Публикации в СМИ
Трипаносомозы — протозойные инфекции, вызываемые жгутиковыми простейшими рода Trypanosoma; протекают в форме африканского (гамбийского и родезийского) трипаносомоза, или сонной болезни и американского трипаносомоза (болезнь Чагаса).
Этиология. Возбудитель гамбийского трипаносомоза — Trypanosoma brucei var. gambiense; родезийского трипаносомоза — Trypanosoma brucei var. rhodesiense. Возбудитель болезни Чагаса — Trypanosoma cruzi.
Эпидемиология • Переносчик гамбийского трипаносомоза — муха цеце Glossina palpalis, обитающая в зарослях рек и озёр. Природный резервуар возбудителя — больной человек. Заболевание чаще регистрируют в Центральной Африке, особенно в местах, расположенных по берегам водоёмов • Переносчик родезийского трипаносомоза — муха цеце 
Природный резервуар — различные мелкие антилопы. Заражение чаще происходит при выпасе скота или на охоте. Пути передачи — от человека человеку и от человека домашним животным. Заболевание распространено в Замбии и Танзании • Переносчики болезни Чагаса — клопы рода Triatoma и близкие им формы семейства Reduviidae. Болезнь развивается при загрязнении ран заражёнными испражнениями переносчиков или при переливании заражённой крови. Заболевание регистрируют в Южной Америке, особенно в Бразилии, Аргентине, Чили.
Клиническая картина
• Африканский трипаносомоз •• Продолжительность инкубационного периода — 2–3 нед. У некоторых пациентов через 2–3 дня на месте укуса переносчика образуется изъязвляющаяся папула (шанкр). В начальной стадии клинические проявления отсутствуют, но возбудитель бурно размножается в месте проникновения и диссеминирует по лимфатической системе в кровоток. У некоторых больных наблюдают регионарную лимфаденопатию (особенно затылочных лимфатических узлов).
• Болезнь Чагаса (южноамериканский трипаносомоз) •• Острая форма (наблюдают преимущественно у маленьких детей). На ранних стадиях характерны лихорадка, лимфаденопатия, увеличение печени, отёк лица. Иногда регистрируют менингоэнцефалиты с судорожным синдромом, приводящие к умственным и физическим дефектам или смерти. Часто развивается острый миокардит с возможным летальным исходом •• Хроническая форма протекает легко, иногда бессимптомно, но может сопровождаться миокардиопатией, мегаэзофагусом и мегаколоном с летальным исходом. В Бразилии и Аргентине чаще наблюдают тяжёлые формы, в Чили — лёгкие.
Методы исследования • Выделение возбудителя. Материалы для исследования: ликвор, кровь, биопсийный материал лимфатических узлов. Центрифугирование облегчает обнаружение возбудителя в крови и ликворе. При поражении ЦНС кровь и лимфатические узлы возбудителя не содержат. В начальной стадии заболевания возбудителя обнаруживают в месте укуса и в шейных лимфатических узлах • При отрицательных результатах микроскопии исследуемый материал вводят белым мышам или крысам (п/к или в/м). На 2–3-е сутки в крови обнаруживают возбудителя • Серологические исследования выявляют АТ класса IgM в диагностических титрах у всех больных • При изучении гистологических препаратов секционного материала обнаруживают сходство поражений ЦНС при африканских трипаносомозах и сифилисе.
ЛЕЧЕНИЕ • Эфлорнитин 400 мг/кг/сут в/в в 4 приёма в течение 14 дней — на ранних и поздних стадиях гамбийского трипаносомоза
Течение и прогноз. Течение обычно хроническое прогрессирующее. Может персистировать в течение нескольких месяцев или лет с последующим поражением ЦНС.
Профилактика
• Профилактика африканского трипаносомоза •• В эндемичных районах рекомендуют носить одежду, закрывающую руки и ноги •• Пентамидин 4 мг/кг в/м обеспечивает защиту от гамбийского трипаносомоза (может маскировать заражение и приводить к почечной недостаточности) • Профилактика болезни Чагаса •• Избегать посещения ветхих домов и надворных построек •• Использование защитных сеток и инсектицидов •• Опрыскивание 5% р-ромМКБ-10 • B56 Африканский трипаносомоз
Африканский трипаносомоз — Симптомы, диагностика и лечение
Смертельна без лечения. Все рекомендованные препараты доступны бесплатно по программе Всемирной организации здравоохранения.
Окончательный диагноз основывается на микроскопическом выявлении трипаносом в жидкостях организма. Определение стадии заболевания основывается на исследовании спинномозговой жидкости.
