Заменитель ремантадина: аналоги и заменители на zdravcity.ru

Характеристика растворимой РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гепатита С, экспрессируемой в Escherichia coli

J Virol

1999

73

1649

54

Справка врача

1997

963–5

Montvale, NJ

Medical Economics Publishing

1013

5

Противовирусная активность 1-адамантанамина (амантадина)

Science

1964

144

862

3

Лечение рецидивирующего гепатита С после трансплантации печени амантадином [аннотация 737]

Hepatology

1998

28

Доп.

347

Монотерапия амантадином больных хроническим гепатитом С, инфицированных генотипом 1b [аннотация 842]

Hepatology

1998

28

Доп.

373

Амантадин и ребетрон оказывают синергетическое противовирусное действие на репликацию ВГС у интерферон-альфа нереагирующих на хронический гепатит С [аннотация]

Gastroen-terology

1999

116

Доп.

A1193

© 2000 Американского общества инфекционистов

Сравнение побочных эффектов амантадина и римантадина на центральную нервную систему, используемых в качестве последовательной профилактики гриппа А у пациентов домов престарелых | Клиническая фармация и фармакология | JAMA Internal Medicine

Фон Центры по контролю и профилактике заболеваний рекомендуют гидрохлорид амантадина и гидрохлорид римантадина для профилактики гриппа А.Хотя данные предполагают, что римантадин лучше переносится, нет данных, изучающих частоту побочных реакций у пожилых пациентов, получающих амантадин по сравнению с римантадином. Наша цель состояла в том, чтобы оценить частоту побочных реакций у пожилых пациентов домов престарелых, последовательно получавших амантадин и римантадин для профилактики гриппа А.

Методы Данные были собраны у 156 пациентов домов престарелых (70% женщин; средний возраст ± стандартное отклонение, 83,7 ± 10,1 года) в условиях одного лечебного учреждения, которые получали последовательную терапию амантадином и римантадином в течение сезона гриппа 1997–1998 годов.Пациенты оценивались на предмет побочных эффектов со стороны центральной нервной системы и прекращения терапии каждым агентом.

Результаты У 29 (18,6%) из 156 пациентов наблюдались побочные эффекты при приеме амантадина по сравнению с 3 пациентами (1,9%) при назначении римантадина ( P <0,01). Применение лекарств было прекращено из-за нежелательных явлений в 17,3% (n = 27) курсов амантадина и 1,9% (n = 3) курсов римантадина ( P <.001). Наиболее частым нежелательным явлением была спутанность сознания (амантадин, 10,6%; римантадин, 0,6%; P <0,001). Многомерный логистический регрессионный анализ показал, что значимые факторы риска нежелательных явлений со стороны центральной нервной системы включают мужской пол (отношение шансов, 3,65), снижение расчетного клиренса креатинина (отношение шансов, 1,78) и использование амантадина (отношение шансов, 12,73).

Выводы Использование амантадина было связано со значительно более высокой частотой нежелательных явлений со стороны центральной нервной системы, чем использование римантадина, у этой пожилой популяции, получающей профилактику гриппа.Кроме того, частота прекращения приема амантадина была значительно выше, чем частота прекращения приема римантадина.

ГРИПП А — частая причина серьезных респираторных заболеваний у пожилых людей. ¹ Среди людей в возрасте 65 лет и старше частота госпитализаций по поводу гриппа колеблется от 200 до более 1000 на 100 000 населения. ¹ Было показано, что иммунизация противогриппозной вакциной эффективна на 50–60% в предотвращении госпитализации и пневмонии, на 80% — в предотвращении смерти и на 30–40% — в профилактике заболеваний среди пожилых людей.Однако из-за ограниченной эффективности вакцины химиопрофилактика часто показана во время предполагаемых или подтвержденных вспышек. ¹

Два противовирусных средства одобрены для профилактики гриппа: гидрохлорид амантадина и гидрохлорид римантадина. Хотя оба агента эффективны для профилактики гриппа A, амантадин, по-видимому, вызывает больше побочных эффектов (НЯ) на центральную нервную систему (ЦНС), чем римантадин. ^{1 -3} На сегодняшний день нет данных о сравнительной токсичности этих препаратов у пожилых пациентов домов престарелых.Поскольку стоимость амантадина значительно ниже, чем стоимость римантадина, амантадин по-прежнему широко используется в домах престарелых. Если действительно высокая частота НЯ возникает при применении амантадина, это может привести к чрезмерному прекращению приема и, возможно, подвергнуть пациентов риску развития гриппа A.

В течение сезона гриппа 1997–1998 гг. Жители дома престарелых в сельской местности в северной части штата Нью-Йорк получали амантадин и римантадин последовательно во время предполагаемой и задокументированной вспышки гриппа А.Для каждого агента мы оценили частоту НЯ ЦНС в этой когорте пациентов и попытались определить факторы риска НЯ. Кроме того, мы оценили частоту отмены препарата из-за побочных эффектов.

Это было ретроспективное когортное исследование для оценки нежелательных явлений при применении противовирусных препаратов для профилактики гриппа А. В исследуемую популяцию вошли 167 жителей округа Отсего, штат Нью-Йорк, учреждения длительного ухода за престарелыми.Все жители получили вакцину против гриппа с октября по ноябрь 1997 года. В январе 1998 года в сообществе произошла вспышка гриппа А, и у нескольких жителей дома престарелых появились симптомы, соответствующие гриппозной инфекции. Были получены культуры; однако ни один из них не был положительным. Для всех пациентов был начат плановый 24-дневный курс амантадина для профилактики. Корректировку дозы (таблица 1) проводили с использованием клиренса креатинина (ClCr), рассчитанного по следующему уравнению ⁴ : ClCr = [(140 — возраст) (идеальная масса тела)] / (72 × Scr) (умноженное на 0.85 для женщин), где ClCr указывается в миллилитрах в минуту на 1,73 квадратных метра, Scr указывает креатинин сыворотки в миллиграммах на децилитр, а вес в килограммах. В феврале 1998 г., примерно через 1 неделю после завершения курса амантадина, в доме престарелых произошла подтвержденная вспышка гриппа А (через положительные культуры). В это время Департамент здравоохранения штата Нью-Йорк обязал всех пациентов получать ремантадин гидрохлорид в дозе 100 мг / сут в течение 28 дней.

Медперсонал обслуживались фармацевтом до начала противовирусной терапии.Средний медперсонал в учреждении собирал подробную информацию о клиническом течении каждого пациента в период лечения амантадином и римантадином. Все НЯ ЦНС (включая впервые возникшее возбуждение, агрессию, спутанность сознания, снижение координации, галлюцинации, летаргию, паранойю, судороги и тремор) были тщательно задокументированы. Пациенты ежедневно оценивались на предмет НЯ ЦНС (во время лечения) с информацией (наличие или отсутствие НЯ ЦНС и их описание), записанной в карте пациента.

Данные, собранные для этого исследования, включали возраст, пол, вес, рост, текущие заболевания ЦНС (например, судороги, инсульт и преходящую ишемическую атаку в анамнезе), дозу амантадина и римантадина, продолжительность противовирусной терапии, одновременное применение препаратов, действующих на ЦНС, причина отмены препарата до завершения запланированного курса терапии и все отмеченные НЯ ЦНС.

