.
После циклического секвенирования алгоритмы BLAST путем выравнивания последовательности ДНК из 34 п.н. в гипервариабельной области гена L1 ниже сайта связывания GP5 + с известными последовательностями генотипа ВПЧ, хранящимися в базе данных GenBank, обычно определяли генотип выявлены изоляты ВПЧ [32]. 100% совпадение «идентичностей» между «запросной» последовательностью и «субъектной» последовательностью было достигнуто для каждого окончательного генотипирования (рис.). Это отслеживание последовательности с его онлайн-алгоритмом BLAST для генотипирования было включено в отчет о клиническом наблюдении за стойкими инфекциями. Однако HPV-16 имеет множество вариантов последовательностей, некоторые из которых имеют идентичную последовательность в этой области с некоторыми штаммами HPV-31 и HPV-33, и для различения генотипов требуется алгоритм BLAST с последовательностью 50 п.н.
Последовательность ДНК вложенного продукта ПЦР ниже GP5 + для генотипирования . Это типичная последовательность ДНК, вырезанная из цветовой дорожки ниже участка связывания GP5 + гена L1 ДНК ВПЧ.Анализ выравнивания BLAST последовательности из 34 (до 50) п.н. этой гипервариабельной области дает однозначные доказательства генотипа 66 HPV на основе базы данных, хранящейся в GenBank.
Из 513 цервиковагинальных образцов на жидкой основе метод вложенной ПЦР выявил по крайней мере один штамм ВПЧ из 107, с общим положительным показателем 20,9%, включая 74 случая, укрывающих по крайней мере один из 13 типов, на которые нацелен Digene HC2 » тест на ВПЧ высокого риска и 33 случая с типами ВПЧ «низкого риска» (таблица).Наиболее распространенным генотипом в районе Нью-Хейвена оказался ВПЧ-16, за которым следует ВПЧ-56. Совокупный уровень распространенности ВПЧ-16 и ВПЧ-18 составил 32,8% от общего числа изолятов.
Таблица 1
Генотипирование ВПЧ с помощью секвенирования ДНК по сравнению с тестом Digene HC2
ПЦР / ДНК-секвенирование
Результаты теста Digene HC2
Тип Случаи
Распространенность (%)
Высокий риск +
Отрицательный
16
29
(27.2)
11
18
56
9
(8,5)
9
0
31
7
(6,5)
2
2
2
2 902 6
6
(5,6)
2
4
18
6
(5,6)
6
0
54
0 6 902
3
58
6
(5.6)
5
1
66
6
(5,6)
6
0
59
4
(3,7)
0 45
3
(2,8)
2
1
83
3
(2,8)
2
1
32
07 2 902
2
35
2
(1.9)
1
1
39
2
(1,9)
2
0
40
2
(1,9)
2
0 52
2
(1,9)
1
1
33
1
(0,9)
1
0
53
0 1 902
0
62
1
(0.9)
1
0
68
1
(0,9)
1
0
70
1
(0,9)
0,9)
1 72
1
(0,9)
0
1
73
1
(0,9)
0
1
M16
07 1
0
M 16, 18
1
(0.9)
1
0
M другие
3
(2,9)
1
2
Итого
107
(100)
HC2 Уровень обнаружения ВПЧ = 67/107 = 62,6%
Образцы
513
9025
513
.9
Тест на ВПЧ высокого риска HC2 выявил только 11 (37,9%) из 29 случаев ВПЧ-16 как положительные. Однако он успешно идентифицировал все образцы, содержащие ВПЧ-56 и ВПЧ-18, как положительные на ВПЧ высокого риска. Чувствительность теста HC2 при обнаружении заранее определенных генотипов ВПЧ «высокого риска» резюмируется следующим образом:
HPV-18 100%
HPC-33 100%
HPV-39 100%
HPV-56 100%
HPV-59 100%
HPV-68 100%
HPV-58 83.3%
HPV-31 71,4%
HPV-45 66,7%
HPV-35 50%
HPV-52 50%
HPV-16 37,9%
Хотя HPV-54, -66, -83, -53 и -62 не были включены в пробу гибридизационного коктейля, эти генотипы часто сообщались как положительные на ВПЧ высокого риска с помощью теста HC2 (таблица).
Среди 107 вложенных ПЦР-положительных образцов секвенирование ДНК с консенсусным общим праймером GP6 + дало множественные перекрывающиеся нечитаемые последовательности в 5 случаях.Использование индивидуального типоспецифического секвенирования праймеров для HPV-6, -11, -16 и -18 доказало, что один из них содержал HPV-16, но не три других генотипа, и что один содержал смесь HPV-16 и HPV. -18, но не два других генотипа. Для оставшихся 3 образцов смешанной инфекции повторное индивидуальное секвенирование ДНК не дало читаемой реакции удлинения / терминации праймера с любым из четырех типоспецифичных праймеров. Следовательно, эти последние 3 случая были сочтены множественными инфекциями, вызванными ВПЧ, отличными от четырех вакцин-релевантных типов, и сгруппированы в категорию «низкого риска».
Из 513 изученных случаев тест Digene HC2 классифицировал 403 пробы как отрицательные, 75 как положительные для ВПЧ «высокого риска» и 35 как неудовлетворительные для оценки. Эти результаты сравнивали с результатами, полученными с помощью анализа вложенной ПЦР (таблица). Так как тест Дигена охватил только генотипы ВПЧ «высокого риска», образцы, инфицированные ВПЧ, отличные от 13 типов, на которые нацелена проба коктейля из ВПЧ «высокого риска» HC2, будут классифицированы как отрицательные или неудовлетворительные для оценки (неудовлетворительно). Таким образом, тест HC2 идентифицировал 50 из 74 HPV-положительных образцов «высокого риска», обнаруженных с помощью вложенной ПЦР.Расчетная чувствительность теста Digene HC2 составила 50/74 = 67,6% по сравнению с анализом вложенной ПЦР. Поскольку в HC2 было зарегистрировано в общей сложности 75 случаев заражения ВПЧ «высокого риска», его аналитическая специфичность составила 50/75 = 66,7%. Два случая, признанных неудовлетворительными для оценки ПЦР и отрицательными с помощью теста HC2, были исключены из общего числа 513 случаев, введенных для анализа.
Таблица 2
Сравнение результатов вложенной ПЦР / секвенирования ВПЧ и результатов теста HC2
Результаты ПЦР
902
907 Высокий риск
Низкий риск
Unsat .
Всего
Результаты HC2
Отрицательное
364
23
16
902 902 902 902 902 902 902 902 902 902 8
50
17
0
75
Низкий риск
NP
NP
NP
902
34
1
0
35
Всего
406
74
33
0
9002 9002
525 Умеренный ™ HiFi ® ДНК-полимеразы представляют собой генно-инженерные производные ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus (Bst) , которая была впервые введена для разрешения структуры шпильки в классическом секвенировании ДНК по Сэнгеру Йе и Хонгом [33]. Bst ДНК-полимераза с оптимальной температурой удлинения праймера 65 ° C чрезвычайно стабильна, способна сохранять качество своего секвенирования в рабочем растворе при комнатной температуре в течение нескольких недель в условиях роботизированной автоматизации [34]. Модификация аминокислотной последовательности природной ДНК-полимеразы Bst с помощью сайт-направленных генетических мутаций увеличивает термостойкость фермента [35], что открыло путь к разработке новых термостабильных ДНК-полимераз для повторных реакций удлинения праймера ниже 85 ° C.Протокол ПЦР ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® использует свойства модифицированной ДНК-полимеразы Bst при пониженных циклических температурах и свойствах высокой процессивности.
Использование ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® для амплификации ДНК ВПЧ исключает все этапы очистки матрицы, которые обычно требуются перед ПЦР или реакцией секвенирования [21,22,32]. Поскольку готовая к использованию смесь полимераз содержит все необходимые ингредиенты для ПЦР, необходимость в пипетировании на дому минимальна.Поскольку ДНК-полимераза и другие компоненты реагента стабилизированы для хранения при комнатной температуре, нет необходимости хранить ледяные блоки при настройке ПЦР. Поскольку в этой системе используются химические плавящие агенты для денатурирования дцДНК и высокопроизводительная ДНК-полимераза для удлинения нуклеотидных праймеров при частичной изостабилизации, она позволяет проводить термоциклирование при 85 ° C для денатурирования, 40 ° C для отжига и 65 ° C для удлинения праймера соответственно. При пониженных температурах циклирования скорость индуцированных нагреванием мутаций [36], а именно депуринизации [37] и дезаминирования [38] азотистых оснований в молекулах ДНК во время амплификации ПЦР снижается.В результате продукты ПЦР более однородны.
В этом отчете мы продемонстрировали, что система ПЦР LoTemp ™ может амплифицировать 1–10 копий очищенного HPV-16, -18 или -6B для создания соответствующего типоспецифичного вложенного продукта ПЦР размером 150 п.н. Чувствительность ПЦР LoTemp ™ при обнаружении плазмидной ДНК ВПЧ примерно в 10 раз выше, чем у традиционных термостойких ДНК-полимераз Taq без вложенной амплификации (рис.). Вложенная ПЦР повысила аналитическую чувствительность обнаружения ДНК ВПЧ на суспензиях цервиковагинальных клеток [21,22,32], что также подтверждается нашим опытом (рис.). Вложенная ПЦР также служит для устранения большинства мешающих веществ, которые в противном случае, возможно, пришлось бы удалить очисткой колонки в этой процедуре.
Хотя согласованные общие пары праймеров MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + использовались для амплификации высококонсервативной области гена L1 всех генотипов ВПЧ, их эффективность в амплификации целевой ДНК варьируется от одного генотипа ВПЧ к другому с противоречивыми паттернами [22] . Мы обнаружили, что некоторые изоляты HPV-39 и HPV-73 не амплифицируются парой праймеров GP5 + / GP6 + ни в первичной ПЦР, ни во вложенной ПЦР.Вторая амплификация с парой праймеров GP5 + / MY09 и GP6 + / MY11 дает более длинный и более короткий продукт ПЦР, соответственно. Геминизированный продукт ПЦР GP6 + / MY11 (рис.) Подходит для прямого секвенирования ДНК. Неудача GP5 + / GP6 + при амплификации HPV-39 [39] и других типов HPV [22,32] в клинических образцах является хорошо известной технической проблемой, если эта единственная пара праймеров используется для обнаружения HPV. Однако GP5 + и GP6 + являются отличными вложенными праймерами для ПЦР для подготовки матриц для генотипирования HPV с прямым секвенированием ДНК.
Оптимизация протокола ПЦР важна для обнаружения ВПЧ. Без оптимизации метод ПЦР с использованием одного набора консенсусных праймеров для амплификации может иметь более низкую чувствительность, чем тест Digene HC2 [40]. Используя первоначальную 40-цикличную амплификацию клинических образцов, Johnson et al . [21] сообщили, что вложенная ПЦР обычно увеличивает чувствительность метода ПЦР на ВПЧ примерно на 60%. С протоколом ПЦР, представленным в этой статье, это различие усиливается за счет принятия 30-цикловой амплификации.Преимущество уменьшения количества циклов амплификации состоит в том, что коамплификация неспецифических мешающих молекул ДНК уменьшается в первичной ПЦР в пользу создания специфических вложенных продуктов ПЦР для прямого секвенирования ДНК.
Используя наш оптимизированный протокол, вложенная ПЦР выявила 107 HPV-положительных случаев среди 513 клинических образцов (таблица). Было идентифицировано двадцать три (23) генотипа ВПЧ, включая 12 из 13 генотипов «высокого риска», т.е. ВПЧ-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -52, -56, -58, -59 и -68, которые нацелены на тест Digene HC2.Отсутствие репрезентативности HPV-51, который также является мишенью для теста HC 2, вероятно, отражает низкую региональную распространенность этого генотипа. Используя те же праймеры для вложенной ПЦР с последующим генотипированием с секвенированием ДНК, было обнаружено, что HPV-51 является относительно распространенным генотипом в Германии, составляя около 5% от общего числа обнаруженных изолятов HPV [22]. Однако среди 894 изолятов ВПЧ в Дании он не был зарегистрирован ни разу [21].
Гипервариабельная область последовательности ДНК ниже сайта связывания GP5 + имеет решающее значение для генотипирования L1 ВПЧ.Хотя большинство генотипов ВПЧ можно определить путем выравнивания последовательности длиной 34 п.н. в этой области с базой данных GenBank [32], для точного генотипирования может потребоваться выравнивание более длинной последовательности, например длиной 50 п.н., когда результат алгоритма BLAST неоднозначен. . Если для генотипирования полагаться на последовательность из 34 пар оснований, количество инфекций HPV-16 может быть недооценено.
Для разработки этого протокола мы обнаружили, что использование 1 мкл 5 мкмоль OPC-очищенного олигонуклеотида GP6 + вместо рекомендованного производителем 3.2 мкмоль раствор в качестве праймера для секвенирования, по-видимому, дает более согласованные результаты секвенирования для типирования различных изолятов ВПЧ. Концентрация праймера может нуждаться в корректировке, если более высокий уровень GP6 + используется в качестве праймера для секвенирования ДНК.
Из 107 ПЦР-положительных образцов тест Digene HC2 классифицировал 67 как ВПЧ-положительные, уровень обнаружения 62,6% (таблица). Когда для сравнения используются только нацеленные на HC2 генотипы HPV «высокого риска», вложенная ПЦР выявляет 74 HPV-положительных случая, в то время как тест HC2 выявляет 50 в этой группе с аналитической чувствительностью 67.6% (50/74).
Наиболее распространенным является ВПЧ-16, составляющий 27,2% от общего числа изолятов (таблица). Этот процент распространенности ВПЧ-16 почти идентичен процентному соотношению, о котором сообщают другие специалисты с использованием гнездовой ПЦР / ДНК-секвенирования MY / GP, генотипирования суспензий цервиковагинальных клеток, например 26% в Дании [21] и 26,2% в Германии [22]. Тест Digene HC2 выявил 11 из 29 ПЦР-положительных случаев ВПЧ-16 с показателем обнаружения 37,9%, что является неожиданно низким. Поскольку все положительные результаты ПЦР на ВПЧ-16 были подтверждены секвенированием ДНК для генотипирования с уровнем распространенности, аналогичным тем, которые обычно встречаются в западном мире, на основе той же методологии [21,22], и поскольку тесты Digene HC2 проводились две независимые клинические лаборатории, должным образом сертифицированные органами здравоохранения, достоверность результатов отдельных тестов, кажется, не подлежит сомнению.Несоответствие, вероятно, связано с тем, что в данной популяции пациентов существует множество вариантов последовательностей HPV-16 [41], которые могут быть не все нацелены на зонд коктейля РНК HC2, но имеют общую высококонсервативную область гена L1, которая праймеры MY09 / MY11 эффективно амплифицируются. В пользу этой интерпретации говорит тот факт, что тест HC2 правильно определил все случаи ВПЧ-18, ВПЧ-39, ВПЧ-56 и ВПЧ-59 как «группы высокого риска» по одним и тем же данным.
ВПЧ-56 — второй по частоте обнаруженный генотип высокого риска (8.5%), за которыми следуют ВПЧ-31, -18, -54, -58 и -66, с примерно одинаковым уровнем распространенности (5,6–6,5%). Общее количество случаев ВПЧ-16 и -18 составляет только 32,8% от единичных изолятов ВПЧ в нашей серии. ВПЧ-18, по-видимому, также играет относительно небольшую роль в возникновении патологии шейки матки в Канаде [42].
Сообщалось другими [43], что тест высокого риска Digene HC2 может обнаруживать типы ВПЧ -53, -54, -62, -66 и -83 и маркировать их как ВПЧ высокого риска, хотя эти Генотипы не являются преднамеренно целевыми в его коктейльном зонде высокого риска.Наши данные подтверждают эти перекрестные реакции (таблица). Вариация последовательностей в сайтах связывания зонда [44] и неспецифическое связывание между зондом и несовпадающей ДНК, не являющейся мишенью [45-48], являются хорошо известными источниками ошибок, если гибридизация нуклеиновых кислот используется для микробного и вирусного генотипирования. Когда продукты ПЦР GP5 + / GP6 + с гипервариабельной последовательностью ДНК нацелены на разработку метода мультиплексного генотипирования [49], обнаруживается, что ДНК-зонд, разработанный для HPV-66, недавно признанного типа высокого риска [50-52], реагирует с ВПЧ-52 и зондом для ВПЧ-82 с ВПЧ-51 из-за перекрестной гибридизации, несмотря на наличие четырех несовпадений оснований в каждой паре.Некоторые эксперты [40] считают непреднамеренные перекрестные реакции теста Digene HC2 с нецелевыми типами ВПЧ, такими как ВПЧ-66, которые иногда могут вызывать рак, «удачными». Однако польза от этих перекрестных реакций для пациентов требует дополнительного подтверждения.
Пятьдесят процентов (50%) изолятов ВПЧ-54 возвращаются тестом на ВПЧ как ВПЧ высокого риска. ВПЧ-54 был классифицирован как вирус низкого риска [51,53], но обнаружено, что он связан с 40-кратным увеличением риска среди женщин американских индейцев с CIN 2/3.Только ВПЧ-16 показал более высокий риск, чем ВПЧ-54 среди этой субпопуляции [54]. При использовании информации о генотипировании ВПЧ для наблюдения за стойкими инфекциями, возможно, придется учитывать генетический состав пациента [55].
Для случаев смешанной инфекции мы выбираем отдельные праймеры, специфичные для HPV-6, -11, -16 и -18 [31], чтобы выполнить секвенирование ДНК с индивидуальным специфическим праймером, чтобы определить, включает ли смешанная инфекция какие-либо из этих вакцин- соответствующие типы ВПЧ. Обоснование этого выбора заключается в том, что большинство множественных инфекций ВПЧ являются временными [6-15].Непосредственную озабоченность пациентки и ее лечащего врача вызывает вопрос о том, вызвана ли смешанная инфекция каким-либо из типов ВПЧ, имеющих отношение к вакцине, если пациент подумывает о вакцинации.
Низкий процент (<5%) множественных инфекций ВПЧ, наблюдаемый в нашей серии, мог быть необъективным, потому что большая часть образцов для этого исследования была собрана в офисе индивидуального частного практикующего врача, и эта группа образцов имела исключительно низкий положительный результат. частота и отсутствие множественных инфекций ВПЧ.Известно, что частота множественных инфекций ВПЧ варьируется среди популяций пациентов, а также зависит от стадии канцерогенеза. Множественные инфекции HPV были обнаружены менее чем в 5% HPV-положительных образцов от пациентов с инвазивным раком, но более чем в 15% положительных образцов в контрольной группе [27]. Множественные инфекции HPV имеют тенденцию развиваться в отдельные инфекции HPV, поскольку инфекция становится хронической и устойчивой, в то время как цитопатология шейки матки прогрессирует от метаплазии, LSIL, HSIL, карциномы in situ до инвазивного рака [56].
Таким образом, мы сообщили о нашем опыте адаптации хорошо охарактеризованного протокола ПЦР / секвенирования ДНК для рутинного генотипирования ВПЧ. Мы считаем, что чувствительный и специфический анализ ВПЧ с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК позволит получить полезную информацию для отслеживания стойких инфекций при направлении пациентов с «высоким риском» развития HSIL, а не пациентов с «ВПЧ высокого риска». до кольпоскопической оценки.
Заключение
Технология вложенной ПЦР с использованием консенсусных праймеров MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + для целевой амплификации ДНК ВПЧ может использоваться в диагностических лабораториях для рутинного обнаружения ВПЧ и подготовки клинических материалов для генотипирования путем прямого секвенирования ДНК.Мы адаптировали недавно внедренную систему низкотемпературной ПЦР и оптимизировали протокол, чтобы облегчить перенос этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику для точного генотипирования ВПЧ, которое является ценным инструментом для последующего наблюдения за пациентами с устойчивой инфекцией ВПЧ, признанной опухолью. промотор в индукции рака.
Тест ДНК вируса папилломы человека HC2-REF 5199-1220 Digene Corporation, Gaithersburg, MD 20878 USA. 2005.
Гогола Дж., Ван Динь Т., Луччи Дж. А., 3, Смит Е., Ханниган Е. В.. Тестирование на вирус папилломы человека для сортировки в направленной популяции. J Low Genit Tract Dis. 2001; 5: 29–32. DOI: 10.1046 / j.1526-0976.2001.51006.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Wu HH, Allen SL, Kirkpatrick JL, Elsheikh TM. Рефлекторный тест ДНК вируса папилломы человека высокого риска полезен при сортировке женщин с атипичными плоскоклеточными клетками и не может исключить плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени. Diagn Cytopathol. 2006; 34: 707–10. DOI: 10.1002 / dc.20497. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Wallin KL, Wiklund F, Angstrom T., Bergman F, Stendahl U, Wadell G, Hallmans G, Dillner J. Типоспецифическая персистентность ДНК вируса папилломы человека до развития инвазивной цервикальной рак.N Engl J Med. 1999; 341: 1633–8. DOI: 10.1056 / NEJM1993412201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Kjaer SK, van den Brule AJ, Paull G, Svare EI, Sherman ME, Thomsen BL, Suntum M, Bock JE, Poll PA, Meijers CJ. Типоспецифическая персистенция вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска как индикатор плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки высокой степени у молодых женщин: проспективное последующее исследование на популяционной основе. BMJ. 2002; 325: 572–6. DOI: 10.1136 / bmj.325.7364.572. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, Gilkison G, Arends MJ, Graham C, McGoogan E.Стойкая ВПЧ-инфекция высокого риска, связанная с развитием неоплазии шейки матки, в проспективном популяционном исследовании. J Clin Pathol. 2005. 58: 946–50. DOI: 10.1136 / jcp.2004.022863. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Якобс М.В., Вальбумерс Дж. М., Снайдерс П. Дж., Вурхорст Ф. Дж., Верхейен Р. Х., Франсен-Даалмейер Н., Мейер С. Дж..Распределение 37 мукозотропных типов ВПЧ у женщин с цитологически нормальными мазками из шейки матки: возрастные закономерности для типов высокого и низкого риска. Int J Cancer. 2000; 87: 221–7. DOI: 10.1002 / 1097-0215 (20000715) 87: 2 <221 :: AID-IJC11> 3.0.CO; 2-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Herrero R, Hildesheim A, Bratti C, Sherman ME, Hutchinson M, Morales J, Balmaceda I, Greenberg MD, Alfaro M, Burk RD, Wacholder S, Plummer M, Schiffman M Популяционное исследование папилломавирусной инфекции и неоплазии шейки матки в сельских районах Коста-Рики.J Natl Cancer Inst. 2000; 92: 464–74. DOI: 10.1093 / jnci / 92.6.464. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Molano M, Posso H, Weiderpass E, van den Brule AJ, Ronderos M, Franceschi S, Meijer CJ, Arslan A, Munoz N, Исследовательская группа ВПЧ Распространенность исследования ВПЧ и детерминанты Инфекция ВПЧ среди колумбийских женщин с нормальной цитологией. Br J Рак. 2002. 87: 324–33. DOI: 10.1038 / sj.bjc.6600442. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Rousseau MC, Pereira JS, Prado JC, Villa LL, Rohan TE, Franco EL.Коинфекция шейки матки с типами вируса папилломы человека (ВПЧ) как предиктор приобретения и сохранения инфекции ВПЧ. J Infect Dis. 2001; 184: 1508–17. DOI: 10,1086 / 324579. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Hinchliffe SA, van Velzen D, Korporaal H, Kok PL, Boon ME. Кратковременность цервикальной ВПЧ-инфекции у сексуально активных молодых женщин с нормальной цитологией шейки матки. Br J Рак. 1995; 72: 943–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Brown DR, Shew ML, Qadadri B, Neptune N, Vargas M, Tu W, Juliar BE, Breen TE, Fortenberry JD.Продольное исследование генитальной инфекции папилломы человека в когорте женщин-подростков, за которыми внимательно наблюдали. J Infect Dis. 2005; 191: 182–92. DOI: 10,1086 / 426867. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, Seagar AL, Arends MJ, Moore C, Gilkisson G, McGoogan E. Множественные инфекции HPV высокого риска распространены в шейном отделе матки неоплазия и молодые женщины в популяции скрининга шейки матки. J Clin Pathol. 2004. 57: 68–72. DOI: 10.1136 / jcp.57.1.68.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Венсвин К.В., Кейджи М.Дж., Нагелькерке, штат Нью-Джерси, Велдхуизен Р.В., Тримбос Дж. Б.. Может ли полуколичественная оценка вирусной нагрузки вируса папилломы человека предсказать цитологический или гистологический результат у женщин с атипичными плоскоклеточными или железистыми клетками неопределенного значения цитологии? Eur J Gynaecol Oncol. 2005; 26: 393–7. [PubMed] [Google Scholar]
Sherman ME, Wang SS, Wheeler CM, Rich L, Gravitt PE, Tarone R, Schiffman M. Детерминанты вирусной нагрузки папилломы человека среди женщин с гистологической цервикальной интраэпителиальной неоплазией 3: доминирующее влияние окружающей среды. степень поражения.Биомаркеры эпидемиологии рака Пред. 2003; 12: 1038–44. [PubMed] [Google Scholar]
Castle PE, Schiffman M, Burk RD, Wacholder S, Hildesheim A, Herrero R, Bratti MC, Sherman ME, Lorincz A. Ограниченная перекрестная реактивность гибридного Capture 2 с неонкогенными типами вируса папилломы человека. Биомаркеры эпидемиологии рака и пред. 2002; 11: 1394–9. [PubMed] [Google Scholar]
Вернон С.Д., Унгер Э.Р., Уильямс Д. Сравнение обнаружения и типирования вируса папилломы человека с помощью циклического секвенирования, линейного блоттинга и гибридного захвата.J Clin Microbiol. 2000; 38: 651–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Джонсон Т., Брайдер К., Корбет С., Фомсгаард А. Обычное генотипирование образцов вируса папилломы человека в Дании. APMIS. 2003; 111: 398–404. DOI: 10.1034 / j.1600-0463.2003.t01-1-1110204.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Speich N, Schmitt C, Bollmann R, Bollmann M. Изучение 2916 цитологических образцов вируса папилломы человека (HPV) с помощью ПЦР и секвенирования ДНК: спектр генотипов пациентов из Западной Германии.J Med Microbiol. 2004; 53: 125–8. DOI: 10.1099 / jmm.0.05447-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Kosel S, Burggraf S, Mommsen J, Engelhardt W., Olgemoller B. Типоспецифическое обнаружение вирусов папилломы человека в обычных лабораторных условиях — сравнение улучшенной чувствительности и специфичности ПЦР и анализа последовательностей для прямой гибридизации. Clin Chem Lab Med. 2003. 41: 787–91. DOI: 10.1515 / CCLM.2003.119. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Lonky NM, Felix JC, Naidu YM, Wolde-Tsadik G.Сортировка атипичных плоскоклеточных клеток неопределенного значения с гибридным захватом II: кольпоскопия и гистологическая корреляция вируса папилломы человека. Obstet Gynecol. 2003; 101: 481–9. DOI: 10.1016 / S0029-7844 (02) 02715-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Stoler MH, Castle PE, Solomon D, Schiffman M. Расширенное использование тестирования на ВПЧ в гинекологической практике в соответствии с управлением под контролем ASCCP требует использования хорошо проверенных тестов. Am J Clin Pathol. 2007; 127: 335–7. [PubMed] [Google Scholar]
Справочный документ VRBPAC Четырехвалентная вакцина против ВПЧ Гардасил ™.Встреча VRBPAC. http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/06/briefing/2006-4222B3.pdf 18 мая 2006 г.
Асато Т., Маэхама Т., Нагаи И., Канадзава К., Уэзато Х., Кария К. Крупное исследование «случай-контроль» риска рака шейки матки, связанного с инфекцией вируса папилломы человека в Японии, путем генотипирования на основе нуклеотидного секвенирования. J Infect Dis. 2004; 189: 1829–32. DOI: 10,1086 / 382896. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Протоколы, используемые в NCI, и обработка связанной информации о микродиссектированных тканях для молекулярного анализа http: // cgap-mf.nih.gov/Protocols/Processing/DNA.html
Аятоллахи М., Закериния М., Хагшенас М. Молекулярный анализ иранских семей с серповидно-клеточной анемией. J Trop Pediatr. 2005; 51: 136–40. DOI: 10,1093 / tropej / fmh201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Gharizadeh B, Oggionni M, Zheng B, Akom E, Pourmand N, Ahmadian A, Wallin KL, Nyren P. Праймеры для множественного секвенирования с типом: новая стратегия надежного и быстрого генотипирование вирусов папилломы человека методом пиросеквенирования.J Mol Diagn. 2005. 7: 198–205. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Feoli-Fonseca JC, Oligny LL, Filion M, Brochu P, Simard P, Russo PA, Yotov WV. Метод прямого секвенирования двухуровневой полимеразной цепной реакции для обнаружения и типирования вирусов папилломы человека в патологических образцах. Diagn Mol Pathol. 1998. 7: 317–23. DOI: 10.1097 / 00019606-199812000-00005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ye S, Hong G. Большой фрагмент термостабильной ДНК-полимеразы I разрешает шпильочную структуру при секвенировании ДНК.Scientia sinica (Series B) 1987; 30: 503–6. [PubMed] [Google Scholar]
Hong GF, Huang W. ДНК-полимераза, обладающая способностью снижать врожденную избирательную дискриминацию в отношении дидезоксинуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями. Патент США. № 6,165,765 .
Андре П., Ким А., Храпко К., Thilly WG. Верность и мутационный спектр ДНК-полимеразы Pfu на последовательности митохондриальной ДНК человека.Genome Res. 1997; 7: 843–52. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Линдаль Т., Ниберг Б. Скорость депуринизации нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Биохимия. 1972; 11: 3610–8. DOI: 10.1021 / bi00769a018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Линдаль Т., Ниберг Б. Вызванное нагреванием дезаминирование остатков цитозина в дезоксирибонуклеиновой кислоте. Биохимия. 1974; 13: 3405–10. DOI: 10.1021 / bi00713a035. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Эванс М.Ф., Адамсон К.С., Симмонс-Арнольд Л., Купер К.ПЦР Touchdown General Primer (GP5 + / GP6 +) и оптимизированная концентрация ДНК в образце поддерживают чувствительное обнаружение вируса папилломы человека. BMC Clin Pathol. 2005; 5: 10. DOI: 10.1186 / 1472-6890-5-10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Шиффман М., Уиллер С.М., Дасгупта А., Соломон Д., Castle PE. Группа компаний ALTS. Сравнение прототипа ПЦР-анализа и гибридного захвата 2 для обнаружения ДНК канцерогенного вируса папилломы человека у женщин с сомнительными или слегка ненормальными мазками Папаниколау.Am J Clin Pathol. 2005; 124: 722–32. DOI: 10.1309 / E067-X0L1-U3CY-37NW. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Tornesello ML, Duraturo ML, Salatiello I, Buonaguro L, Losito S, Botti G, Stellato G, Greggi S, Piccoli R, Pilotti S, Stefanon B, De Palo G, Franceschi S, Буонагуро FM. Анализ вариантов вируса папилломы человека типа 16 у итальянских женщин с цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки. J Med Virol. 2004. 74: 117–26. DOI: 10.1002 / jmv.20154. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Feoli-Fonseca JC, Oligny LL, Brochu P, Simard P, Falconi S, Yotov WV.Изучение вируса папилломы человека (ВПЧ) 691 патологического образца из Квебека методом прямого секвенирования методом ПЦР. J Med Virol. 2001; 63: 284–92. DOI: 10.1002 / 1096-9071 (200104) 63: 4 <284 :: AID-JMV1003> 3.0.CO; 2-H. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ортис М., Торрес М., Муньос Л., Фернандес-Гарсия Е., Каналс Дж., Каборнеро А.И., Агилар Е., Баллестерос Дж., Дель Амо Дж., Гарсия-Саиз А. Онкогенный вирус папилломы человека (HPV) тип распределения и варианты HPV типа 16 E6 в двух испанских группах населения с различными уровнями риска инфицирования HPV.J Clin Microbiol. 2006; 44: 1428–34. DOI: 10.1128 / JCM.44.4.1428-1434.2006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Андерсон Т.П., Верно А.М., Бейнон К.А., Мердок Д.Р. Невозможность определения генотипа вируса простого герпеса с помощью анализа ПЦР в реальном времени и анализа кривой плавления из-за вариации последовательностей в местах связывания зонда. J Clin Microbiol. 2003. 41: 2135–2137. DOI: 10.1128 / JCM.41.5.2135-2137.2003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Горис Дж., Константинидис К.Т., Клаппенбах Дж. А., Коенье Т., Вандам П., Тидье Дж. М..Значения гибридизации ДНК-ДНК и их связь со сходством полногеномных последовательностей. Int J Syst Evol Microbiol. 2007; 57: 81–91. DOI: 10.1099 / ijs.0.64483-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Хуанг CC, Qiu JT, Kashima ML, Kurman RJ, Wu TC. Создание типоспецифичных зондов для обнаружения однокопийного вируса папилломы человека с помощью нового метода гибридизации in situ. Мод Pathol. 1998; 11: 971–7. [PubMed] [Google Scholar]
Наеф Ф., Лим Д.А., Патил Н., Магнаско М. Гибридизация ДНК с несовпадающими матрицами: исследование чипа.Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2002; 65: 040902. [PubMed] [Google Scholar]
Сорокин Н.В., Чечеткин В.Р., Лившиц М.А., Паньков С.В., Донников М.Ю., Грядунов Д.А., Лапа С.А., Заседателев А.С. Различение идеальных и несовпадающих дуплексов с микрочипами олигонуклеотидного геля: роль термодинамических и кинетических эффектов во время гибридизации. J Biomol Struct Dyn. 2005. 22: 725–34. [PubMed] [Google Scholar]
Schmitt M, Bravo IG, Snijders PJ, Gissmann L, Pawlita M, Waterboer T.Мультиплексное генотипирование вирусов папилломы человека на основе гранул. J Clin Microbiol. 2006; 44: 504–12. DOI: 10.1128 / JCM.44.2.504-512.2006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Таухид А.Р., Боденон С., Фавр М., Орт Г. Характеристика вируса папилломы человека типа 66 из инвазивной карциномы шейки матки. J Clin Microbiol. 1991; 29: 2656–2660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, Snijders PJ, Meijer CJ.Многоцентровая группа по изучению рака шейки матки Международного агентства по изучению рака: Эпидемиологическая классификация типов вируса папилломы человека, ассоциированных с раком шейки матки. N Engl J Med. 2003; 348: 518–27. DOI: 10.1056 / NEJMoa021641. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Prado JC, Calleja-Macias IE, Bernard HU, Kalantari M, Macay SA, Allan B, Williamson AL, Chung LP, Collins RJ, Zuna RE, Dunn ST, Ortiz-Lopez R, Barrera-Saldana HA, Cubie HA, Cuschieri K, von Knebel-Doeberitz M, Sanchez GI, Bosch FX, Villa LL.Мировое геномное разнообразие вирусов папилломы человека-53, 56 и 66, группы ВПЧ высокого риска, не связанных с ВПЧ-16 и ВПЧ-18. Вирусология. 2005. 340: 95–104. DOI: 10.1016 / j.virol.2005.06.024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Favre M, Kremsdorf D, Jablonska S, Obalek S, Pehau-Arnaudet G, Croissant O, Orth G. Два новых типа вируса папилломы человека (HPV54 и 55), характерные для генитальных опухолей, иллюстрируют множественность генитальных ВПЧ. Int J Cancer. 1990; 45: 40–6. DOI: 10.1002 / ijc.20109.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Шифф М., Беккер Т.М., Масук М., ван Ассельт-Кинг Л., Уиллер С.М., Альтобелли К.К., Норт CQ, Нахмиас А.Дж. Факторы риска интраэпителиальной неоплазии шейки матки у женщин юго-западных американских индейцев. Am J Epidemiol. 2000; 152: 716–26. DOI: 10.1093 / aje / 152.8.716. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Trimble CL, Piantadosi S, Gravitt P, Ronnett B, Pizer E, Elko A, Wilgus B, Yutzy W, Daniel R, Shah K, Peng S, Hung C, Roden R , Wu TC, Pardoll D. Спонтанная регрессия дисплазии шейки матки высокой степени: эффекты типа вируса папилломы человека и фенотипа HLA.Clin Cancer Res. 2005; 11: 4717–23. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-04-2599. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Zuna RE, Allen RA, Moore WE, Mattu R, Dunn ST. Сравнение генотипов вируса папилломы человека при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях высокой степени и инвазивной карциноме шейки матки: доказательства различий в биологическом потенциале предшественников поражений. Современная патология. 2004; 17: 1314–22. DOI: 10.1038 / modpathol.3800223. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Регулярное генотипирование вируса папилломы человека путем секвенирования ДНК в лабораториях общественных больниц
Заражение агентом рака.2007; 2: 11.
, 1 , 1 , 1 и 1
Sin Hang Lee
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Veronica S Vigliotti
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Джессика С. Виглиотти
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Сури Паппу
1 Отделение патологии , Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Автор, отвечающий за переписку.
Поступило 15 февраля 2007 г .; Принято 5 июня 2007 г.
Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе. при условии правильного цитирования оригинала.
Эта статья цитируется в других статьях в PMC.
Abstract
Предпосылки
Генотипирование вируса папилломы человека (ВПЧ) важно для последующего наблюдения за пациентами с персистирующей инфекцией ВПЧ и для оценки стратегии профилактики для отдельных пациентов, которые должны быть иммунизированы типоспецифическими вакцинами против ВПЧ.Целью этого исследования была оптимизация надежной «низкотемпературной» (LoTemp ™) системы ПЦР для оптимизации протоколов исследования вложенной ПЦР-амплификации ДНК ВПЧ с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК. Оптимизация протокола облегчает перенос этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику. В частности, снижение температуры на 10 ° C на каждом этапе термоциклирования во время in vitro амплификации ДНК дает более однородные продукты ПЦР. С помощью этого протокола очистка матрицы перед удлинением праймера ферментативного цикла больше не требуется.