Цель лечения – полное излечивание заболевания. Подход зависит от подвида паразита и стадии заболевания, но все препараты имеют серьезные побочные эффекты и сложны в использовании.
Бланковый тест агглютинации используют для скрининга населения в эндемических регионах.
Смертельное заболевание, вызываемое внеклеточными паразитами (род Trypanosoma), которые передаются мухами цеце (род Glossina). В организме человека заболевание вызывают два морфологически неразличимых подвида Trypanosoma brucei. В Западной и Центральной Африке к югу от Сахары инфекция, вызванная T. b. gambiense, приводит к хроническому заболеванию, которое может длиться годами. В Восточной и Южной Африке инфекция, вызванная T. b. rhodesiense, приводит к острому заболеванию, которое может закончиться летально в течение месяцев. Изначально паразита обнаруживают в лимфе и крови (гемолимфатическая стадия), но через некоторое время он преодолевает гематоэнцефалитический барьер и проникает в ЦНС (менингоэнцефалитическая стадия).[1]Burri C, Brun R. Human African trypanosomiasis. In: Cook GC, Zumla AI, eds. Manson’s tropical diseases. Philadelphia, PA: Saunders; 2009:1307-1325.[2]World Health Organization. Control and surveillance of human African trypanosomiasis. Technical Report Series 984. Geneva, Switzerland: WHO; 2013. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/95732/1/9789241209847_eng.pdf?ua=1 [3]Chappuis F, Loutan L, Simarro P, et al. Options for the field diagnosis of human African trypanosomiasis. Clin Microbiol Rev. 2005 Jan;18(1):133-46. http://cmr.asm.org/content/18/1/133.long http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15653823?tool=bestpractice.com [4]Simarro PP, Jannin J, Cattand P. Eliminating human African trypanosomiasis: where do we stand and what comes next? PLoS Med. 2008 Feb;5(2):e55. http://journals.plos.org/plosmedicine/article?id=10.1371/journal.pmed.0050055 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18303943?tool=bestpractice.com [5]Stich A, Abel PM, Krishna S. Human African trypanosomiasis. BMJ. 2002 Jul 27;325(7357):203-6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12142311?tool=bestpractice.com [6]Brun R, Blum J, Chappuis F, et al. Human African trypanosomiasis. Lancet. 2010 Jan 9;375(9709):148-59. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19833383?tool=bestpractice.com Также известна как сонная болезнь.
Трипаносомоз
Трипаносомоз – паразитарное тропическое заболевание, которое передается трансмиссивным механизмом. Возбудителем заболевания являются трипаносомы, простейшие, принадлежащие к классу жгутиковых семейства Trypanosomatidae.Этиология
Причиной заболевания являются трипаносомы, которые в организме человека и животных приобретают продолговатую форму с ундулирующей мембраной, переходящей в жгутик. При размножении в организме насекомых, которые являются переносчиком, развиваются нетипичные криптидиальные и метациклические формы трипаносом.
Африканский трипаносомоз
Эпидемиология
Эпидемиологическая характеристика хронической и острой форм трипаносомоза (сонной болезни) различная.
Хроническая форма распространена преимущественно у берегов крупных рек. Передача возбудителя (Trypanosoma brucei gambiense ) от человека к человеку осуществляется посредством двух видов мух цеце (Glossina palparis и Glossina tachinoides). Распространение возбудителя происходит при укусах этих мух или в случае попадания выделений мух на поврежденный кожный покров.
Острая форма является типичным антропозоонозом. Возбудитель (Trypanosoma brucei rhodesiense) распространен в лесах саванны. Естественным природным резервуаром трипаносом являются антилопы, а переносчиком – мухи цеце (Glossina morsitans, Glossina pallidipes, Glossina swinnertoni). Не исключено заражение через продукты питания, при переливании крови, трансплацентарно.
Заболеваемость трипаносомозом встречается в 27 странах Африки с населением 250 миллионов человек.
Эпидемиология и эпизоотология трипаносомоза во многом имеет зависимость от биологических и экологических условий обитания переносчиков. На развитие трипаносом имеет влияние окружающая температура, и в первую очередь температура влияет на развитие куколок мухи цеце.
Снижение относительной влажности воздуха до 30 % увеличивает зараженность мух; предполагается, что это явление имеет влияние на состояние голода мух цеце.
Скорость и объем выделяемой слюны имеет тенденцию к увеличению при голодании мухи в течение 2-х суток.