В анализ были включены только пациенты, которые получали оба противовирусных препарата.Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения SAS версии 6.08. ⁵ Тест Макнемара использовался для категориальных переменных. Парный тест t использовался для оценки продолжительности терапии. Был использован многомерный пошаговый логистический регрессионный анализ (с использованием демографических данных, данных об основном заболевании и данных о сопутствующей лекарственной терапии ЦНС) для оценки факторов риска НЯ и для раннего прекращения терапии. Когда значимые факторы риска были обнаружены с помощью логистического регрессионного анализа, были изучены условия взаимодействия. P ≤,05 считалось значимым. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Из 167 пациентов в учреждении сестринского ухода 156 пациентов получали терапию амантадином с последующей терапией римантадином. Одиннадцать пациентов умерли либо во время терапии амантадином, либо между периодами медикаментозной терапии. Из пациентов, умерших во время терапии амантадином, ни у одного не было положительных культур на грипп А. В таблице 2 приведены демографические данные по 156 пациентам, включенным в анализ.

Средняя продолжительность терапии у всех пациентов составила 20,6 ± 6,7 дня для амантадина и 26,3 ± 5,3 дня для римантадина ( P = 0,21). Продолжительность терапии у пациентов с токсическим действием на ЦНС составила 10,9 ± 4,4 дня в группе амантадина и 16,3 ± 10,6 дня в группе римантадина. Для пациентов, у которых не было токсических реакций, продолжительность терапии амантадином составляла 22,6 ± 5,1 дня, а римантадином — 26,5 ± 5 дней ( P ≤,05 по сравнению с пациентами с токсическими эффектами для каждого препарата).

В Таблице 3 представлены сопутствующие состояния ЦНС и активные препараты ЦНС для 156 пациентов. Сто пять (67%) жителей получали 1 препарат, активный для ЦНС. Сорок один (26%) житель принимал несколько препаратов для ЦНС. В течение периода исследования не было отмечено использования каких-либо дополнительных препаратов, действующих на ЦНС (например, опиоидов, антигистаминных средств, противорвотных средств). Не было изменений в сопутствующих состояниях ЦНС или использовании активных препаратов ЦНС во время периодов лечения амантадином или римантадином.

Таблица 4 показывает сравнительные НЯ ЦНС, наблюдаемые во время терапии амантадином и римантадином. Значительные различия наблюдались в общем числе пациентов с НЯ, связанными с ЦНС, и пациентов, которым требовалось отменить прием амантадина по сравнению с периодами лечения римантадином ( P <0,001). Значительные различия наблюдались в частоте спутанности сознания ( P <0,001) во время периодов лечения. Ни в одной из групп не было зарегистрировано падений ни в одной из фаз лечения.Кроме того, не было случаев госпитализации или эпизодов аспирационной пневмонии в результате НЯ ЦНС.

В Таблице 5 представлены результаты многомерного анализа факторов риска НЯ ЦНС и прекращения приема препарата из-за НЯ ЦНС. Мужской пол и использованные противовирусные препараты были наиболее важными факторами риска как для НЯ ЦНС, так и для прекращения приема препарата из-за НЯ ЦНС. Кроме того, снижение клиренса креатинина было фактором риска НЯ ЦНС. Условия взаимодействия не были значимыми ни для одного из двух анализов логистической регрессии.

Поскольку предполагаемая вспышка гриппа во время фазы лечения амантадином никогда не была подтверждена посевом, сравнительные данные об эффективности не могли быть получены на основе этого анализа.

В то время как иммунизация против гриппа остается основным методом профилактики, химиопрофилактика амантадином или римантадином рекомендуется пожилым пациентам из группы высокого риска во время вспышек гриппа. ¹ Известно, что амантадин имеет высокую частоту НЯ у пожилых пациентов.Сравнительных данных по токсичности амантадина и римантадина на ЦНС (у одних и тех же людей) до этого исследования не было. Высокие показатели НЯ ЦНС (18,6%) наблюдались в период лечения амантадином по сравнению с периодом лечения римантадином (1,9%; P <0,01). Факторы риска НЯ со стороны ЦНС включают мужской пол, прием амантадина и снижение расчетного клиренса креатинина. Клинически обычным явлением является использование уравнения и уровня креатинина в сыворотке для расчета клиренса креатинина для дозирования лекарств.Поскольку использовался рассчитанный клиренс креатинина, возможно, что уравнение могло завышать фактический клиренс креатинина. Таким образом, пациенты с плохой функцией почек могли получить сравнительно большую дозу амантадина. Прекращение приема препарата было сочтено необходимым из-за НЯ со стороны ЦНС у 17,3% пациентов, получавших амантадин, по сравнению с 1,9% пациентов, получавших римантадин ( P <0,01). Неудивительно, что факторы риска отмены препарата были такими же, как и для возникновения НЯ (мужской пол и прием амантадина).Хотя амантадин и римантадин одинаково эффективны в профилактике гриппа A, ^{1 , 6} раннее прекращение лечения из-за НЯ потенциально может подвергнуть пациента или группу пациентов риску развития гриппа.

Небольшие исследования на здоровых добровольцах не показали различий в НЯ со стороны ЦНС при применении амантадина и римантадина. ⁷ Однако другие более крупные исследования показали, что амантадин связан с более высокой частотой НЯ в ЦНС, чем римантадин.Dolin et al. ⁶ обнаружили, что частота НЯ амантадина в ЦНС составляла 13% против 6% и 4%, соответственно, у молодых людей, получающих римантадин или плацебо для профилактики гриппа А. Данные Hayden et al. ⁸ предполагают, что НЯ, наблюдаемые с каждым из этих противовирусных агентов, связаны с концентрациями в плазме. В данном исследовании мы не измеряли концентрации этих агентов в плазме.

Ограничения нашего исследования включают сбор ретроспективных данных и последовательный или рандомизированный метод введения агентов.За пациентами ухаживали одни и те же люди в течение обоих периодов лечения. Данные были извлечены из записей медсестер одним исследователем, и во всех случаях, когда прием препарата был прекращен, имелась точная документация по причинам прекращения приема. Кроме того, мы не можем определить финансовые последствия более высокой частоты НЯ в ЦНС при применении амантадина по сравнению с римантадином.

Наши данные показывают, что амантадин вызывает значительно больше НЯ в ЦНС у пожилых пациентов домов престарелых, чем римантадин.Кроме того, эти НЯ часто приводят к прекращению терапии амантадином, что, возможно, подвергает пациента риску заражения гриппом и сопутствующих заболеваний. Фармакоэкономический анализ может быть полезен при принятии решения о том, какое средство использовать у пожилых пациентов. Однако, исходя из частоты НЯ, римантадин может быть препаратом выбора у пожилых пациентов, нуждающихся в химиопрофилактике гриппа A.

Принята к публикации 22 сентября 1999 г.

Представлено на 38-й Международной конференции по противомикробным препаратам и химиотерапии, Сан-Диего, Калифорния, 26 сентября 1998 г.

Мы хотели бы поблагодарить медперсонал дома престарелых округа Отсего (The Meadows), Куперстаун, штат Нью-Йорк, за их усилия по документации.

Отпечатки: Джозеф С. Бертино, младший, PharmD, Служба клинической аптеки, содиректор, Исследовательский центр клинической фармакологии, Bassett Healthcare, 1 Atwell Rd, Cooperstown, NY 13326 (электронная почта: [email protected]).