Результаты
Геномную ДНК ВПЧ, экстрагированную из консервированных спиртом цервиковагинальных клеток на жидкой основе, сначала амплифицировали консенсусной парой праймеров MY09 / MY11 с последующей вложенной ПЦР с праймерами GP5 + / GP6 +. Гнездовые продукты ПЦР размером 150 п.н. подвергали прямому секвенированию ДНК. Гипервариабельную последовательность ДНК размером 34–50 п.н. ниже праймерного сайта GP5 + сравнивали с известными последовательностями ДНК ВПЧ, хранящимися в GenBank, с использованием онлайн-BLAST для генотипирования. Готовые к использованию реагенты для ПЦР-полимеразы LoTemp ™ оказались стабильными при комнатной температуре в течение как минимум 6 недель.Вложенная ПЦР выявила 107 изолятов ВПЧ в 513 цервиковагинальных клинических образцах, все подтвержденные секвенированием ДНК. ВПЧ-16 был наиболее распространенным генотипом, составляющим 29 из 107 положительных случаев (27,2%), за ним следует ВПЧ-56 (8,5%). Для сравнения: тест Digene HC2 обнаружил 62,6% из 107 изолятов ВПЧ и дал 11 (37,9%) из 29 положительных случаев ВПЧ-16 как «положительные для ВПЧ высокого риска».
Заключение
Готовая к использованию полимеразная система для ПЦР LoTemp ™, которая допускает термоциклирование при 85 ° C для денатурирования, 40 ° C для отжига и 65 ° C для удлинения праймера, может быть адаптирована для амплификации целевой ДНК HPV с помощью вложенной ПЦР и для подготовки клинических материалов для генотипирования методом прямого секвенирования ДНК.Генотипирование ВПЧ выполняется онлайн-алгоритмом BLAST гипервариабельной области L1. Последовательность ДНК включается в каждый отчет, направляемый врачу для сравнения при наблюдении за пациентами с персистирующей инфекцией ВПЧ, признанным промотором опухоли в индукции рака.
Предпосылки
Тестирование на вирус папилломы человека (ВПЧ) было введено, чтобы компенсировать низкую чувствительность и специфичность цитологического исследования мазка Папаниколау, часто используемого в качестве диагностического инструмента для пограничных предраковых поражений [1].Тест Digene Hybrid Capture 2 (HC2), единственный тест, одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), обычно используется для определения того, содержит ли суспензия цервиковагинальных клеток онкогенные ВПЧ «высокого риска» [2], часто действующие как сортировка для кольпоскопической оценки цитологически пограничных случаев [3-5]. Однако в настоящее время признано, что стойкая инфекция ВПЧ «высокого риска», а не простое присутствие самого вируса ВПЧ, является основным промотором, вызывающим предраковые поражения шейки матки и рак [6-9].Большинство инфекций ВПЧ, даже вызванных генотипами «высокого риска», являются временными при нормальной цитологии Папаниколау у сексуально активных молодых женщин [10-13]. У 93% первоначально инфицированных женщин тот же вирусный тип не обнаруживается при повторном обследовании через четыре менструальных цикла [14]. Средняя продолжительность положительной реакции, определяемой с помощью ПЦР для конкретного типа ВПЧ у этих молодых женщин, составляет 168 дней [15]. Множественные инфекции ВПЧ «высокого риска» не представляют более высокого риска развития неоплазии шейки матки по сравнению с единичной стойкой инфекцией ВПЧ высокого риска [16].Для развития и поддержания плоского интраэпителиального поражения высокой степени (SIL) риск наиболее высок у женщин, положительных на тот же генотип ВПЧ при повторном тестировании [6-8]. Вирусная нагрузка не является полезным параметром для прогнозирования высокого уровня SIL [17]. SIL высокого уровня часто ассоциируется с более низкой вирусной нагрузкой ДНК, чем это наблюдается в менее серьезно пораженных клетках [18].
Принимая во внимание недавний прогресс в понимании взаимосвязи между стойкой инфекцией ВПЧ и неоплазией шейки матки, для клинического ведения стойких инфекций необходима чувствительная и специфическая технология для обнаружения и точного определения генотипа ВПЧ.Тест HC2 не может быть преобразован в анализ генотипирования и связан со значительным количеством ложноотрицательных и ложноположительных результатов по сравнению с другими более строгими анализами генотипирования ВПЧ на основе ПЦР [19–23]. Сообщается, что он дает 25% ложноотрицательных результатов в случаях с подтвержденным биопсией высоким уровнем SIL, даже если все эти биопсии содержат ДНК ВПЧ высокого риска с помощью ПЦР [24]. «Отсутствие множества конкурентных, хорошо проверенных тестов» для анализа на ВПЧ цитируется как «проблема» при формулировании новых руководящих принципов лечения аномалий шейки матки [25].
Введение типоспецифических вакцин Gardasil ™ HPV в сексуально активное женское население также требует мониторинга генотипа HPV-инфекций до и после иммунизации для разработки стратегии профилактики для отдельных пациентов. Согласно «Справочному документу», представленному в FDA [26], введение вакцин против ВПЧ женщинам, у которых есть сопутствующие вакцино-релевантные инфекции ВПЧ, может увеличить риск на 44,6% развития предраковых поражений шейки матки высокой степени.Следовательно, было бы разумно выполнить анализ на ВПЧ, специфичный для генотипа, если есть подозрение на предшествующую инфекцию ВПЧ.
Целевая вложенная ПЦР-амплификация консервативной области ДНК гена L1 ВПЧ с консенсусными праймерами MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + или их эквивалентами с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК является общепринятым научным инструментом в исследованиях [21, 22,27]. Однако он не использовался в клинических лабораториях, потому что обращение с чувствительными к температуре реагентами ПЦР и требование очистки матрицы в протоколах ПЦР слишком трудоемко для рутинных применений.В этой статье отражен наш опыт использования высокопроизводительной, устойчивой к комнатной температуре надежной системы ДНК-полимеразы для облегчения переноса этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику. Каждый положительный результат на ВПЧ подтверждается генотипированием с прямым секвенированием ДНК гипервариабельной области гена L1. Информация о секвенировании ДНК ВПЧ может быть включена в лабораторный отчет для будущего клинического наблюдения за стойкими инфекциями.
Методы
Поскольку условия ПЦР, адаптированные для этого протокола, зависели от использования новой низкотемпературной, готовой к использованию умеренно термостабильной системы ДНК-полимеразы, чувствительности и специфичности ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® при амплификации ДНК ВПЧ были сначала проверены и сравнены с ДНК, полученной с помощью стандартных термостойких полимераз Taq , доступных на рынке.
Очищенные полноразмерные плазмидные ДНК типов -16, -18 и -6В ВПЧ, приобретенные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), использовали в качестве стандартов для разработки метода. Затем ДНК ВПЧ типа 16 использовали в качестве обычного положительного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали чистую воду молекулярной степени чистоты вместо экстракта ДНК.
Теоретическая чувствительность системы ПЦР, выбранной для этого исследования, была определена с использованием серийных 10-кратных разведений ATCC-сертифицированного стандарта HPV, содержащего 200 нг плазмидной ДНК HPV-16, -18 и -6B, с буфером TE для получения единственной копии. геномной ДНК на мкл в качестве матрицы для проведения первичной и вложенной ПЦР для каждого разведения в двух экземплярах.Теоретическое количество копий ДНК ВПЧ в матрице, используемой для каждой ПЦР MY09 / MY11, рассчитывалось в соответствии с общепринятой формулой пересчета [28]. Посредством секвенирования ДНК было подтверждено, что все вложенные продукты ПЦР соответствуют ожидаемым генотипам ВПЧ.
Для амплификаций ПЦР Taq реакционная смесь из 25 мкл содержала 100 мМ KCl, 20 мМ Трис-HCl pH 8,0, 25 мМ MgCl 2 , 2,5 мМ каждого дНТФ, 2,5 единицы полимеразы Takara Taq (Takara Bio Inc., Шига, Япония), 100 пмоль каждого консенсусного праймера (MY09 / MY11 или GP5 + / GP6 +) и 1 мкл ДНК ВПЧ при различных разведениях в буфере TE (или, если для вложенной ПЦР, 1 мкл ПЦР MY09 / MY11 продукты).Реакционную смесь подвергали 35 циклам амплификации в термоциклере MJ Research (Waltham, MA). Каждый цикл состоял из стадии денатурации при 94 ° C в течение 0,5 мин, стадии отжига при 55 ° C в течение 1 минуты и стадии удлинения цепи при 72 ° C в течение 1 минуты.
При проведении ПЦР ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® применялся протокол, описанный ниже для клинических образцов, за исключением того, что для сравнения с амплификацией ПЦР Taq использовали 35-цикловую амплификацию.
Клинические образцы, использованные для этого исследования, представляли собой 515 образцов цервиковагинальной цитологии на жидкой основе на спиртовой основе (Cytyc или Surepath), представленные врачами в Нью-Хейвене, штат Коннектикут, в рамках рутинных гинекологических осмотров.Возрастное распределение пациентов и патологические состояния шейки матки не были предметом данного исследования. Тест Digene HC2 на ВПЧ высокого риска, заказанный врачами, выполнялся в обычном порядке для каждого образца в одной из двух независимых клинических лабораторий (Quest Diagnostics Laboratory, Wallingford или Pathology & Laboratory Services, LLC, Woodbridge, CT) в соответствии с инструкциями, предоставленными Digene. Корпорация (Гейтерсбург, Мэриленд). Как правило, это были женщины моложе 30 лет, которым был поставлен Пап-цитологический диагноз атипичных плоскоклеточных клеток пониженной значимости (ASCUS), или женщины 30 лет и старше, независимо от результатов цитологического исследования Папаниколау [4].
После того, как материал был взят из каждого образца для рутинного цитологического исследования и анализа HCl, около 1 мл клеточных суспензий было помещено в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл, закодировано вслепую с номером случая и передано в лабораторию Милфордского госпиталя для лечения ВПЧ. ПЦР / секвенирование ДНК.
Экстракция ДНК из фиксированных спиртом клеток была выполнена в соответствии с протоколом Национального института рака (NCI) [29] с небольшими изменениями. Вкратце, суспензию клеток сначала центрифугировали в микроцентрифуге Eppendorf (модель 5424), оснащенной ротором (модель FA45-24-11), в течение 5 минут при 13000 об / мин.Клетки в осадке промывали 1 мл воды для реагентов, а затем 1 мл буфера, состоящего из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20, pH 8,1. Осадок промытых клеток ресуспендировали и расщепляли при 45–55 ° C в течение ночи в 100 мкл 0,1 мг / мл протеиназы K (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, штат Миссури), растворенных в том же буфере для промывки. После денатурирования белков в дигестате клеток в металлическом блоке, нагретом до 95 ° C в течение 10 мин, и заключительном центрифугировании дигестата при 13000 об / мин в течение 5 мин, супернатант осторожно пипетировали и помещали в чистую микроцентрифужную пробирку для использования. для ПЦР без дополнительной очистки или хранения при -20 ° C.
Для получения ДНК HPV использовали общую методологию первичной ПЦР-амплификации сегмента 450 п.н. гена L1 HPV с парой консенсусных праймеров MY09 / MY11 с последующей вложенной ПЦР с парой общих праймеров GP5 + / GP6 +. Вложенные продукты ПЦР размером 150 п.н. в положительных образцах были генотипированы прямым секвенированием ДНК [21,22] с небольшими модификациями, кратко изложенными ниже.
Для первичной ПЦР-амплификации в пробирку для ПЦР, содержащую 20 мкл LoTemp ™ HiFi ® , добавляли 1 мкл экстракта ДНК, 1 мкл 10-молярного праймера MY09, 1 мкл 10-молярного праймера MY11 и 2 мкл воды. Готовая к использованию смесь ДНК-полимеразы (HiFi DNA Tech, LLC, Trumbull, CT), которая содержит все компоненты, необходимые для низкотемпературной ПЦР, включая dNTP, Mg ++ , буфер, ДНК-полимеразы HiFi ® , запатентованную dsDNA плавящие агенты и консерванты dNTP, чтобы достичь конечного реакционного объема 25 мкл.Для термоциклирования температурные шаги термоциклера TC-412 (Techne Incorporated, Берлингтон, Нью-Джерси) были запрограммированы на начальный нагрев при 85 ° C в течение 2 минут с последующими 30 циклами при 85 ° C в течение 30 секунд, 40 ° C. в течение 30 секунд и 65 ° C в течение 1 мин. Окончательное удлинение составляло 65 ° C в течение 10 мин.
Для вложенной ПЦР «след» продуктов ПЦР MY09 / MY11 переносили стеклянной палочкой с чистой смачиваемой поверхностью диаметром около 1,5 мм во вторую пробирку для ПЦР, содержащую 25 мкл полной реакционной смеси вложенной ПЦР, состоящей из 20 мкл готовой к использованию смеси ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® , 1 мкл 10 мкмолярного праймера GP5 +, 1 мкл 10 мкмоль праймера GP6 + и 3 мкл воды, используя ту же программу термоциклирования, как описано выше.
После завершения первичной и вложенной ПЦР из каждой пробирки пипеткой отбирали 5 мкл продуктов ПЦР и смешивали с 2 мкл загрузочной жидкости для электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Гель исследовали в УФ-свете. Визуализация полосы продукта ПЦР 450 п.н. на дорожке MY09 / MY11 и / или полосы 150 п.н. на вложенной дорожке ПЦР на агарозном геле предоставила доказательства наличия ДНК ВПЧ в образце, ожидающего генотипирования с прямым секвенированием ДНК в качестве окончательного Проверка.
Для секвенирования ДНК, 1 мкл вложенных продуктов ПЦР, если они положительные, отбирали пипеткой из вложенной пробирки для ПЦР для прямого секвенирования ДНК, используя 1 мкл 5 мкмолярного праймера GP6 + в качестве праймера для секвенирования, 1 мкл BigDye ® Terminator (версия 1.1 / стандартный набор для секвенирования), 3,5 мкл 5-кратного буфера и 13,5 мкл воды в общем объеме 20 мкл для 20 циклов ферментативных реакций удлинения / прекращения праймера в термоцилиндре ABI модели 9600 в соответствии с протоколом, предоставленным производитель (Applied Biosystems).После очистки от красителя-терминатора с помощью колонки Centri-Sep (Princeton Separations, Adelphia, NJ) реакционную смесь загружали в автоматический четырехкапиллярный генетический анализатор ABI 3130 для анализа последовательности. Выравнивание последовательностей выполняли против различных стандартных последовательностей генотипов HPV, хранящихся в базе данных GenBank, с помощью онлайн-анализа BLAST, чтобы прийти к конкретному генотипированию.
Один мкл каждого экстракта ДНК помещали в отдельную пробирку для ПЦР с парой праймеров β-глобина [30] для амплификации геномной ДНК человека в качестве контроля адекватности образца.Праймеры для амплификации гена β-глобина представляли собой 1 мкл 80 мкмоль 5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC и 1 мкл 80 мкмоль 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC в 20 мкл готовой к использованию смеси ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® с 2 мкл добавлена вода. Использовалась упомянутая выше программа термоциклирования LoTemp ™.
Три (3) пробирки для ПЦР на образец обычно использовали для гена β-глобина, праймера MY09 / MY11 и вложенной амплификации GP5 + / GP6 +, соответственно.
Для проверки воспроизводимости этой процедуры ПЦР / ДНК-секвенирования аликвоты гидролизата 30 отдельных клинических образцов были протестированы в параллельных дублирующих сериях.Сравнивались повторяющиеся результаты трех ПЦР в каждом случае и результаты генотипирования положительных случаев путем секвенирования ДНК.
Образцы, которые не показали полосы ПЦР MY09 / MY11 или GP5 + / GP6 +, но показали доказательства положительной амплификации гена β-глобина, были интерпретированы как HPV-отрицательные. Образцы, которые не показали продуктов ПЦР на всех трех дорожках, были признаны неудовлетворительными для оценки из-за низкой экстракции ДНК или присутствия ингибитора ПЦР. Было два (2) неудовлетворительных дела из 515 обработанных.Остальные 513 случаев были признаны удовлетворительными для анализа. Из этих 513 случаев 107 были положительными на вложенные продукты ПЦР, все они оказались ДНК ВПЧ прямым секвенированием ДНК с использованием GP6 + в качестве праймера для секвенирования.
Образцы, инфицированные более чем одним генотипом ВПЧ, были обозначены появлением множества неоднозначных или перекрывающихся пиков в записях секвенирования ДНК. Для каждой из этих смешанных инфекций вложенные продукты ПЦР были подвергнуты дополнительным четырем индивидуальным реакциям удлинения / завершения праймера, чтобы исключить инфицирование вакциной Гардасил ™ ВПЧ, а именно ВПЧ типов -16, -18, -6 или -11, с использованием следующих типоспецифичных праймеров [31].
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-16 5′-GCTGCCATATCTACTTCAGA-3 ‘
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-18 5′-GCTTCTACACAGTCTCCTGT-3′
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-6 3′-GTGCATCTCCG ‘
Праймер для секвенирования, специфичный для типа HPV-11 5′-GTGCATCTGTGTCTAAATCTG-3′
Все олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров для этого исследования, были синтезированы и очищены с помощью картриджа для очистки олигонуклеотидов (OPC) лабораторией синтеза ДНК отделения патологии Университет (Нью-Хейвен, Коннектикут).
Чтобы избежать перекрестного заражения, для тестов амплификации нуклеиновых кислот были выделены три отдельные комнаты без рециркуляции воздуха. Каждая из двух комнат была оборудована 32-дюймовой рабочей станцией ПЦР (AirClean Systems, Роли, Северная Каролина). Все процедуры предварительной амплификации выполнялись на станции ПЦР I. Все процедуры после ПЦР выполнялись на станции ПЦР II, включая подготовку к вложенная ПЦР и реакция секвенирования.Гель-электрофорез и секвенирование ДНК проводили в третьей комнате для изоляции.Никакие материалы после ПЦР или любые предметы, загрязненные ампликонами, или оборудование, используемое в комнатах после ПЦР, не допускались в рабочее пространство до ПЦР.
Результаты
ДНК-полимераза LoTemp ™ HiFi ® была примерно в 10 раз эффективнее ДНК-полимеразы Taq при амплификации плазмидной ДНК ВПЧ с помощью ПЦР MY09 / MY11 и примерно в 100–1000 раз эффективнее при первой амплификации с помощью вложенной ПЦР GP5 + / GP6 + в тандеме. Технология вложенной ПЦР, описанная в этой статье, оказалась чувствительным методом для обнаружения 1–10 копий очищенной геномной ДНК типов HPV -16, -18 или -6B.Но 10 4 -10 5 копий геномной ДНК были необходимы в качестве ПЦР-матриц для УФ-визуализации положительной полосы ампликона праймера MY09 / MY11 после электрофореза (рис.). Специфичность всех вложенных продуктов ПЦР была подтверждена генотипированием ВПЧ с прямым секвенированием ДНК.
Сравнительная амплификация ДНК HPV-16 с помощью ДНК-полимеразы Taq и ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® ДНК-полимеразы . Дорожки 1–8: матрица плазмидной ДНК ВПЧ-16 при 85 × 10 1 , 85 × 10 2 , 85 × 10 3 , 85 × 10 4 , 85 × 10 5 , 85 × 10 6 , 85 × 10 7 и 85 × 10 8 копий на миллилитр.NC: отрицательный контроль. M: молекулярный маркер. Стрелки указывают нижний предел обнаружения вложенной ПЦР (A) и первичной ПЦР 1 st (B) с ДНК-полимеразой Takara Taq и ДНК-полимеразой LoTemp ™ HiFi ® соответственно.
Воспроизводимость этого вложенного ПЦР-анализа при обнаружении ДНК ВПЧ в клинических образцах была подтверждена запуском двух параллельных наборов ПЦР с расщепленным дигестатом одного образца в качестве парных матриц, включая ген β-глобина, праймер MY и GP амплификации вложенных праймеров в каждом наборе для 30 HPV-положительных случаев.Пара идентичных результатов на геле электрофореза была получена во всех трех амплификациях для 30 разделенных образцов (рис.). Вложенные продукты ПЦР, полученные на наборах дубликатов, были подтверждены секвенированием ДНК как принадлежащие к одному и тому же генотипу HPV.
Вложенная ПЦР HPV в клинических образцах и воспроизводимость . В агарозном геле показаны продукты ПЦР целевых ДНК, экстрагированных из двух клинических образцов в двух экземплярах. Ампликон ДНК-мишени β-глобина имеет длину 110 п.н., что ясно видно на дорожках 25 и 26 (№ 1210), но почти не видно на дорожках 31 и 32 (№ 1211).Совместная амплификация других фрагментов геномной ДНК человека и положительный вложенный ампликон ПЦР обеспечивают адекватность образцов в обоих образцах. Молекулярная линейка = 100–1000 п.н. (крайняя слева). Дорожки 25/26, 27/28, 29/30 = ген β-глобина, MY09 / MY11, GP5 + / GP6 + ПЦР, соответственно — образец № 1210. Дорожки 31/32, 33/34, 35/36 = ген β-глобина, MY09 / MY11, GP5 + / GP6 + ПЦР, соответственно — образец № 1211
Для клинических образцов первичная ПЦР MY09 / MY11 генерировала отдельный продукт размером 450 п.н. полоса после 30 повторных циклов амплификации только в 37 из 107 HPV-положительных случаев, обнаруженных с помощью вложенной ПЦР.Более 65% клинических ВПЧ-положительных ампликонов полагались на вложенную ПЦР для УФ-визуализации. Без вложенной ПЦР ампликон ПЦР MY09 / MY11 часто был замаскирован из-за совместной амплификации других молекул ДНК в клинических образцах (рис.).
Для некоторых изолятов, особенно изолятов HPV-39 и HPV-73, стандартная вложенная ПЦР GP5 + / GP6 + не смогла амплифицировать целевой фрагмент ДНК, даже если ПЦР-амплификация праймера MY09 / MY11 была успешной. Эти случаи были выявлены при гель-электрофорезе, показав положительный ПЦР-ампликон MY09 / MY11 450 п.н. в отсутствие ожидаемого сопутствующего вложенного продукта ПЦР размером 150 п.н.Для этих штаммов HPV с помощью геминизированной ПЦР с праймерами MY11 / GP6 + был получен гомогенный ампликон (рис.) Для прямого секвенирования ДНК.
После циклического секвенирования алгоритмы BLAST путем выравнивания последовательности ДНК из 34 п.н. в гипервариабельной области гена L1 ниже сайта связывания GP5 + с известными последовательностями генотипа ВПЧ, хранящимися в базе данных GenBank, обычно определяли генотип выявлены изоляты ВПЧ [32]. 100% совпадение «идентичностей» между «запросной» последовательностью и «субъектной» последовательностью было достигнуто для каждого окончательного генотипирования (рис.). Это отслеживание последовательности с его онлайн-алгоритмом BLAST для генотипирования было включено в отчет о клиническом наблюдении за стойкими инфекциями. Однако HPV-16 имеет множество вариантов последовательностей, некоторые из которых имеют идентичную последовательность в этой области с некоторыми штаммами HPV-31 и HPV-33, и для различения генотипов требуется алгоритм BLAST с последовательностью 50 п.н.
Последовательность ДНК вложенного продукта ПЦР ниже GP5 + для генотипирования . Это типичная последовательность ДНК, вырезанная из цветовой дорожки ниже участка связывания GP5 + гена L1 ДНК ВПЧ.Анализ выравнивания BLAST последовательности из 34 (до 50) п.н. этой гипервариабельной области дает однозначные доказательства генотипа 66 HPV на основе базы данных, хранящейся в GenBank.
Из 513 цервиковагинальных образцов на жидкой основе метод вложенной ПЦР выявил по крайней мере один штамм ВПЧ из 107, с общим положительным показателем 20,9%, включая 74 случая, укрывающих по крайней мере один из 13 типов, на которые нацелен Digene HC2 » тест на ВПЧ высокого риска и 33 случая с типами ВПЧ «низкого риска» (таблица).Наиболее распространенным генотипом в районе Нью-Хейвена оказался ВПЧ-16, за которым следует ВПЧ-56. Совокупный уровень распространенности ВПЧ-16 и ВПЧ-18 составил 32,8% от общего числа изолятов.
Таблица 1
Генотипирование ВПЧ с помощью секвенирования ДНК по сравнению с тестом Digene HC2
ПЦР / ДНК-секвенирование
Результаты теста Digene HC2
Тип Случаи
Распространенность (%)
Высокий риск +
Отрицательный
16
29
(27.2)
11
18
56
9
(8,5)
9
0
31
7
(6,5)
2
2
2
2 902 6
6
(5,6)
2
4
18
6
(5,6)
6
0
54
0 6 902
3
58
6
(5.6)
5
1
66
6
(5,6)
6
0
59
4
(3,7)
0 45
3
(2,8)
2
1
83
3
(2,8)
2
1
32
07 2 902
2
35
2
(1.9)
1
1
39
2
(1,9)
2
0
40
2
(1,9)
2
0 52
2
(1,9)
1
1
33
1
(0,9)
1
0
53
0 1 902
0
62
1
(0.9)
1
0
68
1
(0,9)
1
0
70
1
(0,9)
0,9)
1 72
1
(0,9)
0
1
73
1
(0,9)
0
1
M16
07 1
0
M 16, 18
1
(0.9)
1
0
M другие
3
(2,9)
1
2
Итого
107
(100)
HC2 Уровень обнаружения ВПЧ = 67/107 = 62,6%
Образцы
513
9025
513
.9
Тест на ВПЧ высокого риска HC2 выявил только 11 (37,9%) из 29 случаев ВПЧ-16 как положительные. Однако он успешно идентифицировал все образцы, содержащие ВПЧ-56 и ВПЧ-18, как положительные на ВПЧ высокого риска. Чувствительность теста HC2 при обнаружении заранее определенных генотипов ВПЧ «высокого риска» резюмируется следующим образом:
HPV-18 100%
HPC-33 100%
HPV-39 100%
HPV-56 100%
HPV-59 100%
HPV-68 100%
HPV-58 83.3%
HPV-31 71,4%
HPV-45 66,7%
HPV-35 50%
HPV-52 50%
HPV-16 37,9%
Хотя HPV-54, -66, -83, -53 и -62 не были включены в пробу гибридизационного коктейля, эти генотипы часто сообщались как положительные на ВПЧ высокого риска с помощью теста HC2 (таблица).
Среди 107 вложенных ПЦР-положительных образцов секвенирование ДНК с консенсусным общим праймером GP6 + дало множественные перекрывающиеся нечитаемые последовательности в 5 случаях.Использование индивидуального типоспецифического секвенирования праймеров для HPV-6, -11, -16 и -18 доказало, что один из них содержал HPV-16, но не три других генотипа, и что один содержал смесь HPV-16 и HPV. -18, но не два других генотипа. Для оставшихся 3 образцов смешанной инфекции повторное индивидуальное секвенирование ДНК не дало читаемой реакции удлинения / терминации праймера с любым из четырех типоспецифичных праймеров. Следовательно, эти последние 3 случая были сочтены множественными инфекциями, вызванными ВПЧ, отличными от четырех вакцин-релевантных типов, и сгруппированы в категорию «низкого риска».
Из 513 изученных случаев тест Digene HC2 классифицировал 403 пробы как отрицательные, 75 как положительные для ВПЧ «высокого риска» и 35 как неудовлетворительные для оценки. Эти результаты сравнивали с результатами, полученными с помощью анализа вложенной ПЦР (таблица). Так как тест Дигена охватил только генотипы ВПЧ «высокого риска», образцы, инфицированные ВПЧ, отличные от 13 типов, на которые нацелена проба коктейля из ВПЧ «высокого риска» HC2, будут классифицированы как отрицательные или неудовлетворительные для оценки (неудовлетворительно). Таким образом, тест HC2 идентифицировал 50 из 74 HPV-положительных образцов «высокого риска», обнаруженных с помощью вложенной ПЦР.Расчетная чувствительность теста Digene HC2 составила 50/74 = 67,6% по сравнению с анализом вложенной ПЦР. Поскольку в HC2 было зарегистрировано в общей сложности 75 случаев заражения ВПЧ «высокого риска», его аналитическая специфичность составила 50/75 = 66,7%. Два случая, признанных неудовлетворительными для оценки ПЦР и отрицательными с помощью теста HC2, были исключены из общего числа 513 случаев, введенных для анализа.
Таблица 2
Сравнение результатов вложенной ПЦР / секвенирования ВПЧ и результатов теста HC2
Результаты ПЦР
902
907 Высокий риск
Низкий риск
Unsat .
Всего
Результаты HC2
Отрицательное
364
23
16
902 902 902 902 902 902 902 902 902 902 8
50
17
0
75
Низкий риск
NP
NP
NP
902
34
1
0
35
Всего
406
74
33
0
9002 9002
525 Умеренный ™ HiFi ® ДНК-полимеразы представляют собой генно-инженерные производные ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus (Bst) , которая была впервые введена для разрешения структуры шпильки в классическом секвенировании ДНК по Сэнгеру Йе и Хонгом [33]. Bst ДНК-полимераза с оптимальной температурой удлинения праймера 65 ° C чрезвычайно стабильна, способна сохранять качество своего секвенирования в рабочем растворе при комнатной температуре в течение нескольких недель в условиях роботизированной автоматизации [34]. Модификация аминокислотной последовательности природной ДНК-полимеразы Bst с помощью сайт-направленных генетических мутаций увеличивает термостойкость фермента [35], что открыло путь к разработке новых термостабильных ДНК-полимераз для повторных реакций удлинения праймера ниже 85 ° C.Протокол ПЦР ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® использует свойства модифицированной ДНК-полимеразы Bst при пониженных циклических температурах и свойствах высокой процессивности.
Использование ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® для амплификации ДНК ВПЧ исключает все этапы очистки матрицы, которые обычно требуются перед ПЦР или реакцией секвенирования [21,22,32]. Поскольку готовая к использованию смесь полимераз содержит все необходимые ингредиенты для ПЦР, необходимость в пипетировании на дому минимальна.Поскольку ДНК-полимераза и другие компоненты реагента стабилизированы для хранения при комнатной температуре, нет необходимости хранить ледяные блоки при настройке ПЦР. Поскольку в этой системе используются химические плавящие агенты для денатурирования дцДНК и высокопроизводительная ДНК-полимераза для удлинения нуклеотидных праймеров при частичной изостабилизации, она позволяет проводить термоциклирование при 85 ° C для денатурирования, 40 ° C для отжига и 65 ° C для удлинения праймера соответственно. При пониженных температурах циклирования скорость индуцированных нагреванием мутаций [36], а именно депуринизации [37] и дезаминирования [38] азотистых оснований в молекулах ДНК во время амплификации ПЦР снижается.В результате продукты ПЦР более однородны.
В этом отчете мы продемонстрировали, что система ПЦР LoTemp ™ может амплифицировать 1–10 копий очищенного HPV-16, -18 или -6B для создания соответствующего типоспецифичного вложенного продукта ПЦР размером 150 п.н. Чувствительность ПЦР LoTemp ™ при обнаружении плазмидной ДНК ВПЧ примерно в 10 раз выше, чем у традиционных термостойких ДНК-полимераз Taq без вложенной амплификации (рис.). Вложенная ПЦР повысила аналитическую чувствительность обнаружения ДНК ВПЧ на суспензиях цервиковагинальных клеток [21,22,32], что также подтверждается нашим опытом (рис.). Вложенная ПЦР также служит для устранения большинства мешающих веществ, которые в противном случае, возможно, пришлось бы удалить очисткой колонки в этой процедуре.
Хотя согласованные общие пары праймеров MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + использовались для амплификации высококонсервативной области гена L1 всех генотипов ВПЧ, их эффективность в амплификации целевой ДНК варьируется от одного генотипа ВПЧ к другому с противоречивыми паттернами [22] . Мы обнаружили, что некоторые изоляты HPV-39 и HPV-73 не амплифицируются парой праймеров GP5 + / GP6 + ни в первичной ПЦР, ни во вложенной ПЦР.Вторая амплификация с парой праймеров GP5 + / MY09 и GP6 + / MY11 дает более длинный и более короткий продукт ПЦР, соответственно. Геминизированный продукт ПЦР GP6 + / MY11 (рис.) Подходит для прямого секвенирования ДНК. Неудача GP5 + / GP6 + при амплификации HPV-39 [39] и других типов HPV [22,32] в клинических образцах является хорошо известной технической проблемой, если эта единственная пара праймеров используется для обнаружения HPV. Однако GP5 + и GP6 + являются отличными вложенными праймерами для ПЦР для подготовки матриц для генотипирования HPV с прямым секвенированием ДНК.
Оптимизация протокола ПЦР важна для обнаружения ВПЧ. Без оптимизации метод ПЦР с использованием одного набора консенсусных праймеров для амплификации может иметь более низкую чувствительность, чем тест Digene HC2 [40]. Используя первоначальную 40-цикличную амплификацию клинических образцов, Johnson et al . [21] сообщили, что вложенная ПЦР обычно увеличивает чувствительность метода ПЦР на ВПЧ примерно на 60%. С протоколом ПЦР, представленным в этой статье, это различие усиливается за счет принятия 30-цикловой амплификации.Преимущество уменьшения количества циклов амплификации состоит в том, что коамплификация неспецифических мешающих молекул ДНК уменьшается в первичной ПЦР в пользу создания специфических вложенных продуктов ПЦР для прямого секвенирования ДНК.
Используя наш оптимизированный протокол, вложенная ПЦР выявила 107 HPV-положительных случаев среди 513 клинических образцов (таблица). Было идентифицировано двадцать три (23) генотипа ВПЧ, включая 12 из 13 генотипов «высокого риска», т.е. ВПЧ-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -52, -56, -58, -59 и -68, которые нацелены на тест Digene HC2.Отсутствие репрезентативности HPV-51, который также является мишенью для теста HC 2, вероятно, отражает низкую региональную распространенность этого генотипа. Используя те же праймеры для вложенной ПЦР с последующим генотипированием с секвенированием ДНК, было обнаружено, что HPV-51 является относительно распространенным генотипом в Германии, составляя около 5% от общего числа обнаруженных изолятов HPV [22]. Однако среди 894 изолятов ВПЧ в Дании он не был зарегистрирован ни разу [21].
Гипервариабельная область последовательности ДНК ниже сайта связывания GP5 + имеет решающее значение для генотипирования L1 ВПЧ.Хотя большинство генотипов ВПЧ можно определить путем выравнивания последовательности длиной 34 п.н. в этой области с базой данных GenBank [32], для точного генотипирования может потребоваться выравнивание более длинной последовательности, например длиной 50 п.н., когда результат алгоритма BLAST неоднозначен. . Если для генотипирования полагаться на последовательность из 34 пар оснований, количество инфекций HPV-16 может быть недооценено.
Для разработки этого протокола мы обнаружили, что использование 1 мкл 5 мкмоль OPC-очищенного олигонуклеотида GP6 + вместо рекомендованного производителем 3.2 мкмоль раствор в качестве праймера для секвенирования, по-видимому, дает более согласованные результаты секвенирования для типирования различных изолятов ВПЧ. Концентрация праймера может нуждаться в корректировке, если более высокий уровень GP6 + используется в качестве праймера для секвенирования ДНК.
Из 107 ПЦР-положительных образцов тест Digene HC2 классифицировал 67 как ВПЧ-положительные, уровень обнаружения 62,6% (таблица). Когда для сравнения используются только нацеленные на HC2 генотипы HPV «высокого риска», вложенная ПЦР выявляет 74 HPV-положительных случая, в то время как тест HC2 выявляет 50 в этой группе с аналитической чувствительностью 67.6% (50/74).
Наиболее распространенным является ВПЧ-16, составляющий 27,2% от общего числа изолятов (таблица). Этот процент распространенности ВПЧ-16 почти идентичен процентному соотношению, о котором сообщают другие специалисты с использованием гнездовой ПЦР / ДНК-секвенирования MY / GP, генотипирования суспензий цервиковагинальных клеток, например 26% в Дании [21] и 26,2% в Германии [22]. Тест Digene HC2 выявил 11 из 29 ПЦР-положительных случаев ВПЧ-16 с показателем обнаружения 37,9%, что является неожиданно низким. Поскольку все положительные результаты ПЦР на ВПЧ-16 были подтверждены секвенированием ДНК для генотипирования с уровнем распространенности, аналогичным тем, которые обычно встречаются в западном мире, на основе той же методологии [21,22], и поскольку тесты Digene HC2 проводились две независимые клинические лаборатории, должным образом сертифицированные органами здравоохранения, достоверность результатов отдельных тестов, кажется, не подлежит сомнению.Несоответствие, вероятно, связано с тем, что в данной популяции пациентов существует множество вариантов последовательностей HPV-16 [41], которые могут быть не все нацелены на зонд коктейля РНК HC2, но имеют общую высококонсервативную область гена L1, которая праймеры MY09 / MY11 эффективно амплифицируются. В пользу этой интерпретации говорит тот факт, что тест HC2 правильно определил все случаи ВПЧ-18, ВПЧ-39, ВПЧ-56 и ВПЧ-59 как «группы высокого риска» по одним и тем же данным.
ВПЧ-56 — второй по частоте обнаруженный генотип высокого риска (8.5%), за которыми следуют ВПЧ-31, -18, -54, -58 и -66, с примерно одинаковым уровнем распространенности (5,6–6,5%). Общее количество случаев ВПЧ-16 и -18 составляет только 32,8% от единичных изолятов ВПЧ в нашей серии. ВПЧ-18, по-видимому, также играет относительно небольшую роль в возникновении патологии шейки матки в Канаде [42].
Сообщалось другими [43], что тест высокого риска Digene HC2 может обнаруживать типы ВПЧ -53, -54, -62, -66 и -83 и маркировать их как ВПЧ высокого риска, хотя эти Генотипы не являются преднамеренно целевыми в его коктейльном зонде высокого риска.Наши данные подтверждают эти перекрестные реакции (таблица). Вариация последовательностей в сайтах связывания зонда [44] и неспецифическое связывание между зондом и несовпадающей ДНК, не являющейся мишенью [45-48], являются хорошо известными источниками ошибок, если гибридизация нуклеиновых кислот используется для микробного и вирусного генотипирования. Когда продукты ПЦР GP5 + / GP6 + с гипервариабельной последовательностью ДНК нацелены на разработку метода мультиплексного генотипирования [49], обнаруживается, что ДНК-зонд, разработанный для HPV-66, недавно признанного типа высокого риска [50-52], реагирует с ВПЧ-52 и зондом для ВПЧ-82 с ВПЧ-51 из-за перекрестной гибридизации, несмотря на наличие четырех несовпадений оснований в каждой паре.Некоторые эксперты [40] считают непреднамеренные перекрестные реакции теста Digene HC2 с нецелевыми типами ВПЧ, такими как ВПЧ-66, которые иногда могут вызывать рак, «удачными». Однако польза от этих перекрестных реакций для пациентов требует дополнительного подтверждения.