Патогенез
На месте внедрения паразитов формируется инфильтрат с разрушением клеток. Далее трипаносомы по лимфатическим путям распространяются в лимфоузлы. В среднем через 3–4 недели током крови трипаносомы распространяются по различным органам и системам. Вокруг очагов размножения трипаносом формируются лейкоцитарные инфильтраты, происходит активация эозинофилов с выбросом биологически активных веществ, повреждающих окружающие ткани.
Клинические симптомы развиваются в зависимости от расположения некротических очагов. Заболевание имеет тенденцию к прогрессирующему течению.
Клиническая картина
Инкубационный период длится до 3-х недель. В местах внедрения возбудителя формируются темно-красные узлы до 2-х см в диаметре на уплотненном основании. Через неделю узелки самостоятельно рассасываются, оставляя на месте их формирования пигментированную кожу, иногда рубец.
В течение года паразиты распространяются по организму с образованием эритем в виде колец на туловище, реже на конечностях. Такие проявления соответствуют первому периоду заболевания.
Эритемы постепенно увеличиваются до 5 см и бесследно проходят в течение 3-х месяцев, иногда осложняясь многочисленной зудящей сыпью или конъюнктивитом.
Кожные проявления сопровождаются выраженной интоксикацией, лихорадкой неправильного типа, которая может длиться несколько месяцев. С первых дней болезни определяется увеличение печени и селезенки.
Второй период заболевания (сонная болезнь) характеризуется преодолением возбудителями гематоэнцефалического барьера и поражением головного мозга. Признаками вовлечения в патологический процесс головного мозга являются нарастающая общая слабость, безразличие к окружающим, заторможенность, отсутствие сна ночью и сонливость днем. Исподволь развивается летаргический сон, переходящий в коматозное состояние.
Симптомы поражения центральной нервной системы проявляются дрожанием конечностей, парезами мышечных групп.
Длительность второго периода до одного года, больные самостоятельно не выздоравливают.
Американский трипаносомоз протекает с преимущественным поражением периферической нервной системы. Наиболее часто в патологический процесс вовлекается сплетение Ауэрбаха с паралитическими нарушениями двигательной функции кишечника и парезом.
В разгаре заболевания есть риск развития менингоэнцефалита, который часто заканчивается смертельным исходом.
Диагностика
Основным методом является выявление трипаносом в крови при темнопольной микроскопии или в окрашенных мазках крови. При подозрении на африканский трипаносомоз обязательно исследуют спинномозговую жидкость.
Лечение
Основным этиотропным препаратом для лечения африканского трипаносомоза является сурамин. В случае непереносимости сурамина препаратом выбора является пентамидин или орнидил. При поражении африканскими трипаносомами возможно применение арсобала.
Профилактика
Своевременное выявление, лечение и изоляция больных. Проведение мероприятий по уничтожению переносчиков и защита населения от их нападения. Пентамидин применяют в качестве специфической химиопрофилактики.
Американский трипаносомоз
Эпидемиология
Болезнь Шагаса (возбудителем заболевания является Trypanosoma Cruzi) встречается исключительно в Америке. Предается возбудитель заболевания клопами-редувидами преимущественно в бедных районах и сельской местности Центральной и Южной Америки.
Клиническая картина
Первые признаки заболевания появляются через неделю после внедрения паразита и характеризуются участком уплотнения и покраснения, увеличением региональных лимфоузлов. При поражении конъюнктивы формируется отек в области глазницы, симптом Романа.
После появления местных симптомов развивается общая интоксикация, лихорадка, больной отказывается от приема пищи, появляется отек лица и ног.
На пике заболевания есть угроза острого миокардита с развитием сердечной недостаточности.
Острые симптомы заболевания купируются самостоятельно с переходом в бессимптомный период болезни.
Осложнениями со стороны сердечно-сосудистой системы наиболее часто являются кардиомиопатия, аритмии и тромбоэмболия. Поражение желудочно-кишечного тракта характеризуется болью и нарушениями при глотании, болью по ходу пищевода и регургитацией, хроническим запором, кишечной непроходимостью, перфорацией кишечника, сепсисом со смертельным исходом.
Диагностика
Обнаружение паразитов возможно при исследовании лейкоцитарной пленки, в тонком мазке или в толстой капле крови. Применяется исследование переносчика методом ксенодиагностики.
При хронической болезни Шагаса используют серологические тесты.
Лечение
Антипротозойные препараты используются только при острой форме заболевания, назначается нифуртимокс или бензнидазол.
Профилактика
Выявление, лечение и изоляция больных. Проведение мероприятий по защите от нападения клопов, уничтожение переносчиков.