Недоступно, Руководство пользователя SAS. Кэри, институт NC SAS, 1985;

Функциональные исследования показывают, что амантадин связывается с порами протон-селективного ионного канала M2 вируса гриппа A

Аннотация

Вирусы гриппа A и B содержат протон-селективные ионные каналы, A / M2 и BM2, соответственно, а активность канала A / M2 ингибируется лекарствами амантадином и его метилпроизводным римантадином.Структура поро-трансмембранного домена была определена с помощью рентгеновской кристаллографии [Stouffer et al. (2008) Nature 451: 596–599] и методами ЯМР [Schnell and Chou (2008) Nature 451: 591–595]. В то время как кристаллическая структура указывает на единственную молекулу амантадина в поре канала, данные ЯМР показывают, что четыре молекулы римантадина связаны с внешней стороны спиралей по направлению к цитоплазматической стороне мембраны. Связывание лекарств включает взаимодействия с остатками 40–45 с полярной водородной связью между римантадином и остатком 44 аспарагиновой кислоты (D44), что, по-видимому, имеет важное значение.Эти два разных сайта связывания лекарств привели к двум несовместимым механизмам ингибирования лекарств. Мы мутагенизировали D44 и R45 до аланина, поскольку эти мутации могут мешать связыванию римантадина и вести к нечувствительному к лекарству каналу. Однако было обнаружено, что канал D44A чувствителен к амантадину при измерении с помощью электрофизиологических записей в ооцитах Xenopus laevis и в клетках млекопитающих, а также при введении мутаций D44 и R45 в геном вируса гриппа.Более того, трансплантация поровых остатков 24–36 A / M2 в BM2 дает pH-активируемый химерный ионный канал, который частично ингибируется амантадином. Таким образом, вместе взятые наши функциональные данные предполагают, что связывание амантадина / римантадина за пределами поры канала не является первичным сайтом, связанным с фармакологическим ингибированием ионного канала A / M2.

Вирусы гриппа A и B представляют собой оболочечные сегментированные РНК-вирусы с отрицательной цепью, вызывающие эпидемии, а для вируса гриппа A — пандемии.На биохимическом и клеточно-биологическом уровне вирусы обладают некоторыми общими свойствами. К ним относятся вирусные частицы, в которых в качестве рецептора используется сиаловая кислота, экспрессируемая на поверхности клетки-хозяина, и проникновение в клетки путем эндоцитоза. Раскрытие вируса происходит в просвете эндосомы и опосредуется гликопротеином гемагглютинина, который запускается кислой средой, чтобы претерпеть событие рефолдинга белка, которое вызывает слияние вирусной оболочки с эндосомной мембраной (см.1).

Вирусы гриппа A и B кодируют интегральные мембранные белки A / M2 и BM2 (2, 3) соответственно. A / M2 и BM2 представляют собой протон-селективные ионные каналы (4–6), которые позволяют протонам проникать в вирусные частицы во время удаления оболочки в эндосомах. Подкисление внутренней части вируса вызывает диссоциацию белка мембраны (M1) от ядра рибонуклеопротеина (3, 7), что является необходимым этапом для импорта рибонуклеопротеидов в ядро ​​(8). Активность ионных каналов A / M2 и BM2 также модулирует pH сети Гольджи trans в инфицированных вирусом клетках, уравновешивая кислый pH просвета Гольджи с цитоплазмой (9, 10) (см.11). Зрелый белок A / M2 состоит из 96 остатков с N-концевым внеклеточным доменом из 23 остатков, единственного внутреннего гидрофобного домена из 19 остатков, который действует как домен TM и образует поры канала, и цитоплазматического хвоста из 54 остатков. (2). Белок BM2 состоит из эктодомена из 7 остатков, домена TM из 19 остатков и цитоплазматического хвоста из 82 остатков (3). Как для A / M2, так и для BM2 было показано, что белки образуют гомотетрамеры (3, 12, 13). Эктодомен A / M2 содержит два остатка цистеина, которые образуют дисульфидные связи, но ни одна из этих дисульфидных связей не нужна для активности ионного канала (14) или для репликации вируса в культуре ткани или у мышей (15).Функционально активные каналы A / M2 и BM2 представляют собой гомотетрамеры, и каждый канал имеет центрально расположенную пору для протонной проводимости (16–21). Белки протонных каналов A / M2 и BM2 вирусов гриппа A и B являются одними из самых маленьких истинных белков ионных каналов (со свойствами ионной селективности и активации), и они преуспевают в выполнении той же функции, имея лишь незначительное сходство в первичных аминокислотная последовательность. Единственная гомология между аминокислотными последовательностями этих двух белков обнаруживается в мотиве HXXXW домена TM внутренних трансмембранных остатков.Гистидин 37 обеспечивает высокую протонную селективность канала A / M2 (22-24), а триптофан 41 действует как ворота канала, открывая и закрывая поры канала A / M2 (25). Считается, что His 19 и Trp 23 в BM2 выполняют те же роли в функции канала BM2, что и в канале A / M2 (6).

Активность ионного канала A / M2 ингибируется противовирусным препаратом амантадин и его метилпроизводным римантадином (26, 27). Препарат связывается как при нейтральном (закрытое состояние), так и при кислом pH (открытый канал).Вирусы гриппа A, которые мутируют и становятся устойчивыми к лекарствам, содержат мутации в домене A / M2 TM, и возникающие в природе мутации в основном возникают в остатках Val 27, Ala 30, Ser 31 и Gly 34 TM домена (26). Препараты не подавляют ни рост вируса гриппа B, ни активность ионных каналов BM2.

Недавно Stouffer et al. (28) с помощью рентгеновской кристаллографии опубликовал атомную структуру домена A / M2 TM со связанным амантадином и без него, а Schnell и Chou (29), используя методы ЯМР, совместно опубликовали структуру несколько большего пептида A / M2 (M2 остатки 18–60), которые включали домен TM и 17 остатков цитоплазматического хвоста.Как и было предсказано на основе более ранних биохимических исследований и исследований ЯМР (17, 30), недавние структурные данные с высоким разрешением показывают, что общая архитектура TM-домена представляет собой пучок из четырех спиралей, и данные подтверждают предсказания о том, что His 37 формирует датчик pH, а Trp 41 — датчик pH. шлюз канала (25, 31). Индольные кольца Trp 41 находятся на расстоянии Ван-дер-Ваальса друг от друга, препятствуя прохождению воды или ионов, и ворота дополнительно стабилизируются в закрытом состоянии за счет межсубъединичных водородных связей с Asp 44 (28, 29).

Кристаллические структуры были расшифрованы при более низком pH, чем структура ЯМР, и первые структуры более открыты вблизи С-конца His 37, чем структура ЯМР.Однако структуры имеют главное отличие в том, что данные о кристаллической структуре указывают на единственную молекулу амантадина в поре канала, которая окружена Val 27, Ala 30, Ser 31 и Gly 34 (28). Напротив, из данных ЯМР, полученных с пептидом в растворе 40 мМ римантадина и ~ 300 мМ дигексаноилфосфатидилхолина, четыре молекулы римантадина были обнаружены связанными с внешней стороны спирали белка, обращенной к липидному бислою и расположенных в мембране. окружающая среда на конце спирали по направлению к цитоплазматической стороне канала.Связывание лекарств включает взаимодействия с остатками 40–45 с полярной водородной связью между римантадином и остатком аспарагиновой кислоты 44 (D44), что, по-видимому, имеет важное значение (29) (рис. 1). Однако, хотя структура ЯМР очень хорошо определена в области TM, сайт связывания лекарственного средства вокруг D44 четко не определен, и римантадин принимает множество различных конформаций. Даже в пределах одного снимка каждая из четырех молекул римантадина в тетрамере демонстрирует значительную вариативность во взаимодействии.рисунок 1 A иллюстрирует изменчивость геометрии взаимодействий римантадин-N с Asp-карбоксилатом (расстояния в ангстремах) с использованием данных из кадра 7 2RLF. рисунок 1 B показывает структуру, в которой области TM из ансамбля структур ЯМР выровнены по хорошо структурированной области TM (включая остатки, которые, как ожидается, образуют сайт связывания). Белок хорошо упорядочен в области TM, за исключением области вблизи лекарства, где и боковые цепи, и структура лекарства изменчивы.