Пятьдесят процентов (50%) изолятов ВПЧ-54 возвращаются тестом на ВПЧ как ВПЧ высокого риска. ВПЧ-54 был классифицирован как вирус низкого риска [51,53], но обнаружено, что он связан с 40-кратным увеличением риска среди женщин американских индейцев с CIN 2/3.Только ВПЧ-16 показал более высокий риск, чем ВПЧ-54 среди этой субпопуляции [54]. При использовании информации о генотипировании ВПЧ для наблюдения за стойкими инфекциями, возможно, придется учитывать генетический состав пациента [55].
Для случаев смешанной инфекции мы выбираем отдельные праймеры, специфичные для HPV-6, -11, -16 и -18 [31], чтобы выполнить секвенирование ДНК с индивидуальным специфическим праймером, чтобы определить, включает ли смешанная инфекция какие-либо из этих вакцин- соответствующие типы ВПЧ. Обоснование этого выбора заключается в том, что большинство множественных инфекций ВПЧ являются временными [6-15].Непосредственную озабоченность пациентки и ее лечащего врача вызывает вопрос о том, вызвана ли смешанная инфекция каким-либо из типов ВПЧ, имеющих отношение к вакцине, если пациент подумывает о вакцинации.
Низкий процент (<5%) множественных инфекций ВПЧ, наблюдаемый в нашей серии, мог быть необъективным, потому что большая часть образцов для этого исследования была собрана в офисе индивидуального частного практикующего врача, и эта группа образцов имела исключительно низкий положительный результат. частота и отсутствие множественных инфекций ВПЧ.Известно, что частота множественных инфекций ВПЧ варьируется среди популяций пациентов, а также зависит от стадии канцерогенеза. Множественные инфекции HPV были обнаружены менее чем в 5% HPV-положительных образцов от пациентов с инвазивным раком, но более чем в 15% положительных образцов в контрольной группе [27]. Множественные инфекции HPV имеют тенденцию развиваться в отдельные инфекции HPV, поскольку инфекция становится хронической и устойчивой, в то время как цитопатология шейки матки прогрессирует от метаплазии, LSIL, HSIL, карциномы in situ до инвазивного рака [56].
Таким образом, мы сообщили о нашем опыте адаптации хорошо охарактеризованного протокола ПЦР / секвенирования ДНК для рутинного генотипирования ВПЧ. Мы считаем, что чувствительный и специфический анализ ВПЧ с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК позволит получить полезную информацию для отслеживания стойких инфекций при направлении пациентов с «высоким риском» развития HSIL, а не пациентов с «ВПЧ высокого риска». до кольпоскопической оценки.
Заключение
Технология вложенной ПЦР с использованием консенсусных праймеров MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + для целевой амплификации ДНК ВПЧ может использоваться в диагностических лабораториях для рутинного обнаружения ВПЧ и подготовки клинических материалов для генотипирования путем прямого секвенирования ДНК.Мы адаптировали недавно внедренную систему низкотемпературной ПЦР и оптимизировали протокол, чтобы облегчить перенос этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику для точного генотипирования ВПЧ, которое является ценным инструментом для последующего наблюдения за пациентами с устойчивой инфекцией ВПЧ, признанной опухолью. промотор в индукции рака.
Тест ДНК вируса папилломы человека HC2-REF 5199-1220 Digene Corporation, Gaithersburg, MD 20878 USA. 2005.
Гогола Дж., Ван Динь Т., Луччи Дж. А., 3, Смит Е., Ханниган Е. В.. Тестирование на вирус папилломы человека для сортировки в направленной популяции. J Low Genit Tract Dis. 2001; 5: 29–32. DOI: 10.1046 / j.1526-0976.2001.51006.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Wu HH, Allen SL, Kirkpatrick JL, Elsheikh TM. Рефлекторный тест ДНК вируса папилломы человека высокого риска полезен при сортировке женщин с атипичными плоскоклеточными клетками и не может исключить плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени. Diagn Cytopathol. 2006; 34: 707–10. DOI: 10.1002 / dc.20497. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Wallin KL, Wiklund F, Angstrom T., Bergman F, Stendahl U, Wadell G, Hallmans G, Dillner J. Типоспецифическая персистентность ДНК вируса папилломы человека до развития инвазивной цервикальной рак.N Engl J Med. 1999; 341: 1633–8. DOI: 10.1056 / NEJM1993412201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Kjaer SK, van den Brule AJ, Paull G, Svare EI, Sherman ME, Thomsen BL, Suntum M, Bock JE, Poll PA, Meijers CJ. Типоспецифическая персистенция вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска как индикатор плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки высокой степени у молодых женщин: проспективное последующее исследование на популяционной основе. BMJ. 2002; 325: 572–6. DOI: 10.1136 / bmj.325.7364.572. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, Gilkison G, Arends MJ, Graham C, McGoogan E.Стойкая ВПЧ-инфекция высокого риска, связанная с развитием неоплазии шейки матки, в проспективном популяционном исследовании. J Clin Pathol. 2005. 58: 946–50. DOI: 10.1136 / jcp.2004.022863. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Якобс М.В., Вальбумерс Дж. М., Снайдерс П. Дж., Вурхорст Ф. Дж., Верхейен Р. Х., Франсен-Даалмейер Н., Мейер С. Дж..Распределение 37 мукозотропных типов ВПЧ у женщин с цитологически нормальными мазками из шейки матки: возрастные закономерности для типов высокого и низкого риска. Int J Cancer. 2000; 87: 221–7. DOI: 10.1002 / 1097-0215 (20000715) 87: 2 <221 :: AID-IJC11> 3.0.CO; 2-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Herrero R, Hildesheim A, Bratti C, Sherman ME, Hutchinson M, Morales J, Balmaceda I, Greenberg MD, Alfaro M, Burk RD, Wacholder S, Plummer M, Schiffman M Популяционное исследование папилломавирусной инфекции и неоплазии шейки матки в сельских районах Коста-Рики.J Natl Cancer Inst. 2000; 92: 464–74. DOI: 10.1093 / jnci / 92.6.464. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Molano M, Posso H, Weiderpass E, van den Brule AJ, Ronderos M, Franceschi S, Meijer CJ, Arslan A, Munoz N, Исследовательская группа ВПЧ Распространенность исследования ВПЧ и детерминанты Инфекция ВПЧ среди колумбийских женщин с нормальной цитологией. Br J Рак. 2002. 87: 324–33. DOI: 10.1038 / sj.bjc.6600442. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Rousseau MC, Pereira JS, Prado JC, Villa LL, Rohan TE, Franco EL.Коинфекция шейки матки с типами вируса папилломы человека (ВПЧ) как предиктор приобретения и сохранения инфекции ВПЧ. J Infect Dis. 2001; 184: 1508–17. DOI: 10,1086 / 324579. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Hinchliffe SA, van Velzen D, Korporaal H, Kok PL, Boon ME. Кратковременность цервикальной ВПЧ-инфекции у сексуально активных молодых женщин с нормальной цитологией шейки матки. Br J Рак. 1995; 72: 943–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Brown DR, Shew ML, Qadadri B, Neptune N, Vargas M, Tu W, Juliar BE, Breen TE, Fortenberry JD.Продольное исследование генитальной инфекции папилломы человека в когорте женщин-подростков, за которыми внимательно наблюдали. J Infect Dis. 2005; 191: 182–92. DOI: 10,1086 / 426867. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, Seagar AL, Arends MJ, Moore C, Gilkisson G, McGoogan E. Множественные инфекции HPV высокого риска распространены в шейном отделе матки неоплазия и молодые женщины в популяции скрининга шейки матки. J Clin Pathol. 2004. 57: 68–72. DOI: 10.1136 / jcp.57.1.68.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Венсвин К.В., Кейджи М.Дж., Нагелькерке, штат Нью-Джерси, Велдхуизен Р.В., Тримбос Дж. Б.. Может ли полуколичественная оценка вирусной нагрузки вируса папилломы человека предсказать цитологический или гистологический результат у женщин с атипичными плоскоклеточными или железистыми клетками неопределенного значения цитологии? Eur J Gynaecol Oncol. 2005; 26: 393–7. [PubMed] [Google Scholar]
Sherman ME, Wang SS, Wheeler CM, Rich L, Gravitt PE, Tarone R, Schiffman M. Детерминанты вирусной нагрузки папилломы человека среди женщин с гистологической цервикальной интраэпителиальной неоплазией 3: доминирующее влияние окружающей среды. степень поражения.Биомаркеры эпидемиологии рака Пред. 2003; 12: 1038–44. [PubMed] [Google Scholar]
Castle PE, Schiffman M, Burk RD, Wacholder S, Hildesheim A, Herrero R, Bratti MC, Sherman ME, Lorincz A. Ограниченная перекрестная реактивность гибридного Capture 2 с неонкогенными типами вируса папилломы человека. Биомаркеры эпидемиологии рака и пред. 2002; 11: 1394–9. [PubMed] [Google Scholar]
Вернон С.Д., Унгер Э.Р., Уильямс Д. Сравнение обнаружения и типирования вируса папилломы человека с помощью циклического секвенирования, линейного блоттинга и гибридного захвата.J Clin Microbiol. 2000; 38: 651–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Джонсон Т., Брайдер К., Корбет С., Фомсгаард А. Обычное генотипирование образцов вируса папилломы человека в Дании. APMIS. 2003; 111: 398–404. DOI: 10.1034 / j.1600-0463.2003.t01-1-1110204.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Speich N, Schmitt C, Bollmann R, Bollmann M. Изучение 2916 цитологических образцов вируса папилломы человека (HPV) с помощью ПЦР и секвенирования ДНК: спектр генотипов пациентов из Западной Германии.J Med Microbiol. 2004; 53: 125–8. DOI: 10.1099 / jmm.0.05447-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Kosel S, Burggraf S, Mommsen J, Engelhardt W., Olgemoller B. Типоспецифическое обнаружение вирусов папилломы человека в обычных лабораторных условиях — сравнение улучшенной чувствительности и специфичности ПЦР и анализа последовательностей для прямой гибридизации. Clin Chem Lab Med. 2003. 41: 787–91. DOI: 10.1515 / CCLM.2003.119. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Lonky NM, Felix JC, Naidu YM, Wolde-Tsadik G.Сортировка атипичных плоскоклеточных клеток неопределенного значения с гибридным захватом II: кольпоскопия и гистологическая корреляция вируса папилломы человека. Obstet Gynecol. 2003; 101: 481–9. DOI: 10.1016 / S0029-7844 (02) 02715-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Stoler MH, Castle PE, Solomon D, Schiffman M. Расширенное использование тестирования на ВПЧ в гинекологической практике в соответствии с управлением под контролем ASCCP требует использования хорошо проверенных тестов. Am J Clin Pathol. 2007; 127: 335–7. [PubMed] [Google Scholar]
Справочный документ VRBPAC Четырехвалентная вакцина против ВПЧ Гардасил ™.Встреча VRBPAC. http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/06/briefing/2006-4222B3.pdf 18 мая 2006 г.
Асато Т., Маэхама Т., Нагаи И., Канадзава К., Уэзато Х., Кария К. Крупное исследование «случай-контроль» риска рака шейки матки, связанного с инфекцией вируса папилломы человека в Японии, путем генотипирования на основе нуклеотидного секвенирования. J Infect Dis. 2004; 189: 1829–32. DOI: 10,1086 / 382896. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Протоколы, используемые в NCI, и обработка связанной информации о микродиссектированных тканях для молекулярного анализа http: // cgap-mf.nih.gov/Protocols/Processing/DNA.html
Аятоллахи М., Закериния М., Хагшенас М. Молекулярный анализ иранских семей с серповидно-клеточной анемией. J Trop Pediatr. 2005; 51: 136–40. DOI: 10,1093 / tropej / fmh201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Gharizadeh B, Oggionni M, Zheng B, Akom E, Pourmand N, Ahmadian A, Wallin KL, Nyren P. Праймеры для множественного секвенирования с типом: новая стратегия надежного и быстрого генотипирование вирусов папилломы человека методом пиросеквенирования.J Mol Diagn. 2005. 7: 198–205. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Feoli-Fonseca JC, Oligny LL, Filion M, Brochu P, Simard P, Russo PA, Yotov WV. Метод прямого секвенирования двухуровневой полимеразной цепной реакции для обнаружения и типирования вирусов папилломы человека в патологических образцах. Diagn Mol Pathol. 1998. 7: 317–23. DOI: 10.1097 / 00019606-199812000-00005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ye S, Hong G. Большой фрагмент термостабильной ДНК-полимеразы I разрешает шпильочную структуру при секвенировании ДНК.Scientia sinica (Series B) 1987; 30: 503–6. [PubMed] [Google Scholar]
Hong GF, Huang W. ДНК-полимераза, обладающая способностью снижать врожденную избирательную дискриминацию в отношении дидезоксинуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями. Патент США. № 6,165,765 .
Андре П., Ким А., Храпко К., Thilly WG. Верность и мутационный спектр ДНК-полимеразы Pfu на последовательности митохондриальной ДНК человека.Genome Res. 1997; 7: 843–52. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Линдаль Т., Ниберг Б. Скорость депуринизации нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Биохимия. 1972; 11: 3610–8. DOI: 10.1021 / bi00769a018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Линдаль Т., Ниберг Б. Вызванное нагреванием дезаминирование остатков цитозина в дезоксирибонуклеиновой кислоте. Биохимия. 1974; 13: 3405–10. DOI: 10.1021 / bi00713a035. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Эванс М.Ф., Адамсон К.С., Симмонс-Арнольд Л., Купер К.ПЦР Touchdown General Primer (GP5 + / GP6 +) и оптимизированная концентрация ДНК в образце поддерживают чувствительное обнаружение вируса папилломы человека. BMC Clin Pathol. 2005; 5: 10. DOI: 10.1186 / 1472-6890-5-10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Шиффман М., Уиллер С.М., Дасгупта А., Соломон Д., Castle PE. Группа компаний ALTS. Сравнение прототипа ПЦР-анализа и гибридного захвата 2 для обнаружения ДНК канцерогенного вируса папилломы человека у женщин с сомнительными или слегка ненормальными мазками Папаниколау.Am J Clin Pathol. 2005; 124: 722–32. DOI: 10.1309 / E067-X0L1-U3CY-37NW. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Tornesello ML, Duraturo ML, Salatiello I, Buonaguro L, Losito S, Botti G, Stellato G, Greggi S, Piccoli R, Pilotti S, Stefanon B, De Palo G, Franceschi S, Буонагуро FM. Анализ вариантов вируса папилломы человека типа 16 у итальянских женщин с цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки. J Med Virol. 2004. 74: 117–26. DOI: 10.1002 / jmv.20154. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Feoli-Fonseca JC, Oligny LL, Brochu P, Simard P, Falconi S, Yotov WV.Изучение вируса папилломы человека (ВПЧ) 691 патологического образца из Квебека методом прямого секвенирования методом ПЦР. J Med Virol. 2001; 63: 284–92. DOI: 10.1002 / 1096-9071 (200104) 63: 4 <284 :: AID-JMV1003> 3.0.CO; 2-H. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ортис М., Торрес М., Муньос Л., Фернандес-Гарсия Е., Каналс Дж., Каборнеро А.И., Агилар Е., Баллестерос Дж., Дель Амо Дж., Гарсия-Саиз А. Онкогенный вирус папилломы человека (HPV) тип распределения и варианты HPV типа 16 E6 в двух испанских группах населения с различными уровнями риска инфицирования HPV.J Clin Microbiol. 2006; 44: 1428–34. DOI: 10.1128 / JCM.44.4.1428-1434.2006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Андерсон Т.П., Верно А.М., Бейнон К.А., Мердок Д.Р. Невозможность определения генотипа вируса простого герпеса с помощью анализа ПЦР в реальном времени и анализа кривой плавления из-за вариации последовательностей в местах связывания зонда. J Clin Microbiol. 2003. 41: 2135–2137. DOI: 10.1128 / JCM.41.5.2135-2137.2003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Горис Дж., Константинидис К.Т., Клаппенбах Дж. А., Коенье Т., Вандам П., Тидье Дж. М..Значения гибридизации ДНК-ДНК и их связь со сходством полногеномных последовательностей. Int J Syst Evol Microbiol. 2007; 57: 81–91. DOI: 10.1099 / ijs.0.64483-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Хуанг CC, Qiu JT, Kashima ML, Kurman RJ, Wu TC. Создание типоспецифичных зондов для обнаружения однокопийного вируса папилломы человека с помощью нового метода гибридизации in situ. Мод Pathol. 1998; 11: 971–7. [PubMed] [Google Scholar]
Наеф Ф., Лим Д.А., Патил Н., Магнаско М. Гибридизация ДНК с несовпадающими матрицами: исследование чипа.Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2002; 65: 040902. [PubMed] [Google Scholar]
Сорокин Н.В., Чечеткин В.Р., Лившиц М.А., Паньков С.В., Донников М.Ю., Грядунов Д.А., Лапа С.А., Заседателев А.С. Различение идеальных и несовпадающих дуплексов с микрочипами олигонуклеотидного геля: роль термодинамических и кинетических эффектов во время гибридизации. J Biomol Struct Dyn. 2005. 22: 725–34. [PubMed] [Google Scholar]
Schmitt M, Bravo IG, Snijders PJ, Gissmann L, Pawlita M, Waterboer T.Мультиплексное генотипирование вирусов папилломы человека на основе гранул. J Clin Microbiol. 2006; 44: 504–12. DOI: 10.1128 / JCM.44.2.504-512.2006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Таухид А.Р., Боденон С., Фавр М., Орт Г. Характеристика вируса папилломы человека типа 66 из инвазивной карциномы шейки матки. J Clin Microbiol. 1991; 29: 2656–2660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, Snijders PJ, Meijer CJ.Многоцентровая группа по изучению рака шейки матки Международного агентства по изучению рака: Эпидемиологическая классификация типов вируса папилломы человека, ассоциированных с раком шейки матки. N Engl J Med. 2003; 348: 518–27. DOI: 10.1056 / NEJMoa021641. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Prado JC, Calleja-Macias IE, Bernard HU, Kalantari M, Macay SA, Allan B, Williamson AL, Chung LP, Collins RJ, Zuna RE, Dunn ST, Ortiz-Lopez R, Barrera-Saldana HA, Cubie HA, Cuschieri K, von Knebel-Doeberitz M, Sanchez GI, Bosch FX, Villa LL.Мировое геномное разнообразие вирусов папилломы человека-53, 56 и 66, группы ВПЧ высокого риска, не связанных с ВПЧ-16 и ВПЧ-18. Вирусология. 2005. 340: 95–104. DOI: 10.1016 / j.virol.2005.06.024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Favre M, Kremsdorf D, Jablonska S, Obalek S, Pehau-Arnaudet G, Croissant O, Orth G. Два новых типа вируса папилломы человека (HPV54 и 55), характерные для генитальных опухолей, иллюстрируют множественность генитальных ВПЧ. Int J Cancer. 1990; 45: 40–6. DOI: 10.1002 / ijc.20109.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Шифф М., Беккер Т.М., Масук М., ван Ассельт-Кинг Л., Уиллер С.М., Альтобелли К.К., Норт CQ, Нахмиас А.Дж. Факторы риска интраэпителиальной неоплазии шейки матки у женщин юго-западных американских индейцев. Am J Epidemiol. 2000; 152: 716–26. DOI: 10.1093 / aje / 152.8.716. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Trimble CL, Piantadosi S, Gravitt P, Ronnett B, Pizer E, Elko A, Wilgus B, Yutzy W, Daniel R, Shah K, Peng S, Hung C, Roden R , Wu TC, Pardoll D. Спонтанная регрессия дисплазии шейки матки высокой степени: эффекты типа вируса папилломы человека и фенотипа HLA.Clin Cancer Res. 2005; 11: 4717–23. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-04-2599. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Zuna RE, Allen RA, Moore WE, Mattu R, Dunn ST. Сравнение генотипов вируса папилломы человека при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях высокой степени и инвазивной карциноме шейки матки: доказательства различий в биологическом потенциале предшественников поражений. Современная патология. 2004; 17: 1314–22. DOI: 10.1038 / modpathol.3800223. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Регулярное генотипирование вируса папилломы человека путем секвенирования ДНК в лабораториях общественных больниц
Заражение агентом рака.2007; 2: 11.
, 1 , 1 , 1 и 1
Sin Hang Lee
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Veronica S Vigliotti
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Джессика С. Виглиотти
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Сури Паппу
1 Отделение патологии , Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Автор, отвечающий за переписку.
Поступило 15 февраля 2007 г .; Принято 5 июня 2007 г.
Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе. при условии правильного цитирования оригинала.
Эта статья цитируется в других статьях в PMC.
Abstract
Предпосылки
Генотипирование вируса папилломы человека (ВПЧ) важно для последующего наблюдения за пациентами с персистирующей инфекцией ВПЧ и для оценки стратегии профилактики для отдельных пациентов, которые должны быть иммунизированы типоспецифическими вакцинами против ВПЧ.Целью этого исследования была оптимизация надежной «низкотемпературной» (LoTemp ™) системы ПЦР для оптимизации протоколов исследования вложенной ПЦР-амплификации ДНК ВПЧ с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК. Оптимизация протокола облегчает перенос этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику. В частности, снижение температуры на 10 ° C на каждом этапе термоциклирования во время in vitro амплификации ДНК дает более однородные продукты ПЦР. С помощью этого протокола очистка матрицы перед удлинением праймера ферментативного цикла больше не требуется.
Результаты
Геномную ДНК ВПЧ, экстрагированную из консервированных спиртом цервиковагинальных клеток на жидкой основе, сначала амплифицировали консенсусной парой праймеров MY09 / MY11 с последующей вложенной ПЦР с праймерами GP5 + / GP6 +. Гнездовые продукты ПЦР размером 150 п.н. подвергали прямому секвенированию ДНК. Гипервариабельную последовательность ДНК размером 34–50 п.н. ниже праймерного сайта GP5 + сравнивали с известными последовательностями ДНК ВПЧ, хранящимися в GenBank, с использованием онлайн-BLAST для генотипирования. Готовые к использованию реагенты для ПЦР-полимеразы LoTemp ™ оказались стабильными при комнатной температуре в течение как минимум 6 недель.Вложенная ПЦР выявила 107 изолятов ВПЧ в 513 цервиковагинальных клинических образцах, все подтвержденные секвенированием ДНК. ВПЧ-16 был наиболее распространенным генотипом, составляющим 29 из 107 положительных случаев (27,2%), за ним следует ВПЧ-56 (8,5%). Для сравнения: тест Digene HC2 обнаружил 62,6% из 107 изолятов ВПЧ и дал 11 (37,9%) из 29 положительных случаев ВПЧ-16 как «положительные для ВПЧ высокого риска».
Заключение
Готовая к использованию полимеразная система для ПЦР LoTemp ™, которая допускает термоциклирование при 85 ° C для денатурирования, 40 ° C для отжига и 65 ° C для удлинения праймера, может быть адаптирована для амплификации целевой ДНК HPV с помощью вложенной ПЦР и для подготовки клинических материалов для генотипирования методом прямого секвенирования ДНК.Генотипирование ВПЧ выполняется онлайн-алгоритмом BLAST гипервариабельной области L1. Последовательность ДНК включается в каждый отчет, направляемый врачу для сравнения при наблюдении за пациентами с персистирующей инфекцией ВПЧ, признанным промотором опухоли в индукции рака.
Предпосылки
Тестирование на вирус папилломы человека (ВПЧ) было введено, чтобы компенсировать низкую чувствительность и специфичность цитологического исследования мазка Папаниколау, часто используемого в качестве диагностического инструмента для пограничных предраковых поражений [1].Тест Digene Hybrid Capture 2 (HC2), единственный тест, одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), обычно используется для определения того, содержит ли суспензия цервиковагинальных клеток онкогенные ВПЧ «высокого риска» [2], часто действующие как сортировка для кольпоскопической оценки цитологически пограничных случаев [3-5]. Однако в настоящее время признано, что стойкая инфекция ВПЧ «высокого риска», а не простое присутствие самого вируса ВПЧ, является основным промотором, вызывающим предраковые поражения шейки матки и рак [6-9].Большинство инфекций ВПЧ, даже вызванных генотипами «высокого риска», являются временными при нормальной цитологии Папаниколау у сексуально активных молодых женщин [10-13]. У 93% первоначально инфицированных женщин тот же вирусный тип не обнаруживается при повторном обследовании через четыре менструальных цикла [14]. Средняя продолжительность положительной реакции, определяемой с помощью ПЦР для конкретного типа ВПЧ у этих молодых женщин, составляет 168 дней [15]. Множественные инфекции ВПЧ «высокого риска» не представляют более высокого риска развития неоплазии шейки матки по сравнению с единичной стойкой инфекцией ВПЧ высокого риска [16].Для развития и поддержания плоского интраэпителиального поражения высокой степени (SIL) риск наиболее высок у женщин, положительных на тот же генотип ВПЧ при повторном тестировании [6-8]. Вирусная нагрузка не является полезным параметром для прогнозирования высокого уровня SIL [17]. SIL высокого уровня часто ассоциируется с более низкой вирусной нагрузкой ДНК, чем это наблюдается в менее серьезно пораженных клетках [18].
Принимая во внимание недавний прогресс в понимании взаимосвязи между стойкой инфекцией ВПЧ и неоплазией шейки матки, для клинического ведения стойких инфекций необходима чувствительная и специфическая технология для обнаружения и точного определения генотипа ВПЧ.Тест HC2 не может быть преобразован в анализ генотипирования и связан со значительным количеством ложноотрицательных и ложноположительных результатов по сравнению с другими более строгими анализами генотипирования ВПЧ на основе ПЦР [19–23]. Сообщается, что он дает 25% ложноотрицательных результатов в случаях с подтвержденным биопсией высоким уровнем SIL, даже если все эти биопсии содержат ДНК ВПЧ высокого риска с помощью ПЦР [24]. «Отсутствие множества конкурентных, хорошо проверенных тестов» для анализа на ВПЧ цитируется как «проблема» при формулировании новых руководящих принципов лечения аномалий шейки матки [25].
Введение типоспецифических вакцин Gardasil ™ HPV в сексуально активное женское население также требует мониторинга генотипа HPV-инфекций до и после иммунизации для разработки стратегии профилактики для отдельных пациентов. Согласно «Справочному документу», представленному в FDA [26], введение вакцин против ВПЧ женщинам, у которых есть сопутствующие вакцино-релевантные инфекции ВПЧ, может увеличить риск на 44,6% развития предраковых поражений шейки матки высокой степени.Следовательно, было бы разумно выполнить анализ на ВПЧ, специфичный для генотипа, если есть подозрение на предшествующую инфекцию ВПЧ.
Целевая вложенная ПЦР-амплификация консервативной области ДНК гена L1 ВПЧ с консенсусными праймерами MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + или их эквивалентами с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК является общепринятым научным инструментом в исследованиях [21, 22,27]. Однако он не использовался в клинических лабораториях, потому что обращение с чувствительными к температуре реагентами ПЦР и требование очистки матрицы в протоколах ПЦР слишком трудоемко для рутинных применений.В этой статье отражен наш опыт использования высокопроизводительной, устойчивой к комнатной температуре надежной системы ДНК-полимеразы для облегчения переноса этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику. Каждый положительный результат на ВПЧ подтверждается генотипированием с прямым секвенированием ДНК гипервариабельной области гена L1. Информация о секвенировании ДНК ВПЧ может быть включена в лабораторный отчет для будущего клинического наблюдения за стойкими инфекциями.
Методы
Поскольку условия ПЦР, адаптированные для этого протокола, зависели от использования новой низкотемпературной, готовой к использованию умеренно термостабильной системы ДНК-полимеразы, чувствительности и специфичности ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® при амплификации ДНК ВПЧ были сначала проверены и сравнены с ДНК, полученной с помощью стандартных термостойких полимераз Taq , доступных на рынке.
Очищенные полноразмерные плазмидные ДНК типов -16, -18 и -6В ВПЧ, приобретенные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), использовали в качестве стандартов для разработки метода. Затем ДНК ВПЧ типа 16 использовали в качестве обычного положительного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали чистую воду молекулярной степени чистоты вместо экстракта ДНК.
Теоретическая чувствительность системы ПЦР, выбранной для этого исследования, была определена с использованием серийных 10-кратных разведений ATCC-сертифицированного стандарта HPV, содержащего 200 нг плазмидной ДНК HPV-16, -18 и -6B, с буфером TE для получения единственной копии. геномной ДНК на мкл в качестве матрицы для проведения первичной и вложенной ПЦР для каждого разведения в двух экземплярах.Теоретическое количество копий ДНК ВПЧ в матрице, используемой для каждой ПЦР MY09 / MY11, рассчитывалось в соответствии с общепринятой формулой пересчета [28]. Посредством секвенирования ДНК было подтверждено, что все вложенные продукты ПЦР соответствуют ожидаемым генотипам ВПЧ.
Для амплификаций ПЦР Taq реакционная смесь из 25 мкл содержала 100 мМ KCl, 20 мМ Трис-HCl pH 8,0, 25 мМ MgCl 2 , 2,5 мМ каждого дНТФ, 2,5 единицы полимеразы Takara Taq (Takara Bio Inc., Шига, Япония), 100 пмоль каждого консенсусного праймера (MY09 / MY11 или GP5 + / GP6 +) и 1 мкл ДНК ВПЧ при различных разведениях в буфере TE (или, если для вложенной ПЦР, 1 мкл ПЦР MY09 / MY11 продукты).Реакционную смесь подвергали 35 циклам амплификации в термоциклере MJ Research (Waltham, MA). Каждый цикл состоял из стадии денатурации при 94 ° C в течение 0,5 мин, стадии отжига при 55 ° C в течение 1 минуты и стадии удлинения цепи при 72 ° C в течение 1 минуты.
При проведении ПЦР ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® применялся протокол, описанный ниже для клинических образцов, за исключением того, что для сравнения с амплификацией ПЦР Taq использовали 35-цикловую амплификацию.
Клинические образцы, использованные для этого исследования, представляли собой 515 образцов цервиковагинальной цитологии на жидкой основе на спиртовой основе (Cytyc или Surepath), представленные врачами в Нью-Хейвене, штат Коннектикут, в рамках рутинных гинекологических осмотров.Возрастное распределение пациентов и патологические состояния шейки матки не были предметом данного исследования. Тест Digene HC2 на ВПЧ высокого риска, заказанный врачами, выполнялся в обычном порядке для каждого образца в одной из двух независимых клинических лабораторий (Quest Diagnostics Laboratory, Wallingford или Pathology & Laboratory Services, LLC, Woodbridge, CT) в соответствии с инструкциями, предоставленными Digene. Корпорация (Гейтерсбург, Мэриленд). Как правило, это были женщины моложе 30 лет, которым был поставлен Пап-цитологический диагноз атипичных плоскоклеточных клеток пониженной значимости (ASCUS), или женщины 30 лет и старше, независимо от результатов цитологического исследования Папаниколау [4].
После того, как материал был взят из каждого образца для рутинного цитологического исследования и анализа HCl, около 1 мл клеточных суспензий было помещено в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл, закодировано вслепую с номером случая и передано в лабораторию Милфордского госпиталя для лечения ВПЧ. ПЦР / секвенирование ДНК.
Экстракция ДНК из фиксированных спиртом клеток была выполнена в соответствии с протоколом Национального института рака (NCI) [29] с небольшими изменениями. Вкратце, суспензию клеток сначала центрифугировали в микроцентрифуге Eppendorf (модель 5424), оснащенной ротором (модель FA45-24-11), в течение 5 минут при 13000 об / мин.Клетки в осадке промывали 1 мл воды для реагентов, а затем 1 мл буфера, состоящего из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20, pH 8,1. Осадок промытых клеток ресуспендировали и расщепляли при 45–55 ° C в течение ночи в 100 мкл 0,1 мг / мл протеиназы K (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, штат Миссури), растворенных в том же буфере для промывки. После денатурирования белков в дигестате клеток в металлическом блоке, нагретом до 95 ° C в течение 10 мин, и заключительном центрифугировании дигестата при 13000 об / мин в течение 5 мин, супернатант осторожно пипетировали и помещали в чистую микроцентрифужную пробирку для использования. для ПЦР без дополнительной очистки или хранения при -20 ° C.
Для получения ДНК HPV использовали общую методологию первичной ПЦР-амплификации сегмента 450 п.н. гена L1 HPV с парой консенсусных праймеров MY09 / MY11 с последующей вложенной ПЦР с парой общих праймеров GP5 + / GP6 +. Вложенные продукты ПЦР размером 150 п.н. в положительных образцах были генотипированы прямым секвенированием ДНК [21,22] с небольшими модификациями, кратко изложенными ниже.
Для первичной ПЦР-амплификации в пробирку для ПЦР, содержащую 20 мкл LoTemp ™ HiFi ® , добавляли 1 мкл экстракта ДНК, 1 мкл 10-молярного праймера MY09, 1 мкл 10-молярного праймера MY11 и 2 мкл воды. Готовая к использованию смесь ДНК-полимеразы (HiFi DNA Tech, LLC, Trumbull, CT), которая содержит все компоненты, необходимые для низкотемпературной ПЦР, включая dNTP, Mg ++ , буфер, ДНК-полимеразы HiFi ® , запатентованную dsDNA плавящие агенты и консерванты dNTP, чтобы достичь конечного реакционного объема 25 мкл.Для термоциклирования температурные шаги термоциклера TC-412 (Techne Incorporated, Берлингтон, Нью-Джерси) были запрограммированы на начальный нагрев при 85 ° C в течение 2 минут с последующими 30 циклами при 85 ° C в течение 30 секунд, 40 ° C. в течение 30 секунд и 65 ° C в течение 1 мин. Окончательное удлинение составляло 65 ° C в течение 10 мин.
Для вложенной ПЦР «след» продуктов ПЦР MY09 / MY11 переносили стеклянной палочкой с чистой смачиваемой поверхностью диаметром около 1,5 мм во вторую пробирку для ПЦР, содержащую 25 мкл полной реакционной смеси вложенной ПЦР, состоящей из 20 мкл готовой к использованию смеси ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® , 1 мкл 10 мкмолярного праймера GP5 +, 1 мкл 10 мкмоль праймера GP6 + и 3 мкл воды, используя ту же программу термоциклирования, как описано выше.
После завершения первичной и вложенной ПЦР из каждой пробирки пипеткой отбирали 5 мкл продуктов ПЦР и смешивали с 2 мкл загрузочной жидкости для электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Гель исследовали в УФ-свете. Визуализация полосы продукта ПЦР 450 п.н. на дорожке MY09 / MY11 и / или полосы 150 п.н. на вложенной дорожке ПЦР на агарозном геле предоставила доказательства наличия ДНК ВПЧ в образце, ожидающего генотипирования с прямым секвенированием ДНК в качестве окончательного Проверка.
Для секвенирования ДНК, 1 мкл вложенных продуктов ПЦР, если они положительные, отбирали пипеткой из вложенной пробирки для ПЦР для прямого секвенирования ДНК, используя 1 мкл 5 мкмолярного праймера GP6 + в качестве праймера для секвенирования, 1 мкл BigDye ® Terminator (версия 1.1 / стандартный набор для секвенирования), 3,5 мкл 5-кратного буфера и 13,5 мкл воды в общем объеме 20 мкл для 20 циклов ферментативных реакций удлинения / прекращения праймера в термоцилиндре ABI модели 9600 в соответствии с протоколом, предоставленным производитель (Applied Biosystems).После очистки от красителя-терминатора с помощью колонки Centri-Sep (Princeton Separations, Adelphia, NJ) реакционную смесь загружали в автоматический четырехкапиллярный генетический анализатор ABI 3130 для анализа последовательности. Выравнивание последовательностей выполняли против различных стандартных последовательностей генотипов HPV, хранящихся в базе данных GenBank, с помощью онлайн-анализа BLAST, чтобы прийти к конкретному генотипированию.
Один мкл каждого экстракта ДНК помещали в отдельную пробирку для ПЦР с парой праймеров β-глобина [30] для амплификации геномной ДНК человека в качестве контроля адекватности образца.Праймеры для амплификации гена β-глобина представляли собой 1 мкл 80 мкмоль 5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC и 1 мкл 80 мкмоль 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC в 20 мкл готовой к использованию смеси ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® с 2 мкл добавлена вода. Использовалась упомянутая выше программа термоциклирования LoTemp ™.
Три (3) пробирки для ПЦР на образец обычно использовали для гена β-глобина, праймера MY09 / MY11 и вложенной амплификации GP5 + / GP6 +, соответственно.
Для проверки воспроизводимости этой процедуры ПЦР / ДНК-секвенирования аликвоты гидролизата 30 отдельных клинических образцов были протестированы в параллельных дублирующих сериях.Сравнивались повторяющиеся результаты трех ПЦР в каждом случае и результаты генотипирования положительных случаев путем секвенирования ДНК.
Образцы, которые не показали полосы ПЦР MY09 / MY11 или GP5 + / GP6 +, но показали доказательства положительной амплификации гена β-глобина, были интерпретированы как HPV-отрицательные. Образцы, которые не показали продуктов ПЦР на всех трех дорожках, были признаны неудовлетворительными для оценки из-за низкой экстракции ДНК или присутствия ингибитора ПЦР. Было два (2) неудовлетворительных дела из 515 обработанных.Остальные 513 случаев были признаны удовлетворительными для анализа. Из этих 513 случаев 107 были положительными на вложенные продукты ПЦР, все они оказались ДНК ВПЧ прямым секвенированием ДНК с использованием GP6 + в качестве праймера для секвенирования.
Образцы, инфицированные более чем одним генотипом ВПЧ, были обозначены появлением множества неоднозначных или перекрывающихся пиков в записях секвенирования ДНК. Для каждой из этих смешанных инфекций вложенные продукты ПЦР были подвергнуты дополнительным четырем индивидуальным реакциям удлинения / завершения праймера, чтобы исключить инфицирование вакциной Гардасил ™ ВПЧ, а именно ВПЧ типов -16, -18, -6 или -11, с использованием следующих типоспецифичных праймеров [31].
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-16 5′-GCTGCCATATCTACTTCAGA-3 ‘
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-18 5′-GCTTCTACACAGTCTCCTGT-3′
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-6 3′-GTGCATCTCCG ‘
Праймер для секвенирования, специфичный для типа HPV-11 5′-GTGCATCTGTGTCTAAATCTG-3′
Все олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров для этого исследования, были синтезированы и очищены с помощью картриджа для очистки олигонуклеотидов (OPC) лабораторией синтеза ДНК отделения патологии Университет (Нью-Хейвен, Коннектикут).