Санитарно-просветительная работа.
Сонная болезнь скрывается в человеческой коже
Ученые давно заметили, что опасная африканская инфекция, известная под названием «сонная болезнь», способна неожиданно возвращаться в местность, где в течение нескольких недель не наблюдалось ни одного человека или животного, в крови которых находился бы возбудитель болезни. Теперь эта особенность сонной болезни получила объяснение.
Возбудитель сонной болезни – одноклеточные организмы из рода трипаносом (Trypanosoma), которые переносятся с укусами мухи цеце. В зоне обитания этой мухи сейчас проживает около 65 миллионов человек. От момента заражения до проявления явных симптомов заболевания может пройти от нескольких недель до нескольких месяцев. У больных начинается лихорадка, головная боль, боль в суставах, затем наступают нарушения сознания, координации движений, появляются неожиданные приступы сонливости, из-за которых болезнь получила свое название. Без специального лечения болезнь всегда заканчивается комой и смертью.
В 1950-х – 1960-х годах благодаря усилиям врачей число заболеваний сонной болезнью снизилось до нескольких тысяч в год, и врачи уже считали, что скоро болезнь исчезнет. Но окончательно это сделать так и не удалось. По оценкам ВОЗ, и в XXI веке ежегодно сонной болезнью заболевают от семи до десяти тысяч человек.
Возможную причину устойчивости трипаносом открыла Аннет Маклауд (Annette MacLeod) из Университета Глазго, которая в течение последних 20 лет изучает сонную болезнь в разных странах тропической Африки. Когда исследовательница изучала развитие трипаносом в организме мышей, она неожиданно увидела в микроскоп, как возбудитель сонной болезни внедрился в клетки кожи. Тогда Аннет Маклауд получила у коллег образцы биопсии кожи людей из ДР Конго, полученные в начале 1990-х годов во время борьбы с другой болезнью – речной слепотой. Изучив образцы, она отметила трипаносомы в клетках кожи нескольких человек. Причем никаких симптомов сонной болезни у данных пациентов не проявлялось. Маклауд пришла к выводу, что такие бессимптомные носители и обеспечивают сонной болезни возможность возрождаться, а используемые методы диагностики не могут их выявить.
Аннет Маклауд считает, что биопсия кожи должна быть добавлена к обычным схемам скриннига, выявляющим сонную болезнь. Также она надеется, что будет создан неизвазивный метод диагностики. В ближайшее время исследовательница намерена установить, оказываются ли современные схемы лечения сонной болезни эффективными при проникновении трипаносом в кожу.
Исследование Аннет Маклауд и ее коллег опубликовано в научном журнале eLife.
Микроскоп МТБ-1
Микроскоп МТБ-1 – это устройство, используемое для исследования и проверки различных видов мясных и других продуктов на наличие вредных паразитов и микробов. При помощи этого микроскопа можно определить таких микробов, как сальмонелла, трипаносома, спирилла, трихинелла и золотистый стафилококк. Исследование при помощи этого прибора осуществляются при помощи различных видов освещения. Оно может быть как природным, то есть дневное освещение свет плюс дополнительный свет осветителя. Или же искусственное освещение плюс сверху свет от осветителя.
Область применения и параметры:
Является незаменимым прибором для различных исследований. С его помощью можно определять вредоносных паразитов. Также его можно применять и в других сферах и профилях индустрии. При своей различной кратности увеличения, микроскоп может применяться натуралистами, филателистами, при выполнение ювелирных работ, в школах и университетах на уроках биологии или фармацевтической науки, часовщиками при ремонте механических и электронных часов различной конфигурации. Увеличение происходит благодаря различным объективам в микроскопе. С объективом с увеличением в четыре раза, изображение увеличивается в 50 крат, с объективом в восемь раз, увеличивается в 100 крат. Предлагаемый нами микроскоп имеет угол наклона в интервале от 45 до 90 градусов. При этом отсутствует какая-либо погрешность измерений. При своем компактном размере 200х220х220 миллиметров, микроскоп имеет массу равную три с половиной килограмма. В комплекте с микроскопом также поставляются четыре аккумулятора VARTA AA 750 mA/h.
Условия заказа и поставки:
Заказать микроскоп МТБ-1 можно в нашей организации «Амторг». Если Вам необходимо проверить различные продукты на наличие потенциально вредных микробов, либо же просто необходим хороший и качественный микроскоп, заказывайте оптическую продукцию в нашей организации. Товар всегда находиться на складе завода-производителя и готов быть отгружен в любой момент. Для предотвращения поломки микроскопа во время транспортировки, используется специальная упаковка, полностью защищающая продукцию от различных дефектов. Телефон для справок (4722) 40-00-02.