Структура сайта связывания римантадина на границе домена A / M2 TM с цитоплазматическим хвостом. ( А ). Ленточная диаграмма, показывающая четыре α-спирали TM-домена и взаимодействия между римантадином (фиолетовый) и D44. Взято из кадра 7 регистрационного номера Protein Data Bank.2RLF. Показана изменчивость геометрии римантадина-N и Asp-карбоксилата (расстояния в ангстремах). ( B ) Ленточная диаграмма, показывающая структуру, в которой области TM из ансамбля структур ЯМР выровнены по хорошо структурированной области TM (включая остатки, которые, как ожидается, образуют сайт связывания лекарственного средства). Белок хорошо упорядочен в области TM, за исключением области вблизи лекарства, где и боковые цепи, и лекарство изменчивы. Взято из банка данных Protein, инвентарный номер.2RLF по данным Schnell и Chou (29).

Эти два разных сайта связывания лекарств привели к двум несовместимым механизмам ингибирования лекарств (32). Stouffer et al. (28) предположил, что амантадин физически закупоривает поры канала, ограничивая прохождение протонов, и естественно возникающие мутации, устойчивые к лекарствам (остатки 27, 30, 31 и 34 ТМ-домена), близки к предполагаемому сайту связывания лекарственного средства в порах канала. . Коэффициент Хилла, равный 1, для ингибирования амантадина согласуется с одной молекулой амантадина, блокирующей канал (33), хотя возможны и другие модели связывания лекарств.Обнаружение электронной плотности в поре канала в присутствии амантадина и отсутствие плотности без амантадина согласуется с тем, что лекарственное средство присутствует в поре канала (28), тем не менее следует добавить предостережение, что при 3,5 Å разрешение не может быть доказано, что плотность представляет собой амантадин. Schnell и Chou (29) предположили, что ингибирование канала происходит за счет аллостерического механизма с внешним связыванием лекарственного средства, стабилизирующим закрытое состояние, что затрудняет перемещение четырех спиралей и открытие канала.В этом отношении важно понятие дальнодействующих спиральных эффектов из-за наблюдения, что устойчивая к амантадину мутация отображается на Leu 38 (L38F) (33), и было высказано предположение, что мутация, вероятно, нарушает упаковку спираль-спираль и снижает энергетические затраты. открытия канала (29).

Мы мутагенизировали D44 и R45 до аланина, поскольку ожидается, что эти мутации будут мешать наблюдаемому взаимодействию с римантадином и могут привести к нечувствительному к лекарству каналу, но канал оставался чувствительным к лекарству.Мы также заменили поровые остатки 24–36 A / M2 на BM2 (вместо остатков поры BM2 6–18), и этот химерный белок давал pH-активируемый ионный канал, который частично ингибировался амантадином. Таким образом, наши функциональные данные предполагают, что связывание амантадина / римантадина вне поры канала не является первичным сайтом, связанным с фармакологическим ингибированием ионного канала A / M2.

Результаты и обсуждение

Активность ионных каналов и чувствительность к ингибированию мутантов M2 амантадином.

Чтобы исследовать взаимодействие между остатком Asp 44 в порах ионного канала A / M2 и амантадином / римантадином, мы мутировали Asp 44 в аланин и исследовали активность ионного канала и его чувствительность к амантадину в ооцитах Xenopus laevis (рис. А ). Мы также исследовали активность ионных каналов известного мутанта, устойчивого к амантадину, S31N и двойного мутанта S31N / D44A. Уровни экспрессии на поверхности клеток WT и мутантных каналов в ооцитах были эквивалентными (данные не показаны).Первоначально ооциты промывали при pH 8,5, чтобы канал M2 оставался в закрытом состоянии, а затем раствор для купания меняли до pH 5,5, чтобы открыть канал (4). В то время как токи ионных каналов WT M2 и D44A были чувствительны к амантадину, токи каналов S31N и S31N / D44A были в значительной степени устойчивыми к препарату (рис. А ). Для WT A / M2 и D44A ингибирование тока амантадином сохраняется даже после того, как ооциты вернули к pH 8,5 и затем промыли pH 5,5, потому что ингибирование амантадина эффективно необратимо в этой временной шкале: константа скорости обратной реакции амантадинового блока составляет 3 × 10 ⁻⁴ с ⁻¹ (33).Экспрессия и чувствительность к амантадину WT M2, S31N, D44A и S31 / D44A также была исследована в клетках млекопитающих (клетки CHO-K1), и наблюдалась очень аналогичная лекарственная чувствительность, обнаруженная в ооцитах [подтверждающая информация (SI), рис. S1. ]. Входящие токи клеток CHO-K1, экспрессирующих мутанты D44A и S31N / D44A, были временными по своей природе, когда клетки подвергались воздействию растворов с низким pH (рис. S1), что, возможно, указывает на изменение гейтинга в соответствии с взаимодействиями, наблюдаемыми между Trp- 41 затвор и Asp44 в структуре ЯМР (27, 28).Ранее при исследовании различий между активностью ионных каналов вирусов гриппа A / chicken / Germany / 34 (H7N1, штамм Росток) и A / chicken / Germany / 27 (H7N7, штамм Weybridge) отмечалось, что замена остатка аспарагиновой кислоты 44 для аспарагина дает активность канала, чувствительного к амантадину (34).

Мутантные ионные каналы M2 вируса гриппа D44A и L38F чувствительны к ингибированию амантадином. Чувствительность к амантадину и римантадину мутантных ионных каналов WT M2 и M2 D44A, S31N, D44A / S31N и L38F. МРНК, кодирующие WT и мутантные ионные каналы M2, были экспрессированы в ооцитах Xenopus laevis , а поверхностные токи измерены с использованием двухэлектодного устройства фиксации напряжения (4). ( A ) Репрезентативные записи записей WT M2 и мутантных каналов.Чувствительность этих вариантов A / M2 к амантадину определяли путем купания ооцитов в растворе Барта с pH 5,5, который содержит 100 мкМ амантадина, когда ооциты демонстрируют максимальный внутренний ток (отклонение вниз). ( B ) Процент ингибирования входящего тока A / M2 в присутствии либо 100 мкМ амантадина, либо 100 мкМ римантадина ( n = минимум 5).