Чтобы избежать перекрестного заражения, для тестов амплификации нуклеиновых кислот были выделены три отдельные комнаты без рециркуляции воздуха. Каждая из двух комнат была оборудована 32-дюймовой рабочей станцией ПЦР (AirClean Systems, Роли, Северная Каролина). Все процедуры предварительной амплификации выполнялись на станции ПЦР I. Все процедуры после ПЦР выполнялись на станции ПЦР II, включая подготовку к вложенная ПЦР и реакция секвенирования.Гель-электрофорез и секвенирование ДНК проводили в третьей комнате для изоляции.Никакие материалы после ПЦР или любые предметы, загрязненные ампликонами, или оборудование, используемое в комнатах после ПЦР, не допускались в рабочее пространство до ПЦР.
Результаты
ДНК-полимераза LoTemp ™ HiFi ® была примерно в 10 раз эффективнее ДНК-полимеразы Taq при амплификации плазмидной ДНК ВПЧ с помощью ПЦР MY09 / MY11 и примерно в 100–1000 раз эффективнее при первой амплификации с помощью вложенной ПЦР GP5 + / GP6 + в тандеме. Технология вложенной ПЦР, описанная в этой статье, оказалась чувствительным методом для обнаружения 1–10 копий очищенной геномной ДНК типов HPV -16, -18 или -6B.Но 10 4 -10 5 копий геномной ДНК были необходимы в качестве ПЦР-матриц для УФ-визуализации положительной полосы ампликона праймера MY09 / MY11 после электрофореза (рис.). Специфичность всех вложенных продуктов ПЦР была подтверждена генотипированием ВПЧ с прямым секвенированием ДНК.
Сравнительная амплификация ДНК HPV-16 с помощью ДНК-полимеразы Taq и ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® ДНК-полимеразы . Дорожки 1–8: матрица плазмидной ДНК ВПЧ-16 при 85 × 10 1 , 85 × 10 2 , 85 × 10 3 , 85 × 10 4 , 85 × 10 5 , 85 × 10 6 , 85 × 10 7 и 85 × 10 8 копий на миллилитр.NC: отрицательный контроль. M: молекулярный маркер. Стрелки указывают нижний предел обнаружения вложенной ПЦР (A) и первичной ПЦР 1 st (B) с ДНК-полимеразой Takara Taq и ДНК-полимеразой LoTemp ™ HiFi ® соответственно.
Воспроизводимость этого вложенного ПЦР-анализа при обнаружении ДНК ВПЧ в клинических образцах была подтверждена запуском двух параллельных наборов ПЦР с расщепленным дигестатом одного образца в качестве парных матриц, включая ген β-глобина, праймер MY и GP амплификации вложенных праймеров в каждом наборе для 30 HPV-положительных случаев.Пара идентичных результатов на геле электрофореза была получена во всех трех амплификациях для 30 разделенных образцов (рис.). Вложенные продукты ПЦР, полученные на наборах дубликатов, были подтверждены секвенированием ДНК как принадлежащие к одному и тому же генотипу HPV.
Вложенная ПЦР HPV в клинических образцах и воспроизводимость . В агарозном геле показаны продукты ПЦР целевых ДНК, экстрагированных из двух клинических образцов в двух экземплярах. Ампликон ДНК-мишени β-глобина имеет длину 110 п.н., что ясно видно на дорожках 25 и 26 (№ 1210), но почти не видно на дорожках 31 и 32 (№ 1211).Совместная амплификация других фрагментов геномной ДНК человека и положительный вложенный ампликон ПЦР обеспечивают адекватность образцов в обоих образцах. Молекулярная линейка = 100–1000 п.н. (крайняя слева). Дорожки 25/26, 27/28, 29/30 = ген β-глобина, MY09 / MY11, GP5 + / GP6 + ПЦР, соответственно — образец № 1210. Дорожки 31/32, 33/34, 35/36 = ген β-глобина, MY09 / MY11, GP5 + / GP6 + ПЦР, соответственно — образец № 1211
Для клинических образцов первичная ПЦР MY09 / MY11 генерировала отдельный продукт размером 450 п.н. полоса после 30 повторных циклов амплификации только в 37 из 107 HPV-положительных случаев, обнаруженных с помощью вложенной ПЦР.Более 65% клинических ВПЧ-положительных ампликонов полагались на вложенную ПЦР для УФ-визуализации. Без вложенной ПЦР ампликон ПЦР MY09 / MY11 часто был замаскирован из-за совместной амплификации других молекул ДНК в клинических образцах (рис.).
Для некоторых изолятов, особенно изолятов HPV-39 и HPV-73, стандартная вложенная ПЦР GP5 + / GP6 + не смогла амплифицировать целевой фрагмент ДНК, даже если ПЦР-амплификация праймера MY09 / MY11 была успешной. Эти случаи были выявлены при гель-электрофорезе, показав положительный ПЦР-ампликон MY09 / MY11 450 п.н. в отсутствие ожидаемого сопутствующего вложенного продукта ПЦР размером 150 п.н.Для этих штаммов HPV с помощью геминизированной ПЦР с праймерами MY11 / GP6 + был получен гомогенный ампликон (рис.) Для прямого секвенирования ДНК.
После циклического секвенирования алгоритмы BLAST путем выравнивания последовательности ДНК из 34 п.н. в гипервариабельной области гена L1 ниже сайта связывания GP5 + с известными последовательностями генотипа ВПЧ, хранящимися в базе данных GenBank, обычно определяли генотип выявлены изоляты ВПЧ [32]. 100% совпадение «идентичностей» между «запросной» последовательностью и «субъектной» последовательностью было достигнуто для каждого окончательного генотипирования (рис.). Это отслеживание последовательности с его онлайн-алгоритмом BLAST для генотипирования было включено в отчет о клиническом наблюдении за стойкими инфекциями. Однако HPV-16 имеет множество вариантов последовательностей, некоторые из которых имеют идентичную последовательность в этой области с некоторыми штаммами HPV-31 и HPV-33, и для различения генотипов требуется алгоритм BLAST с последовательностью 50 п.н.
Последовательность ДНК вложенного продукта ПЦР ниже GP5 + для генотипирования . Это типичная последовательность ДНК, вырезанная из цветовой дорожки ниже участка связывания GP5 + гена L1 ДНК ВПЧ.Анализ выравнивания BLAST последовательности из 34 (до 50) п.н. этой гипервариабельной области дает однозначные доказательства генотипа 66 HPV на основе базы данных, хранящейся в GenBank.
Из 513 цервиковагинальных образцов на жидкой основе метод вложенной ПЦР выявил по крайней мере один штамм ВПЧ из 107, с общим положительным показателем 20,9%, включая 74 случая, укрывающих по крайней мере один из 13 типов, на которые нацелен Digene HC2 » тест на ВПЧ высокого риска и 33 случая с типами ВПЧ «низкого риска» (таблица).Наиболее распространенным генотипом в районе Нью-Хейвена оказался ВПЧ-16, за которым следует ВПЧ-56. Совокупный уровень распространенности ВПЧ-16 и ВПЧ-18 составил 32,8% от общего числа изолятов.
Таблица 1
Генотипирование ВПЧ с помощью секвенирования ДНК по сравнению с тестом Digene HC2
ПЦР / ДНК-секвенирование
Результаты теста Digene HC2
Тип Случаи
Распространенность (%)
Высокий риск +
Отрицательный
16
29
(27.2)
11
18
56
9
(8,5)
9
0
31
7
(6,5)
2
2
2
2 902 6
6
(5,6)
2
4
18
6
(5,6)
6
0
54
0 6 902
3
58
6
(5.6)
5
1
66
6
(5,6)
6
0
59
4
(3,7)
0 45
3
(2,8)
2
1
83
3
(2,8)
2
1
32
07 2 902
2
35
2
(1.9)
1
1
39
2
(1,9)
2
0
40
2
(1,9)
2
0 52
2
(1,9)
1
1
33
1
(0,9)
1
0
53
0 1 902
0
62
1
(0.9)
1
0
68
1
(0,9)
1
0
70
1
(0,9)
0,9)
1 72
1
(0,9)
0
1
73
1
(0,9)
0
1
M16
07 1
0
M 16, 18
1
(0.9)
1
0
M другие
3
(2,9)
1
2
Итого
107
(100)
HC2 Уровень обнаружения ВПЧ = 67/107 = 62,6%
Образцы
513
9025
513
.9
Тест на ВПЧ высокого риска HC2 выявил только 11 (37,9%) из 29 случаев ВПЧ-16 как положительные. Однако он успешно идентифицировал все образцы, содержащие ВПЧ-56 и ВПЧ-18, как положительные на ВПЧ высокого риска. Чувствительность теста HC2 при обнаружении заранее определенных генотипов ВПЧ «высокого риска» резюмируется следующим образом:
HPV-18 100%
HPC-33 100%
HPV-39 100%
HPV-56 100%
HPV-59 100%
HPV-68 100%
HPV-58 83.3%
HPV-31 71,4%
HPV-45 66,7%
HPV-35 50%
HPV-52 50%
HPV-16 37,9%
Хотя HPV-54, -66, -83, -53 и -62 не были включены в пробу гибридизационного коктейля, эти генотипы часто сообщались как положительные на ВПЧ высокого риска с помощью теста HC2 (таблица).
Среди 107 вложенных ПЦР-положительных образцов секвенирование ДНК с консенсусным общим праймером GP6 + дало множественные перекрывающиеся нечитаемые последовательности в 5 случаях.Использование индивидуального типоспецифического секвенирования праймеров для HPV-6, -11, -16 и -18 доказало, что один из них содержал HPV-16, но не три других генотипа, и что один содержал смесь HPV-16 и HPV. -18, но не два других генотипа. Для оставшихся 3 образцов смешанной инфекции повторное индивидуальное секвенирование ДНК не дало читаемой реакции удлинения / терминации праймера с любым из четырех типоспецифичных праймеров. Следовательно, эти последние 3 случая были сочтены множественными инфекциями, вызванными ВПЧ, отличными от четырех вакцин-релевантных типов, и сгруппированы в категорию «низкого риска».
Из 513 изученных случаев тест Digene HC2 классифицировал 403 пробы как отрицательные, 75 как положительные для ВПЧ «высокого риска» и 35 как неудовлетворительные для оценки. Эти результаты сравнивали с результатами, полученными с помощью анализа вложенной ПЦР (таблица). Так как тест Дигена охватил только генотипы ВПЧ «высокого риска», образцы, инфицированные ВПЧ, отличные от 13 типов, на которые нацелена проба коктейля из ВПЧ «высокого риска» HC2, будут классифицированы как отрицательные или неудовлетворительные для оценки (неудовлетворительно). Таким образом, тест HC2 идентифицировал 50 из 74 HPV-положительных образцов «высокого риска», обнаруженных с помощью вложенной ПЦР.Расчетная чувствительность теста Digene HC2 составила 50/74 = 67,6% по сравнению с анализом вложенной ПЦР. Поскольку в HC2 было зарегистрировано в общей сложности 75 случаев заражения ВПЧ «высокого риска», его аналитическая специфичность составила 50/75 = 66,7%. Два случая, признанных неудовлетворительными для оценки ПЦР и отрицательными с помощью теста HC2, были исключены из общего числа 513 случаев, введенных для анализа.
Таблица 2
Сравнение результатов вложенной ПЦР / секвенирования ВПЧ и результатов теста HC2
Результаты ПЦР
902
907 Высокий риск
Низкий риск
Unsat .
Всего
Результаты HC2
Отрицательное
364
23
16
902 902 902 902 902 902 902 902 902 902 8
50
17
0
75
Низкий риск
NP
NP
NP
902
34
1
0
35
Всего
406
74
33
0
9002 9002
525 Умеренный ™ HiFi ® ДНК-полимеразы представляют собой генно-инженерные производные ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus (Bst) , которая была впервые введена для разрешения структуры шпильки в классическом секвенировании ДНК по Сэнгеру Йе и Хонгом [33]. Bst ДНК-полимераза с оптимальной температурой удлинения праймера 65 ° C чрезвычайно стабильна, способна сохранять качество своего секвенирования в рабочем растворе при комнатной температуре в течение нескольких недель в условиях роботизированной автоматизации [34]. Модификация аминокислотной последовательности природной ДНК-полимеразы Bst с помощью сайт-направленных генетических мутаций увеличивает термостойкость фермента [35], что открыло путь к разработке новых термостабильных ДНК-полимераз для повторных реакций удлинения праймера ниже 85 ° C.Протокол ПЦР ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® использует свойства модифицированной ДНК-полимеразы Bst при пониженных циклических температурах и свойствах высокой процессивности.
Использование ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® для амплификации ДНК ВПЧ исключает все этапы очистки матрицы, которые обычно требуются перед ПЦР или реакцией секвенирования [21,22,32]. Поскольку готовая к использованию смесь полимераз содержит все необходимые ингредиенты для ПЦР, необходимость в пипетировании на дому минимальна.Поскольку ДНК-полимераза и другие компоненты реагента стабилизированы для хранения при комнатной температуре, нет необходимости хранить ледяные блоки при настройке ПЦР. Поскольку в этой системе используются химические плавящие агенты для денатурирования дцДНК и высокопроизводительная ДНК-полимераза для удлинения нуклеотидных праймеров при частичной изостабилизации, она позволяет проводить термоциклирование при 85 ° C для денатурирования, 40 ° C для отжига и 65 ° C для удлинения праймера соответственно. При пониженных температурах циклирования скорость индуцированных нагреванием мутаций [36], а именно депуринизации [37] и дезаминирования [38] азотистых оснований в молекулах ДНК во время амплификации ПЦР снижается.В результате продукты ПЦР более однородны.
В этом отчете мы продемонстрировали, что система ПЦР LoTemp ™ может амплифицировать 1–10 копий очищенного HPV-16, -18 или -6B для создания соответствующего типоспецифичного вложенного продукта ПЦР размером 150 п.н. Чувствительность ПЦР LoTemp ™ при обнаружении плазмидной ДНК ВПЧ примерно в 10 раз выше, чем у традиционных термостойких ДНК-полимераз Taq без вложенной амплификации (рис.). Вложенная ПЦР повысила аналитическую чувствительность обнаружения ДНК ВПЧ на суспензиях цервиковагинальных клеток [21,22,32], что также подтверждается нашим опытом (рис.). Вложенная ПЦР также служит для устранения большинства мешающих веществ, которые в противном случае, возможно, пришлось бы удалить очисткой колонки в этой процедуре.
Хотя согласованные общие пары праймеров MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + использовались для амплификации высококонсервативной области гена L1 всех генотипов ВПЧ, их эффективность в амплификации целевой ДНК варьируется от одного генотипа ВПЧ к другому с противоречивыми паттернами [22] . Мы обнаружили, что некоторые изоляты HPV-39 и HPV-73 не амплифицируются парой праймеров GP5 + / GP6 + ни в первичной ПЦР, ни во вложенной ПЦР.Вторая амплификация с парой праймеров GP5 + / MY09 и GP6 + / MY11 дает более длинный и более короткий продукт ПЦР, соответственно. Геминизированный продукт ПЦР GP6 + / MY11 (рис.) Подходит для прямого секвенирования ДНК. Неудача GP5 + / GP6 + при амплификации HPV-39 [39] и других типов HPV [22,32] в клинических образцах является хорошо известной технической проблемой, если эта единственная пара праймеров используется для обнаружения HPV. Однако GP5 + и GP6 + являются отличными вложенными праймерами для ПЦР для подготовки матриц для генотипирования HPV с прямым секвенированием ДНК.
Оптимизация протокола ПЦР важна для обнаружения ВПЧ. Без оптимизации метод ПЦР с использованием одного набора консенсусных праймеров для амплификации может иметь более низкую чувствительность, чем тест Digene HC2 [40]. Используя первоначальную 40-цикличную амплификацию клинических образцов, Johnson et al . [21] сообщили, что вложенная ПЦР обычно увеличивает чувствительность метода ПЦР на ВПЧ примерно на 60%. С протоколом ПЦР, представленным в этой статье, это различие усиливается за счет принятия 30-цикловой амплификации.Преимущество уменьшения количества циклов амплификации состоит в том, что коамплификация неспецифических мешающих молекул ДНК уменьшается в первичной ПЦР в пользу создания специфических вложенных продуктов ПЦР для прямого секвенирования ДНК.
Используя наш оптимизированный протокол, вложенная ПЦР выявила 107 HPV-положительных случаев среди 513 клинических образцов (таблица). Было идентифицировано двадцать три (23) генотипа ВПЧ, включая 12 из 13 генотипов «высокого риска», т.е. ВПЧ-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -52, -56, -58, -59 и -68, которые нацелены на тест Digene HC2.Отсутствие репрезентативности HPV-51, который также является мишенью для теста HC 2, вероятно, отражает низкую региональную распространенность этого генотипа. Используя те же праймеры для вложенной ПЦР с последующим генотипированием с секвенированием ДНК, было обнаружено, что HPV-51 является относительно распространенным генотипом в Германии, составляя около 5% от общего числа обнаруженных изолятов HPV [22]. Однако среди 894 изолятов ВПЧ в Дании он не был зарегистрирован ни разу [21].
Гипервариабельная область последовательности ДНК ниже сайта связывания GP5 + имеет решающее значение для генотипирования L1 ВПЧ.Хотя большинство генотипов ВПЧ можно определить путем выравнивания последовательности длиной 34 п.н. в этой области с базой данных GenBank [32], для точного генотипирования может потребоваться выравнивание более длинной последовательности, например длиной 50 п.н., когда результат алгоритма BLAST неоднозначен. . Если для генотипирования полагаться на последовательность из 34 пар оснований, количество инфекций HPV-16 может быть недооценено.
Для разработки этого протокола мы обнаружили, что использование 1 мкл 5 мкмоль OPC-очищенного олигонуклеотида GP6 + вместо рекомендованного производителем 3.2 мкмоль раствор в качестве праймера для секвенирования, по-видимому, дает более согласованные результаты секвенирования для типирования различных изолятов ВПЧ. Концентрация праймера может нуждаться в корректировке, если более высокий уровень GP6 + используется в качестве праймера для секвенирования ДНК.
Из 107 ПЦР-положительных образцов тест Digene HC2 классифицировал 67 как ВПЧ-положительные, уровень обнаружения 62,6% (таблица). Когда для сравнения используются только нацеленные на HC2 генотипы HPV «высокого риска», вложенная ПЦР выявляет 74 HPV-положительных случая, в то время как тест HC2 выявляет 50 в этой группе с аналитической чувствительностью 67.6% (50/74).
Наиболее распространенным является ВПЧ-16, составляющий 27,2% от общего числа изолятов (таблица). Этот процент распространенности ВПЧ-16 почти идентичен процентному соотношению, о котором сообщают другие специалисты с использованием гнездовой ПЦР / ДНК-секвенирования MY / GP, генотипирования суспензий цервиковагинальных клеток, например 26% в Дании [21] и 26,2% в Германии [22]. Тест Digene HC2 выявил 11 из 29 ПЦР-положительных случаев ВПЧ-16 с показателем обнаружения 37,9%, что является неожиданно низким. Поскольку все положительные результаты ПЦР на ВПЧ-16 были подтверждены секвенированием ДНК для генотипирования с уровнем распространенности, аналогичным тем, которые обычно встречаются в западном мире, на основе той же методологии [21,22], и поскольку тесты Digene HC2 проводились две независимые клинические лаборатории, должным образом сертифицированные органами здравоохранения, достоверность результатов отдельных тестов, кажется, не подлежит сомнению.Несоответствие, вероятно, связано с тем, что в данной популяции пациентов существует множество вариантов последовательностей HPV-16 [41], которые могут быть не все нацелены на зонд коктейля РНК HC2, но имеют общую высококонсервативную область гена L1, которая праймеры MY09 / MY11 эффективно амплифицируются. В пользу этой интерпретации говорит тот факт, что тест HC2 правильно определил все случаи ВПЧ-18, ВПЧ-39, ВПЧ-56 и ВПЧ-59 как «группы высокого риска» по одним и тем же данным.
ВПЧ-56 — второй по частоте обнаруженный генотип высокого риска (8.5%), за которыми следуют ВПЧ-31, -18, -54, -58 и -66, с примерно одинаковым уровнем распространенности (5,6–6,5%). Общее количество случаев ВПЧ-16 и -18 составляет только 32,8% от единичных изолятов ВПЧ в нашей серии. ВПЧ-18, по-видимому, также играет относительно небольшую роль в возникновении патологии шейки матки в Канаде [42].
Сообщалось другими [43], что тест высокого риска Digene HC2 может обнаруживать типы ВПЧ -53, -54, -62, -66 и -83 и маркировать их как ВПЧ высокого риска, хотя эти Генотипы не являются преднамеренно целевыми в его коктейльном зонде высокого риска.Наши данные подтверждают эти перекрестные реакции (таблица). Вариация последовательностей в сайтах связывания зонда [44] и неспецифическое связывание между зондом и несовпадающей ДНК, не являющейся мишенью [45-48], являются хорошо известными источниками ошибок, если гибридизация нуклеиновых кислот используется для микробного и вирусного генотипирования. Когда продукты ПЦР GP5 + / GP6 + с гипервариабельной последовательностью ДНК нацелены на разработку метода мультиплексного генотипирования [49], обнаруживается, что ДНК-зонд, разработанный для HPV-66, недавно признанного типа высокого риска [50-52], реагирует с ВПЧ-52 и зондом для ВПЧ-82 с ВПЧ-51 из-за перекрестной гибридизации, несмотря на наличие четырех несовпадений оснований в каждой паре.Некоторые эксперты [40] считают непреднамеренные перекрестные реакции теста Digene HC2 с нецелевыми типами ВПЧ, такими как ВПЧ-66, которые иногда могут вызывать рак, «удачными». Однако польза от этих перекрестных реакций для пациентов требует дополнительного подтверждения.
Пятьдесят процентов (50%) изолятов ВПЧ-54 возвращаются тестом на ВПЧ как ВПЧ высокого риска. ВПЧ-54 был классифицирован как вирус низкого риска [51,53], но обнаружено, что он связан с 40-кратным увеличением риска среди женщин американских индейцев с CIN 2/3.Только ВПЧ-16 показал более высокий риск, чем ВПЧ-54 среди этой субпопуляции [54]. При использовании информации о генотипировании ВПЧ для наблюдения за стойкими инфекциями, возможно, придется учитывать генетический состав пациента [55].
Для случаев смешанной инфекции мы выбираем отдельные праймеры, специфичные для HPV-6, -11, -16 и -18 [31], чтобы выполнить секвенирование ДНК с индивидуальным специфическим праймером, чтобы определить, включает ли смешанная инфекция какие-либо из этих вакцин- соответствующие типы ВПЧ. Обоснование этого выбора заключается в том, что большинство множественных инфекций ВПЧ являются временными [6-15].Непосредственную озабоченность пациентки и ее лечащего врача вызывает вопрос о том, вызвана ли смешанная инфекция каким-либо из типов ВПЧ, имеющих отношение к вакцине, если пациент подумывает о вакцинации.
Низкий процент (<5%) множественных инфекций ВПЧ, наблюдаемый в нашей серии, мог быть необъективным, потому что большая часть образцов для этого исследования была собрана в офисе индивидуального частного практикующего врача, и эта группа образцов имела исключительно низкий положительный результат. частота и отсутствие множественных инфекций ВПЧ.Известно, что частота множественных инфекций ВПЧ варьируется среди популяций пациентов, а также зависит от стадии канцерогенеза. Множественные инфекции HPV были обнаружены менее чем в 5% HPV-положительных образцов от пациентов с инвазивным раком, но более чем в 15% положительных образцов в контрольной группе [27]. Множественные инфекции HPV имеют тенденцию развиваться в отдельные инфекции HPV, поскольку инфекция становится хронической и устойчивой, в то время как цитопатология шейки матки прогрессирует от метаплазии, LSIL, HSIL, карциномы in situ до инвазивного рака [56].
Таким образом, мы сообщили о нашем опыте адаптации хорошо охарактеризованного протокола ПЦР / секвенирования ДНК для рутинного генотипирования ВПЧ. Мы считаем, что чувствительный и специфический анализ ВПЧ с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК позволит получить полезную информацию для отслеживания стойких инфекций при направлении пациентов с «высоким риском» развития HSIL, а не пациентов с «ВПЧ высокого риска». до кольпоскопической оценки.
Заключение
Технология вложенной ПЦР с использованием консенсусных праймеров MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + для целевой амплификации ДНК ВПЧ может использоваться в диагностических лабораториях для рутинного обнаружения ВПЧ и подготовки клинических материалов для генотипирования путем прямого секвенирования ДНК.Мы адаптировали недавно внедренную систему низкотемпературной ПЦР и оптимизировали протокол, чтобы облегчить перенос этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику для точного генотипирования ВПЧ, которое является ценным инструментом для последующего наблюдения за пациентами с устойчивой инфекцией ВПЧ, признанной опухолью. промотор в индукции рака.
Тест ДНК вируса папилломы человека HC2-REF 5199-1220 Digene Corporation, Gaithersburg, MD 20878 USA. 2005.
Гогола Дж., Ван Динь Т., Луччи Дж. А., 3, Смит Е., Ханниган Е. В.. Тестирование на вирус папилломы человека для сортировки в направленной популяции. J Low Genit Tract Dis. 2001; 5: 29–32. DOI: 10.1046 / j.1526-0976.2001.51006.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Wu HH, Allen SL, Kirkpatrick JL, Elsheikh TM. Рефлекторный тест ДНК вируса папилломы человека высокого риска полезен при сортировке женщин с атипичными плоскоклеточными клетками и не может исключить плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени. Diagn Cytopathol. 2006; 34: 707–10. DOI: 10.1002 / dc.20497. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Wallin KL, Wiklund F, Angstrom T., Bergman F, Stendahl U, Wadell G, Hallmans G, Dillner J. Типоспецифическая персистентность ДНК вируса папилломы человека до развития инвазивной цервикальной рак.N Engl J Med. 1999; 341: 1633–8. DOI: 10.1056 / NEJM1993412201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Kjaer SK, van den Brule AJ, Paull G, Svare EI, Sherman ME, Thomsen BL, Suntum M, Bock JE, Poll PA, Meijers CJ. Типоспецифическая персистенция вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска как индикатор плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки высокой степени у молодых женщин: проспективное последующее исследование на популяционной основе. BMJ. 2002; 325: 572–6. DOI: 10.1136 / bmj.325.7364.572. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, Gilkison G, Arends MJ, Graham C, McGoogan E.Стойкая ВПЧ-инфекция высокого риска, связанная с развитием неоплазии шейки матки, в проспективном популяционном исследовании. J Clin Pathol. 2005. 58: 946–50. DOI: 10.1136 / jcp.2004.022863. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Якобс М.В., Вальбумерс Дж. М., Снайдерс П. Дж., Вурхорст Ф. Дж., Верхейен Р. Х., Франсен-Даалмейер Н., Мейер С. Дж..Распределение 37 мукозотропных типов ВПЧ у женщин с цитологически нормальными мазками из шейки матки: возрастные закономерности для типов высокого и низкого риска. Int J Cancer. 2000; 87: 221–7. DOI: 10.1002 / 1097-0215 (20000715) 87: 2 <221 :: AID-IJC11> 3.0.CO; 2-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Herrero R, Hildesheim A, Bratti C, Sherman ME, Hutchinson M, Morales J, Balmaceda I, Greenberg MD, Alfaro M, Burk RD, Wacholder S, Plummer M, Schiffman M Популяционное исследование папилломавирусной инфекции и неоплазии шейки матки в сельских районах Коста-Рики.J Natl Cancer Inst. 2000; 92: 464–74. DOI: 10.1093 / jnci / 92.6.464. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Molano M, Posso H, Weiderpass E, van den Brule AJ, Ronderos M, Franceschi S, Meijer CJ, Arslan A, Munoz N, Исследовательская группа ВПЧ Распространенность исследования ВПЧ и детерминанты Инфекция ВПЧ среди колумбийских женщин с нормальной цитологией. Br J Рак. 2002. 87: 324–33. DOI: 10.1038 / sj.bjc.6600442. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Rousseau MC, Pereira JS, Prado JC, Villa LL, Rohan TE, Franco EL.Коинфекция шейки матки с типами вируса папилломы человека (ВПЧ) как предиктор приобретения и сохранения инфекции ВПЧ. J Infect Dis. 2001; 184: 1508–17. DOI: 10,1086 / 324579. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Hinchliffe SA, van Velzen D, Korporaal H, Kok PL, Boon ME. Кратковременность цервикальной ВПЧ-инфекции у сексуально активных молодых женщин с нормальной цитологией шейки матки. Br J Рак. 1995; 72: 943–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Brown DR, Shew ML, Qadadri B, Neptune N, Vargas M, Tu W, Juliar BE, Breen TE, Fortenberry JD.Продольное исследование генитальной инфекции папилломы человека в когорте женщин-подростков, за которыми внимательно наблюдали. J Infect Dis. 2005; 191: 182–92. DOI: 10,1086 / 426867. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, Seagar AL, Arends MJ, Moore C, Gilkisson G, McGoogan E. Множественные инфекции HPV высокого риска распространены в шейном отделе матки неоплазия и молодые женщины в популяции скрининга шейки матки. J Clin Pathol. 2004. 57: 68–72. DOI: 10.1136 / jcp.57.1.68.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Венсвин К.В., Кейджи М.Дж., Нагелькерке, штат Нью-Джерси, Велдхуизен Р.В., Тримбос Дж. Б.. Может ли полуколичественная оценка вирусной нагрузки вируса папилломы человека предсказать цитологический или гистологический результат у женщин с атипичными плоскоклеточными или железистыми клетками неопределенного значения цитологии? Eur J Gynaecol Oncol. 2005; 26: 393–7. [PubMed] [Google Scholar]
Sherman ME, Wang SS, Wheeler CM, Rich L, Gravitt PE, Tarone R, Schiffman M. Детерминанты вирусной нагрузки папилломы человека среди женщин с гистологической цервикальной интраэпителиальной неоплазией 3: доминирующее влияние окружающей среды. степень поражения.Биомаркеры эпидемиологии рака Пред. 2003; 12: 1038–44. [PubMed] [Google Scholar]
Castle PE, Schiffman M, Burk RD, Wacholder S, Hildesheim A, Herrero R, Bratti MC, Sherman ME, Lorincz A. Ограниченная перекрестная реактивность гибридного Capture 2 с неонкогенными типами вируса папилломы человека. Биомаркеры эпидемиологии рака и пред. 2002; 11: 1394–9. [PubMed] [Google Scholar]
Вернон С.Д., Унгер Э.Р., Уильямс Д. Сравнение обнаружения и типирования вируса папилломы человека с помощью циклического секвенирования, линейного блоттинга и гибридного захвата.J Clin Microbiol. 2000; 38: 651–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Джонсон Т., Брайдер К., Корбет С., Фомсгаард А. Обычное генотипирование образцов вируса папилломы человека в Дании. APMIS. 2003; 111: 398–404. DOI: 10.1034 / j.1600-0463.2003.t01-1-1110204.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Speich N, Schmitt C, Bollmann R, Bollmann M. Изучение 2916 цитологических образцов вируса папилломы человека (HPV) с помощью ПЦР и секвенирования ДНК: спектр генотипов пациентов из Западной Германии.J Med Microbiol. 2004; 53: 125–8. DOI: 10.1099 / jmm.0.05447-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Kosel S, Burggraf S, Mommsen J, Engelhardt W., Olgemoller B. Типоспецифическое обнаружение вирусов папилломы человека в обычных лабораторных условиях — сравнение улучшенной чувствительности и специфичности ПЦР и анализа последовательностей для прямой гибридизации. Clin Chem Lab Med. 2003. 41: 787–91. DOI: 10.1515 / CCLM.2003.119. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Lonky NM, Felix JC, Naidu YM, Wolde-Tsadik G.Сортировка атипичных плоскоклеточных клеток неопределенного значения с гибридным захватом II: кольпоскопия и гистологическая корреляция вируса папилломы человека. Obstet Gynecol. 2003; 101: 481–9. DOI: 10.1016 / S0029-7844 (02) 02715-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Stoler MH, Castle PE, Solomon D, Schiffman M. Расширенное использование тестирования на ВПЧ в гинекологической практике в соответствии с управлением под контролем ASCCP требует использования хорошо проверенных тестов. Am J Clin Pathol. 2007; 127: 335–7. [PubMed] [Google Scholar]
Справочный документ VRBPAC Четырехвалентная вакцина против ВПЧ Гардасил ™.Встреча VRBPAC. http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/06/briefing/2006-4222B3.pdf 18 мая 2006 г.
Асато Т., Маэхама Т., Нагаи И., Канадзава К., Уэзато Х., Кария К. Крупное исследование «случай-контроль» риска рака шейки матки, связанного с инфекцией вируса папилломы человека в Японии, путем генотипирования на основе нуклеотидного секвенирования. J Infect Dis. 2004; 189: 1829–32. DOI: 10,1086 / 382896. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Протоколы, используемые в NCI, и обработка связанной информации о микродиссектированных тканях для молекулярного анализа http: // cgap-mf.nih.gov/Protocols/Processing/DNA.html
Аятоллахи М., Закериния М., Хагшенас М. Молекулярный анализ иранских семей с серповидно-клеточной анемией. J Trop Pediatr. 2005; 51: 136–40. DOI: 10,1093 / tropej / fmh201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Gharizadeh B, Oggionni M, Zheng B, Akom E, Pourmand N, Ahmadian A, Wallin KL, Nyren P. Праймеры для множественного секвенирования с типом: новая стратегия надежного и быстрого генотипирование вирусов папилломы человека методом пиросеквенирования.J Mol Diagn. 2005. 7: 198–205. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Feoli-Fonseca JC, Oligny LL, Filion M, Brochu P, Simard P, Russo PA, Yotov WV. Метод прямого секвенирования двухуровневой полимеразной цепной реакции для обнаружения и типирования вирусов папилломы человека в патологических образцах. Diagn Mol Pathol. 1998. 7: 317–23. DOI: 10.1097 / 00019606-199812000-00005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ye S, Hong G. Большой фрагмент термостабильной ДНК-полимеразы I разрешает шпильочную структуру при секвенировании ДНК.Scientia sinica (Series B) 1987; 30: 503–6. [PubMed] [Google Scholar]
Hong GF, Huang W. ДНК-полимераза, обладающая способностью снижать врожденную избирательную дискриминацию в отношении дидезоксинуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями. Патент США. № 6,165,765 .
Андре П., Ким А., Храпко К., Thilly WG. Верность и мутационный спектр ДНК-полимеразы Pfu на последовательности митохондриальной ДНК человека.Genome Res. 1997; 7: 843–52. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Линдаль Т., Ниберг Б. Скорость депуринизации нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Биохимия. 1972; 11: 3610–8. DOI: 10.1021 / bi00769a018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Линдаль Т., Ниберг Б. Вызванное нагреванием дезаминирование остатков цитозина в дезоксирибонуклеиновой кислоте. Биохимия. 1974; 13: 3405–10. DOI: 10.1021 / bi00713a035. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Эванс М.Ф., Адамсон К.С., Симмонс-Арнольд Л., Купер К.ПЦР Touchdown General Primer (GP5 + / GP6 +) и оптимизированная концентрация ДНК в образце поддерживают чувствительное обнаружение вируса папилломы человека. BMC Clin Pathol. 2005; 5: 10. DOI: 10.1186 / 1472-6890-5-10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Шиффман М., Уиллер С.М., Дасгупта А., Соломон Д., Castle PE. Группа компаний ALTS. Сравнение прототипа ПЦР-анализа и гибридного захвата 2 для обнаружения ДНК канцерогенного вируса папилломы человека у женщин с сомнительными или слегка ненормальными мазками Папаниколау.Am J Clin Pathol. 2005; 124: 722–32. DOI: 10.1309 / E067-X0L1-U3CY-37NW. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Tornesello ML, Duraturo ML, Salatiello I, Buonaguro L, Losito S, Botti G, Stellato G, Greggi S, Piccoli R, Pilotti S, Stefanon B, De Palo G, Franceschi S, Буонагуро FM. Анализ вариантов вируса папилломы человека типа 16 у итальянских женщин с цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки. J Med Virol. 2004. 74: 117–26. DOI: 10.1002 / jmv.20154. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Feoli-Fonseca JC, Oligny LL, Brochu P, Simard P, Falconi S, Yotov WV.Изучение вируса папилломы человека (ВПЧ) 691 патологического образца из Квебека методом прямого секвенирования методом ПЦР. J Med Virol. 2001; 63: 284–92. DOI: 10.1002 / 1096-9071 (200104) 63: 4 <284 :: AID-JMV1003> 3.0.CO; 2-H. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ортис М., Торрес М., Муньос Л., Фернандес-Гарсия Е., Каналс Дж., Каборнеро А.И., Агилар Е., Баллестерос Дж., Дель Амо Дж., Гарсия-Саиз А. Онкогенный вирус папилломы человека (HPV) тип распределения и варианты HPV типа 16 E6 в двух испанских группах населения с различными уровнями риска инфицирования HPV.J Clin Microbiol. 2006; 44: 1428–34. DOI: 10.1128 / JCM.44.4.1428-1434.2006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Андерсон Т.П., Верно А.М., Бейнон К.А., Мердок Д.Р. Невозможность определения генотипа вируса простого герпеса с помощью анализа ПЦР в реальном времени и анализа кривой плавления из-за вариации последовательностей в местах связывания зонда. J Clin Microbiol. 2003. 41: 2135–2137. DOI: 10.1128 / JCM.41.5.2135-2137.2003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Горис Дж., Константинидис К.Т., Клаппенбах Дж. А., Коенье Т., Вандам П., Тидье Дж. М..Значения гибридизации ДНК-ДНК и их связь со сходством полногеномных последовательностей. Int J Syst Evol Microbiol. 2007; 57: 81–91. DOI: 10.1099 / ijs.0.64483-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Хуанг CC, Qiu JT, Kashima ML, Kurman RJ, Wu TC. Создание типоспецифичных зондов для обнаружения однокопийного вируса папилломы человека с помощью нового метода гибридизации in situ. Мод Pathol. 1998; 11: 971–7. [PubMed] [Google Scholar]
Наеф Ф., Лим Д.А., Патил Н., Магнаско М. Гибридизация ДНК с несовпадающими матрицами: исследование чипа.Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2002; 65: 040902. [PubMed] [Google Scholar]
Сорокин Н.В., Чечеткин В.Р., Лившиц М.А., Паньков С.В., Донников М.Ю., Грядунов Д.А., Лапа С.А., Заседателев А.С. Различение идеальных и несовпадающих дуплексов с микрочипами олигонуклеотидного геля: роль термодинамических и кинетических эффектов во время гибридизации. J Biomol Struct Dyn. 2005. 22: 725–34. [PubMed] [Google Scholar]
Schmitt M, Bravo IG, Snijders PJ, Gissmann L, Pawlita M, Waterboer T.Мультиплексное генотипирование вирусов папилломы человека на основе гранул. J Clin Microbiol. 2006; 44: 504–12. DOI: 10.1128 / JCM.44.2.504-512.2006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Таухид А.Р., Боденон С., Фавр М., Орт Г. Характеристика вируса папилломы человека типа 66 из инвазивной карциномы шейки матки. J Clin Microbiol. 1991; 29: 2656–2660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, Snijders PJ, Meijer CJ.Многоцентровая группа по изучению рака шейки матки Международного агентства по изучению рака: Эпидемиологическая классификация типов вируса папилломы человека, ассоциированных с раком шейки матки. N Engl J Med. 2003; 348: 518–27. DOI: 10.1056 / NEJMoa021641. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Prado JC, Calleja-Macias IE, Bernard HU, Kalantari M, Macay SA, Allan B, Williamson AL, Chung LP, Collins RJ, Zuna RE, Dunn ST, Ortiz-Lopez R, Barrera-Saldana HA, Cubie HA, Cuschieri K, von Knebel-Doeberitz M, Sanchez GI, Bosch FX, Villa LL.Мировое геномное разнообразие вирусов папилломы человека-53, 56 и 66, группы ВПЧ высокого риска, не связанных с ВПЧ-16 и ВПЧ-18. Вирусология. 2005. 340: 95–104. DOI: 10.1016 / j.virol.2005.06.024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Favre M, Kremsdorf D, Jablonska S, Obalek S, Pehau-Arnaudet G, Croissant O, Orth G. Два новых типа вируса папилломы человека (HPV54 и 55), характерные для генитальных опухолей, иллюстрируют множественность генитальных ВПЧ. Int J Cancer. 1990; 45: 40–6. DOI: 10.1002 / ijc.20109.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Шифф М., Беккер Т.М., Масук М., ван Ассельт-Кинг Л., Уиллер С.М., Альтобелли К.К., Норт CQ, Нахмиас А.Дж. Факторы риска интраэпителиальной неоплазии шейки матки у женщин юго-западных американских индейцев. Am J Epidemiol. 2000; 152: 716–26. DOI: 10.1093 / aje / 152.8.716. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Trimble CL, Piantadosi S, Gravitt P, Ronnett B, Pizer E, Elko A, Wilgus B, Yutzy W, Daniel R, Shah K, Peng S, Hung C, Roden R , Wu TC, Pardoll D. Спонтанная регрессия дисплазии шейки матки высокой степени: эффекты типа вируса папилломы человека и фенотипа HLA.Clin Cancer Res. 2005; 11: 4717–23. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-04-2599. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Zuna RE, Allen RA, Moore WE, Mattu R, Dunn ST. Сравнение генотипов вируса папилломы человека при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях высокой степени и инвазивной карциноме шейки матки: доказательства различий в биологическом потенциале предшественников поражений. Современная патология. 2004; 17: 1314–22. DOI: 10.1038 / modpathol.3800223. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Регулярное генотипирование вируса папилломы человека путем секвенирования ДНК в лабораториях общественных больниц
Заражение агентом рака.2007; 2: 11.