Противотрипаносомный T. equiperdum антиген Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ и ммунология ♦
УДК 619: 616.99: 616-074
Противотрипаносомный T. equiperdum антиген
Х. Гэоргиу, доктор биологических наук ([email protected])
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» (ВИЭВ) Россельхозакадемии (Москва).
Приведены результаты получения от зараженных собак, мышей и крыс трипаносомных соматических и экзоантигенов с активностью 95.97 % для диагностических исследований в РДСК, РНГА и ИФА.
Ключевые слова: антиген, инвазия, ИФА, паразите-мия, РДСК, РНГА, трипаносомоз, экзоантиген Сокращения: ИНАН — инфекционная анемия, ИФА — иммуноферментный анализ, МЭБ — Международное эпизоотическое бюро, РДСК—реакция длительного связывания комплемента, РНГА—реакция непрямой гема-гглютинации, РСК—реакция связывания комплемента
Введение
Трипаносомы — одноклеточные простейшие жгутиковые паразиты класса кинетопластид. На территории России встречаются возбудители случной болезни однокопытных (Trypanosoma еquiperdum) и сурры лошадей и верблюдов (T. еуажi) [1].
По данным МЭБ, случную болезнь, вызываемую T. еqui-perdum, регистрируют в Южной Африке, на юге Западной Европы, в Южной Америке, КНР, Среднем Востоке, Средней Азии (Киргизии, Узбекистане) и в России (Сибири). У лошадей случная болезнь протекает наиболее тяжело с высоким уровнем смертности (30…50 %) [15].
T. evansi широко распространена в Азии, Северной Африке, Центральной и Южной Америке. К ней восприимчивы большинство видов домашних и многие виды диких животных. У непривитых лошадей и верблюдов вызываемая этой трипаносомой болезнь сурра (су-ауру), как правило, заканчивается летально [16].
По международным правилам, ввоз лошадей из неблагополучных по случной болезни стран разрешен только при условии исключения у них данного трипаносомоза. С этой целью, в основном, применяют серологические тесты (чаще РСК и дополнительно ИФА) микроскопию и биопробу на лабораторных животных. При диагностических исследованиях особую сложность представляет видовая дифференциация T. еquiperdum и T. evansi, поскольку они неразличимы морфологически, имеют перекрестно-реагирующие антигены и многочисленные сходные участки генома [1, 4, 9, 11].
Мировая практика борьбы со случной болезнью показала, что наиболее эффективным способом является убой больных и положительно реагирующих в РСК животных. Лечение дает временный положительный эффект и не позволяет искоренить болезнь. В связи с этим разработка и внедрение новых способов изготовления ди-агностикумов трипаносомозов остается весьма актуальным направлением в современной ветеринарии.
Диагноз на случную болезнь устанавливают в соответствии с «Инструкцией о мероприятиях по борьбе со случной болезнью однокопытных» от 14.01.1997 г., на основании эпизоотологических, клинических, патолого-анатомических данных и результатов лабораторных исследований (микроскопического, серологического). Для микроскопии берут соскобы с пораженных слизистых
оболочек половых органов и пунктат (сукровицу) из краев талерных бляшек. Соскобы берут уретральной ложкой или даже краем предметного стекла, а для получения пунктата делают укол иглой или надрез скальпелем. Исследуют методом раздавленной капли или из соскоба приготавливают тонкие мазки и окрашивают их по методу Романовского.
Цель исследования
Выявить возможность получения антигенов — как соматических, так и экзоантигенов из крови зараженных собак, мышей и крыс.
Материалы и методы
Материалом для получения трипаносомного антигена послужила кровь больных животных (собак, мышей и крыс), инфицированных соответствующим возбудителем с пораженностью 250 и более трипаносом в 1 поле зрения микроскопа. На высоте паразитемии животных обескровливали.
Кровь собирали в стерильные колбы с антикоагулянтом из расчета 50 мл 20%-го раствора цитрата натрия на 1 л крови. Дальнейшую обработку крови проводили в день ее взятия или не позднее следующих суток по методике Х. Георгиу [13]. Полученный антиген консервировали и титровали в РДСК и ИФА с заведомо положительными и отрицательными сыворотками.
Экзогенные антигены из плазмы крови и надосадоч-ной жидкости (супернатанта), полученной после первого центрифугирования лизированных эритроцитов, выделяли посредством осаждения в 20%-м растворе по-лиэтиленгликоля по стандартной методике [18] и титровали в РДСК и ИФА (табл. 1).