В модели внешнего связывания лекарств (29) ранее сообщенная устойчивость мутанта L38F к амантадину (33) была важна, потому что это была единственная известная C-концевая мутация устойчивости к амантадину по сравнению с мутациями, обнаруженными между остатками M2 26 и 34.Существование L38F как резистентного к амантадину подкрепляет аргумент в пользу отдаленных эффектов связывания лекарственного средства, стабилизирующего четырехспиральный пучок в закрытом состоянии, тогда как мутант дестабилизирует спирали и позволяет каналу открываться. Таким образом, мы сконструировали мутацию L38F в идентичную последовательность M2, используемую для всех других используемых здесь мутантов (последовательность M2, полученная из вируса гриппа A / Udorn / 72), и исследовали свойства каналов мутанта M2 L38F. Как показано на рис. 2 Мутант L38F имел свойства ионных каналов, неотличимые от WT M2, и был полностью чувствителен к амантадину.Возможно, что более раннее обнаружение нечувствительности мутанта L38F к амантадину произошло из-за того, что для ингибирования было отведено меньше времени, и мы пришли к выводу, что не существует известных примеров мутаций, которые приводят к более С-концевой устойчивости к амантадину M2, чем остаток 34. Это также можно вывести из данных, приведенных в Betakova et al. , (32), что M2 вируса гриппа Ростока, который содержит мутацию L38F, является чувствительным к амантадину.

Амантадин и его метильное производное римантадин ингибируют активность ионного канала M2 и репликацию вируса гриппа (5, 26, 33).Поскольку в рентгеновской структуре моделировался амантадин (28), а в структуре ЯМР моделировался римантадин (29), было важно определить, что не было значительной разницы в ингибирующем действии двух препаратов. Как показано на рис. 2 B активность ионных каналов WT M2 и мутантов D44A и L38F была полностью чувствительна к обоим лекарствам. Мутанты S31N и S31N / D44A были устойчивы к препарату, но мутанты, содержащие S31N, были более устойчивы к римантадину, чем к амантадину.Это может быть связано с тем, что некоторые лекарственно-устойчивые мутации в остатках выстилки поры M2 сохраняют способность связывать лекарство (35), а римантадин может связываться с белком S31N хуже, чем амантадин.

Чтобы убедиться, что амантадин был одинаково эффективен в ингибировании D44A, как и WT, была построена кривая доза-ответ путем измерения ингибирования через 2 мин применения лекарства для каждой из многих концентраций лекарства. Было обнаружено, что WT A / M2 и D44A имели практически одинаковую чувствительность к амантадину (рис.3).

Кривые изохронного ингибирования амантадина для ионных каналов WT A / M2, D44A и S31N. Девять различных концентраций амантадина применяли к ооцитам, экспрессирующим ионные каналы WT, D44A и S31N, в течение 2 минут при pH 5,5, и измеряли ток до и после добавления лекарства.Для каждой концентрации лекарственного средства использовали три ооцита. Результаты соответствовали кривой доза-ответ в GraphPad Prism 5. Наиболее подходящие значения IC ₅₀ для WT A / M2, D44A и S31N составляли 16,0 ± 1,1, 15,8 ± 1,1 и 199,9 ± 1,1 мкМ, соответственно.

Рост и лекарственная чувствительность вирусов гриппа, содержащих мутации M2.

Чтобы изучить влияние мутаций M2 D44A, S31N, S31N / D44A и L38F в контексте инфекции вируса гриппа, мутации были введены в геном вируса гриппа A с использованием процедур обратной генетики (36, 37), и вирусы были выделены. .Из-за участия остатка M2 W41 (ворота канала) с D44 и R45 и в модели ЯМР взаимодействия римантадина со всеми тремя остатками были сконструированы и извлечены два дополнительных мутантных вируса M2 W41A и R45A. Как показано на рис. 4, все вирусы имели одинаковые размеры бляшек. Хотя D44A показал такой же размер бляшек, что и вирус WT, одностадийные кривые роста вируса D44A показали немного более медленную кинетику, чем вирус WT, и D44A достиг максимального титра на 1 log ниже, чем у клеток вируса WT (данные не показаны).Тем не менее мутантный вирус D44A, по-видимому, обладал активностью ионного канала, достаточной для роста в культуре ткани. Образование бляшек вируса WT и мутантных вирусов M2 D44A, L38F, W41A и R45A было чувствительным к амантадину / римантадину (рис. A и B ), а образование бляшек из S31N и S31N / D44A было нечувствительным к любому лекарственному лечению. Чувствительность к лекарствам / нечувствительность вирусов, содержащих мутации M2, полностью согласуется с электрофизиологическими записями активности каналов мутантных белков.Интересно отметить, что даже несмотря на то, что W41 является ключевым остатком в функции канала (ворота), а D44 и R45 взаимодействуют с W41 (рис.1), канал M2 в вирусе может переносить эти изменения и остается чувствительным к амантадину / римантадину. .

Влияние амантадина и римантадина на образование бляшек вируса гриппа А.Вирус гриппа WT (A / Udorn / 72) и вирус гриппа, содержащие мутации в домене M2 TM, были выделены из клонированной ДНК (36) и проанализированы на образование бляшек на клетках MDCK в присутствии или в отсутствие 5 мкМ амантадина (Ama) ( A ) или 5 мкМ римантадина (Rim) ( B ). Монослои клеток MDCK предварительно инкубировали с амантадином (5 мкМ) или римантадином (5 мкМ) или без них в течение 30 мин, а затем инфицировали соответствующим вирусом в присутствии или в отсутствие лекарственного средства. После 1 ч инкубации монослои промывали PBS (с лекарством или без него) и покрывали 0.6% микрокристаллическая целлюлоза Avicel-DMEM с добавлением 1,0 мкг / мл N -ацетилтрипсина с амантадином (5 мкМ) или римантадином (5 мкМ) или без него. Через 2–3 дня инкубации монослои фиксировали и окрашивали раствором нафталинового черного красителя. Эквивалентное разведение показано для каждой подобранной пары монослоев с лекарственным средством и без него (-Ama, + Ama; -Rim, + Rim).

Химерный домен TM A / M2 и BM2 делает ионный канал BM2 чувствительным к амантадину.

Чтобы предоставить еще одно доказательство того, что амантадин ингибирует ионный канал A / M2, связываясь с порами между остатками 26 и 34, был построен гибридный канал между двумя протон-селективными ионными каналами A / M2 (чувствительный к амантадину) и BM2 (нечувствительный к амантадину). Остатки 6–18 TM домена BM2 были заменены на остатки 24–36 A / M2. Химерный канал (24–36 аминокислотных остатков A / M2) BM2 экспрессировался в ооцитах, и его активность канала измерялась в сравнении с активностями ионных каналов A / M2 и BM2.Подобно A / M2 и BM2 химерный канал активировался при pH 5,5 (рис. 5). Ток канала A / M2 подавлялся добавлением 100 мкМ амантадина (94,0% ± 0,9% SE, n = 8) и 100 мкМ римантадина (92,7% ± 0,7% SE; n = 8), тогда как напротив, ток BM2 не подавлялся добавлением 100 мкМ амантадина (-1,4% ± 0,2%, n = 5). Важно отметить, что ток химерного канала частично ингибировался амантадином (49,1 ± 1,7% SE, n = 8) и 100 мкМ римантадином (50.2 ± 1,6% SE, n = 3). Постоянную времени (τ) (в секундах) ингибирования определяли путем подгонки кривых ингибирования к стандартному уравнению экспоненциального затухания и для канала A / M2 τ = 34 ± 2,3 секунды. SE ( n = 8), а для химерного (24–36 а.о. A / M2) канала BM2 τ = 108,4 ± 2,8 с SE ( n = 8). Учитывая, что замещения одной боковой цепи в остатках 27, 30, 31 и 34 приводят к устойчивости к амантадину, чувствительность химерного канала к амантадину заслуживает особого внимания, особенно потому, что эта химерная пора может иметь тонкие изменения в структуре по сравнению с WT M2 поры.Таким образом, простейшая интерпретация данных состоит в том, что амантадин / римантадин взаимодействует с остатками 24–36 A / M2, перекрывая поры канала и что эти остатки могут переноситься в поры BM2, чтобы сделать BM2 частично чувствительным к амантадину.