, 1 , 1 , 1 и 1
Sin Hang Lee
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Veronica S Vigliotti
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Джессика С. Виглиотти
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Сури Паппу
1 Отделение патологии , Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Автор, отвечающий за переписку.
Поступило 15 февраля 2007 г .; Принято 5 июня 2007 г.
Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе. при условии правильного цитирования оригинала.
Эта статья цитируется в других статьях в PMC.
Abstract
Предпосылки
Генотипирование вируса папилломы человека (ВПЧ) важно для последующего наблюдения за пациентами с персистирующей инфекцией ВПЧ и для оценки стратегии профилактики для отдельных пациентов, которые должны быть иммунизированы типоспецифическими вакцинами против ВПЧ.Целью этого исследования была оптимизация надежной «низкотемпературной» (LoTemp ™) системы ПЦР для оптимизации протоколов исследования вложенной ПЦР-амплификации ДНК ВПЧ с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК. Оптимизация протокола облегчает перенос этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику. В частности, снижение температуры на 10 ° C на каждом этапе термоциклирования во время in vitro амплификации ДНК дает более однородные продукты ПЦР. С помощью этого протокола очистка матрицы перед удлинением праймера ферментативного цикла больше не требуется.
Результаты
Геномную ДНК ВПЧ, экстрагированную из консервированных спиртом цервиковагинальных клеток на жидкой основе, сначала амплифицировали консенсусной парой праймеров MY09 / MY11 с последующей вложенной ПЦР с праймерами GP5 + / GP6 +. Гнездовые продукты ПЦР размером 150 п.н. подвергали прямому секвенированию ДНК. Гипервариабельную последовательность ДНК размером 34–50 п.н. ниже праймерного сайта GP5 + сравнивали с известными последовательностями ДНК ВПЧ, хранящимися в GenBank, с использованием онлайн-BLAST для генотипирования. Готовые к использованию реагенты для ПЦР-полимеразы LoTemp ™ оказались стабильными при комнатной температуре в течение как минимум 6 недель.Вложенная ПЦР выявила 107 изолятов ВПЧ в 513 цервиковагинальных клинических образцах, все подтвержденные секвенированием ДНК. ВПЧ-16 был наиболее распространенным генотипом, составляющим 29 из 107 положительных случаев (27,2%), за ним следует ВПЧ-56 (8,5%). Для сравнения: тест Digene HC2 обнаружил 62,6% из 107 изолятов ВПЧ и дал 11 (37,9%) из 29 положительных случаев ВПЧ-16 как «положительные для ВПЧ высокого риска».
Заключение
Готовая к использованию полимеразная система для ПЦР LoTemp ™, которая допускает термоциклирование при 85 ° C для денатурирования, 40 ° C для отжига и 65 ° C для удлинения праймера, может быть адаптирована для амплификации целевой ДНК HPV с помощью вложенной ПЦР и для подготовки клинических материалов для генотипирования методом прямого секвенирования ДНК.Генотипирование ВПЧ выполняется онлайн-алгоритмом BLAST гипервариабельной области L1. Последовательность ДНК включается в каждый отчет, направляемый врачу для сравнения при наблюдении за пациентами с персистирующей инфекцией ВПЧ, признанным промотором опухоли в индукции рака.
Предпосылки
Тестирование на вирус папилломы человека (ВПЧ) было введено, чтобы компенсировать низкую чувствительность и специфичность цитологического исследования мазка Папаниколау, часто используемого в качестве диагностического инструмента для пограничных предраковых поражений [1].Тест Digene Hybrid Capture 2 (HC2), единственный тест, одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), обычно используется для определения того, содержит ли суспензия цервиковагинальных клеток онкогенные ВПЧ «высокого риска» [2], часто действующие как сортировка для кольпоскопической оценки цитологически пограничных случаев [3-5]. Однако в настоящее время признано, что стойкая инфекция ВПЧ «высокого риска», а не простое присутствие самого вируса ВПЧ, является основным промотором, вызывающим предраковые поражения шейки матки и рак [6-9].Большинство инфекций ВПЧ, даже вызванных генотипами «высокого риска», являются временными при нормальной цитологии Папаниколау у сексуально активных молодых женщин [10-13]. У 93% первоначально инфицированных женщин тот же вирусный тип не обнаруживается при повторном обследовании через четыре менструальных цикла [14]. Средняя продолжительность положительной реакции, определяемой с помощью ПЦР для конкретного типа ВПЧ у этих молодых женщин, составляет 168 дней [15]. Множественные инфекции ВПЧ «высокого риска» не представляют более высокого риска развития неоплазии шейки матки по сравнению с единичной стойкой инфекцией ВПЧ высокого риска [16].Для развития и поддержания плоского интраэпителиального поражения высокой степени (SIL) риск наиболее высок у женщин, положительных на тот же генотип ВПЧ при повторном тестировании [6-8]. Вирусная нагрузка не является полезным параметром для прогнозирования высокого уровня SIL [17]. SIL высокого уровня часто ассоциируется с более низкой вирусной нагрузкой ДНК, чем это наблюдается в менее серьезно пораженных клетках [18].
Принимая во внимание недавний прогресс в понимании взаимосвязи между стойкой инфекцией ВПЧ и неоплазией шейки матки, для клинического ведения стойких инфекций необходима чувствительная и специфическая технология для обнаружения и точного определения генотипа ВПЧ.Тест HC2 не может быть преобразован в анализ генотипирования и связан со значительным количеством ложноотрицательных и ложноположительных результатов по сравнению с другими более строгими анализами генотипирования ВПЧ на основе ПЦР [19–23]. Сообщается, что он дает 25% ложноотрицательных результатов в случаях с подтвержденным биопсией высоким уровнем SIL, даже если все эти биопсии содержат ДНК ВПЧ высокого риска с помощью ПЦР [24]. «Отсутствие множества конкурентных, хорошо проверенных тестов» для анализа на ВПЧ цитируется как «проблема» при формулировании новых руководящих принципов лечения аномалий шейки матки [25].
Введение типоспецифических вакцин Gardasil ™ HPV в сексуально активное женское население также требует мониторинга генотипа HPV-инфекций до и после иммунизации для разработки стратегии профилактики для отдельных пациентов. Согласно «Справочному документу», представленному в FDA [26], введение вакцин против ВПЧ женщинам, у которых есть сопутствующие вакцино-релевантные инфекции ВПЧ, может увеличить риск на 44,6% развития предраковых поражений шейки матки высокой степени.Следовательно, было бы разумно выполнить анализ на ВПЧ, специфичный для генотипа, если есть подозрение на предшествующую инфекцию ВПЧ.
Целевая вложенная ПЦР-амплификация консервативной области ДНК гена L1 ВПЧ с консенсусными праймерами MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + или их эквивалентами с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК является общепринятым научным инструментом в исследованиях [21, 22,27]. Однако он не использовался в клинических лабораториях, потому что обращение с чувствительными к температуре реагентами ПЦР и требование очистки матрицы в протоколах ПЦР слишком трудоемко для рутинных применений.В этой статье отражен наш опыт использования высокопроизводительной, устойчивой к комнатной температуре надежной системы ДНК-полимеразы для облегчения переноса этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику. Каждый положительный результат на ВПЧ подтверждается генотипированием с прямым секвенированием ДНК гипервариабельной области гена L1. Информация о секвенировании ДНК ВПЧ может быть включена в лабораторный отчет для будущего клинического наблюдения за стойкими инфекциями.
Методы
Поскольку условия ПЦР, адаптированные для этого протокола, зависели от использования новой низкотемпературной, готовой к использованию умеренно термостабильной системы ДНК-полимеразы, чувствительности и специфичности ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® при амплификации ДНК ВПЧ были сначала проверены и сравнены с ДНК, полученной с помощью стандартных термостойких полимераз Taq , доступных на рынке.
Очищенные полноразмерные плазмидные ДНК типов -16, -18 и -6В ВПЧ, приобретенные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), использовали в качестве стандартов для разработки метода. Затем ДНК ВПЧ типа 16 использовали в качестве обычного положительного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали чистую воду молекулярной степени чистоты вместо экстракта ДНК.
Теоретическая чувствительность системы ПЦР, выбранной для этого исследования, была определена с использованием серийных 10-кратных разведений ATCC-сертифицированного стандарта HPV, содержащего 200 нг плазмидной ДНК HPV-16, -18 и -6B, с буфером TE для получения единственной копии. геномной ДНК на мкл в качестве матрицы для проведения первичной и вложенной ПЦР для каждого разведения в двух экземплярах.Теоретическое количество копий ДНК ВПЧ в матрице, используемой для каждой ПЦР MY09 / MY11, рассчитывалось в соответствии с общепринятой формулой пересчета [28]. Посредством секвенирования ДНК было подтверждено, что все вложенные продукты ПЦР соответствуют ожидаемым генотипам ВПЧ.
Для амплификаций ПЦР Taq реакционная смесь из 25 мкл содержала 100 мМ KCl, 20 мМ Трис-HCl pH 8,0, 25 мМ MgCl 2 , 2,5 мМ каждого дНТФ, 2,5 единицы полимеразы Takara Taq (Takara Bio Inc., Шига, Япония), 100 пмоль каждого консенсусного праймера (MY09 / MY11 или GP5 + / GP6 +) и 1 мкл ДНК ВПЧ при различных разведениях в буфере TE (или, если для вложенной ПЦР, 1 мкл ПЦР MY09 / MY11 продукты).Реакционную смесь подвергали 35 циклам амплификации в термоциклере MJ Research (Waltham, MA). Каждый цикл состоял из стадии денатурации при 94 ° C в течение 0,5 мин, стадии отжига при 55 ° C в течение 1 минуты и стадии удлинения цепи при 72 ° C в течение 1 минуты.
При проведении ПЦР ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® применялся протокол, описанный ниже для клинических образцов, за исключением того, что для сравнения с амплификацией ПЦР Taq использовали 35-цикловую амплификацию.
Клинические образцы, использованные для этого исследования, представляли собой 515 образцов цервиковагинальной цитологии на жидкой основе на спиртовой основе (Cytyc или Surepath), представленные врачами в Нью-Хейвене, штат Коннектикут, в рамках рутинных гинекологических осмотров.Возрастное распределение пациентов и патологические состояния шейки матки не были предметом данного исследования. Тест Digene HC2 на ВПЧ высокого риска, заказанный врачами, выполнялся в обычном порядке для каждого образца в одной из двух независимых клинических лабораторий (Quest Diagnostics Laboratory, Wallingford или Pathology & Laboratory Services, LLC, Woodbridge, CT) в соответствии с инструкциями, предоставленными Digene. Корпорация (Гейтерсбург, Мэриленд). Как правило, это были женщины моложе 30 лет, которым был поставлен Пап-цитологический диагноз атипичных плоскоклеточных клеток пониженной значимости (ASCUS), или женщины 30 лет и старше, независимо от результатов цитологического исследования Папаниколау [4].
После того, как материал был взят из каждого образца для рутинного цитологического исследования и анализа HCl, около 1 мл клеточных суспензий было помещено в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл, закодировано вслепую с номером случая и передано в лабораторию Милфордского госпиталя для лечения ВПЧ. ПЦР / секвенирование ДНК.
Экстракция ДНК из фиксированных спиртом клеток была выполнена в соответствии с протоколом Национального института рака (NCI) [29] с небольшими изменениями. Вкратце, суспензию клеток сначала центрифугировали в микроцентрифуге Eppendorf (модель 5424), оснащенной ротором (модель FA45-24-11), в течение 5 минут при 13000 об / мин.Клетки в осадке промывали 1 мл воды для реагентов, а затем 1 мл буфера, состоящего из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20, pH 8,1. Осадок промытых клеток ресуспендировали и расщепляли при 45–55 ° C в течение ночи в 100 мкл 0,1 мг / мл протеиназы K (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, штат Миссури), растворенных в том же буфере для промывки. После денатурирования белков в дигестате клеток в металлическом блоке, нагретом до 95 ° C в течение 10 мин, и заключительном центрифугировании дигестата при 13000 об / мин в течение 5 мин, супернатант осторожно пипетировали и помещали в чистую микроцентрифужную пробирку для использования. для ПЦР без дополнительной очистки или хранения при -20 ° C.
Для получения ДНК HPV использовали общую методологию первичной ПЦР-амплификации сегмента 450 п.н. гена L1 HPV с парой консенсусных праймеров MY09 / MY11 с последующей вложенной ПЦР с парой общих праймеров GP5 + / GP6 +. Вложенные продукты ПЦР размером 150 п.н. в положительных образцах были генотипированы прямым секвенированием ДНК [21,22] с небольшими модификациями, кратко изложенными ниже.
Для первичной ПЦР-амплификации в пробирку для ПЦР, содержащую 20 мкл LoTemp ™ HiFi ® , добавляли 1 мкл экстракта ДНК, 1 мкл 10-молярного праймера MY09, 1 мкл 10-молярного праймера MY11 и 2 мкл воды. Готовая к использованию смесь ДНК-полимеразы (HiFi DNA Tech, LLC, Trumbull, CT), которая содержит все компоненты, необходимые для низкотемпературной ПЦР, включая dNTP, Mg ++ , буфер, ДНК-полимеразы HiFi ® , запатентованную dsDNA плавящие агенты и консерванты dNTP, чтобы достичь конечного реакционного объема 25 мкл.Для термоциклирования температурные шаги термоциклера TC-412 (Techne Incorporated, Берлингтон, Нью-Джерси) были запрограммированы на начальный нагрев при 85 ° C в течение 2 минут с последующими 30 циклами при 85 ° C в течение 30 секунд, 40 ° C. в течение 30 секунд и 65 ° C в течение 1 мин. Окончательное удлинение составляло 65 ° C в течение 10 мин.
Для вложенной ПЦР «след» продуктов ПЦР MY09 / MY11 переносили стеклянной палочкой с чистой смачиваемой поверхностью диаметром около 1,5 мм во вторую пробирку для ПЦР, содержащую 25 мкл полной реакционной смеси вложенной ПЦР, состоящей из 20 мкл готовой к использованию смеси ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® , 1 мкл 10 мкмолярного праймера GP5 +, 1 мкл 10 мкмоль праймера GP6 + и 3 мкл воды, используя ту же программу термоциклирования, как описано выше.
После завершения первичной и вложенной ПЦР из каждой пробирки пипеткой отбирали 5 мкл продуктов ПЦР и смешивали с 2 мкл загрузочной жидкости для электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Гель исследовали в УФ-свете. Визуализация полосы продукта ПЦР 450 п.н. на дорожке MY09 / MY11 и / или полосы 150 п.н. на вложенной дорожке ПЦР на агарозном геле предоставила доказательства наличия ДНК ВПЧ в образце, ожидающего генотипирования с прямым секвенированием ДНК в качестве окончательного Проверка.
Для секвенирования ДНК, 1 мкл вложенных продуктов ПЦР, если они положительные, отбирали пипеткой из вложенной пробирки для ПЦР для прямого секвенирования ДНК, используя 1 мкл 5 мкмолярного праймера GP6 + в качестве праймера для секвенирования, 1 мкл BigDye ® Terminator (версия 1.1 / стандартный набор для секвенирования), 3,5 мкл 5-кратного буфера и 13,5 мкл воды в общем объеме 20 мкл для 20 циклов ферментативных реакций удлинения / прекращения праймера в термоцилиндре ABI модели 9600 в соответствии с протоколом, предоставленным производитель (Applied Biosystems).После очистки от красителя-терминатора с помощью колонки Centri-Sep (Princeton Separations, Adelphia, NJ) реакционную смесь загружали в автоматический четырехкапиллярный генетический анализатор ABI 3130 для анализа последовательности. Выравнивание последовательностей выполняли против различных стандартных последовательностей генотипов HPV, хранящихся в базе данных GenBank, с помощью онлайн-анализа BLAST, чтобы прийти к конкретному генотипированию.
Один мкл каждого экстракта ДНК помещали в отдельную пробирку для ПЦР с парой праймеров β-глобина [30] для амплификации геномной ДНК человека в качестве контроля адекватности образца.Праймеры для амплификации гена β-глобина представляли собой 1 мкл 80 мкмоль 5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC и 1 мкл 80 мкмоль 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC в 20 мкл готовой к использованию смеси ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® с 2 мкл добавлена вода. Использовалась упомянутая выше программа термоциклирования LoTemp ™.
Три (3) пробирки для ПЦР на образец обычно использовали для гена β-глобина, праймера MY09 / MY11 и вложенной амплификации GP5 + / GP6 +, соответственно.
Для проверки воспроизводимости этой процедуры ПЦР / ДНК-секвенирования аликвоты гидролизата 30 отдельных клинических образцов были протестированы в параллельных дублирующих сериях.Сравнивались повторяющиеся результаты трех ПЦР в каждом случае и результаты генотипирования положительных случаев путем секвенирования ДНК.
Образцы, которые не показали полосы ПЦР MY09 / MY11 или GP5 + / GP6 +, но показали доказательства положительной амплификации гена β-глобина, были интерпретированы как HPV-отрицательные. Образцы, которые не показали продуктов ПЦР на всех трех дорожках, были признаны неудовлетворительными для оценки из-за низкой экстракции ДНК или присутствия ингибитора ПЦР. Было два (2) неудовлетворительных дела из 515 обработанных.Остальные 513 случаев были признаны удовлетворительными для анализа. Из этих 513 случаев 107 были положительными на вложенные продукты ПЦР, все они оказались ДНК ВПЧ прямым секвенированием ДНК с использованием GP6 + в качестве праймера для секвенирования.
Образцы, инфицированные более чем одним генотипом ВПЧ, были обозначены появлением множества неоднозначных или перекрывающихся пиков в записях секвенирования ДНК. Для каждой из этих смешанных инфекций вложенные продукты ПЦР были подвергнуты дополнительным четырем индивидуальным реакциям удлинения / завершения праймера, чтобы исключить инфицирование вакциной Гардасил ™ ВПЧ, а именно ВПЧ типов -16, -18, -6 или -11, с использованием следующих типоспецифичных праймеров [31].
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-16 5′-GCTGCCATATCTACTTCAGA-3 ‘
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-18 5′-GCTTCTACACAGTCTCCTGT-3′
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-6 3′-GTGCATCTCCG ‘
Праймер для секвенирования, специфичный для типа HPV-11 5′-GTGCATCTGTGTCTAAATCTG-3′
Все олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров для этого исследования, были синтезированы и очищены с помощью картриджа для очистки олигонуклеотидов (OPC) лабораторией синтеза ДНК отделения патологии Университет (Нью-Хейвен, Коннектикут).
Чтобы избежать перекрестного заражения, для тестов амплификации нуклеиновых кислот были выделены три отдельные комнаты без рециркуляции воздуха. Каждая из двух комнат была оборудована 32-дюймовой рабочей станцией ПЦР (AirClean Systems, Роли, Северная Каролина). Все процедуры предварительной амплификации выполнялись на станции ПЦР I. Все процедуры после ПЦР выполнялись на станции ПЦР II, включая подготовку к вложенная ПЦР и реакция секвенирования.Гель-электрофорез и секвенирование ДНК проводили в третьей комнате для изоляции.Никакие материалы после ПЦР или любые предметы, загрязненные ампликонами, или оборудование, используемое в комнатах после ПЦР, не допускались в рабочее пространство до ПЦР.
Результаты
ДНК-полимераза LoTemp ™ HiFi ® была примерно в 10 раз эффективнее ДНК-полимеразы Taq при амплификации плазмидной ДНК ВПЧ с помощью ПЦР MY09 / MY11 и примерно в 100–1000 раз эффективнее при первой амплификации с помощью вложенной ПЦР GP5 + / GP6 + в тандеме. Технология вложенной ПЦР, описанная в этой статье, оказалась чувствительным методом для обнаружения 1–10 копий очищенной геномной ДНК типов HPV -16, -18 или -6B.Но 10 4 -10 5 копий геномной ДНК были необходимы в качестве ПЦР-матриц для УФ-визуализации положительной полосы ампликона праймера MY09 / MY11 после электрофореза (рис.). Специфичность всех вложенных продуктов ПЦР была подтверждена генотипированием ВПЧ с прямым секвенированием ДНК.
Сравнительная амплификация ДНК HPV-16 с помощью ДНК-полимеразы Taq и ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® ДНК-полимеразы . Дорожки 1–8: матрица плазмидной ДНК ВПЧ-16 при 85 × 10 1 , 85 × 10 2 , 85 × 10 3 , 85 × 10 4 , 85 × 10 5 , 85 × 10 6 , 85 × 10 7 и 85 × 10 8 копий на миллилитр.NC: отрицательный контроль. M: молекулярный маркер. Стрелки указывают нижний предел обнаружения вложенной ПЦР (A) и первичной ПЦР 1 st (B) с ДНК-полимеразой Takara Taq и ДНК-полимеразой LoTemp ™ HiFi ® соответственно.
Воспроизводимость этого вложенного ПЦР-анализа при обнаружении ДНК ВПЧ в клинических образцах была подтверждена запуском двух параллельных наборов ПЦР с расщепленным дигестатом одного образца в качестве парных матриц, включая ген β-глобина, праймер MY и GP амплификации вложенных праймеров в каждом наборе для 30 HPV-положительных случаев.Пара идентичных результатов на геле электрофореза была получена во всех трех амплификациях для 30 разделенных образцов (рис.). Вложенные продукты ПЦР, полученные на наборах дубликатов, были подтверждены секвенированием ДНК как принадлежащие к одному и тому же генотипу HPV.
Вложенная ПЦР HPV в клинических образцах и воспроизводимость . В агарозном геле показаны продукты ПЦР целевых ДНК, экстрагированных из двух клинических образцов в двух экземплярах. Ампликон ДНК-мишени β-глобина имеет длину 110 п.н., что ясно видно на дорожках 25 и 26 (№ 1210), но почти не видно на дорожках 31 и 32 (№ 1211).Совместная амплификация других фрагментов геномной ДНК человека и положительный вложенный ампликон ПЦР обеспечивают адекватность образцов в обоих образцах. Молекулярная линейка = 100–1000 п.н. (крайняя слева). Дорожки 25/26, 27/28, 29/30 = ген β-глобина, MY09 / MY11, GP5 + / GP6 + ПЦР, соответственно — образец № 1210. Дорожки 31/32, 33/34, 35/36 = ген β-глобина, MY09 / MY11, GP5 + / GP6 + ПЦР, соответственно — образец № 1211
Для клинических образцов первичная ПЦР MY09 / MY11 генерировала отдельный продукт размером 450 п.н. полоса после 30 повторных циклов амплификации только в 37 из 107 HPV-положительных случаев, обнаруженных с помощью вложенной ПЦР.Более 65% клинических ВПЧ-положительных ампликонов полагались на вложенную ПЦР для УФ-визуализации. Без вложенной ПЦР ампликон ПЦР MY09 / MY11 часто был замаскирован из-за совместной амплификации других молекул ДНК в клинических образцах (рис.).
Для некоторых изолятов, особенно изолятов HPV-39 и HPV-73, стандартная вложенная ПЦР GP5 + / GP6 + не смогла амплифицировать целевой фрагмент ДНК, даже если ПЦР-амплификация праймера MY09 / MY11 была успешной. Эти случаи были выявлены при гель-электрофорезе, показав положительный ПЦР-ампликон MY09 / MY11 450 п.н. в отсутствие ожидаемого сопутствующего вложенного продукта ПЦР размером 150 п.н.Для этих штаммов HPV с помощью геминизированной ПЦР с праймерами MY11 / GP6 + был получен гомогенный ампликон (рис.) Для прямого секвенирования ДНК.
После циклического секвенирования алгоритмы BLAST путем выравнивания последовательности ДНК из 34 п.н. в гипервариабельной области гена L1 ниже сайта связывания GP5 + с известными последовательностями генотипа ВПЧ, хранящимися в базе данных GenBank, обычно определяли генотип выявлены изоляты ВПЧ [32]. 100% совпадение «идентичностей» между «запросной» последовательностью и «субъектной» последовательностью было достигнуто для каждого окончательного генотипирования (рис.). Это отслеживание последовательности с его онлайн-алгоритмом BLAST для генотипирования было включено в отчет о клиническом наблюдении за стойкими инфекциями. Однако HPV-16 имеет множество вариантов последовательностей, некоторые из которых имеют идентичную последовательность в этой области с некоторыми штаммами HPV-31 и HPV-33, и для различения генотипов требуется алгоритм BLAST с последовательностью 50 п.н.
Последовательность ДНК вложенного продукта ПЦР ниже GP5 + для генотипирования . Это типичная последовательность ДНК, вырезанная из цветовой дорожки ниже участка связывания GP5 + гена L1 ДНК ВПЧ.Анализ выравнивания BLAST последовательности из 34 (до 50) п.н. этой гипервариабельной области дает однозначные доказательства генотипа 66 HPV на основе базы данных, хранящейся в GenBank.
Из 513 цервиковагинальных образцов на жидкой основе метод вложенной ПЦР выявил по крайней мере один штамм ВПЧ из 107, с общим положительным показателем 20,9%, включая 74 случая, укрывающих по крайней мере один из 13 типов, на которые нацелен Digene HC2 » тест на ВПЧ высокого риска и 33 случая с типами ВПЧ «низкого риска» (таблица).Наиболее распространенным генотипом в районе Нью-Хейвена оказался ВПЧ-16, за которым следует ВПЧ-56. Совокупный уровень распространенности ВПЧ-16 и ВПЧ-18 составил 32,8% от общего числа изолятов.
Таблица 1
Генотипирование ВПЧ с помощью секвенирования ДНК по сравнению с тестом Digene HC2
ПЦР / ДНК-секвенирование
Результаты теста Digene HC2
Тип Случаи
Распространенность (%)
Высокий риск +
Отрицательный
16
29
(27.2)
11
18
56
9
(8,5)
9
0
31
7
(6,5)
2
2
2
2 902 6
6
(5,6)
2
4
18
6
(5,6)
6
0
54
0 6 902
3
58
6
(5.6)
5
1
66
6
(5,6)
6
0
59
4
(3,7)
0 45
3
(2,8)
2
1
83
3
(2,8)
2
1
32
07 2 902
2
35
2
(1.9)
1
1
39
2
(1,9)
2
0
40
2
(1,9)
2
0 52
2
(1,9)
1
1
33
1
(0,9)
1
0
53
0 1 902
0
62
1
(0.9)
1
0
68
1
(0,9)
1
0
70
1
(0,9)
0,9)
1 72
1
(0,9)
0
1
73
1
(0,9)
0
1
M16
07 1
0
M 16, 18
1
(0.9)
1
0
M другие
3
(2,9)
1
2
Итого
107
(100)
HC2 Уровень обнаружения ВПЧ = 67/107 = 62,6%
Образцы
513
9025
513
.9
Тест на ВПЧ высокого риска HC2 выявил только 11 (37,9%) из 29 случаев ВПЧ-16 как положительные. Однако он успешно идентифицировал все образцы, содержащие ВПЧ-56 и ВПЧ-18, как положительные на ВПЧ высокого риска. Чувствительность теста HC2 при обнаружении заранее определенных генотипов ВПЧ «высокого риска» резюмируется следующим образом:
HPV-18 100%
HPC-33 100%
HPV-39 100%
HPV-56 100%
HPV-59 100%
HPV-68 100%
HPV-58 83.3%
HPV-31 71,4%
HPV-45 66,7%
HPV-35 50%
HPV-52 50%
HPV-16 37,9%
Хотя HPV-54, -66, -83, -53 и -62 не были включены в пробу гибридизационного коктейля, эти генотипы часто сообщались как положительные на ВПЧ высокого риска с помощью теста HC2 (таблица).
Среди 107 вложенных ПЦР-положительных образцов секвенирование ДНК с консенсусным общим праймером GP6 + дало множественные перекрывающиеся нечитаемые последовательности в 5 случаях.Использование индивидуального типоспецифического секвенирования праймеров для HPV-6, -11, -16 и -18 доказало, что один из них содержал HPV-16, но не три других генотипа, и что один содержал смесь HPV-16 и HPV. -18, но не два других генотипа. Для оставшихся 3 образцов смешанной инфекции повторное индивидуальное секвенирование ДНК не дало читаемой реакции удлинения / терминации праймера с любым из четырех типоспецифичных праймеров. Следовательно, эти последние 3 случая были сочтены множественными инфекциями, вызванными ВПЧ, отличными от четырех вакцин-релевантных типов, и сгруппированы в категорию «низкого риска».
Из 513 изученных случаев тест Digene HC2 классифицировал 403 пробы как отрицательные, 75 как положительные для ВПЧ «высокого риска» и 35 как неудовлетворительные для оценки. Эти результаты сравнивали с результатами, полученными с помощью анализа вложенной ПЦР (таблица). Так как тест Дигена охватил только генотипы ВПЧ «высокого риска», образцы, инфицированные ВПЧ, отличные от 13 типов, на которые нацелена проба коктейля из ВПЧ «высокого риска» HC2, будут классифицированы как отрицательные или неудовлетворительные для оценки (неудовлетворительно). Таким образом, тест HC2 идентифицировал 50 из 74 HPV-положительных образцов «высокого риска», обнаруженных с помощью вложенной ПЦР.Расчетная чувствительность теста Digene HC2 составила 50/74 = 67,6% по сравнению с анализом вложенной ПЦР. Поскольку в HC2 было зарегистрировано в общей сложности 75 случаев заражения ВПЧ «высокого риска», его аналитическая специфичность составила 50/75 = 66,7%. Два случая, признанных неудовлетворительными для оценки ПЦР и отрицательными с помощью теста HC2, были исключены из общего числа 513 случаев, введенных для анализа.
Таблица 2
Сравнение результатов вложенной ПЦР / секвенирования ВПЧ и результатов теста HC2
Результаты ПЦР
902
907 Высокий риск
Низкий риск
Unsat .
Всего
Результаты HC2
Отрицательное
364
23
16
902 902 902 902 902 902 902 902 902 902 8
50
17
0
75
Низкий риск
NP
NP
NP
902
34
1
0
35
Всего
406
74
33
0
9002 9002
525 Умеренный ™ HiFi ® ДНК-полимеразы представляют собой генно-инженерные производные ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus (Bst) , которая была впервые введена для разрешения структуры шпильки в классическом секвенировании ДНК по Сэнгеру Йе и Хонгом [33]. Bst ДНК-полимераза с оптимальной температурой удлинения праймера 65 ° C чрезвычайно стабильна, способна сохранять качество своего секвенирования в рабочем растворе при комнатной температуре в течение нескольких недель в условиях роботизированной автоматизации [34]. Модификация аминокислотной последовательности природной ДНК-полимеразы Bst с помощью сайт-направленных генетических мутаций увеличивает термостойкость фермента [35], что открыло путь к разработке новых термостабильных ДНК-полимераз для повторных реакций удлинения праймера ниже 85 ° C.Протокол ПЦР ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® использует свойства модифицированной ДНК-полимеразы Bst при пониженных циклических температурах и свойствах высокой процессивности.
Использование ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® для амплификации ДНК ВПЧ исключает все этапы очистки матрицы, которые обычно требуются перед ПЦР или реакцией секвенирования [21,22,32]. Поскольку готовая к использованию смесь полимераз содержит все необходимые ингредиенты для ПЦР, необходимость в пипетировании на дому минимальна.Поскольку ДНК-полимераза и другие компоненты реагента стабилизированы для хранения при комнатной температуре, нет необходимости хранить ледяные блоки при настройке ПЦР. Поскольку в этой системе используются химические плавящие агенты для денатурирования дцДНК и высокопроизводительная ДНК-полимераза для удлинения нуклеотидных праймеров при частичной изостабилизации, она позволяет проводить термоциклирование при 85 ° C для денатурирования, 40 ° C для отжига и 65 ° C для удлинения праймера соответственно. При пониженных температурах циклирования скорость индуцированных нагреванием мутаций [36], а именно депуринизации [37] и дезаминирования [38] азотистых оснований в молекулах ДНК во время амплификации ПЦР снижается.В результате продукты ПЦР более однородны.
В этом отчете мы продемонстрировали, что система ПЦР LoTemp ™ может амплифицировать 1–10 копий очищенного HPV-16, -18 или -6B для создания соответствующего типоспецифичного вложенного продукта ПЦР размером 150 п.н. Чувствительность ПЦР LoTemp ™ при обнаружении плазмидной ДНК ВПЧ примерно в 10 раз выше, чем у традиционных термостойких ДНК-полимераз Taq без вложенной амплификации (рис.). Вложенная ПЦР повысила аналитическую чувствительность обнаружения ДНК ВПЧ на суспензиях цервиковагинальных клеток [21,22,32], что также подтверждается нашим опытом (рис.). Вложенная ПЦР также служит для устранения большинства мешающих веществ, которые в противном случае, возможно, пришлось бы удалить очисткой колонки в этой процедуре.
Хотя согласованные общие пары праймеров MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + использовались для амплификации высококонсервативной области гена L1 всех генотипов ВПЧ, их эффективность в амплификации целевой ДНК варьируется от одного генотипа ВПЧ к другому с противоречивыми паттернами [22] . Мы обнаружили, что некоторые изоляты HPV-39 и HPV-73 не амплифицируются парой праймеров GP5 + / GP6 + ни в первичной ПЦР, ни во вложенной ПЦР.Вторая амплификация с парой праймеров GP5 + / MY09 и GP6 + / MY11 дает более длинный и более короткий продукт ПЦР, соответственно. Геминизированный продукт ПЦР GP6 + / MY11 (рис.) Подходит для прямого секвенирования ДНК. Неудача GP5 + / GP6 + при амплификации HPV-39 [39] и других типов HPV [22,32] в клинических образцах является хорошо известной технической проблемой, если эта единственная пара праймеров используется для обнаружения HPV. Однако GP5 + и GP6 + являются отличными вложенными праймерами для ПЦР для подготовки матриц для генотипирования HPV с прямым секвенированием ДНК.
Оптимизация протокола ПЦР важна для обнаружения ВПЧ. Без оптимизации метод ПЦР с использованием одного набора консенсусных праймеров для амплификации может иметь более низкую чувствительность, чем тест Digene HC2 [40]. Используя первоначальную 40-цикличную амплификацию клинических образцов, Johnson et al . [21] сообщили, что вложенная ПЦР обычно увеличивает чувствительность метода ПЦР на ВПЧ примерно на 60%. С протоколом ПЦР, представленным в этой статье, это различие усиливается за счет принятия 30-цикловой амплификации.Преимущество уменьшения количества циклов амплификации состоит в том, что коамплификация неспецифических мешающих молекул ДНК уменьшается в первичной ПЦР в пользу создания специфических вложенных продуктов ПЦР для прямого секвенирования ДНК.