РДСК ставили согласно «Временному наставлению по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в РДСК» [14]; РНГА — согласно «Методическим рекомендациям по диагностике трипаносомозов лошадей (Т. equiperdum и Т. еуапэ!)» [15]; ИФА — согласно «Методическим рекомендациям для серологической диагностики случной болезни лошадей с применением экзоантигенов Т. equiperdum в иммуноферментном анализе» [16].
Полученный антиген проверяли на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Романовскому—Гимзе, на активность, отсутствие антикомплементарных свойств.
Для проверки антигена на активность его разводили физиологическим раствором в соотношении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128. Остальные компоненты, используемые в РДСК при определении активности антигена (сыворотки — позитивная, нормальная, комплемент, гемолитическая система), брали в рабочих дозах. Реакцию ставили по схеме, приведенной в таблице 1.
Противотрипаносомный T. equiperdum антиген
1. Схема постановки РДСК при определении активности трипаносомного антигена Количество трипаносомного антигена, мл, Компоненты реакции при разных разведениях
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Контроль
Антиген 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Одно разведение сыворотки 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Комплемент 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Холодильник при 2…4°С — 18…20 ч, затем 30 мин при комнатной температуре
Гемолитическая система
0,2 0,2 0,2 0,2
Водяная баня при 37…38°С — 20 мин, затем холодильник при 2…4°С — 4…5 ч
2. Титры серий трипаносомных антигенов
Соматический антиген
из плазмы крови
Экзоантиген
из супернатанта лизированных
РДСК ИФА РДСК ИФА РДСК ИФА
1 1:32 1:64 1:256 1:512 1:32 1:128
2 1:16 1:32 1:64 1:128 1:32 1:64
3 1:8 1:16 1:64 1:128 1:8 1:16
4 1:16 1:32 1:32 1:64 1:32 1:64
3. Определение специфичности трипаносомного антигена в РДСК
Происхождение сывороток Разведение сывороток 1:5 1:10 Без антигена
Положительные сыворотки от лошадей, переболевших разными болезнями (по п=1): бруцеллезом сапом ИНАН ринопневмонией вирусным артериитом ОТ ОТ ОТ
Здоровые лошади (п=2) ОТ ОТ ОТ
Фабричная сыворотка (Омская) № 1 от лошади, зараженной Т. еquiperdum ПОЛ ПОЛ ПОЛ
Положительная сыворотка от кролика, зараженного Т. еуапэ: ПОЛ ПОЛ ПОЛ
Положительная сыворотка от лошади из Китая, зараженной Т. еуапэ: ПОЛ ПОЛ ПОЛ
| Примечание: ОТ — отрицательная, ПОЛ — положительная
Номер серий
Результаты реакции оценивали по степени гемолиза и выражали в крестах: «++++» — гемолиз отсутствует — реакция положительная; «+++» — 25 % гемолиза — реакция положительная; «++» — 50 % гемолиза — реакция положительная; «+» — 75% гемолиза — реакция сомнительная; «-» — 100 % гемолиза — реакция отрицательная.
По этой схеме учитывали реакцию и с другими разведениями сыворотки.
Титром антигена считали то наибольшее разведение, при котором проходит 50%-я задержка гемолиза эритроцитов, с наибольшим разведением 1:20…1:40 позитивной контрольной сыворотки.
Антикомплементарные свойства антигена устанавливали в РДСК при определении активности и специфичности антигена путем добавления в пробирки двойной дозы антигена в рабочем разведении в присутствии комплемента, причем в пробирках не должно быть задержки гемолиза эритроцитов барана. После чего консервировали и определяли рабочий титр в РДСК в объеме 0,5 мл с положительными и отрицательными сыворотками. На специфичность антиген проверяли с сыворотками животных, перенесших паразитарные или инфекционные болезни непротозойной природы.
Сублимационное высушивание приготовленных серий антигена проводили на базе ВГНКИ. Лиофилизирован-ные серии антигена хранили в бытовом холодильнике при (при 4 °С).
Результаты и обсуждение
Результаты титрования соматического и экзогенного (растворимого) трипаносомного антигена приведены в таблице 2.
Титры супернатанта лизированных эритроцитов уступали титрам экзогенного антигена, полученного из плазмы, но не соматического антигена. По-видимому, определенное количество растворимого трипаносомного антигена фиксируется на мембране эритроцитов и лейкоцитов, после лизиса которых переходит в супернатант.