Создание химерного ионного канала A / M2 и BM2, чувствительного к амантадину.( A ) Схематическая диаграмма, показывающая остатки TM-домена A / M2 (полученные из последовательности вируса гриппа A / Udorn / 72 M2) (45) и BM2 (полученные из последовательности вируса гриппа B / Lee / 40 BM2) ( 46), и химерный белок BM2 с остатками 6–18 а.о. домена BM2 TM, замещенными остатками 24–36 домена A / M2 TM. ( B ) Активность ионных каналов A / M2, BM2 и химерного ионного канала (24–36 аминокислотных остатков A / M2) BM2. Ооциты, экспрессирующие химерный ионный канал, демонстрировали сильный входящий ток, активируемый pH, по сравнению с неинъектированными ооцитами.Амантадин (100 мкМ) подавлял ток A / M2 (94,0 ± 0,9%; n = 8). Активность ионного канала BM2 была нечувствительной к 100 мкМ амантадина. Химерный ионный канал BM2 был частично ингибирован (49,1% ± 1,7%; n = 8) 100 мкМ амантадином и частично ингибирован 100 мкМ римантадином (50,2% ± 1,6%; n = 3) (данные не показаны ). Подобно каналу M2 WT, ингибирование препарата не было обратимым в течение короткого периода времени.

Резюме.

Наши функциональные исследования протон-селективного ионного канала A / M2 вируса гриппа A и его ингибирования амантадином или римантадином предполагают, что связывание амантадина / римантадина вне поры канала не является основным сайтом, связанным с фармакологическим ингибированием A / M2. ионный канал. Во-первых, мутация D44 и R45 в аланин не изменила чувствительность каналов к лекарственному средству, что позволяет предположить, что взаимодействия римантадина с D44 и R45 не важны для ингибирования лекарственного средства.Во-вторых, первоначальный вывод о том, что мутация L38 в фенилаланин вызывает устойчивость к амантадину, кажется неверным, и, таким образом, нет никаких доказательств долгосрочных эффектов устойчивости к амантадину, которые были предложены в аллостерическом механизме ингибирования римантадина с цитоплазматической стороны четырехкомпонентной системы. пучок спиралей. В-третьих, химерный канал (24–36 аминокислотных остатков A / M2) BM2 активируется низким pH и частично ингибируется амантадином. Мы предпочитаем интерпретацию этих данных так, что мы перенесли сайт лекарственного средства с A / M2 на обычно нечувствительный к лекарству ионный канал BM2.Кажется маловероятным, что амантадин стабилизирует закрытое состояние химерного канала с помощью аллостерического механизма и с участием остатков M2 24-36, когда этот химерный белок лишен остатков D44 и R45, которые взаимодействуют с римантадином в модели ЯМР.

Существует множество примеров вторых сайтов связывания субстрата или лиганда для белков, но биологическое значение этих вторых сайтов часто неясно. Для вируса гриппа второй сайт связывания сиаловой кислоты был идентифицирован на гемагглютинине (38), а птичья нейраминидаза N9 содержит второй сайт связывания сиаловой кислоты (39, 40).Однако ни один из этих вторых сайтов не требуется для репликации вируса. Амантадин разделяется на липидные бислои (41–43), открывая доступ лекарству к цитоплазматической стороне четырехспирального пучка. Еще предстоит определить, играет ли внешний сайт связывания римантадина, который мы считаем вторым сайтом связывания лекарственного средства, другую роль в свойствах функции A / M2, которые не связаны напрямую с ингибированием активности канала.

Материалы и методы

Клетки, вирусы и плазмиды.

293-Т и клетки собачьей почки Мадина-Дарби (MDCK) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA), с добавлением 10% FBS. Вирус гриппа A / Udorn / 72 (WT) и мутантные вирусы размножали в клетках MDCK, покрытых бессывороточной DMEM, содержащей 3,0 мкг / мл N -ацетилтрипсина (NAT; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) при 37 ° C. Вирусы WT и мутантные вирусы были созданы с использованием обратной генетики из кДНК, по существу, как описано ранее (36).Восемь геномно-смысловых плазмид (pHh31) и четыре плазмиды, экспрессирующие белок (pcDNA3.1), используемые для создания вируса гриппа с помощью обратной генетики, были описаны ранее (36). Мутации в гене M2 в векторах pHh31 и pGEM3 генерировали с использованием мутагенеза Quick Change (Stratagene, La Jolla, CA). 293-Т-клетки трансфицировали с использованием TransIT-LT1 (Mirus, Madison, WI) в соответствии с протоколами производителя. Запасы вируса размножали в клетках MDCK, и титры вируса определяли с помощью анализа бляшек на клетках MDCK.Для определения последовательностей вирусного генома вирусную РНК экстрагировали с помощью набора для вирусной РНК QIAamp (Qiagen, Валенсия, Калифорния), затем использовали супер обратную транскриптазу (Molecular Genetic Resources, Тампа, Флорида), используя специфичные для генома праймеры, и амплифицировали с помощью Ampli. Taq ДНК-полимераза (Applied Biosystems, Foster City, CA). Полные нуклеотидные последовательности генов М определяли с использованием генетического анализатора 3100-Avant (Applied Biosystems).

Для получения дополнительной информации см. SI Материалы и методы .

Анализ зубного налета.

Конфлюэнтных монослоев клеток MDCK инкубировали с 10-кратно серийно разведенными образцами вируса в DMEM 1% BSA в течение 1 ч при 37 ° C. Инокуляты удаляли, и клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Затем клетки покрывали DMEM, содержащей 0,6% микрокристаллической целлюлозы Avicel (FMC BioPolymer, Филадельфия, Пенсильвания) (44) и NAT (1,0 мкг / мл). Чтобы изучить влияние препарата (амантадин или римантадин) на образование бляшек, монослои предварительно инкубировали с DMEM, дополненной лекарственным средством (5 мкМ), при 37 ° C в течение 30 минут, а образцы вирусов предварительно инкубировали с DMEM 1% BSA с лекарством. (5 мкМ) при 4 ° C в течение 30 мин перед заражением.Через 2–3 дня после заражения монослои фиксировали и окрашивали раствором красителя нафталиновой сажи (0,1% нафталиновой сажи, 6% ледяной уксусной кислоты, 1,36% безводного ацетата натрия).

, культивирование и микроинъекция ооцитов.

кДНК WT A / M2-pGEM3 и мутантные ДНК (D44A / S31N / D44A, S31N / L38F) были линеаризованы с использованием HindIII, и реакции транскрипции in vitro были выполнены на линеаризованной кДНК с использованием набора для транскрипции mMESSAGE mMACHINE T7 (Ambion, Austin, TX ) и вводили в ооциты, как описано ранее (4).

Анализ двухэлектродных зажимов напряжения.