Используя наш оптимизированный протокол, вложенная ПЦР выявила 107 HPV-положительных случаев среди 513 клинических образцов (таблица). Было идентифицировано двадцать три (23) генотипа ВПЧ, включая 12 из 13 генотипов «высокого риска», т.е. ВПЧ-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -52, -56, -58, -59 и -68, которые нацелены на тест Digene HC2.Отсутствие репрезентативности HPV-51, который также является мишенью для теста HC 2, вероятно, отражает низкую региональную распространенность этого генотипа. Используя те же праймеры для вложенной ПЦР с последующим генотипированием с секвенированием ДНК, было обнаружено, что HPV-51 является относительно распространенным генотипом в Германии, составляя около 5% от общего числа обнаруженных изолятов HPV [22]. Однако среди 894 изолятов ВПЧ в Дании он не был зарегистрирован ни разу [21].
Гипервариабельная область последовательности ДНК ниже сайта связывания GP5 + имеет решающее значение для генотипирования L1 ВПЧ.Хотя большинство генотипов ВПЧ можно определить путем выравнивания последовательности длиной 34 п.н. в этой области с базой данных GenBank [32], для точного генотипирования может потребоваться выравнивание более длинной последовательности, например длиной 50 п.н., когда результат алгоритма BLAST неоднозначен. . Если для генотипирования полагаться на последовательность из 34 пар оснований, количество инфекций HPV-16 может быть недооценено.
Для разработки этого протокола мы обнаружили, что использование 1 мкл 5 мкмоль OPC-очищенного олигонуклеотида GP6 + вместо рекомендованного производителем 3.2 мкмоль раствор в качестве праймера для секвенирования, по-видимому, дает более согласованные результаты секвенирования для типирования различных изолятов ВПЧ. Концентрация праймера может нуждаться в корректировке, если более высокий уровень GP6 + используется в качестве праймера для секвенирования ДНК.
Из 107 ПЦР-положительных образцов тест Digene HC2 классифицировал 67 как ВПЧ-положительные, уровень обнаружения 62,6% (таблица). Когда для сравнения используются только нацеленные на HC2 генотипы HPV «высокого риска», вложенная ПЦР выявляет 74 HPV-положительных случая, в то время как тест HC2 выявляет 50 в этой группе с аналитической чувствительностью 67.6% (50/74).
Наиболее распространенным является ВПЧ-16, составляющий 27,2% от общего числа изолятов (таблица). Этот процент распространенности ВПЧ-16 почти идентичен процентному соотношению, о котором сообщают другие специалисты с использованием гнездовой ПЦР / ДНК-секвенирования MY / GP, генотипирования суспензий цервиковагинальных клеток, например 26% в Дании [21] и 26,2% в Германии [22]. Тест Digene HC2 выявил 11 из 29 ПЦР-положительных случаев ВПЧ-16 с показателем обнаружения 37,9%, что является неожиданно низким. Поскольку все положительные результаты ПЦР на ВПЧ-16 были подтверждены секвенированием ДНК для генотипирования с уровнем распространенности, аналогичным тем, которые обычно встречаются в западном мире, на основе той же методологии [21,22], и поскольку тесты Digene HC2 проводились две независимые клинические лаборатории, должным образом сертифицированные органами здравоохранения, достоверность результатов отдельных тестов, кажется, не подлежит сомнению.Несоответствие, вероятно, связано с тем, что в данной популяции пациентов существует множество вариантов последовательностей HPV-16 [41], которые могут быть не все нацелены на зонд коктейля РНК HC2, но имеют общую высококонсервативную область гена L1, которая праймеры MY09 / MY11 эффективно амплифицируются. В пользу этой интерпретации говорит тот факт, что тест HC2 правильно определил все случаи ВПЧ-18, ВПЧ-39, ВПЧ-56 и ВПЧ-59 как «группы высокого риска» по одним и тем же данным.
ВПЧ-56 — второй по частоте обнаруженный генотип высокого риска (8.5%), за которыми следуют ВПЧ-31, -18, -54, -58 и -66, с примерно одинаковым уровнем распространенности (5,6–6,5%). Общее количество случаев ВПЧ-16 и -18 составляет только 32,8% от единичных изолятов ВПЧ в нашей серии. ВПЧ-18, по-видимому, также играет относительно небольшую роль в возникновении патологии шейки матки в Канаде [42].
Сообщалось другими [43], что тест высокого риска Digene HC2 может обнаруживать типы ВПЧ -53, -54, -62, -66 и -83 и маркировать их как ВПЧ высокого риска, хотя эти Генотипы не являются преднамеренно целевыми в его коктейльном зонде высокого риска.Наши данные подтверждают эти перекрестные реакции (таблица). Вариация последовательностей в сайтах связывания зонда [44] и неспецифическое связывание между зондом и несовпадающей ДНК, не являющейся мишенью [45-48], являются хорошо известными источниками ошибок, если гибридизация нуклеиновых кислот используется для микробного и вирусного генотипирования. Когда продукты ПЦР GP5 + / GP6 + с гипервариабельной последовательностью ДНК нацелены на разработку метода мультиплексного генотипирования [49], обнаруживается, что ДНК-зонд, разработанный для HPV-66, недавно признанного типа высокого риска [50-52], реагирует с ВПЧ-52 и зондом для ВПЧ-82 с ВПЧ-51 из-за перекрестной гибридизации, несмотря на наличие четырех несовпадений оснований в каждой паре.Некоторые эксперты [40] считают непреднамеренные перекрестные реакции теста Digene HC2 с нецелевыми типами ВПЧ, такими как ВПЧ-66, которые иногда могут вызывать рак, «удачными». Однако польза от этих перекрестных реакций для пациентов требует дополнительного подтверждения.
Пятьдесят процентов (50%) изолятов ВПЧ-54 возвращаются тестом на ВПЧ как ВПЧ высокого риска. ВПЧ-54 был классифицирован как вирус низкого риска [51,53], но обнаружено, что он связан с 40-кратным увеличением риска среди женщин американских индейцев с CIN 2/3.Только ВПЧ-16 показал более высокий риск, чем ВПЧ-54 среди этой субпопуляции [54]. При использовании информации о генотипировании ВПЧ для наблюдения за стойкими инфекциями, возможно, придется учитывать генетический состав пациента [55].
Для случаев смешанной инфекции мы выбираем отдельные праймеры, специфичные для HPV-6, -11, -16 и -18 [31], чтобы выполнить секвенирование ДНК с индивидуальным специфическим праймером, чтобы определить, включает ли смешанная инфекция какие-либо из этих вакцин- соответствующие типы ВПЧ. Обоснование этого выбора заключается в том, что большинство множественных инфекций ВПЧ являются временными [6-15].Непосредственную озабоченность пациентки и ее лечащего врача вызывает вопрос о том, вызвана ли смешанная инфекция каким-либо из типов ВПЧ, имеющих отношение к вакцине, если пациент подумывает о вакцинации.
Низкий процент (<5%) множественных инфекций ВПЧ, наблюдаемый в нашей серии, мог быть необъективным, потому что большая часть образцов для этого исследования была собрана в офисе индивидуального частного практикующего врача, и эта группа образцов имела исключительно низкий положительный результат. частота и отсутствие множественных инфекций ВПЧ.Известно, что частота множественных инфекций ВПЧ варьируется среди популяций пациентов, а также зависит от стадии канцерогенеза. Множественные инфекции HPV были обнаружены менее чем в 5% HPV-положительных образцов от пациентов с инвазивным раком, но более чем в 15% положительных образцов в контрольной группе [27]. Множественные инфекции HPV имеют тенденцию развиваться в отдельные инфекции HPV, поскольку инфекция становится хронической и устойчивой, в то время как цитопатология шейки матки прогрессирует от метаплазии, LSIL, HSIL, карциномы in situ до инвазивного рака [56].
Таким образом, мы сообщили о нашем опыте адаптации хорошо охарактеризованного протокола ПЦР / секвенирования ДНК для рутинного генотипирования ВПЧ. Мы считаем, что чувствительный и специфический анализ ВПЧ с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК позволит получить полезную информацию для отслеживания стойких инфекций при направлении пациентов с «высоким риском» развития HSIL, а не пациентов с «ВПЧ высокого риска». до кольпоскопической оценки.
Заключение
Технология вложенной ПЦР с использованием консенсусных праймеров MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + для целевой амплификации ДНК ВПЧ может использоваться в диагностических лабораториях для рутинного обнаружения ВПЧ и подготовки клинических материалов для генотипирования путем прямого секвенирования ДНК.Мы адаптировали недавно внедренную систему низкотемпературной ПЦР и оптимизировали протокол, чтобы облегчить перенос этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику для точного генотипирования ВПЧ, которое является ценным инструментом для последующего наблюдения за пациентами с устойчивой инфекцией ВПЧ, признанной опухолью. промотор в индукции рака.
Тест ДНК вируса папилломы человека HC2-REF 5199-1220 Digene Corporation, Gaithersburg, MD 20878 USA. 2005.
Гогола Дж., Ван Динь Т., Луччи Дж. А., 3, Смит Е., Ханниган Е. В.. Тестирование на вирус папилломы человека для сортировки в направленной популяции. J Low Genit Tract Dis. 2001; 5: 29–32. DOI: 10.1046 / j.1526-0976.2001.51006.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Wu HH, Allen SL, Kirkpatrick JL, Elsheikh TM. Рефлекторный тест ДНК вируса папилломы человека высокого риска полезен при сортировке женщин с атипичными плоскоклеточными клетками и не может исключить плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени. Diagn Cytopathol. 2006; 34: 707–10. DOI: 10.1002 / dc.20497. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Wallin KL, Wiklund F, Angstrom T., Bergman F, Stendahl U, Wadell G, Hallmans G, Dillner J. Типоспецифическая персистентность ДНК вируса папилломы человека до развития инвазивной цервикальной рак.N Engl J Med. 1999; 341: 1633–8. DOI: 10.1056 / NEJM1993412201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Kjaer SK, van den Brule AJ, Paull G, Svare EI, Sherman ME, Thomsen BL, Suntum M, Bock JE, Poll PA, Meijers CJ. Типоспецифическая персистенция вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска как индикатор плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки высокой степени у молодых женщин: проспективное последующее исследование на популяционной основе. BMJ. 2002; 325: 572–6. DOI: 10.1136 / bmj.325.7364.572. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, Gilkison G, Arends MJ, Graham C, McGoogan E.Стойкая ВПЧ-инфекция высокого риска, связанная с развитием неоплазии шейки матки, в проспективном популяционном исследовании. J Clin Pathol. 2005. 58: 946–50. DOI: 10.1136 / jcp.2004.022863. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Якобс М.В., Вальбумерс Дж. М., Снайдерс П. Дж., Вурхорст Ф. Дж., Верхейен Р. Х., Франсен-Даалмейер Н., Мейер С. Дж..Распределение 37 мукозотропных типов ВПЧ у женщин с цитологически нормальными мазками из шейки матки: возрастные закономерности для типов высокого и низкого риска. Int J Cancer. 2000; 87: 221–7. DOI: 10.1002 / 1097-0215 (20000715) 87: 2 <221 :: AID-IJC11> 3.0.CO; 2-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Herrero R, Hildesheim A, Bratti C, Sherman ME, Hutchinson M, Morales J, Balmaceda I, Greenberg MD, Alfaro M, Burk RD, Wacholder S, Plummer M, Schiffman M Популяционное исследование папилломавирусной инфекции и неоплазии шейки матки в сельских районах Коста-Рики.J Natl Cancer Inst. 2000; 92: 464–74. DOI: 10.1093 / jnci / 92.6.464. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Molano M, Posso H, Weiderpass E, van den Brule AJ, Ronderos M, Franceschi S, Meijer CJ, Arslan A, Munoz N, Исследовательская группа ВПЧ Распространенность исследования ВПЧ и детерминанты Инфекция ВПЧ среди колумбийских женщин с нормальной цитологией. Br J Рак. 2002. 87: 324–33. DOI: 10.1038 / sj.bjc.6600442. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Rousseau MC, Pereira JS, Prado JC, Villa LL, Rohan TE, Franco EL.Коинфекция шейки матки с типами вируса папилломы человека (ВПЧ) как предиктор приобретения и сохранения инфекции ВПЧ. J Infect Dis. 2001; 184: 1508–17. DOI: 10,1086 / 324579. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Hinchliffe SA, van Velzen D, Korporaal H, Kok PL, Boon ME. Кратковременность цервикальной ВПЧ-инфекции у сексуально активных молодых женщин с нормальной цитологией шейки матки. Br J Рак. 1995; 72: 943–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Brown DR, Shew ML, Qadadri B, Neptune N, Vargas M, Tu W, Juliar BE, Breen TE, Fortenberry JD.Продольное исследование генитальной инфекции папилломы человека в когорте женщин-подростков, за которыми внимательно наблюдали. J Infect Dis. 2005; 191: 182–92. DOI: 10,1086 / 426867. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, Seagar AL, Arends MJ, Moore C, Gilkisson G, McGoogan E. Множественные инфекции HPV высокого риска распространены в шейном отделе матки неоплазия и молодые женщины в популяции скрининга шейки матки. J Clin Pathol. 2004. 57: 68–72. DOI: 10.1136 / jcp.57.1.68.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Венсвин К.В., Кейджи М.Дж., Нагелькерке, штат Нью-Джерси, Велдхуизен Р.В., Тримбос Дж. Б.. Может ли полуколичественная оценка вирусной нагрузки вируса папилломы человека предсказать цитологический или гистологический результат у женщин с атипичными плоскоклеточными или железистыми клетками неопределенного значения цитологии? Eur J Gynaecol Oncol. 2005; 26: 393–7. [PubMed] [Google Scholar]
Sherman ME, Wang SS, Wheeler CM, Rich L, Gravitt PE, Tarone R, Schiffman M. Детерминанты вирусной нагрузки папилломы человека среди женщин с гистологической цервикальной интраэпителиальной неоплазией 3: доминирующее влияние окружающей среды. степень поражения.Биомаркеры эпидемиологии рака Пред. 2003; 12: 1038–44. [PubMed] [Google Scholar]
Castle PE, Schiffman M, Burk RD, Wacholder S, Hildesheim A, Herrero R, Bratti MC, Sherman ME, Lorincz A. Ограниченная перекрестная реактивность гибридного Capture 2 с неонкогенными типами вируса папилломы человека. Биомаркеры эпидемиологии рака и пред. 2002; 11: 1394–9. [PubMed] [Google Scholar]
Вернон С.Д., Унгер Э.Р., Уильямс Д. Сравнение обнаружения и типирования вируса папилломы человека с помощью циклического секвенирования, линейного блоттинга и гибридного захвата.J Clin Microbiol. 2000; 38: 651–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Джонсон Т., Брайдер К., Корбет С., Фомсгаард А. Обычное генотипирование образцов вируса папилломы человека в Дании. APMIS. 2003; 111: 398–404. DOI: 10.1034 / j.1600-0463.2003.t01-1-1110204.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Speich N, Schmitt C, Bollmann R, Bollmann M. Изучение 2916 цитологических образцов вируса папилломы человека (HPV) с помощью ПЦР и секвенирования ДНК: спектр генотипов пациентов из Западной Германии.J Med Microbiol. 2004; 53: 125–8. DOI: 10.1099 / jmm.0.05447-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Kosel S, Burggraf S, Mommsen J, Engelhardt W., Olgemoller B. Типоспецифическое обнаружение вирусов папилломы человека в обычных лабораторных условиях — сравнение улучшенной чувствительности и специфичности ПЦР и анализа последовательностей для прямой гибридизации. Clin Chem Lab Med. 2003. 41: 787–91. DOI: 10.1515 / CCLM.2003.119. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Lonky NM, Felix JC, Naidu YM, Wolde-Tsadik G.Сортировка атипичных плоскоклеточных клеток неопределенного значения с гибридным захватом II: кольпоскопия и гистологическая корреляция вируса папилломы человека. Obstet Gynecol. 2003; 101: 481–9. DOI: 10.1016 / S0029-7844 (02) 02715-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Stoler MH, Castle PE, Solomon D, Schiffman M. Расширенное использование тестирования на ВПЧ в гинекологической практике в соответствии с управлением под контролем ASCCP требует использования хорошо проверенных тестов. Am J Clin Pathol. 2007; 127: 335–7. [PubMed] [Google Scholar]
Справочный документ VRBPAC Четырехвалентная вакцина против ВПЧ Гардасил ™.Встреча VRBPAC. http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/06/briefing/2006-4222B3.pdf 18 мая 2006 г.
Асато Т., Маэхама Т., Нагаи И., Канадзава К., Уэзато Х., Кария К. Крупное исследование «случай-контроль» риска рака шейки матки, связанного с инфекцией вируса папилломы человека в Японии, путем генотипирования на основе нуклеотидного секвенирования. J Infect Dis. 2004; 189: 1829–32. DOI: 10,1086 / 382896. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Протоколы, используемые в NCI, и обработка связанной информации о микродиссектированных тканях для молекулярного анализа http: // cgap-mf.nih.gov/Protocols/Processing/DNA.html
Аятоллахи М., Закериния М., Хагшенас М. Молекулярный анализ иранских семей с серповидно-клеточной анемией. J Trop Pediatr. 2005; 51: 136–40. DOI: 10,1093 / tropej / fmh201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Gharizadeh B, Oggionni M, Zheng B, Akom E, Pourmand N, Ahmadian A, Wallin KL, Nyren P. Праймеры для множественного секвенирования с типом: новая стратегия надежного и быстрого генотипирование вирусов папилломы человека методом пиросеквенирования.J Mol Diagn. 2005. 7: 198–205. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Feoli-Fonseca JC, Oligny LL, Filion M, Brochu P, Simard P, Russo PA, Yotov WV. Метод прямого секвенирования двухуровневой полимеразной цепной реакции для обнаружения и типирования вирусов папилломы человека в патологических образцах. Diagn Mol Pathol. 1998. 7: 317–23. DOI: 10.1097 / 00019606-199812000-00005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ye S, Hong G. Большой фрагмент термостабильной ДНК-полимеразы I разрешает шпильочную структуру при секвенировании ДНК.Scientia sinica (Series B) 1987; 30: 503–6. [PubMed] [Google Scholar]
Hong GF, Huang W. ДНК-полимераза, обладающая способностью снижать врожденную избирательную дискриминацию в отношении дидезоксинуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями. Патент США. № 6,165,765 .
Андре П., Ким А., Храпко К., Thilly WG. Верность и мутационный спектр ДНК-полимеразы Pfu на последовательности митохондриальной ДНК человека.Genome Res. 1997; 7: 843–52. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Линдаль Т., Ниберг Б. Скорость депуринизации нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Биохимия. 1972; 11: 3610–8. DOI: 10.1021 / bi00769a018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Линдаль Т., Ниберг Б. Вызванное нагреванием дезаминирование остатков цитозина в дезоксирибонуклеиновой кислоте. Биохимия. 1974; 13: 3405–10. DOI: 10.1021 / bi00713a035. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Эванс М.Ф., Адамсон К.С., Симмонс-Арнольд Л., Купер К.ПЦР Touchdown General Primer (GP5 + / GP6 +) и оптимизированная концентрация ДНК в образце поддерживают чувствительное обнаружение вируса папилломы человека. BMC Clin Pathol. 2005; 5: 10. DOI: 10.1186 / 1472-6890-5-10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Шиффман М., Уиллер С.М., Дасгупта А., Соломон Д., Castle PE. Группа компаний ALTS. Сравнение прототипа ПЦР-анализа и гибридного захвата 2 для обнаружения ДНК канцерогенного вируса папилломы человека у женщин с сомнительными или слегка ненормальными мазками Папаниколау.Am J Clin Pathol. 2005; 124: 722–32. DOI: 10.1309 / E067-X0L1-U3CY-37NW. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Tornesello ML, Duraturo ML, Salatiello I, Buonaguro L, Losito S, Botti G, Stellato G, Greggi S, Piccoli R, Pilotti S, Stefanon B, De Palo G, Franceschi S, Буонагуро FM. Анализ вариантов вируса папилломы человека типа 16 у итальянских женщин с цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки. J Med Virol. 2004. 74: 117–26. DOI: 10.1002 / jmv.20154. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Feoli-Fonseca JC, Oligny LL, Brochu P, Simard P, Falconi S, Yotov WV.Изучение вируса папилломы человека (ВПЧ) 691 патологического образца из Квебека методом прямого секвенирования методом ПЦР. J Med Virol. 2001; 63: 284–92. DOI: 10.1002 / 1096-9071 (200104) 63: 4 <284 :: AID-JMV1003> 3.0.CO; 2-H. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ортис М., Торрес М., Муньос Л., Фернандес-Гарсия Е., Каналс Дж., Каборнеро А.И., Агилар Е., Баллестерос Дж., Дель Амо Дж., Гарсия-Саиз А. Онкогенный вирус папилломы человека (HPV) тип распределения и варианты HPV типа 16 E6 в двух испанских группах населения с различными уровнями риска инфицирования HPV.J Clin Microbiol. 2006; 44: 1428–34. DOI: 10.1128 / JCM.44.4.1428-1434.2006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Андерсон Т.П., Верно А.М., Бейнон К.А., Мердок Д.Р. Невозможность определения генотипа вируса простого герпеса с помощью анализа ПЦР в реальном времени и анализа кривой плавления из-за вариации последовательностей в местах связывания зонда. J Clin Microbiol. 2003. 41: 2135–2137. DOI: 10.1128 / JCM.41.5.2135-2137.2003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Горис Дж., Константинидис К.Т., Клаппенбах Дж. А., Коенье Т., Вандам П., Тидье Дж. М..Значения гибридизации ДНК-ДНК и их связь со сходством полногеномных последовательностей. Int J Syst Evol Microbiol. 2007; 57: 81–91. DOI: 10.1099 / ijs.0.64483-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Хуанг CC, Qiu JT, Kashima ML, Kurman RJ, Wu TC. Создание типоспецифичных зондов для обнаружения однокопийного вируса папилломы человека с помощью нового метода гибридизации in situ. Мод Pathol. 1998; 11: 971–7. [PubMed] [Google Scholar]
Наеф Ф., Лим Д.А., Патил Н., Магнаско М. Гибридизация ДНК с несовпадающими матрицами: исследование чипа.Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2002; 65: 040902. [PubMed] [Google Scholar]
Сорокин Н.В., Чечеткин В.Р., Лившиц М.А., Паньков С.В., Донников М.Ю., Грядунов Д.А., Лапа С.А., Заседателев А.С. Различение идеальных и несовпадающих дуплексов с микрочипами олигонуклеотидного геля: роль термодинамических и кинетических эффектов во время гибридизации. J Biomol Struct Dyn. 2005. 22: 725–34. [PubMed] [Google Scholar]
Schmitt M, Bravo IG, Snijders PJ, Gissmann L, Pawlita M, Waterboer T.Мультиплексное генотипирование вирусов папилломы человека на основе гранул. J Clin Microbiol. 2006; 44: 504–12. DOI: 10.1128 / JCM.44.2.504-512.2006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Таухид А.Р., Боденон С., Фавр М., Орт Г. Характеристика вируса папилломы человека типа 66 из инвазивной карциномы шейки матки. J Clin Microbiol. 1991; 29: 2656–2660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, Snijders PJ, Meijer CJ.Многоцентровая группа по изучению рака шейки матки Международного агентства по изучению рака: Эпидемиологическая классификация типов вируса папилломы человека, ассоциированных с раком шейки матки. N Engl J Med. 2003; 348: 518–27. DOI: 10.1056 / NEJMoa021641. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Prado JC, Calleja-Macias IE, Bernard HU, Kalantari M, Macay SA, Allan B, Williamson AL, Chung LP, Collins RJ, Zuna RE, Dunn ST, Ortiz-Lopez R, Barrera-Saldana HA, Cubie HA, Cuschieri K, von Knebel-Doeberitz M, Sanchez GI, Bosch FX, Villa LL.Мировое геномное разнообразие вирусов папилломы человека-53, 56 и 66, группы ВПЧ высокого риска, не связанных с ВПЧ-16 и ВПЧ-18. Вирусология. 2005. 340: 95–104. DOI: 10.1016 / j.virol.2005.06.024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Favre M, Kremsdorf D, Jablonska S, Obalek S, Pehau-Arnaudet G, Croissant O, Orth G. Два новых типа вируса папилломы человека (HPV54 и 55), характерные для генитальных опухолей, иллюстрируют множественность генитальных ВПЧ. Int J Cancer. 1990; 45: 40–6. DOI: 10.1002 / ijc.20109.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Шифф М., Беккер Т.М., Масук М., ван Ассельт-Кинг Л., Уиллер С.М., Альтобелли К.К., Норт CQ, Нахмиас А.Дж. Факторы риска интраэпителиальной неоплазии шейки матки у женщин юго-западных американских индейцев. Am J Epidemiol. 2000; 152: 716–26. DOI: 10.1093 / aje / 152.8.716. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Trimble CL, Piantadosi S, Gravitt P, Ronnett B, Pizer E, Elko A, Wilgus B, Yutzy W, Daniel R, Shah K, Peng S, Hung C, Roden R , Wu TC, Pardoll D. Спонтанная регрессия дисплазии шейки матки высокой степени: эффекты типа вируса папилломы человека и фенотипа HLA.Clin Cancer Res. 2005; 11: 4717–23. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-04-2599. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Zuna RE, Allen RA, Moore WE, Mattu R, Dunn ST. Сравнение генотипов вируса папилломы человека при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях высокой степени и инвазивной карциноме шейки матки: доказательства различий в биологическом потенциале предшественников поражений. Современная патология. 2004; 17: 1314–22. DOI: 10.1038 / modpathol.3800223. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Регулярное генотипирование вируса папилломы человека путем секвенирования ДНК в лабораториях общественных больниц
Заражение агентом рака.2007; 2: 11.
, 1 , 1 , 1 и 1
Sin Hang Lee
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Veronica S Vigliotti
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Джессика С. Виглиотти
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Сури Паппу
1 Отделение патологии , Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
1 Отделение патологии, Милфордская больница, Милфорд, Коннектикут, США
Автор, отвечающий за переписку.
Поступило 15 февраля 2007 г .; Принято 5 июня 2007 г.
Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе. при условии правильного цитирования оригинала.
Эта статья цитируется в других статьях в PMC.
Abstract
Предпосылки
Генотипирование вируса папилломы человека (ВПЧ) важно для последующего наблюдения за пациентами с персистирующей инфекцией ВПЧ и для оценки стратегии профилактики для отдельных пациентов, которые должны быть иммунизированы типоспецифическими вакцинами против ВПЧ.Целью этого исследования была оптимизация надежной «низкотемпературной» (LoTemp ™) системы ПЦР для оптимизации протоколов исследования вложенной ПЦР-амплификации ДНК ВПЧ с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК. Оптимизация протокола облегчает перенос этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику. В частности, снижение температуры на 10 ° C на каждом этапе термоциклирования во время in vitro амплификации ДНК дает более однородные продукты ПЦР. С помощью этого протокола очистка матрицы перед удлинением праймера ферментативного цикла больше не требуется.
Результаты
Геномную ДНК ВПЧ, экстрагированную из консервированных спиртом цервиковагинальных клеток на жидкой основе, сначала амплифицировали консенсусной парой праймеров MY09 / MY11 с последующей вложенной ПЦР с праймерами GP5 + / GP6 +. Гнездовые продукты ПЦР размером 150 п.н. подвергали прямому секвенированию ДНК. Гипервариабельную последовательность ДНК размером 34–50 п.н. ниже праймерного сайта GP5 + сравнивали с известными последовательностями ДНК ВПЧ, хранящимися в GenBank, с использованием онлайн-BLAST для генотипирования. Готовые к использованию реагенты для ПЦР-полимеразы LoTemp ™ оказались стабильными при комнатной температуре в течение как минимум 6 недель.Вложенная ПЦР выявила 107 изолятов ВПЧ в 513 цервиковагинальных клинических образцах, все подтвержденные секвенированием ДНК. ВПЧ-16 был наиболее распространенным генотипом, составляющим 29 из 107 положительных случаев (27,2%), за ним следует ВПЧ-56 (8,5%). Для сравнения: тест Digene HC2 обнаружил 62,6% из 107 изолятов ВПЧ и дал 11 (37,9%) из 29 положительных случаев ВПЧ-16 как «положительные для ВПЧ высокого риска».
Заключение
Готовая к использованию полимеразная система для ПЦР LoTemp ™, которая допускает термоциклирование при 85 ° C для денатурирования, 40 ° C для отжига и 65 ° C для удлинения праймера, может быть адаптирована для амплификации целевой ДНК HPV с помощью вложенной ПЦР и для подготовки клинических материалов для генотипирования методом прямого секвенирования ДНК.Генотипирование ВПЧ выполняется онлайн-алгоритмом BLAST гипервариабельной области L1. Последовательность ДНК включается в каждый отчет, направляемый врачу для сравнения при наблюдении за пациентами с персистирующей инфекцией ВПЧ, признанным промотором опухоли в индукции рака.
Предпосылки
Тестирование на вирус папилломы человека (ВПЧ) было введено, чтобы компенсировать низкую чувствительность и специфичность цитологического исследования мазка Папаниколау, часто используемого в качестве диагностического инструмента для пограничных предраковых поражений [1].Тест Digene Hybrid Capture 2 (HC2), единственный тест, одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), обычно используется для определения того, содержит ли суспензия цервиковагинальных клеток онкогенные ВПЧ «высокого риска» [2], часто действующие как сортировка для кольпоскопической оценки цитологически пограничных случаев [3-5]. Однако в настоящее время признано, что стойкая инфекция ВПЧ «высокого риска», а не простое присутствие самого вируса ВПЧ, является основным промотором, вызывающим предраковые поражения шейки матки и рак [6-9].Большинство инфекций ВПЧ, даже вызванных генотипами «высокого риска», являются временными при нормальной цитологии Папаниколау у сексуально активных молодых женщин [10-13]. У 93% первоначально инфицированных женщин тот же вирусный тип не обнаруживается при повторном обследовании через четыре менструальных цикла [14]. Средняя продолжительность положительной реакции, определяемой с помощью ПЦР для конкретного типа ВПЧ у этих молодых женщин, составляет 168 дней [15]. Множественные инфекции ВПЧ «высокого риска» не представляют более высокого риска развития неоплазии шейки матки по сравнению с единичной стойкой инфекцией ВПЧ высокого риска [16].Для развития и поддержания плоского интраэпителиального поражения высокой степени (SIL) риск наиболее высок у женщин, положительных на тот же генотип ВПЧ при повторном тестировании [6-8]. Вирусная нагрузка не является полезным параметром для прогнозирования высокого уровня SIL [17]. SIL высокого уровня часто ассоциируется с более низкой вирусной нагрузкой ДНК, чем это наблюдается в менее серьезно пораженных клетках [18].
Принимая во внимание недавний прогресс в понимании взаимосвязи между стойкой инфекцией ВПЧ и неоплазией шейки матки, для клинического ведения стойких инфекций необходима чувствительная и специфическая технология для обнаружения и точного определения генотипа ВПЧ.Тест HC2 не может быть преобразован в анализ генотипирования и связан со значительным количеством ложноотрицательных и ложноположительных результатов по сравнению с другими более строгими анализами генотипирования ВПЧ на основе ПЦР [19–23]. Сообщается, что он дает 25% ложноотрицательных результатов в случаях с подтвержденным биопсией высоким уровнем SIL, даже если все эти биопсии содержат ДНК ВПЧ высокого риска с помощью ПЦР [24]. «Отсутствие множества конкурентных, хорошо проверенных тестов» для анализа на ВПЧ цитируется как «проблема» при формулировании новых руководящих принципов лечения аномалий шейки матки [25].
Введение типоспецифических вакцин Gardasil ™ HPV в сексуально активное женское население также требует мониторинга генотипа HPV-инфекций до и после иммунизации для разработки стратегии профилактики для отдельных пациентов. Согласно «Справочному документу», представленному в FDA [26], введение вакцин против ВПЧ женщинам, у которых есть сопутствующие вакцино-релевантные инфекции ВПЧ, может увеличить риск на 44,6% развития предраковых поражений шейки матки высокой степени.Следовательно, было бы разумно выполнить анализ на ВПЧ, специфичный для генотипа, если есть подозрение на предшествующую инфекцию ВПЧ.
Целевая вложенная ПЦР-амплификация консервативной области ДНК гена L1 ВПЧ с консенсусными праймерами MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + или их эквивалентами с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК является общепринятым научным инструментом в исследованиях [21, 22,27]. Однако он не использовался в клинических лабораториях, потому что обращение с чувствительными к температуре реагентами ПЦР и требование очистки матрицы в протоколах ПЦР слишком трудоемко для рутинных применений.В этой статье отражен наш опыт использования высокопроизводительной, устойчивой к комнатной температуре надежной системы ДНК-полимеразы для облегчения переноса этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику. Каждый положительный результат на ВПЧ подтверждается генотипированием с прямым секвенированием ДНК гипервариабельной области гена L1. Информация о секвенировании ДНК ВПЧ может быть включена в лабораторный отчет для будущего клинического наблюдения за стойкими инфекциями.
Методы
Поскольку условия ПЦР, адаптированные для этого протокола, зависели от использования новой низкотемпературной, готовой к использованию умеренно термостабильной системы ДНК-полимеразы, чувствительности и специфичности ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® при амплификации ДНК ВПЧ были сначала проверены и сравнены с ДНК, полученной с помощью стандартных термостойких полимераз Taq , доступных на рынке.
Очищенные полноразмерные плазмидные ДНК типов -16, -18 и -6В ВПЧ, приобретенные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), использовали в качестве стандартов для разработки метода. Затем ДНК ВПЧ типа 16 использовали в качестве обычного положительного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали чистую воду молекулярной степени чистоты вместо экстракта ДНК.
Теоретическая чувствительность системы ПЦР, выбранной для этого исследования, была определена с использованием серийных 10-кратных разведений ATCC-сертифицированного стандарта HPV, содержащего 200 нг плазмидной ДНК HPV-16, -18 и -6B, с буфером TE для получения единственной копии. геномной ДНК на мкл в качестве матрицы для проведения первичной и вложенной ПЦР для каждого разведения в двух экземплярах.Теоретическое количество копий ДНК ВПЧ в матрице, используемой для каждой ПЦР MY09 / MY11, рассчитывалось в соответствии с общепринятой формулой пересчета [28]. Посредством секвенирования ДНК было подтверждено, что все вложенные продукты ПЦР соответствуют ожидаемым генотипам ВПЧ.
Для амплификаций ПЦР Taq реакционная смесь из 25 мкл содержала 100 мМ KCl, 20 мМ Трис-HCl pH 8,0, 25 мМ MgCl 2 , 2,5 мМ каждого дНТФ, 2,5 единицы полимеразы Takara Taq (Takara Bio Inc., Шига, Япония), 100 пмоль каждого консенсусного праймера (MY09 / MY11 или GP5 + / GP6 +) и 1 мкл ДНК ВПЧ при различных разведениях в буфере TE (или, если для вложенной ПЦР, 1 мкл ПЦР MY09 / MY11 продукты).Реакционную смесь подвергали 35 циклам амплификации в термоциклере MJ Research (Waltham, MA). Каждый цикл состоял из стадии денатурации при 94 ° C в течение 0,5 мин, стадии отжига при 55 ° C в течение 1 минуты и стадии удлинения цепи при 72 ° C в течение 1 минуты.
При проведении ПЦР ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® применялся протокол, описанный ниже для клинических образцов, за исключением того, что для сравнения с амплификацией ПЦР Taq использовали 35-цикловую амплификацию.
Клинические образцы, использованные для этого исследования, представляли собой 515 образцов цервиковагинальной цитологии на жидкой основе на спиртовой основе (Cytyc или Surepath), представленные врачами в Нью-Хейвене, штат Коннектикут, в рамках рутинных гинекологических осмотров.Возрастное распределение пациентов и патологические состояния шейки матки не были предметом данного исследования. Тест Digene HC2 на ВПЧ высокого риска, заказанный врачами, выполнялся в обычном порядке для каждого образца в одной из двух независимых клинических лабораторий (Quest Diagnostics Laboratory, Wallingford или Pathology & Laboratory Services, LLC, Woodbridge, CT) в соответствии с инструкциями, предоставленными Digene. Корпорация (Гейтерсбург, Мэриленд). Как правило, это были женщины моложе 30 лет, которым был поставлен Пап-цитологический диагноз атипичных плоскоклеточных клеток пониженной значимости (ASCUS), или женщины 30 лет и старше, независимо от результатов цитологического исследования Папаниколау [4].
После того, как материал был взят из каждого образца для рутинного цитологического исследования и анализа HCl, около 1 мл клеточных суспензий было помещено в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл, закодировано вслепую с номером случая и передано в лабораторию Милфордского госпиталя для лечения ВПЧ. ПЦР / секвенирование ДНК.
Экстракция ДНК из фиксированных спиртом клеток была выполнена в соответствии с протоколом Национального института рака (NCI) [29] с небольшими изменениями. Вкратце, суспензию клеток сначала центрифугировали в микроцентрифуге Eppendorf (модель 5424), оснащенной ротором (модель FA45-24-11), в течение 5 минут при 13000 об / мин.Клетки в осадке промывали 1 мл воды для реагентов, а затем 1 мл буфера, состоящего из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20, pH 8,1. Осадок промытых клеток ресуспендировали и расщепляли при 45–55 ° C в течение ночи в 100 мкл 0,1 мг / мл протеиназы K (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, штат Миссури), растворенных в том же буфере для промывки. После денатурирования белков в дигестате клеток в металлическом блоке, нагретом до 95 ° C в течение 10 мин, и заключительном центрифугировании дигестата при 13000 об / мин в течение 5 мин, супернатант осторожно пипетировали и помещали в чистую микроцентрифужную пробирку для использования. для ПЦР без дополнительной очистки или хранения при -20 ° C.
Для получения ДНК HPV использовали общую методологию первичной ПЦР-амплификации сегмента 450 п.н. гена L1 HPV с парой консенсусных праймеров MY09 / MY11 с последующей вложенной ПЦР с парой общих праймеров GP5 + / GP6 +. Вложенные продукты ПЦР размером 150 п.н. в положительных образцах были генотипированы прямым секвенированием ДНК [21,22] с небольшими модификациями, кратко изложенными ниже.