Таким образом, опыты показали, что кроме соматических антигенов можно выделить и использовать в диагностике и экзоантигены трипаносом, которые по титрам не уступают первым.
Результаты исследования полученного трипаносом-ного антигена на специфичность и чувствительность в РСК и РДСК с сыворотками крови от лошадей, зараженных случной болезнью, суррой, нутталлиозом, сапом, ИНАН, ринопневмонией, вирусным артериитом, а также от здоровых лошадей приведены в таблице 3.
Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что эти сыворотки ни в одном случае, кроме сывороток, полученных от зараженных случной болезнью и суррой животных, не реагировали с трипаносомным антигеном. Кроме того, нами установлено, что предложенный нами антиген с активностью 95.97 % можно использовать для диагностики трипаносомоза лошадей в РДСК, РНГА и ИФА с аналогичным результатом.
Как видно из приведенных результатов, предложенный способ позволяет получить чувствительный и специфичный трипаносомный антиген.
Выводы
Полученные нами результаты показывают, что кровь от зараженных животных (собак, мышей или крыс) можно использовать для приготовления антигенов (соматических и экзоантигенов). Предложенный нами трипаносомный антиген с активностью 95.97 % пригоден для диагностики трипаносомоза лошадей в РДСК, РНГА и ИФА.
Библиография
1. Георгиу, Х. Получение высокоактивных и высокоспецифичных трипаносомных сывороток / Х. Георгиу // Вет-корм. — 2014. — №1. — С. 26-28.
2. Георгиу, Х. Экспериментальный анаплазмоз овец (симптомокомплекс, иммунологические реакции) / Х. Георгиу: автореф. дис. … канд. вет. наук; защищена 27.05.1980. — М.: МГАВМиБ, 1980. — 18 с.
3. 3. Георгиу, Х. РДСК, РНГА, И ИФА при диагностике трипаносомозов лошадей / Х. Георгиу // Мат-лы Пятой научно-практической конференции по болезням лошадей, 2004. — С. 19-21.
4. Георгиу, Х. ИФА для диагностики трипаносомоза (дурина) лошадей / Х. Георгиу // Ветеринарная патология. — 2003. — № 1. — С. 99-101.
5. Георгиу, Х. Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталлиоза лошадей / Х. Георгиу: автореф. дис. … докт. биол. наук; защищена 26.06.1997; утв. 31.10.1997. — М.: ВИЭВ, 1997. — 56 с.
6. Георгиу, Х. Применение экзоантигенов трипаносом для серодиагностики случной болезни лошадей / Х. Георгиу, В.Т. Заблоцкий // Мат-лы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозой патологии животных, рыб и пчел», 2008. — С. 402-406.
7. Заблоцкий, В.Т. Методические рекомендации для серологической диагностики случной болезни лошадей с применением экзоантигенов T. equiperdum в иммуноферментном анализе (ИФА) / В.Т. Заблоцкий, Х. Георгиу / В кн. «Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины» / А.М. Смирнов, Н.В. Скира, А.В. Суворов и др. — М.: РАСХН, 2006. С. 163-172.
8. Ломакина, Н.Ф. Изучение генома возбудителей трипаносомозах лошадей (T. еquiperdum и T. evansi) / Н.Ф. Ломакина, Х. Георгиу, В.Т. Заблоцкий, М.И. Гулюкин, Люис Тюрейтер // Ветеринария. — 2013. — № 3. — С. 29-33.
9. Ломакина, Н.Ф. Трудности дифференциации трипаносом T. evansi и T. equiperdum / Н.Ф. Ломакина, Х. Георгиу, М.И. Гулюкин // Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика». — 2014. — Том II. — С. 491-492.
10. Claes, F. Trypanosoma equiperdum: master of disguise or historical mistake? / F. Claes, P. Buscher, L. Touratier, B.M. God-deeris // Trends Parasitol. — 2005. — Vol. 21(7). — P. 316-321.
11. Claes, F. Variable surface glycoprotein RoTat 1.2 PCR as a specific diagnostic tool for the detection of Trypanosoma evansi infections / F. Claes, M. Radwanska, T. Urakawa et al. // Kinetoplastid Biol. Dis. — 2004. — Vol. 3. — P. 3.
12. Clausen, P.H. A field study to estimate the prevalence of Trypanosoma equiperdum in Mongolian horses / P.H. Clausen, S. Chuluun, R. Sodnomdarjaa et al. // Vet. Parasitol. — 2003. — Vol. 115. — P. 9-18.