Двухэлектродные токи фиксации напряжения во всей клетке измеряли через 48–72 ч после инъекции ооцитов, как описано ранее (4). Токи были получены и проанализированы с использованием программного пакета pCLAMP 10.0 (Axon Instruments, Саннивейл, Калифорния).

Благодарности

Исследование поддержано исследовательскими грантами Национального института здравоохранения R01 AI-20201 (R.A.L.) и R01 Al-57363 (L.H.P.). R.A.L. является следователем Медицинского института Говарда Хьюза.

Сноски

• ^‖ Кому следует обращаться по адресу:
  Департамент биохимии, молекулярной биологии и клеточной биологии, Северо-Западный университет, 2205 Tech Drive, Evanston, IL 60208-3500.
  Эл. Почта: ralamb {at} northwestern.edu

• Вклад авторов: X.J., C.M., Y.O., T.S.J., L.H.P. и R.A.L. спланированное исследование; X.J., C.M., Y.O., F.A.O. и T.S.J. проведенное исследование; X.J., C.M., Y.O., F.A.O., T.S.J., L.H.P. и R.A.L. проанализированные данные; и X.J., T.S.J., L.H.P. и R.A.L. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/0804958105/DCSupplemental.

• Свободно доступен онлайн через опцию открытого доступа PNAS.

• © 2008 Национальная академия наук США

Мониторинг

Мониторинг устойчивости вирусов гриппа к противовирусным препаратам осуществляется с помощью ряда инициатив по эпиднадзору и специальных исследований .

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) собирает данные из национальных центров ВОЗ по гриппу и сотрудничающих центров ВОЗ через Глобальную систему эпиднадзора за гриппом и ответных мер (ГСЭГО).Данные из европейских стран (ЕС / ЕЭЗ) собраны Европейской системой надзора (TESSy) под эгидой Европейского центра профилактики и контроля заболеваний (ECDC).

Амантадин и римантадин нацелены на ионный канал M2 вирусов гриппа А. Мониторинг устойчивости к ингибиторам M2 основан на обнаружении аминокислотных замен в остатках 26, 27, 30, 31 или 34 (Hayden and Hay 1992), которые обеспечивают перекрестную устойчивость.

Вирусы гриппа A обоих подтипов, которые в настоящее время циркулируют в человеческой популяции, устойчивы к амантадину и римантадину.Устойчивые вирусы A (h4N2), содержащие S31N в белке M2, впервые появились в начале 21-го ^{-го века} и впоследствии распространились по всему миру (Bright et al ., 2005). Вирус A (h2N1) pdm09 получил свой ’резистентный’ ген M из евразийской линии вирусов свиней, которые приобрели устойчивость к амантадину в середине 1980-х годов (Smith et al ., 2009)

Брайт, Р. А., Медина, М. Дж., Сюй, Х., Перес-Оронос, Г., Уоллис, Т. Р., Дэвис, Х. М., Повинелли, Л., Кокс, Н.J. 2005. Распространенность устойчивости к адамантану среди вирусов гриппа A (h4N2), выделенных во всем мире с 1994 по 2005 годы: причина для беспокойства. Ланцет. 366: 1175-81.

Хайден, Ф. Г., Хей, А. Дж. 1992. Возникновение и передача вирусов гриппа А, устойчивых к амантадину и римантадину. Curr Top Microbiol Immunol. 176: 119-30.

Смит, Г.Дж., Виджайкришна, Д., Бахл, Дж., Лисетт, С.Дж., Воробей, М., Пибус, О.Г., Ма, С.К., Чунг, К.Л., Рагвани, Дж., Бхатт, С., Пейрис, Д.С., Гуань, Ю., Рамбо, А. 2009. Происхождение и эволюционная геномика эпидемии гриппа А свиного происхождения в 2009 г. Природа. 459: 1122-5.

Ингибиторы нейраминидазы (NA) (NAI), включая занамивир, осельтамивир, перамивир и ланинамивир, были рационально разработаны на основе кристаллической структуры NA. Анализ ингибирования ферментов (функциональный анализ) используется для оценки восприимчивости к NAI, поскольку анализы на основе клеточных культур не являются надежными для тестирования этого класса противовирусных препаратов. Многочисленные замены аминокислот в NA участвуют в снижении ингибирования NAI.Мониторинг появления устойчивости к NAI проводится с использованием как функциональных, так и генотипических анализов.

До 2007 года наблюдение за вирусами, циркулирующими по всему миру, показало, что частота возникновения устойчивости или пониженной чувствительности к осельтамивиру или занамивиру была низкой. В Японии, где самый высокий уровень потребления противовирусных препаратов на душу населения, частота обнаружения составила менее 1% (Tashiro et al ., 2009).

устойчивых к озельтамивиру сезонных вирусов A (h2N1), несущих замену h375Y в NA, появились в 2007 году и распространились по всему миру (Collins et al ., 2009). Эти устойчивые вирусы A (h2N1) были вытеснены чувствительными к осельтамивиру вирусами A (h2N1) pdm09 во время пандемии 2009 года.

Возникновение устойчивости к осельтамивиру, вызванной h375Y, среди вирусов A (h2N1) pdm09 было в основном спорадическим. Было зарегистрировано несколько случаев небольших кластеров вирусов, устойчивых к осельтамивиру, у пациентов с ослабленным иммунитетом и здоровых взрослых, что указывает на возможность передачи устойчивых вирусов. Более того, в 2011 г. в Австралии было зарегистрировано местное распространение устойчивых к осельтамивиру вирусов A (h2N1) pdm09 с h375Y (Hurt et al ,.2012) и в Японии в 2013–2014 годах (Takashita et al ., 2015). Однако эти вирусы сохранили чувствительность к занамивиру.

С 2012 года эпиднадзор за вирусами сезонного гриппа выявляет устойчивость или пониженную восприимчивость к NAI с частотой 0,5% — 1,9%, согласно глобальным обновлениям Центров сотрудничества ВОЗ (например, Lackenby et al ., 2018).

Коллинз, П. Дж., Хейр, Л. Ф., Лин, Ю. П., Лю, Дж., Рассел, Р. Дж., Уокер, П. А., Мартин, С. Р., Дэниэлс, Р. С., Грегори, В., Скехел, Дж. Дж., Гамблин, С. Дж., Хей, А. Дж. 2009. Структурные основы устойчивости вирусов гриппа к осельтамивиру. Vaccine 27: 6317-23.

Хёрт, А.С., Харди, К., Уилсон, Нью-Джерси, Дэн, Ю.М., Осборн, М., Линг, С.К., Ли, Р.Т., Яннелло, П., Гериг, Н., Шоу, Р., Уорк, П. , Колдуэлл, Н., Гивни, Р.К., Сюэ, Л., Маурер-Стро, С., Дуайер, Д.Е., Ван, Б., Смит, Д.У., Леви, А., Буй, Р., Диксит, Р., Мерритт Т., Келсо А., Далтон К., Дюррхейм Д., Барр И.Г. 2012. Характеристики широко распространенного в Австралии кластера устойчивого к осельтамивиру гриппа A (h2N1) pdm09 в сообществах.J Infect Dis. 206: 148-57.