Для первичной ПЦР-амплификации в пробирку для ПЦР, содержащую 20 мкл LoTemp ™ HiFi ® , добавляли 1 мкл экстракта ДНК, 1 мкл 10-молярного праймера MY09, 1 мкл 10-молярного праймера MY11 и 2 мкл воды. Готовая к использованию смесь ДНК-полимеразы (HiFi DNA Tech, LLC, Trumbull, CT), которая содержит все компоненты, необходимые для низкотемпературной ПЦР, включая dNTP, Mg ++ , буфер, ДНК-полимеразы HiFi ® , запатентованную dsDNA плавящие агенты и консерванты dNTP, чтобы достичь конечного реакционного объема 25 мкл.Для термоциклирования температурные шаги термоциклера TC-412 (Techne Incorporated, Берлингтон, Нью-Джерси) были запрограммированы на начальный нагрев при 85 ° C в течение 2 минут с последующими 30 циклами при 85 ° C в течение 30 секунд, 40 ° C. в течение 30 секунд и 65 ° C в течение 1 мин. Окончательное удлинение составляло 65 ° C в течение 10 мин.
Для вложенной ПЦР «след» продуктов ПЦР MY09 / MY11 переносили стеклянной палочкой с чистой смачиваемой поверхностью диаметром около 1,5 мм во вторую пробирку для ПЦР, содержащую 25 мкл полной реакционной смеси вложенной ПЦР, состоящей из 20 мкл готовой к использованию смеси ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® , 1 мкл 10 мкмолярного праймера GP5 +, 1 мкл 10 мкмоль праймера GP6 + и 3 мкл воды, используя ту же программу термоциклирования, как описано выше.
После завершения первичной и вложенной ПЦР из каждой пробирки пипеткой отбирали 5 мкл продуктов ПЦР и смешивали с 2 мкл загрузочной жидкости для электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Гель исследовали в УФ-свете. Визуализация полосы продукта ПЦР 450 п.н. на дорожке MY09 / MY11 и / или полосы 150 п.н. на вложенной дорожке ПЦР на агарозном геле предоставила доказательства наличия ДНК ВПЧ в образце, ожидающего генотипирования с прямым секвенированием ДНК в качестве окончательного Проверка.
Для секвенирования ДНК, 1 мкл вложенных продуктов ПЦР, если они положительные, отбирали пипеткой из вложенной пробирки для ПЦР для прямого секвенирования ДНК, используя 1 мкл 5 мкмолярного праймера GP6 + в качестве праймера для секвенирования, 1 мкл BigDye ® Terminator (версия 1.1 / стандартный набор для секвенирования), 3,5 мкл 5-кратного буфера и 13,5 мкл воды в общем объеме 20 мкл для 20 циклов ферментативных реакций удлинения / прекращения праймера в термоцилиндре ABI модели 9600 в соответствии с протоколом, предоставленным производитель (Applied Biosystems).После очистки от красителя-терминатора с помощью колонки Centri-Sep (Princeton Separations, Adelphia, NJ) реакционную смесь загружали в автоматический четырехкапиллярный генетический анализатор ABI 3130 для анализа последовательности. Выравнивание последовательностей выполняли против различных стандартных последовательностей генотипов HPV, хранящихся в базе данных GenBank, с помощью онлайн-анализа BLAST, чтобы прийти к конкретному генотипированию.
Один мкл каждого экстракта ДНК помещали в отдельную пробирку для ПЦР с парой праймеров β-глобина [30] для амплификации геномной ДНК человека в качестве контроля адекватности образца.Праймеры для амплификации гена β-глобина представляли собой 1 мкл 80 мкмоль 5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC и 1 мкл 80 мкмоль 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC в 20 мкл готовой к использованию смеси ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® с 2 мкл добавлена вода. Использовалась упомянутая выше программа термоциклирования LoTemp ™.
Три (3) пробирки для ПЦР на образец обычно использовали для гена β-глобина, праймера MY09 / MY11 и вложенной амплификации GP5 + / GP6 +, соответственно.
Для проверки воспроизводимости этой процедуры ПЦР / ДНК-секвенирования аликвоты гидролизата 30 отдельных клинических образцов были протестированы в параллельных дублирующих сериях.Сравнивались повторяющиеся результаты трех ПЦР в каждом случае и результаты генотипирования положительных случаев путем секвенирования ДНК.
Образцы, которые не показали полосы ПЦР MY09 / MY11 или GP5 + / GP6 +, но показали доказательства положительной амплификации гена β-глобина, были интерпретированы как HPV-отрицательные. Образцы, которые не показали продуктов ПЦР на всех трех дорожках, были признаны неудовлетворительными для оценки из-за низкой экстракции ДНК или присутствия ингибитора ПЦР. Было два (2) неудовлетворительных дела из 515 обработанных.Остальные 513 случаев были признаны удовлетворительными для анализа. Из этих 513 случаев 107 были положительными на вложенные продукты ПЦР, все они оказались ДНК ВПЧ прямым секвенированием ДНК с использованием GP6 + в качестве праймера для секвенирования.
Образцы, инфицированные более чем одним генотипом ВПЧ, были обозначены появлением множества неоднозначных или перекрывающихся пиков в записях секвенирования ДНК. Для каждой из этих смешанных инфекций вложенные продукты ПЦР были подвергнуты дополнительным четырем индивидуальным реакциям удлинения / завершения праймера, чтобы исключить инфицирование вакциной Гардасил ™ ВПЧ, а именно ВПЧ типов -16, -18, -6 или -11, с использованием следующих типоспецифичных праймеров [31].
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-16 5′-GCTGCCATATCTACTTCAGA-3 ‘
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-18 5′-GCTTCTACACAGTCTCCTGT-3′
Праймер для секвенирования, специфичный для типа ВПЧ-6 3′-GTGCATCTCCG ‘
Праймер для секвенирования, специфичный для типа HPV-11 5′-GTGCATCTGTGTCTAAATCTG-3′
Все олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров для этого исследования, были синтезированы и очищены с помощью картриджа для очистки олигонуклеотидов (OPC) лабораторией синтеза ДНК отделения патологии Университет (Нью-Хейвен, Коннектикут).
Чтобы избежать перекрестного заражения, для тестов амплификации нуклеиновых кислот были выделены три отдельные комнаты без рециркуляции воздуха. Каждая из двух комнат была оборудована 32-дюймовой рабочей станцией ПЦР (AirClean Systems, Роли, Северная Каролина). Все процедуры предварительной амплификации выполнялись на станции ПЦР I. Все процедуры после ПЦР выполнялись на станции ПЦР II, включая подготовку к вложенная ПЦР и реакция секвенирования.Гель-электрофорез и секвенирование ДНК проводили в третьей комнате для изоляции.Никакие материалы после ПЦР или любые предметы, загрязненные ампликонами, или оборудование, используемое в комнатах после ПЦР, не допускались в рабочее пространство до ПЦР.
Результаты
ДНК-полимераза LoTemp ™ HiFi ® была примерно в 10 раз эффективнее ДНК-полимеразы Taq при амплификации плазмидной ДНК ВПЧ с помощью ПЦР MY09 / MY11 и примерно в 100–1000 раз эффективнее при первой амплификации с помощью вложенной ПЦР GP5 + / GP6 + в тандеме. Технология вложенной ПЦР, описанная в этой статье, оказалась чувствительным методом для обнаружения 1–10 копий очищенной геномной ДНК типов HPV -16, -18 или -6B.Но 10 4 -10 5 копий геномной ДНК были необходимы в качестве ПЦР-матриц для УФ-визуализации положительной полосы ампликона праймера MY09 / MY11 после электрофореза (рис.). Специфичность всех вложенных продуктов ПЦР была подтверждена генотипированием ВПЧ с прямым секвенированием ДНК.
Сравнительная амплификация ДНК HPV-16 с помощью ДНК-полимеразы Taq и ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® ДНК-полимеразы . Дорожки 1–8: матрица плазмидной ДНК ВПЧ-16 при 85 × 10 1 , 85 × 10 2 , 85 × 10 3 , 85 × 10 4 , 85 × 10 5 , 85 × 10 6 , 85 × 10 7 и 85 × 10 8 копий на миллилитр.NC: отрицательный контроль. M: молекулярный маркер. Стрелки указывают нижний предел обнаружения вложенной ПЦР (A) и первичной ПЦР 1 st (B) с ДНК-полимеразой Takara Taq и ДНК-полимеразой LoTemp ™ HiFi ® соответственно.
Воспроизводимость этого вложенного ПЦР-анализа при обнаружении ДНК ВПЧ в клинических образцах была подтверждена запуском двух параллельных наборов ПЦР с расщепленным дигестатом одного образца в качестве парных матриц, включая ген β-глобина, праймер MY и GP амплификации вложенных праймеров в каждом наборе для 30 HPV-положительных случаев.Пара идентичных результатов на геле электрофореза была получена во всех трех амплификациях для 30 разделенных образцов (рис.). Вложенные продукты ПЦР, полученные на наборах дубликатов, были подтверждены секвенированием ДНК как принадлежащие к одному и тому же генотипу HPV.
Вложенная ПЦР HPV в клинических образцах и воспроизводимость . В агарозном геле показаны продукты ПЦР целевых ДНК, экстрагированных из двух клинических образцов в двух экземплярах. Ампликон ДНК-мишени β-глобина имеет длину 110 п.н., что ясно видно на дорожках 25 и 26 (№ 1210), но почти не видно на дорожках 31 и 32 (№ 1211).Совместная амплификация других фрагментов геномной ДНК человека и положительный вложенный ампликон ПЦР обеспечивают адекватность образцов в обоих образцах. Молекулярная линейка = 100–1000 п.н. (крайняя слева). Дорожки 25/26, 27/28, 29/30 = ген β-глобина, MY09 / MY11, GP5 + / GP6 + ПЦР, соответственно — образец № 1210. Дорожки 31/32, 33/34, 35/36 = ген β-глобина, MY09 / MY11, GP5 + / GP6 + ПЦР, соответственно — образец № 1211
Для клинических образцов первичная ПЦР MY09 / MY11 генерировала отдельный продукт размером 450 п.н. полоса после 30 повторных циклов амплификации только в 37 из 107 HPV-положительных случаев, обнаруженных с помощью вложенной ПЦР.Более 65% клинических ВПЧ-положительных ампликонов полагались на вложенную ПЦР для УФ-визуализации. Без вложенной ПЦР ампликон ПЦР MY09 / MY11 часто был замаскирован из-за совместной амплификации других молекул ДНК в клинических образцах (рис.).
Для некоторых изолятов, особенно изолятов HPV-39 и HPV-73, стандартная вложенная ПЦР GP5 + / GP6 + не смогла амплифицировать целевой фрагмент ДНК, даже если ПЦР-амплификация праймера MY09 / MY11 была успешной. Эти случаи были выявлены при гель-электрофорезе, показав положительный ПЦР-ампликон MY09 / MY11 450 п.н. в отсутствие ожидаемого сопутствующего вложенного продукта ПЦР размером 150 п.н.Для этих штаммов HPV с помощью геминизированной ПЦР с праймерами MY11 / GP6 + был получен гомогенный ампликон (рис.) Для прямого секвенирования ДНК.
После циклического секвенирования алгоритмы BLAST путем выравнивания последовательности ДНК из 34 п.н. в гипервариабельной области гена L1 ниже сайта связывания GP5 + с известными последовательностями генотипа ВПЧ, хранящимися в базе данных GenBank, обычно определяли генотип выявлены изоляты ВПЧ [32]. 100% совпадение «идентичностей» между «запросной» последовательностью и «субъектной» последовательностью было достигнуто для каждого окончательного генотипирования (рис.). Это отслеживание последовательности с его онлайн-алгоритмом BLAST для генотипирования было включено в отчет о клиническом наблюдении за стойкими инфекциями. Однако HPV-16 имеет множество вариантов последовательностей, некоторые из которых имеют идентичную последовательность в этой области с некоторыми штаммами HPV-31 и HPV-33, и для различения генотипов требуется алгоритм BLAST с последовательностью 50 п.н.
Последовательность ДНК вложенного продукта ПЦР ниже GP5 + для генотипирования . Это типичная последовательность ДНК, вырезанная из цветовой дорожки ниже участка связывания GP5 + гена L1 ДНК ВПЧ.Анализ выравнивания BLAST последовательности из 34 (до 50) п.н. этой гипервариабельной области дает однозначные доказательства генотипа 66 HPV на основе базы данных, хранящейся в GenBank.
Из 513 цервиковагинальных образцов на жидкой основе метод вложенной ПЦР выявил по крайней мере один штамм ВПЧ из 107, с общим положительным показателем 20,9%, включая 74 случая, укрывающих по крайней мере один из 13 типов, на которые нацелен Digene HC2 » тест на ВПЧ высокого риска и 33 случая с типами ВПЧ «низкого риска» (таблица).Наиболее распространенным генотипом в районе Нью-Хейвена оказался ВПЧ-16, за которым следует ВПЧ-56. Совокупный уровень распространенности ВПЧ-16 и ВПЧ-18 составил 32,8% от общего числа изолятов.
Таблица 1
Генотипирование ВПЧ с помощью секвенирования ДНК по сравнению с тестом Digene HC2
ПЦР / ДНК-секвенирование
Результаты теста Digene HC2
Тип Случаи
Распространенность (%)
Высокий риск +
Отрицательный
16
29
(27.2)
11
18
56
9
(8,5)
9
0
31
7
(6,5)
2
2
2
2 902 6
6
(5,6)
2
4
18
6
(5,6)
6
0
54
0 6 902
3
58
6
(5.6)
5
1
66
6
(5,6)
6
0
59
4
(3,7)
0 45
3
(2,8)
2
1
83
3
(2,8)
2
1
32
07 2 902
2
35
2
(1.9)
1
1
39
2
(1,9)
2
0
40
2
(1,9)
2
0 52
2
(1,9)
1
1
33
1
(0,9)
1
0
53
0 1 902
0
62
1
(0.9)
1
0
68
1
(0,9)
1
0
70
1
(0,9)
0,9)
1 72
1
(0,9)
0
1
73
1
(0,9)
0
1
M16
07 1
0
M 16, 18
1
(0.9)
1
0
M другие
3
(2,9)
1
2
Итого
107
(100)
HC2 Уровень обнаружения ВПЧ = 67/107 = 62,6%
Образцы
513
9025
513
.9
Тест на ВПЧ высокого риска HC2 выявил только 11 (37,9%) из 29 случаев ВПЧ-16 как положительные. Однако он успешно идентифицировал все образцы, содержащие ВПЧ-56 и ВПЧ-18, как положительные на ВПЧ высокого риска. Чувствительность теста HC2 при обнаружении заранее определенных генотипов ВПЧ «высокого риска» резюмируется следующим образом:
HPV-18 100%
HPC-33 100%
HPV-39 100%
HPV-56 100%
HPV-59 100%
HPV-68 100%
HPV-58 83.3%
HPV-31 71,4%
HPV-45 66,7%
HPV-35 50%
HPV-52 50%
HPV-16 37,9%
Хотя HPV-54, -66, -83, -53 и -62 не были включены в пробу гибридизационного коктейля, эти генотипы часто сообщались как положительные на ВПЧ высокого риска с помощью теста HC2 (таблица).
Среди 107 вложенных ПЦР-положительных образцов секвенирование ДНК с консенсусным общим праймером GP6 + дало множественные перекрывающиеся нечитаемые последовательности в 5 случаях.Использование индивидуального типоспецифического секвенирования праймеров для HPV-6, -11, -16 и -18 доказало, что один из них содержал HPV-16, но не три других генотипа, и что один содержал смесь HPV-16 и HPV. -18, но не два других генотипа. Для оставшихся 3 образцов смешанной инфекции повторное индивидуальное секвенирование ДНК не дало читаемой реакции удлинения / терминации праймера с любым из четырех типоспецифичных праймеров. Следовательно, эти последние 3 случая были сочтены множественными инфекциями, вызванными ВПЧ, отличными от четырех вакцин-релевантных типов, и сгруппированы в категорию «низкого риска».
Из 513 изученных случаев тест Digene HC2 классифицировал 403 пробы как отрицательные, 75 как положительные для ВПЧ «высокого риска» и 35 как неудовлетворительные для оценки. Эти результаты сравнивали с результатами, полученными с помощью анализа вложенной ПЦР (таблица). Так как тест Дигена охватил только генотипы ВПЧ «высокого риска», образцы, инфицированные ВПЧ, отличные от 13 типов, на которые нацелена проба коктейля из ВПЧ «высокого риска» HC2, будут классифицированы как отрицательные или неудовлетворительные для оценки (неудовлетворительно). Таким образом, тест HC2 идентифицировал 50 из 74 HPV-положительных образцов «высокого риска», обнаруженных с помощью вложенной ПЦР.Расчетная чувствительность теста Digene HC2 составила 50/74 = 67,6% по сравнению с анализом вложенной ПЦР. Поскольку в HC2 было зарегистрировано в общей сложности 75 случаев заражения ВПЧ «высокого риска», его аналитическая специфичность составила 50/75 = 66,7%. Два случая, признанных неудовлетворительными для оценки ПЦР и отрицательными с помощью теста HC2, были исключены из общего числа 513 случаев, введенных для анализа.
Таблица 2
Сравнение результатов вложенной ПЦР / секвенирования ВПЧ и результатов теста HC2
Результаты ПЦР
902
907 Высокий риск
Низкий риск
Unsat .
Всего
Результаты HC2
Отрицательное
364
23
16
902 902 902 902 902 902 902 902 902 902 8
50
17
0
75
Низкий риск
NP
NP
NP
902
34
1
0
35
Всего
406
74
33
0
9002 9002
525 Умеренный ™ HiFi ® ДНК-полимеразы представляют собой генно-инженерные производные ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus (Bst) , которая была впервые введена для разрешения структуры шпильки в классическом секвенировании ДНК по Сэнгеру Йе и Хонгом [33]. Bst ДНК-полимераза с оптимальной температурой удлинения праймера 65 ° C чрезвычайно стабильна, способна сохранять качество своего секвенирования в рабочем растворе при комнатной температуре в течение нескольких недель в условиях роботизированной автоматизации [34]. Модификация аминокислотной последовательности природной ДНК-полимеразы Bst с помощью сайт-направленных генетических мутаций увеличивает термостойкость фермента [35], что открыло путь к разработке новых термостабильных ДНК-полимераз для повторных реакций удлинения праймера ниже 85 ° C.Протокол ПЦР ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® использует свойства модифицированной ДНК-полимеразы Bst при пониженных циклических температурах и свойствах высокой процессивности.
Использование ДНК-полимеразы LoTemp ™ HiFi ® для амплификации ДНК ВПЧ исключает все этапы очистки матрицы, которые обычно требуются перед ПЦР или реакцией секвенирования [21,22,32]. Поскольку готовая к использованию смесь полимераз содержит все необходимые ингредиенты для ПЦР, необходимость в пипетировании на дому минимальна.Поскольку ДНК-полимераза и другие компоненты реагента стабилизированы для хранения при комнатной температуре, нет необходимости хранить ледяные блоки при настройке ПЦР. Поскольку в этой системе используются химические плавящие агенты для денатурирования дцДНК и высокопроизводительная ДНК-полимераза для удлинения нуклеотидных праймеров при частичной изостабилизации, она позволяет проводить термоциклирование при 85 ° C для денатурирования, 40 ° C для отжига и 65 ° C для удлинения праймера соответственно. При пониженных температурах циклирования скорость индуцированных нагреванием мутаций [36], а именно депуринизации [37] и дезаминирования [38] азотистых оснований в молекулах ДНК во время амплификации ПЦР снижается.В результате продукты ПЦР более однородны.
В этом отчете мы продемонстрировали, что система ПЦР LoTemp ™ может амплифицировать 1–10 копий очищенного HPV-16, -18 или -6B для создания соответствующего типоспецифичного вложенного продукта ПЦР размером 150 п.н. Чувствительность ПЦР LoTemp ™ при обнаружении плазмидной ДНК ВПЧ примерно в 10 раз выше, чем у традиционных термостойких ДНК-полимераз Taq без вложенной амплификации (рис.). Вложенная ПЦР повысила аналитическую чувствительность обнаружения ДНК ВПЧ на суспензиях цервиковагинальных клеток [21,22,32], что также подтверждается нашим опытом (рис.). Вложенная ПЦР также служит для устранения большинства мешающих веществ, которые в противном случае, возможно, пришлось бы удалить очисткой колонки в этой процедуре.
Хотя согласованные общие пары праймеров MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + использовались для амплификации высококонсервативной области гена L1 всех генотипов ВПЧ, их эффективность в амплификации целевой ДНК варьируется от одного генотипа ВПЧ к другому с противоречивыми паттернами [22] . Мы обнаружили, что некоторые изоляты HPV-39 и HPV-73 не амплифицируются парой праймеров GP5 + / GP6 + ни в первичной ПЦР, ни во вложенной ПЦР.Вторая амплификация с парой праймеров GP5 + / MY09 и GP6 + / MY11 дает более длинный и более короткий продукт ПЦР, соответственно. Геминизированный продукт ПЦР GP6 + / MY11 (рис.) Подходит для прямого секвенирования ДНК. Неудача GP5 + / GP6 + при амплификации HPV-39 [39] и других типов HPV [22,32] в клинических образцах является хорошо известной технической проблемой, если эта единственная пара праймеров используется для обнаружения HPV. Однако GP5 + и GP6 + являются отличными вложенными праймерами для ПЦР для подготовки матриц для генотипирования HPV с прямым секвенированием ДНК.
Оптимизация протокола ПЦР важна для обнаружения ВПЧ. Без оптимизации метод ПЦР с использованием одного набора консенсусных праймеров для амплификации может иметь более низкую чувствительность, чем тест Digene HC2 [40]. Используя первоначальную 40-цикличную амплификацию клинических образцов, Johnson et al . [21] сообщили, что вложенная ПЦР обычно увеличивает чувствительность метода ПЦР на ВПЧ примерно на 60%. С протоколом ПЦР, представленным в этой статье, это различие усиливается за счет принятия 30-цикловой амплификации.Преимущество уменьшения количества циклов амплификации состоит в том, что коамплификация неспецифических мешающих молекул ДНК уменьшается в первичной ПЦР в пользу создания специфических вложенных продуктов ПЦР для прямого секвенирования ДНК.
Используя наш оптимизированный протокол, вложенная ПЦР выявила 107 HPV-положительных случаев среди 513 клинических образцов (таблица). Было идентифицировано двадцать три (23) генотипа ВПЧ, включая 12 из 13 генотипов «высокого риска», т.е. ВПЧ-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -52, -56, -58, -59 и -68, которые нацелены на тест Digene HC2.Отсутствие репрезентативности HPV-51, который также является мишенью для теста HC 2, вероятно, отражает низкую региональную распространенность этого генотипа. Используя те же праймеры для вложенной ПЦР с последующим генотипированием с секвенированием ДНК, было обнаружено, что HPV-51 является относительно распространенным генотипом в Германии, составляя около 5% от общего числа обнаруженных изолятов HPV [22]. Однако среди 894 изолятов ВПЧ в Дании он не был зарегистрирован ни разу [21].
Гипервариабельная область последовательности ДНК ниже сайта связывания GP5 + имеет решающее значение для генотипирования L1 ВПЧ.Хотя большинство генотипов ВПЧ можно определить путем выравнивания последовательности длиной 34 п.н. в этой области с базой данных GenBank [32], для точного генотипирования может потребоваться выравнивание более длинной последовательности, например длиной 50 п.н., когда результат алгоритма BLAST неоднозначен. . Если для генотипирования полагаться на последовательность из 34 пар оснований, количество инфекций HPV-16 может быть недооценено.
Для разработки этого протокола мы обнаружили, что использование 1 мкл 5 мкмоль OPC-очищенного олигонуклеотида GP6 + вместо рекомендованного производителем 3.2 мкмоль раствор в качестве праймера для секвенирования, по-видимому, дает более согласованные результаты секвенирования для типирования различных изолятов ВПЧ. Концентрация праймера может нуждаться в корректировке, если более высокий уровень GP6 + используется в качестве праймера для секвенирования ДНК.
Из 107 ПЦР-положительных образцов тест Digene HC2 классифицировал 67 как ВПЧ-положительные, уровень обнаружения 62,6% (таблица). Когда для сравнения используются только нацеленные на HC2 генотипы HPV «высокого риска», вложенная ПЦР выявляет 74 HPV-положительных случая, в то время как тест HC2 выявляет 50 в этой группе с аналитической чувствительностью 67.6% (50/74).
Наиболее распространенным является ВПЧ-16, составляющий 27,2% от общего числа изолятов (таблица). Этот процент распространенности ВПЧ-16 почти идентичен процентному соотношению, о котором сообщают другие специалисты с использованием гнездовой ПЦР / ДНК-секвенирования MY / GP, генотипирования суспензий цервиковагинальных клеток, например 26% в Дании [21] и 26,2% в Германии [22]. Тест Digene HC2 выявил 11 из 29 ПЦР-положительных случаев ВПЧ-16 с показателем обнаружения 37,9%, что является неожиданно низким. Поскольку все положительные результаты ПЦР на ВПЧ-16 были подтверждены секвенированием ДНК для генотипирования с уровнем распространенности, аналогичным тем, которые обычно встречаются в западном мире, на основе той же методологии [21,22], и поскольку тесты Digene HC2 проводились две независимые клинические лаборатории, должным образом сертифицированные органами здравоохранения, достоверность результатов отдельных тестов, кажется, не подлежит сомнению.Несоответствие, вероятно, связано с тем, что в данной популяции пациентов существует множество вариантов последовательностей HPV-16 [41], которые могут быть не все нацелены на зонд коктейля РНК HC2, но имеют общую высококонсервативную область гена L1, которая праймеры MY09 / MY11 эффективно амплифицируются. В пользу этой интерпретации говорит тот факт, что тест HC2 правильно определил все случаи ВПЧ-18, ВПЧ-39, ВПЧ-56 и ВПЧ-59 как «группы высокого риска» по одним и тем же данным.
ВПЧ-56 — второй по частоте обнаруженный генотип высокого риска (8.5%), за которыми следуют ВПЧ-31, -18, -54, -58 и -66, с примерно одинаковым уровнем распространенности (5,6–6,5%). Общее количество случаев ВПЧ-16 и -18 составляет только 32,8% от единичных изолятов ВПЧ в нашей серии. ВПЧ-18, по-видимому, также играет относительно небольшую роль в возникновении патологии шейки матки в Канаде [42].
Сообщалось другими [43], что тест высокого риска Digene HC2 может обнаруживать типы ВПЧ -53, -54, -62, -66 и -83 и маркировать их как ВПЧ высокого риска, хотя эти Генотипы не являются преднамеренно целевыми в его коктейльном зонде высокого риска.Наши данные подтверждают эти перекрестные реакции (таблица). Вариация последовательностей в сайтах связывания зонда [44] и неспецифическое связывание между зондом и несовпадающей ДНК, не являющейся мишенью [45-48], являются хорошо известными источниками ошибок, если гибридизация нуклеиновых кислот используется для микробного и вирусного генотипирования. Когда продукты ПЦР GP5 + / GP6 + с гипервариабельной последовательностью ДНК нацелены на разработку метода мультиплексного генотипирования [49], обнаруживается, что ДНК-зонд, разработанный для HPV-66, недавно признанного типа высокого риска [50-52], реагирует с ВПЧ-52 и зондом для ВПЧ-82 с ВПЧ-51 из-за перекрестной гибридизации, несмотря на наличие четырех несовпадений оснований в каждой паре.Некоторые эксперты [40] считают непреднамеренные перекрестные реакции теста Digene HC2 с нецелевыми типами ВПЧ, такими как ВПЧ-66, которые иногда могут вызывать рак, «удачными». Однако польза от этих перекрестных реакций для пациентов требует дополнительного подтверждения.
Пятьдесят процентов (50%) изолятов ВПЧ-54 возвращаются тестом на ВПЧ как ВПЧ высокого риска. ВПЧ-54 был классифицирован как вирус низкого риска [51,53], но обнаружено, что он связан с 40-кратным увеличением риска среди женщин американских индейцев с CIN 2/3.Только ВПЧ-16 показал более высокий риск, чем ВПЧ-54 среди этой субпопуляции [54]. При использовании информации о генотипировании ВПЧ для наблюдения за стойкими инфекциями, возможно, придется учитывать генетический состав пациента [55].
Для случаев смешанной инфекции мы выбираем отдельные праймеры, специфичные для HPV-6, -11, -16 и -18 [31], чтобы выполнить секвенирование ДНК с индивидуальным специфическим праймером, чтобы определить, включает ли смешанная инфекция какие-либо из этих вакцин- соответствующие типы ВПЧ. Обоснование этого выбора заключается в том, что большинство множественных инфекций ВПЧ являются временными [6-15].Непосредственную озабоченность пациентки и ее лечащего врача вызывает вопрос о том, вызвана ли смешанная инфекция каким-либо из типов ВПЧ, имеющих отношение к вакцине, если пациент подумывает о вакцинации.
Низкий процент (<5%) множественных инфекций ВПЧ, наблюдаемый в нашей серии, мог быть необъективным, потому что большая часть образцов для этого исследования была собрана в офисе индивидуального частного практикующего врача, и эта группа образцов имела исключительно низкий положительный результат. частота и отсутствие множественных инфекций ВПЧ.Известно, что частота множественных инфекций ВПЧ варьируется среди популяций пациентов, а также зависит от стадии канцерогенеза. Множественные инфекции HPV были обнаружены менее чем в 5% HPV-положительных образцов от пациентов с инвазивным раком, но более чем в 15% положительных образцов в контрольной группе [27]. Множественные инфекции HPV имеют тенденцию развиваться в отдельные инфекции HPV, поскольку инфекция становится хронической и устойчивой, в то время как цитопатология шейки матки прогрессирует от метаплазии, LSIL, HSIL, карциномы in situ до инвазивного рака [56].
Таким образом, мы сообщили о нашем опыте адаптации хорошо охарактеризованного протокола ПЦР / секвенирования ДНК для рутинного генотипирования ВПЧ. Мы считаем, что чувствительный и специфический анализ ВПЧ с последующим генотипированием с прямым секвенированием ДНК позволит получить полезную информацию для отслеживания стойких инфекций при направлении пациентов с «высоким риском» развития HSIL, а не пациентов с «ВПЧ высокого риска». до кольпоскопической оценки.
Заключение
Технология вложенной ПЦР с использованием консенсусных праймеров MY09 / MY11 и GP5 + / GP6 + для целевой амплификации ДНК ВПЧ может использоваться в диагностических лабораториях для рутинного обнаружения ВПЧ и подготовки клинических материалов для генотипирования путем прямого секвенирования ДНК.Мы адаптировали недавно внедренную систему низкотемпературной ПЦР и оптимизировали протокол, чтобы облегчить перенос этой молекулярной технологии в клиническую лабораторную практику для точного генотипирования ВПЧ, которое является ценным инструментом для последующего наблюдения за пациентами с устойчивой инфекцией ВПЧ, признанной опухолью. промотор в индукции рака.
Тест ДНК вируса папилломы человека HC2-REF 5199-1220 Digene Corporation, Gaithersburg, MD 20878 USA. 2005.
Гогола Дж., Ван Динь Т., Луччи Дж. А., 3, Смит Е., Ханниган Е. В.. Тестирование на вирус папилломы человека для сортировки в направленной популяции. J Low Genit Tract Dis. 2001; 5: 29–32. DOI: 10.1046 / j.1526-0976.2001.51006.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Wu HH, Allen SL, Kirkpatrick JL, Elsheikh TM. Рефлекторный тест ДНК вируса папилломы человека высокого риска полезен при сортировке женщин с атипичными плоскоклеточными клетками и не может исключить плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени. Diagn Cytopathol. 2006; 34: 707–10. DOI: 10.1002 / dc.20497. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Wallin KL, Wiklund F, Angstrom T., Bergman F, Stendahl U, Wadell G, Hallmans G, Dillner J. Типоспецифическая персистентность ДНК вируса папилломы человека до развития инвазивной цервикальной рак.N Engl J Med. 1999; 341: 1633–8. DOI: 10.1056 / NEJM1993412201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Kjaer SK, van den Brule AJ, Paull G, Svare EI, Sherman ME, Thomsen BL, Suntum M, Bock JE, Poll PA, Meijers CJ. Типоспецифическая персистенция вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска как индикатор плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки высокой степени у молодых женщин: проспективное последующее исследование на популяционной основе. BMJ. 2002; 325: 572–6. DOI: 10.1136 / bmj.325.7364.572. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, Gilkison G, Arends MJ, Graham C, McGoogan E.Стойкая ВПЧ-инфекция высокого риска, связанная с развитием неоплазии шейки матки, в проспективном популяционном исследовании. J Clin Pathol. 2005. 58: 946–50. DOI: 10.1136 / jcp.2004.022863. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Якобс М.В., Вальбумерс Дж. М., Снайдерс П. Дж., Вурхорст Ф. Дж., Верхейен Р. Х., Франсен-Даалмейер Н., Мейер С. Дж..Распределение 37 мукозотропных типов ВПЧ у женщин с цитологически нормальными мазками из шейки матки: возрастные закономерности для типов высокого и низкого риска. Int J Cancer. 2000; 87: 221–7. DOI: 10.1002 / 1097-0215 (20000715) 87: 2 <221 :: AID-IJC11> 3.0.CO; 2-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Herrero R, Hildesheim A, Bratti C, Sherman ME, Hutchinson M, Morales J, Balmaceda I, Greenberg MD, Alfaro M, Burk RD, Wacholder S, Plummer M, Schiffman M Популяционное исследование папилломавирусной инфекции и неоплазии шейки матки в сельских районах Коста-Рики.J Natl Cancer Inst. 2000; 92: 464–74. DOI: 10.1093 / jnci / 92.6.464. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Molano M, Posso H, Weiderpass E, van den Brule AJ, Ronderos M, Franceschi S, Meijer CJ, Arslan A, Munoz N, Исследовательская группа ВПЧ Распространенность исследования ВПЧ и детерминанты Инфекция ВПЧ среди колумбийских женщин с нормальной цитологией. Br J Рак. 2002. 87: 324–33. DOI: 10.1038 / sj.bjc.6600442. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Rousseau MC, Pereira JS, Prado JC, Villa LL, Rohan TE, Franco EL.Коинфекция шейки матки с типами вируса папилломы человека (ВПЧ) как предиктор приобретения и сохранения инфекции ВПЧ. J Infect Dis. 2001; 184: 1508–17. DOI: 10,1086 / 324579. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Hinchliffe SA, van Velzen D, Korporaal H, Kok PL, Boon ME. Кратковременность цервикальной ВПЧ-инфекции у сексуально активных молодых женщин с нормальной цитологией шейки матки. Br J Рак. 1995; 72: 943–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Brown DR, Shew ML, Qadadri B, Neptune N, Vargas M, Tu W, Juliar BE, Breen TE, Fortenberry JD.Продольное исследование генитальной инфекции папилломы человека в когорте женщин-подростков, за которыми внимательно наблюдали. J Infect Dis. 2005; 191: 182–92. DOI: 10,1086 / 426867. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, Seagar AL, Arends MJ, Moore C, Gilkisson G, McGoogan E. Множественные инфекции HPV высокого риска распространены в шейном отделе матки неоплазия и молодые женщины в популяции скрининга шейки матки. J Clin Pathol. 2004. 57: 68–72. DOI: 10.1136 / jcp.57.1.68.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Венсвин К.В., Кейджи М.Дж., Нагелькерке, штат Нью-Джерси, Велдхуизен Р.В., Тримбос Дж. Б.. Может ли полуколичественная оценка вирусной нагрузки вируса папилломы человека предсказать цитологический или гистологический результат у женщин с атипичными плоскоклеточными или железистыми клетками неопределенного значения цитологии? Eur J Gynaecol Oncol. 2005; 26: 393–7. [PubMed] [Google Scholar]
Sherman ME, Wang SS, Wheeler CM, Rich L, Gravitt PE, Tarone R, Schiffman M. Детерминанты вирусной нагрузки папилломы человека среди женщин с гистологической цервикальной интраэпителиальной неоплазией 3: доминирующее влияние окружающей среды. степень поражения.Биомаркеры эпидемиологии рака Пред. 2003; 12: 1038–44. [PubMed] [Google Scholar]
Castle PE, Schiffman M, Burk RD, Wacholder S, Hildesheim A, Herrero R, Bratti MC, Sherman ME, Lorincz A. Ограниченная перекрестная реактивность гибридного Capture 2 с неонкогенными типами вируса папилломы человека. Биомаркеры эпидемиологии рака и пред. 2002; 11: 1394–9. [PubMed] [Google Scholar]
Вернон С.Д., Унгер Э.Р., Уильямс Д. Сравнение обнаружения и типирования вируса папилломы человека с помощью циклического секвенирования, линейного блоттинга и гибридного захвата.J Clin Microbiol. 2000; 38: 651–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Джонсон Т., Брайдер К., Корбет С., Фомсгаард А. Обычное генотипирование образцов вируса папилломы человека в Дании. APMIS. 2003; 111: 398–404. DOI: 10.1034 / j.1600-0463.2003.t01-1-1110204.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Speich N, Schmitt C, Bollmann R, Bollmann M. Изучение 2916 цитологических образцов вируса папилломы человека (HPV) с помощью ПЦР и секвенирования ДНК: спектр генотипов пациентов из Западной Германии.J Med Microbiol. 2004; 53: 125–8. DOI: 10.1099 / jmm.0.05447-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Kosel S, Burggraf S, Mommsen J, Engelhardt W., Olgemoller B. Типоспецифическое обнаружение вирусов папилломы человека в обычных лабораторных условиях — сравнение улучшенной чувствительности и специфичности ПЦР и анализа последовательностей для прямой гибридизации. Clin Chem Lab Med. 2003. 41: 787–91. DOI: 10.1515 / CCLM.2003.119. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Lonky NM, Felix JC, Naidu YM, Wolde-Tsadik G.Сортировка атипичных плоскоклеточных клеток неопределенного значения с гибридным захватом II: кольпоскопия и гистологическая корреляция вируса папилломы человека. Obstet Gynecol. 2003; 101: 481–9. DOI: 10.1016 / S0029-7844 (02) 02715-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Stoler MH, Castle PE, Solomon D, Schiffman M. Расширенное использование тестирования на ВПЧ в гинекологической практике в соответствии с управлением под контролем ASCCP требует использования хорошо проверенных тестов. Am J Clin Pathol. 2007; 127: 335–7. [PubMed] [Google Scholar]
Справочный документ VRBPAC Четырехвалентная вакцина против ВПЧ Гардасил ™.Встреча VRBPAC. http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/06/briefing/2006-4222B3.pdf 18 мая 2006 г.
Асато Т., Маэхама Т., Нагаи И., Канадзава К., Уэзато Х., Кария К. Крупное исследование «случай-контроль» риска рака шейки матки, связанного с инфекцией вируса папилломы человека в Японии, путем генотипирования на основе нуклеотидного секвенирования. J Infect Dis. 2004; 189: 1829–32. DOI: 10,1086 / 382896. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Протоколы, используемые в NCI, и обработка связанной информации о микродиссектированных тканях для молекулярного анализа http: // cgap-mf.nih.gov/Protocols/Processing/DNA.html
Аятоллахи М., Закериния М., Хагшенас М. Молекулярный анализ иранских семей с серповидно-клеточной анемией. J Trop Pediatr. 2005; 51: 136–40. DOI: 10,1093 / tropej / fmh201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Gharizadeh B, Oggionni M, Zheng B, Akom E, Pourmand N, Ahmadian A, Wallin KL, Nyren P. Праймеры для множественного секвенирования с типом: новая стратегия надежного и быстрого генотипирование вирусов папилломы человека методом пиросеквенирования.J Mol Diagn. 2005. 7: 198–205. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Feoli-Fonseca JC, Oligny LL, Filion M, Brochu P, Simard P, Russo PA, Yotov WV. Метод прямого секвенирования двухуровневой полимеразной цепной реакции для обнаружения и типирования вирусов папилломы человека в патологических образцах. Diagn Mol Pathol. 1998. 7: 317–23. DOI: 10.1097 / 00019606-199812000-00005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ye S, Hong G. Большой фрагмент термостабильной ДНК-полимеразы I разрешает шпильочную структуру при секвенировании ДНК.Scientia sinica (Series B) 1987; 30: 503–6. [PubMed] [Google Scholar]
Hong GF, Huang W. ДНК-полимераза, обладающая способностью снижать врожденную избирательную дискриминацию в отношении дидезоксинуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями. Патент США. № 6,165,765 .
Андре П., Ким А., Храпко К., Thilly WG. Верность и мутационный спектр ДНК-полимеразы Pfu на последовательности митохондриальной ДНК человека.Genome Res. 1997; 7: 843–52. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Линдаль Т., Ниберг Б. Скорость депуринизации нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Биохимия. 1972; 11: 3610–8. DOI: 10.1021 / bi00769a018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Линдаль Т., Ниберг Б. Вызванное нагреванием дезаминирование остатков цитозина в дезоксирибонуклеиновой кислоте. Биохимия. 1974; 13: 3405–10. DOI: 10.1021 / bi00713a035. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Эванс М.Ф., Адамсон К.С., Симмонс-Арнольд Л., Купер К.ПЦР Touchdown General Primer (GP5 + / GP6 +) и оптимизированная концентрация ДНК в образце поддерживают чувствительное обнаружение вируса папилломы человека. BMC Clin Pathol. 2005; 5: 10. DOI: 10.1186 / 1472-6890-5-10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Шиффман М., Уиллер С.М., Дасгупта А., Соломон Д., Castle PE. Группа компаний ALTS. Сравнение прототипа ПЦР-анализа и гибридного захвата 2 для обнаружения ДНК канцерогенного вируса папилломы человека у женщин с сомнительными или слегка ненормальными мазками Папаниколау.Am J Clin Pathol. 2005; 124: 722–32. DOI: 10.1309 / E067-X0L1-U3CY-37NW. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Tornesello ML, Duraturo ML, Salatiello I, Buonaguro L, Losito S, Botti G, Stellato G, Greggi S, Piccoli R, Pilotti S, Stefanon B, De Palo G, Franceschi S, Буонагуро FM. Анализ вариантов вируса папилломы человека типа 16 у итальянских женщин с цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки. J Med Virol. 2004. 74: 117–26. DOI: 10.1002 / jmv.20154. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Feoli-Fonseca JC, Oligny LL, Brochu P, Simard P, Falconi S, Yotov WV.Изучение вируса папилломы человека (ВПЧ) 691 патологического образца из Квебека методом прямого секвенирования методом ПЦР. J Med Virol. 2001; 63: 284–92. DOI: 10.1002 / 1096-9071 (200104) 63: 4 <284 :: AID-JMV1003> 3.0.CO; 2-H. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ортис М., Торрес М., Муньос Л., Фернандес-Гарсия Е., Каналс Дж., Каборнеро А.И., Агилар Е., Баллестерос Дж., Дель Амо Дж., Гарсия-Саиз А. Онкогенный вирус папилломы человека (HPV) тип распределения и варианты HPV типа 16 E6 в двух испанских группах населения с различными уровнями риска инфицирования HPV.J Clin Microbiol. 2006; 44: 1428–34. DOI: 10.1128 / JCM.44.4.1428-1434.2006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Андерсон Т.П., Верно А.М., Бейнон К.А., Мердок Д.Р. Невозможность определения генотипа вируса простого герпеса с помощью анализа ПЦР в реальном времени и анализа кривой плавления из-за вариации последовательностей в местах связывания зонда. J Clin Microbiol. 2003. 41: 2135–2137. DOI: 10.1128 / JCM.41.5.2135-2137.2003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Горис Дж., Константинидис К.Т., Клаппенбах Дж. А., Коенье Т., Вандам П., Тидье Дж. М..Значения гибридизации ДНК-ДНК и их связь со сходством полногеномных последовательностей. Int J Syst Evol Microbiol. 2007; 57: 81–91. DOI: 10.1099 / ijs.0.64483-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Хуанг CC, Qiu JT, Kashima ML, Kurman RJ, Wu TC. Создание типоспецифичных зондов для обнаружения однокопийного вируса папилломы человека с помощью нового метода гибридизации in situ. Мод Pathol. 1998; 11: 971–7. [PubMed] [Google Scholar]
Наеф Ф., Лим Д.А., Патил Н., Магнаско М. Гибридизация ДНК с несовпадающими матрицами: исследование чипа.Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2002; 65: 040902. [PubMed] [Google Scholar]
Сорокин Н.В., Чечеткин В.Р., Лившиц М.А., Паньков С.В., Донников М.Ю., Грядунов Д.А., Лапа С.А., Заседателев А.С. Различение идеальных и несовпадающих дуплексов с микрочипами олигонуклеотидного геля: роль термодинамических и кинетических эффектов во время гибридизации. J Biomol Struct Dyn. 2005. 22: 725–34. [PubMed] [Google Scholar]
Schmitt M, Bravo IG, Snijders PJ, Gissmann L, Pawlita M, Waterboer T.Мультиплексное генотипирование вирусов папилломы человека на основе гранул. J Clin Microbiol. 2006; 44: 504–12. DOI: 10.1128 / JCM.44.2.504-512.2006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Таухид А.Р., Боденон С., Фавр М., Орт Г. Характеристика вируса папилломы человека типа 66 из инвазивной карциномы шейки матки. J Clin Microbiol. 1991; 29: 2656–2660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, Snijders PJ, Meijer CJ.Многоцентровая группа по изучению рака шейки матки Международного агентства по изучению рака: Эпидемиологическая классификация типов вируса папилломы человека, ассоциированных с раком шейки матки. N Engl J Med. 2003; 348: 518–27. DOI: 10.1056 / NEJMoa021641. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Prado JC, Calleja-Macias IE, Bernard HU, Kalantari M, Macay SA, Allan B, Williamson AL, Chung LP, Collins RJ, Zuna RE, Dunn ST, Ortiz-Lopez R, Barrera-Saldana HA, Cubie HA, Cuschieri K, von Knebel-Doeberitz M, Sanchez GI, Bosch FX, Villa LL.Мировое геномное разнообразие вирусов папилломы человека-53, 56 и 66, группы ВПЧ высокого риска, не связанных с ВПЧ-16 и ВПЧ-18. Вирусология. 2005. 340: 95–104. DOI: 10.1016 / j.virol.2005.06.024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Favre M, Kremsdorf D, Jablonska S, Obalek S, Pehau-Arnaudet G, Croissant O, Orth G. Два новых типа вируса папилломы человека (HPV54 и 55), характерные для генитальных опухолей, иллюстрируют множественность генитальных ВПЧ. Int J Cancer. 1990; 45: 40–6. DOI: 10.1002 / ijc.20109.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Шифф М., Беккер Т.М., Масук М., ван Ассельт-Кинг Л., Уиллер С.М., Альтобелли К.К., Норт CQ, Нахмиас А.Дж. Факторы риска интраэпителиальной неоплазии шейки матки у женщин юго-западных американских индейцев. Am J Epidemiol. 2000; 152: 716–26. DOI: 10.1093 / aje / 152.8.716. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Trimble CL, Piantadosi S, Gravitt P, Ronnett B, Pizer E, Elko A, Wilgus B, Yutzy W, Daniel R, Shah K, Peng S, Hung C, Roden R , Wu TC, Pardoll D. Спонтанная регрессия дисплазии шейки матки высокой степени: эффекты типа вируса папилломы человека и фенотипа HLA.Clin Cancer Res. 2005; 11: 4717–23. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-04-2599. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Zuna RE, Allen RA, Moore WE, Mattu R, Dunn ST. Сравнение генотипов вируса папилломы человека при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях высокой степени и инвазивной карциноме шейки матки: доказательства различий в биологическом потенциале предшественников поражений. Современная патология. 2004; 17: 1314–22. DOI: 10.1038 / modpathol.3800223. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Оценка недавно разработанного GenoArray Анализ генотипирования вируса папилломы человека (HPV) и сравнение с анализом Roche Linear Array Genotyping Assay
Вирус папилломы человека (HPV) является основным этиологическим агентом развития рака шейки матки.Персистирующая инфекция типами ВПЧ высокого риска (ВР) считается необходимым этапом на пути к неопластическому заболеванию (26). Тесты на ДНК ВПЧ показали обнадеживающие результаты, когда они используются в сочетании с традиционным методом цитологического скрининга (3, 7, 8). В настоящее время доступно множество молекулярных методов тестирования на ВПЧ. Коммерческий набор Digene / Hybrid Capture II (HC II) для обнаружения ВПЧ и тесты Cervista HPV HR и Cervista 16/18 одобрены FDA для использования для рутинного скрининга на ВПЧ (9, 19).Однако и анализ HC II, и анализ Cervista HPV HR не в состоянии различать конкретные генотипы или идентифицировать инфекции, включающие несколько генотипов, а анализ Cervista обнаруживает только два типа HPV (типы 16 и 18). Недавние исследования показали, что разные типы ВПЧ высокого риска обладают разным онкогенным потенциалом (5). Помимо клинического аспекта, генотипирование ВПЧ также является ключевой частью эпидемиологических исследований инфекций ВПЧ во всем мире.
Тест HPV GenoArray (GA) (Hybribio Ltd., Гонконг) — это недавно разработанный анализ генотипирования ВПЧ на основе ПЦР.Он использует консенсусные праймеры L1 для одновременной амплификации 21 генотипа ВПЧ с последующей проточной гибридизацией с иммобилизованными генотип-специфическими зондами. Он имеет маркировку Conformité Européenne (CE) для использования в Европе и в настоящее время используется в некоторых больницах Китая.
Настоящее исследование было разработано для оценки аналитических и клинических характеристик теста Hybribio GA, и уровень соответствия генотипов, обнаруженных с помощью теста GA, сравнивался с уровнем соответствия теста HPV Roche Linear Array (LA).Мы сосредоточились на межисследовательском соглашении для общего обнаружения ДНК ВПЧ и для выявления типов онкогенного риска ВПЧ. Мы также оценили межисследовательское согласие для типоспецифичных, а также одиночных и множественных инфекций ВПЧ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клинические образцы и подготовка образцов.
Сто два образца ткани рака шейки матки были ретроспективно собраны в отделении акушерства и гинекологии больницы Королевы Марии Университета Гонконга.Возраст пациентов колебался от 23 до 89 лет, а средний возраст составлял 58 лет. Образцы раковой ткани замораживали и хранили в жидком азоте. Гистологическое подтверждение и оценка образцов раковой ткани проводились патологами, чтобы гарантировать, что образцы содержат более 70% раковых клеток.
Двести шестнадцать образцов цервикальной цитологии, обработанных методом Thin-Prep, включая 24 образца с нормальной цитологией, 93 образца с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями низкой степени (LSIL) и 99 образцов с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями высокой степени (HSIL), были взяты из лаборатории цитологии шейки матки отделения патологии Гонконгского университета.Образцы были исследованы патологоанатомами для постановки диагноза, а отчеты были просмотрены (А. Н. Я. Чунг). Средний возраст субъектов с образцами с нормальной цитологией, LSIL и HSIL составлял 37 лет (диапазон от 22 до 55 лет), 37 лет (диапазон от 18 до 58 лет) и 37 лет (диапазон от 16 до 54 лет). , соответственно.
Использование человеческих тканей и цитологических образцов было одобрено местным институциональным комитетом по этике (одобрение Институционального наблюдательного совета №№ 05-143 T / 806, UW 06-362 T / 1387, 01-19 RC / B / 220 и UW 04-267 Т / 589).
Клетки собирали из остатков цитологических образцов ThinPrep центрифугированием и промывали фосфатно-солевым буфером. Геномную ДНК экстрагировали расщеплением протеиназой К и обычным методом экстракции фенол-хлороформ-этанол (21). Аналогичный протокол также применялся для извлечения ДНК из замороженных образцов ткани рака шейки матки. Количество экстрагированной нуклеиновой кислоты измеряли с помощью спектрофотометра, а качество проверяли амплификацией гена бета-глобина человека.
Оценка аналитической чувствительности и воспроизводимости.
Плазмиды, содержащие полноразмерные геномы ВПЧ типа 16 (ВПЧ-16) и ВПЧ-18, использовали для определения аналитической чувствительности анализа GenoArray. Их разводили до серий концентраций 5 × 10 3 , 1 × 10 3 , 5 × 10 2 , 1 × 10 2 , 5 × 10 1 , 1 × 10 1 . и 5 × 10 -1 копий и смешанные с 30 нг геномной ДНК клеток C33-A (отрицательные по ВПЧ).Использовали две разные партии реагента GenoArray и две машины для ПЦР. Каждую концентрацию плазмиды тестировали в трех экземплярах двумя операторами с использованием двух разных партий реагентов в двух машинах для ПЦР.
Панель из 22 образцов цервикального мазка была выбрана для проверки воспроизводимости анализа GenoArray. Всего было проведено 47 сравнений с использованием 2 образцов, которые были положительными для одного типа HPV, 18 образцов, которые были положительными для различных комбинаций нескольких типов HPV (от двух до трех типов), и 2 образцов, которые были отрицательными на HPV.22 члена тестовой группы были протестированы в двух экземплярах с использованием двух разных партий реагентов.
Генотипирование ВПЧ с помощью теста HybriBio HPV GenoArray.
Тест GA представляет собой ПЦР-анализ на основе консенсусных праймеров L1 и позволяет амплифицировать 21 генотип ВПЧ, включая 13 типов HR (типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68), 2 вероятных типа HR (PHR) (типы 53 и 66) и 6 типов низкого риска (LR) и неизвестного риска (UR) (типы 6, 11, 42, 43, 44 и CP8304 [HPV-81]) (Таблица 1).Анализ проводили согласно протоколу производителя. Вкратце, ПЦР выполняли с реакционным объемом 25 мкл, содержащим 5 мкл ДНК-матрицы, 19,25 мкл предоставленной основной смеси и 0,75 мкл полимеразы ДНК Taq в приборе Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems). . Протокол амплификации был следующим: 9 минут денатурации при 95 ° C и 40 циклов по 20 секунд денатурации при 95 ° C, 30 секунд отжига при 55 ° C и 30 секунд элонгации при 72 ° C, затем окончательное удлинение в течение 5 мин при 72 ° C.Затем ампликон денатурировали и подвергали гибридизации. В анализе использовался метод проточной гибридизации, активно направляя молекулы-мишени к иммобилизованным зондам внутри мембранных волокон, при этом комплементарные молекулы удерживаются за счет образования дуплексов. После тщательной отмывки гибриды были обнаружены путем добавления конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена (входит в комплект), который связывается с биотинилированными продуктами ПЦР, и субстрата (нитросиний тетразолий-5-бром-4-хлор-3 -индолилфосфат) с образованием пурпурного осадка в точке зонда.Результаты интерпретировали путем прямой визуализации. Положительный контроль, поставляемый с набором, и два отрицательных контроля (HPV-отрицательные клетки C33-A и вода для ПЦР) были включены в каждый набор ПЦР для оценки эффективности теста. После гибридизации наличие положительного результата как для «внутреннего контроля», так и для точек «биотин» внутри мембраны указывало на то, что выделенная ДНК была хорошего качества, ферментный конъюгат действовал и процесс гибридизации был правильным.
Генотипирование HPV с помощью теста Roche Linear Array HPV.
Тест LA от Roche Diagnostics использует биотинилированные консенсусные праймеры PGMY09 / 11 для амплификации области 450 п.н. гена L1 и способен обнаруживать 37 генотипов HPV, включая 15 типов HR (Таблица 1). Тест проводился в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, ДНК амплифицировали с помощью ПЦР в аппарате Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems). Затем денатурированный продукт ПЦР гибридизовали с полосой-матрицей, содержащей иммобилизованные олигонуклеотидные зонды. Результаты интерпретировались с помощью справочного руководства и считывания соответствующих индивидуальных типов по длине полоски.
ПЦР для конкретного типа ВПЧ и секвенирование.
ПЦР, специфичная для типа HPV, была проведена с праймерами, специфичными для L1-типа, для уточнения типов, несоответствующих между двумя анализами генотипирования. Ампликон ПЦР был дополнительно подтвержден секвенированием ДНК.
Анализ данных и статистика.
Результаты, полученные с помощью анализа GA, сравнивали с результатами, полученными с помощью анализа LA. Поскольку в анализах GA и LA используются зонды с перекрывающимся диапазоном генотипов ВПЧ, для точного сравнения между двумя тестами только генотипы ВПЧ, идентифицированные обоими анализами (т.е., HR HPV типов 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68; PHR типов 53 и 66; LR HPV типов 6, 11 и 42) учитывались при прямом сравнении отдельных обнаруженных генотипов HPV. Эти генотипы называются генотипами, обнаруженными обоими анализами, или генотипами, общими для анализа. При сравнении результатов анализов генотипирования GA и LA результаты были классифицированы как согласующиеся, совместимые или несогласные на основе следующих определений. Результаты классифицировались как совпадающие, если анализы давали идентичные общие для анализа генотипы (один или несколько) или были отрицательными в обоих анализах.Если один или несколько дополнительных общих генотипов были обнаружены с помощью любого из анализов, результаты классифицировались как совместимые. Противоречивые результаты указывают на отсутствие сходства в обнаружении общих генотипов этими двумя анализами.
Все данные были проанализированы с использованием статистического программного обеспечения SPSS (версия 13.0) (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). Согласие между результатами двух методов обнаружения оценивалось с использованием абсолютного совпадения и каппа-статистики Коэна. Примерное процентное (абсолютное) соответствие между анализами GA и LA было процентным соотношением образцов с идентичными результатами при использовании обоих методов (16).Невзвешенная статистика каппа была рассчитана для определения уровня согласованности с поправкой на случайность между парой методов анализа (25). Значение каппа, равное 0, указывает на отсутствие согласия лучше, чем вероятность, а значение каппа, равное 1, указывает на полное совпадение. Значения каппа от 0 до 0,20, от 0,21 до 0,40, от 0,41 до 0,60, от 0,61 до 0,80 и выше 0,81 указывают на плохое, удовлетворительное, умеренное, хорошее и отличное соответствие соответственно. Непараметрический тест МакНемара использовался для анализа взаимодополняемости методов обнаружения и определения значительного различия результатов, полученных двумя методами. P значений
номеров доступа нуклеотидной последовательности.
Все подтвержденные последовательности генотипов HPV (см. Таблицу 5) были депонированы в базе данных GenBank под номерами доступа GU296023 — GU296094 (см. Таблицу S1 в дополнительном материале).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Аналитическая чувствительность и воспроизводимость анализа GenoArray.
Аналитическая чувствительность анализа GA была определена с плазмидами, несущими геном HPV-16 или HPV-18, поскольку эти два типа HPV относятся к типам высокого риска и являются наиболее важными онкогенными агентами.Две разные партии реагента для анализа GA были способны обнаружить от 10 до 50 копий каждой плазмиды, содержащей геном ВПЧ, смешанной с геномной ДНК. Было небольшое различие в сигналах гибридизации, полученных с двумя партиями реагента. Одна партия реагента показала менее интенсивный сигнал, чем другая партия, но аналитическая чувствительность была аналогичной в этом конкретном тесте с двумя партиями реагентов.
Воспроизводимость анализа GA оценивалась путем тестирования панели из 22 образцов цервикального свопа, которые включали 188 сравнений (таблица 2).Общее согласие между результатами повторений для каждого образца составляло 100%. Было показано, что три отдельных типа были слабо положительными с одной партией реагента, но не были обнаружены с другой партией реагента. Абсолютное согласие для 188 сравнений между двумя разными партиями реагента составило 93,6%. Расхождения в результатах были в основном из-за различий в интенсивности сигнала гибридизации между двумя партиями использованного реагента, поскольку общая интенсивность сигнала была немного выше с одной партией тестового реагента, чем с другой.
Выявление общей ДНК ВПЧ и онкогенного генотипа ВПЧ.
Сначала мы сравнили результаты общего обнаружения ДНК ВПЧ двумя методами. Общий уровень обнаружения ДНК ВПЧ с помощью анализа GA составил 92,5% (294 из 318 образцов), тогда как с помощью анализа LA он составил 95,9% (305 из 318). Абсолютное соответствие между анализами GA и LA составило 95,9%, а значение каппа 0,63 указывает на хорошее совпадение (таблица 3). Хотя общие показатели положительной реакции на ВПЧ двумя методами значительно различались ( P = 0.003), это было в основном из-за разного количества генотипов, обнаруженных двумя анализами (анализ LA обнаруживает 37 генотипов, а анализ GA обнаруживает 21 генотип).
Для общих для анализа генотипов ВПЧ общие уровни обнаружения двумя анализами были одинаковыми (91,8%; 292 из 318). Между этими двумя анализами генотипирования не наблюдалось значительных различий ( P = 1,0), абсолютное соответствие составляло 97,5%, а значение каппа составляло 0,83, что указывает на отличное согласие между двумя методами.
Для выявления онкогенных генотипов ВПЧ (13 типов HR и 2 типа PHR) анализ GA показал степень обнаружения, аналогичную таковой для анализа LA: 90,9% (289 из 318) и 90,6% (288 из 318) , соответственно. Подобно результатам общего анализа генотипа ВПЧ, не наблюдалось значительных различий между двумя анализами генотипирования ( P = 1,0), а согласие между анализами было превосходным (значение каппа = 0,87).
Обнаружение ВПЧ, специфичного для генотипа.
Сравнивались уровни согласованности генотип-специфической детекции с помощью анализов GA и LA: 227 образцов (71.4%) показали совпадающие результаты и 83 (26,1%) показали совместимые результаты по двум анализам; только 8 образцов (2,5%) показали противоречивые результаты генотипирования. Таким образом, два анализа генотипирования выявили либо совпадающие, либо совместимые результаты генотипирования в 97,5% образцов. Далее были проанализированы восемьдесят три образца с совместимыми результатами генотипирования. Для 36 из 83 образцов с совместимыми результатами анализ GA выявил дополнительные типы по сравнению с типами, идентифицированными анализом LA. И наоборот, анализ LA обнаружил дополнительные типы в 39 образцах.Для остальных 8 образцов анализы GA и LA идентифицировали другие генотипы HPV.
Впоследствии было проведено сравнение специфической идентификации отдельных генотипов ВПЧ с помощью анализов генотипирования GA и LA, и результаты суммированы в Таблице 4. Ни один анализ не обнаружил ВПЧ-45, вероятно, из-за его низкой распространенности, и два анализа имели идеальное совпадение для обнаружения HPV-35 и HPV-6. Для большинства общих для анализа генотипов ВПЧ результаты, полученные двумя методами генотипирования, существенно не различались.Сила межисследовательского согласия считалась хорошей (значения каппа = 0,73–0,77) до превосходной (значения каппа = 0,81–0,96), за исключением типов ВПЧ 51, 56 и 42, для которых два анализа показали умеренное согласие при обнаружении ( значения каппа = от 0,45 до 0,54). Анализ LA обнаружил типы 39, 51 и 56 ВПЧ в значительно большем количестве образцов, чем анализ GA. Поскольку анализ LA не может отличить HPV-52 от других типов HR (HPV типов 33, 35 и 58), образцы, которые дали положительный результат на HPV-52, но которые были отрицательными для типов HPV 33, 35 и 58, были индивидуально рассмотрены. ВПЧ-52 положительный.Если образцы дали положительный результат на ВПЧ типа 33, 35 или 58, они считались имеющими неопределенный статус ВПЧ-52 и в настоящем анализе считались отрицательными на ВПЧ-52. Таким образом, анализ GA был более чувствительным для обнаружения HPV-52, чем анализ LA, так как он позволял идентифицировать HPV-52 при наличии инфекций с несколькими типами HPV. было выполнено для выяснения этих несовпадающих типов в совместимых и несогласованных случаях.Поскольку мы сосредоточились на онкогенных типах ВПЧ, было переоценено 86 случаев со 106 дискордантными типами. Как показано в Таблице 5, было доказано, что 28 из 53 (52,8%) несогласных типов, обнаруженных с помощью анализа GA, имеют онкогенные типы, в то время как большинство несовместимых типов (44 из 53, 83%), обнаруженных с помощью анализа LA, были подтверждены. иметь онкогенные типы. Анализ LA кажется более чувствительным и точным для обнаружения типов HPV 16, 31, 39, 51, 56 и 58 и менее чувствительным для обнаружения HPV-33 и HPV-52, чем анализ GA.В случае одиночных и множественных инфекций HPV не наблюдалось значительной разницы между анализами GA и LA ( P = 1,0) (таблица 6). Оба анализа выявляли множественные инфекции примерно в 46% образцов, демонстрируя хорошее межисследовательское согласие (значение каппа = 0,73). Большинство обнаруженных инфекций с несколькими типами ВПЧ были двойными: 27,7% (88 из 318) и 28,3% (90 из 318) по тестам GA и LA, соответственно (таблица 7). Наибольшее количество типов ВПЧ (пять типов), обнаруженных в одном образце, было идентифицировано с помощью анализа GA.
Клиническая ассоциация.
Была проанализирована взаимосвязь между соответствием обнаружения ВПЧ двумя методами обнаружения и цитологическим и гистологическим диагнозами, и результаты показаны в таблице 8. Далее сравнение было выполнено с подгруппами образцов с нормальным или ненормальным цитологическим и гистологическим диагнозами. Не было существенной разницы между анализами GA и LA в обнаружении общих и онкогенных генотипов HPV в подгруппах образцов с нормальной цитологией, LSIL, HSIL и раком ( P = 1.0). Соглашения между исследованиями были от хорошего до идеального (значения каппа = 0,63–1,0). Все образцы с раком шейки матки ( n = 102) оказались положительными на онкогенные типы ВПЧ двумя анализами, и результаты двух анализов полностью или частично совпали (т. Е. Они имели совпадающие и совместимые результаты. ). Соответствующие и совместимые результаты были также обнаружены для 83,3%, 97,8% и 98% образцов в группах нормальной цитологии, LSIL и HSIL, соответственно (таблица 9).
ОБСУЖДЕНИЕ
Различия в эффективности тестов на генотипирование ВПЧ могут сильно повлиять на результаты эпидемиологических исследований и выбранную стратегию клинического лечения. В настоящем исследовании мы оценили недавно разработанный тест генотипирования ВПЧ, анализ GenoArray, который клинически использовался в некоторых больницах материкового Китая (14) и других стран, таких как Турция и Израиль (10, 13). Однако этот тест сравнивали только с тестом Amplicor HPV (Roche Diagnostics) в исследовании с ограниченным количеством образцов (13).Хотя это исследование продемонстрировало отличное согласие между двумя тестами (значение каппа = 0,98) для общего выявления ВПЧ, другие сравнения не проводились, что может быть связано с ограничением теста Amplicor (который не является тестом на генотипирование) и небольшое количество протестированных образцов. В настоящем исследовании оценивались аналитические и клинические характеристики анализа GA, и уровень соответствия между результатами анализа GA и анализа LA HPV сравнивался путем тестирования большого количества образцов.Тестируемые клинические образцы были отобраны таким образом, чтобы коллекция образцов содержала ряд патологий, от образцов, которые были цитологически нормальными, до образцов с раком шейки матки, чтобы проверить широкий спектр генотипов HPV. Следовательно, результаты обнаружения ВПЧ, продемонстрированные в настоящем исследовании, не могут считаться репрезентативными для распространенности инфекции ВПЧ в случайной популяции.
Была проведена оценка аналитических характеристик анализа GA. Он имел аналитическую чувствительность для обнаружения ВПЧ типов 16 и 18 всего от 10 до 50 копий.Высокая воспроизводимость результатов была также продемонстрирована на клинических образцах. Однако при использовании разных партий реагента, поставляемого с тестовым набором, наблюдались различные уровни сигнала, что привело к расхождению в результатах генотипирования до 6,4% в этом исследовании.
В анализе LA используется набор праймеров для ПЦР PGMY09 / 11, который обычно использовался для генотипирования ВПЧ в исследованиях естественной истории ВПЧ (4, 12, 23), и, следовательно, он служил разумным анализом для использования. для сравнения с анализом GA в этом анализе.В анализе GA используется набор праймеров для ПЦР, который отличается от PGMY09 / 11, но он также нацелен на область L1 генома HPV для амплификации широкого диапазона генотипов HPV (21 тип). Сила межисследовательского согласия увеличивалась, когда сравнивались выявленные общие для анализа и онкогенные генотипы ВПЧ, и между двумя анализами не было получено существенной разницы в обнаружении этих генотипов ВПЧ. В целом, анализ GA очень совместим с коммерческим анализом LA для обнаружения общих и онкогенных генотипов HPV, а также одиночных и множественных инфекций.Это было дополнительно подтверждено при оценке соответствия результатов испытаний. Анализы GA и LA выявили либо совпадающие, либо совместимые результаты генотипирования для 97,5% образцов и несогласованные генотипы только для восьми (2,5%) образцов. Однако анализ расхождений выявил различную чувствительность при генотипировании между двумя анализами. Анализ GA был менее чувствителен, чем анализ LA, для обнаружения некоторых генотипов. Типоспецифические эффекты могут частично объясняться различными сайтами-мишенями праймеров некоторых типов HPV и недостаточным соответствием между любыми праймерами в смеси.Анализ LA сильно недооценил присутствие HPV-52, потому что анализ не может отличить его от HPV типа 33, 35 или 58 в образцах, коинфицированных этими типами, что является известным ограничением анализа. Эта дилемма может ограничить применение анализа LA в будущих эпидемиологических исследованиях, поскольку ВПЧ-52 распространен примерно у 5% ВПЧ-положительных женщин с нормальной цитологией шейки матки (6) и у 8,9-15,2% ВПЧ-положительных LSIL и HSIL. и от 2,2 до 5,2% случаев рака шейки матки (15, 18).Анализ GA преодолевает это ограничение и показал лучшую аналитическую специфичность для обнаружения HPV-52. Кроме того, инфекция ВПЧ-52 относительно чаще встречается в популяциях Азиатско-Тихоокеанского региона, чем в популяциях западных стран (11). Это также один из пяти наиболее распространенных типов ВПЧ высокого риска, обнаруживаемых у женщин с нормальными результатами цитологического исследования в большинстве стран Южной Азии (11, 22, 24). Следовательно, анализ GA имеет преимущество для использования при реализации программы скрининга на ВПЧ и в эпидемиологических исследованиях в этих регионах.Чтобы оценить клиническую эффективность анализа GA, результаты генотипирования HPV двух анализов были разделены и сопоставлены с использованием образцов с нормальными результатами цитологического исследования или аномальными цитологическими и гистологическими диагнозами. Интересно, что не было значительных различий в обнаружении общих или онкогенных генотипов между двумя анализами генотипирования для подгрупп образцов от женщин с нормальными результатами цитологического исследования, LSIL, HSIL или раком. Соглашения между исследованиями варьировались от хороших до идеальных, что указывает на совпадающие клинические характеристики как анализа GA, так и анализа LA.Однако для образцов с нормальными результатами цитологического исследования уровни соответствия анализов были ниже (83,3%), чем уровни соответствия с образцами из групп LSIL, HSIL и рака (97,8–100%). Это может быть связано с небольшим размером выборки (24 образца) для группы с нормальными результатами цитологического исследования. Также было высказано предположение, что женщины с нормальным цитологическим исследованием имеют широкий спектр генотипов ВПЧ с особенно низкой вирусной нагрузкой. Следовательно, частота обнаружения ВПЧ у этих женщин может просто отражать аналитическую чувствительность используемого анализа (1).
В заключение, настоящее исследование продемонстрировало, что результаты генотипирования ВПЧ, полученные с помощью анализа GA, в высокой степени совместимы с результатами, полученными с помощью анализа LA, с обнаружением очень небольшого количества образцов с противоречивыми результатами. В общем, эти два анализа выполнить одинаково легко. Время подготовки к ПЦР и время амплификации одинаковы. Пятнадцать и 24 образца могут быть обработаны за одну процедуру гибридизации с помощью анализа GA и анализа LA, соответственно, но время гибридизации анализа GA составляет примерно половину времени гибридизации анализа LA.Таким образом, до 30 или 24 образцов могут быть обработаны одним оператором за 1 рабочий день с помощью анализа GA и анализа LA, соответственно. С другой стороны, каждый анализ генотипирования имеет свои преимущества. Стоимость анализа GA составляет около одной четвертой стоимости анализа LA; Таким образом, анализ GA имеет преимущество в качестве теста на генотипирование ВПЧ для реализации в рамках программ скрининга шейки матки в развивающихся странах. Анализ LA выявляет больше генотипов HPV, в то время как анализ GA способен специфически обнаруживать HPV-52, что важно для генотипирования, особенно в регионах, где HPV-52 имеет высокую распространенность.Таким образом, анализ генотипирования GA представляется точным и чувствительным методом выявления и генотипирования инфекций ВПЧ, и его потенциальная ценность требует дальнейшего определения в проспективных клинических и эпидемиологических исследованиях.
Общенациональное комплексное генотипирование инвазивного рака шейки матки вирусом папилломы человека (ВПЧ)
Источники данных и реестры, используемые для сбора данных
Данные обо всех случаях рака шейки матки и неуточненного рака матки, диагностированных в период с 2002 по 2011 год, были получены из Шведского национального онкологического реестра (NCR).Медицинские карты всех 4533 зарегистрированных онкологических заболеваний были получены из соответствующих больниц и подверглись подробному анализу опытным гинекологом. Первичный инвазивный рак эпителиального и цервикального происхождения был подтвержден в 4254 случаях, и были собраны клинические данные, включая гистопатологию, стадию рака FIGO и лечение (рис. 1).
Рис. 1
Мы получили этическое разрешение на сбор архивных материалов по всем случаям рака шейки матки, на выполнение гистопатологического анализа диагностических слайдов и на сбор фиксированных формалином парафиновых блоков (FFPE) для генотипирования ВПЧ.Региональный совет по этике определил, что из-за популяционного характера исследования информированное согласие участников исследования не требовалось (EPN-Dnr: 2011 / 1026-31 / 4) и сбор образцов для гистологического анализа и ВПЧ. -типирование также разрешено (EPN-Dnr: 2012/1028/32).
Доступ к образцам был запрошен из 25 различных биобанков, которые служат региональными административными единицами. Образцы хранятся в 30 местных патологических лабораториях (для округа Стокгольм самые старые случаи хранятся в хранилище длительного хранения).Все биобанки одобрили доступ к диагностическим слайдам. Двадцать два биобанка также одобрили заявку на FFPE-блоки, но три биобанка отказались. Всего пять биобанков так и не отправили никаких блоков. Все диагностические слайды были просмотрены экспертом-патологом. Всего на секционирование поступило 2954 блока от 2932 пациентов. Была собрана информация о типе гистопатологии, и для генотипирования ВПЧ был выбран блок FFPE с наибольшим соотношением опухоли к здоровой ткани и наиболее тяжелой морфологией (один блок на пациента).
Секционирование, выделение ДНК и генотипирование
Все случаи были разделены на секции в аккредитованной лаборатории HistoCenter, Inc. в Гетеборге, Швеция, в соответствии с процедурой защиты от контаминации, как описано ранее. 5 Первый и последний срезы для каждого случая окрашивали гематоксилином и эозином (окрашивание H и E) для последующего повторного анализа. Между каждым блоком-случаем делали срезы пустой блок для контроля загрязнения. Все срезы, пустые блоки и блоки случая экстрагировали методом без ксилола 5, 6 и генотипировали HPV с помощью ПЦР с модифицированными общими праймерами (MGP) -PCR (праймер, нацеленный на L1 ) и гибридизацией с типом- специфические зонды в Luminex, как описано ранее. 7, 8 В Luminex были включены 42 шарика, включающих 37 различных типов ВПЧ, три варианта ВПЧ и два «универсальных» зонда ВПЧ. Если случай был HPV-отрицательным, экстрагированный материал как из холостого блока, так и из блока случая разбавляли 1/10 и повторно тестировали.
Пустые блоки и соответствующие блоки case обрабатывались одинаково на протяжении всего процесса. Все образцы были проанализированы на бета-глобин с помощью количественной ПЦР в реальном времени для подтверждения адекватности образца, как описано ранее. 9 Пустой блок должен быть отрицательным как для ВПЧ, так и для бета-глобина, а случайный блок должен быть положительным для бета-глобина. Случаи, которые были отрицательными по бета-глобину, были классифицированы как неадекватные образцы и не анализировались ( n = 4). Случаи с загрязненным пустым блоком не анализировались ( n = 11). Случаи с достоверным отрицательным результатом на ВПЧ (как в неразбавленном, так и в разведенном виде 1/10) были повторно рассмотрены опытным патологом для подтверждения наличия инвазивной ткани рака шейки матки, как описано ранее. 5 В целом 44 случая не подтвердили наличие инвазивного рака шейки матки в блоке и были исключены из исследования.
Количественная ПЦР в реальном времени для HPV16 и HPV18
Случаи, которые были HPV-отрицательными при генотипировании, но чей опухолевый материал, как было подтверждено, содержал ткань инвазивного рака шейки матки, были проанализированы на E6 / E7 областей двух наиболее распространенных онкогенных HPV.
![Генотипирование папилломавирус: Human Papillomavirus высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы), ДНК генотипирование [реал-тайм ПЦР]](https://optifishing.ru/wp-content/themes/generpress/images/default-small.jpg)