Лакенби, А., Бесселаар, Т.Г., Дэниелс, Р.С., Фрай, А., Грегори, В., Губарева, Л.В., Хуанг, В., Херт, А.С., Лианг, С.К., Ли, РТК, Ло, Дж., Lollis, L., Maurer-Stroh, S., Odagiri, T., Pereyaslov, D., Takashita, E., Wang, D., Zhang, W., Meijer, A. 2018. Глобальная обновленная информация о восприимчивости человека от вирусов гриппа до ингибиторов нейраминидазы и статуса новых противовирусных препаратов, 2016-2017 гг. Antiviral Res. 157: 38-46.

Такасита, Э., Кисо, М., Фудзисаки, С., Йокояма, М., Накамура, К., Сиракура, М., Сато, Х., Одагири, Т., Каваока, Ю., Таширо, М., 2015. Характеристика большого кластера вируса гриппа A (h2N1) pdm09 вирусы, обладающие перекрестной устойчивостью к осельтамивиру и перамивиру, во время сезона гриппа 2013–2014 гг. в Японии. Противомикробный. Агенты Chemother. 59, 2607e2617.

Таширо, М., Маккимм-Брешкин, Дж. Л., Сайто, Т., Климов, А., Маккен, К., Замбон, М., Хайден, Ф. Г. 2009. Надзор за вирусами гриппа, устойчивыми к ингибиторам нейраминидазы, в Японии, 1996 г. -2007.Антивир Тер 14: 751-61

Ингибиторы полимеразы

Ингибитор PB1 фавипиравир одобрен в Японии, а ингибитор PA балоксавир одобрен в нескольких странах. Восприимчивость к этим ингибиторам полимеразы оценивается с помощью анализов на основе клеточных культур и анализа последовательностей (Губарева и др. ., 2019; Кошалка и др. ., 2019; Такашита и др. ., 2016, 2018).

Возникающая в результате лечения устойчивость к балоксавиру связана с аминокислотными заменами в остатке 38 в белке PA, который является высококонсервативным у вирусов гриппа A и B (Omoto et al., 2018; Губарева и др., 2019).

В 2018–2019 годах балоксавир был наиболее широко используемым противовирусным средством от гриппа в Японии. В этот период замены PA I38X были обнаружены в вирусах A (h2N1) pdm09 и A (h4N2) в 1,5% и 9,5% соответственно. Эти вирусы были получены в основном от детей младше 12 лет, получавших балоксавир. Однако некоторые были от нелеченных детей, что указывает на передачу от человека к человеку (Takashita et al ., 2019; Imai et al ., 2020). В США, где балоксавир одобрен только для пациентов в возрасте от 12 лет и старше, в течение того же периода не было обнаружено устойчивых к балоксавиру вирусов (Xu et al .2019).

Репликативная приспособленность современных вирусов гриппа A с заменой PA I38X была относительно неизменной in vitro и на животных моделях (Checkmahomed et al ., 2020, Chesnokov et al ., 2019, Imai et al. al ., 2020).

Checkmahomed, L., M’hamdi. З., Карбонно, Дж., Венейбл, М.К., Баз, М., Абед, Ю., Бойвин, Дж. 2020. Влияние замещения кислоты I38T на устойчивость к балоксавиру полимеразы и кислоты на приспособленность современного гриппа A (h2N1) pdm09 и Штаммы A (h4N2).J Infect Dis. 221: 63-70.

Чесноков, А., Патель, М.К., Мишин, В.П., Де Ла Крус, Дж. А., Лоллис, Л., Нгуен, Х.Т., Дуган, В., Вентворт, Д.Е., Губарева, Л.В. 2019. Репликативная пригодность вирусов сезонного гриппа А. с пониженной восприимчивостью к балоксавиру. J Infect Dis. pii: jiz472.

Губарева, Л.В., Мишин, В.П., Патель, М.С., Чесноков, А., Нгуен, Х.Т., Де Ла Круз, Дж., Спенсер, С., Кэмпбелл, А.П., Синнер, М., Рид, Х., Гартен, Р., Кац, Дж. М., Фрай, А. М., Барнс, Дж., Вентворт, Д. 2019. Оценка чувствительности к балоксавиру вирусов гриппа, циркулирующих в США в сезонах 2016/17 и 2017/18. Euro Surveill. 24 (3): pii = 1800666.

Имаи, М., Ямасита, М., Сакаи-Тагава, Ю., Ивацуки-Хоримото, К., Кисо, М., Мураками, Дж., Ясухара, А., Такада, К., Ито, М., Накадзима, Н., Такахаши, К., Лопес, Т.Д.С., Датта, Дж., Хан, З., Крити, Д., ван Бакель, Х., Токита, А., Хагивара, Х., Изумида, Н., Куроки, Х., Нишино, Т., Вада, Н., Кога, М., Adachi, E., Jubishi, D., Hasegawa, H., Kawaoka, Y. 2020. Варианты гриппа A с пониженной чувствительностью к балоксавиру, выделенные от японских пациентов, подходят и передаются через респираторные капли. Nat Microbiol. 5: 27-33.

Кошалка, П., Тилманис, Д., Роу, М., Виджайкришна, Д., Херт, А.С. 2019. Чувствительность к балоксавиру марбоксилу вирусов гриппа из Азиатско-Тихоокеанского региона, 2012-2018 гг. Antiviral Res. 164: 91-96.

Омото, С., Сперанзини, В., Хашимото, Т., Ноши, Т., Ямагути, Х., Kawai, M., Kawaguchi, K., Uehara, T., Shishido, T., Naito, A., Cusack, S. 2018. Характеристика вариантов вируса гриппа, индуцированных лечением ингибитором эндонуклеаз балоксавиром марбоксилом. Научный журнал 8: 9633.

Такашита, Э., Эдзима, М., Огава, Р., Фудзисаки, С., Нойман, Г., Фурута, Ю., Каваока, Ю., Таширо, М., Одагири, Т. 2016. Чувствительность к противовирусным препаратам вирусы гриппа, выделенные от пациентов до и после приема фавипиравира. Antiviral Res. 132: 170-7.

Такашита, Э., Итикава, М., Морита, Х., Огава, Р., Фудзисаки, С., Ширакура, М., Миура, Х., Накамура, К., Кишида, Н., Кувахара, Т., Сугавара, Х. , Сато, А., Акимото, М., Митамура, К., Абэ, Т., Ямазаки, М., Ватанабе, С., Хасегава, Х., Одагири, Т. 2019. Передача гриппа от человека к человеку Вирус A (h4N2) с пониженной чувствительностью к балоксавиру, Япония, февраль 2019 г. Emerg Infect Dis. 25: 2108-2111.

Такашита, Э., Морита, Х., Огава, Р., Накамура, К., Фудзисаки, С., Ширакура, М., Кувахара, Т., Кишида, Н., Ватанабе, С., Одагири, Т. 2018. Восприимчивость вирусов гриппа к новому кэп-зависимому ингибитору эндонуклеаз Балоксавир Марбоксил. Front Microbiol. 9: 3026.

Сюй, X., Блэнтон, Б., Абд Элал, А.И., Алаби, Н., Барнс, Дж., Биггерстафф, М., Браммер, Л., Бадд, А.П., Бернс, Э., Каммингс, С.Н., Гарг , С., Кондор, Р., Губарева, Л., Книсс, К., Ньянсеор, С., О’Халлоран, А., Рольфес, М., Сешнс, В., Дуган, В.Г., Фрай, А.М., Вентворт , DE, Стивенс, Дж., Джерниган Д. 2019. Обновленная информация: активность гриппа в Соединенных Штатах в течение сезона 2018–19 гг.