13. Lai, D.H. Adaptations of Trypanosoma brucei to gradual loss of kinetoplast DNA: Trypanosoma equiperdum and Trypanosoma evansi are petite mutants of T. brucei / D.H. Lai, H. Hashimi, Z.R. Lun et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2008. — Vol. 105(6). — P. 1999-2004.
14. Li, Fj. HCR approach for the detection of Trypanosoma brucei and Tr. Equiperdum and their differentiation from T. evansi based on maxicircle kinetoplast DNA / Fj Li, R.B. Gasser, D.H Lai., F. Claes et al. // Mol Cell Propes. — 2007. — Vol. 21(1). — P. 1-7.
15. OIE Terrestrial Manual. 2008. Chapter 2.5.3. P. 845-851. Режим доступа: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_stan-dards/tahm/2.05.03_D0URINE.pdf.
16. Интернет-ресурс. Режим доступа: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_TRY-PANO_SURRA.pdf.
17. Young, R. Isolation and analysis of the genetic diversity of repertoires of VSG expression site containing telomeres from Trypanosoma brucei gambiense, T.b.brucei and T. equiperdum / R. Young, J.E. Taylor, A. Kurioka, M. Becker et al. // BMC Genomics. — 2008. — Vol. 9. — P. 385.
18. Zablotskij, V.T. The current challenges of dourine: difficulties in differentiating Trypanosoma equiperdum within the subgenus Trypanozoon / V.T. Zablotskij, C. Georgiu, T. De Waal et al. // Rev. Sci. Tech. — 2003. — Vol. 22(3). — P. 1087-1096.
SUMMARY
Ch. equiperdum Antigen. Received data showed that developed tripanosomosis exoantigen is specific, highly active and does not need significant expenses because initial material for manufacturing is earlier thrown out plasma of blood of infected animals. We proposed besiny antigen activity 95…97 % can be used to diagnose tripanosomosis of horses the ICFT, IHAT and ELISA.
Трипаносомы. Систематика, морфология, цикл развития
Презентация на тему:Систематика, морфология, цикл развития, Trypanosoma
cruzi, Trypanosoma brucei rhodesiense, Trypanosoma
gambiense
Выполнила Студентка:
Дрыгина Глория Владимировна группа 202(2)
Проверил преподователь: Доцент Смирнова Светлана Николаевна
Систематика
Царство
Protista
Тип
Sarcomastigophora (
саркомастигофоры)
Подтип
Mastigophora ( Жгутиковые)
Класс
Zoomastigophora
Отряд
Kinetoplastida
Виды:
Trypanosoma cruzi, Trypanosoma
brucei rhodesiense
Трипоносомы
Трипаносомы (лат. Trypanosoma) — род паразитических
одноклеточных организмов из семейства трипаносоматид, которые
паразитируют на различных хозяевах и вызывают многие
заболевания как у людей (сонная болезнь, болезнь Чагаса), так и у
животных (случная болезнь лошадей). Естественным резервуаром
трипаносом в основном являются млекопитающие, переносчиком —
насекомые. Муха цеце является переносчиком Trypanosoma brucei —
возбудителя сонной болезни. Триатомовые клопы являются
переносчиками Trypanosoma cruzi — возбудителя болезни Чагаса.
Различные клеточные формы трипаносом
Для трипаносом характерно чередование клеточных форм:
эпимастиготной в кишечнике насекомого и трипомастиготной и
амастиготной в организме млекопитающих.
Морфология Трипоносомы
Тело продолговатое, узкое, имеет жгутики и ундулирующую мембрану.
Имеет заостренную с обеих сторон форму, Длина тела 17-28 мкм.
Митохондриальная ДНК трипаносом- кинепластная ДНК, состоит из
комплекса больших и малых колец.
Стадии, паразитирующие в человеке имеют один жгутик и ундулирующую
мембрану сбоку, а также кинепласт у основания жгутика.
Трипаносомы размножаются исключительно бесполым путём,
множественным делением (шизогония) и проходят более или менее
сложный цикл развития, связанный с полиморфизмом и переменой хозяев
(дигенетические виды, патогенные для теплокровных).
Развитие трипоносомы происходит в несколько стадий: критидиальная
стадия, трипаносомная стадия.
Строение Трипоносомы
Виды Трипоносмозов
Африканские трипаносомозы. Выделяют острый
родезийский трипаносомоз (восточно-африканская
сонная болезнь, возбудитель — Т. brucei подвид
rhodesiense) и хронический гамбийский трипаносомоз
(западно-африканская сонная болезнь, возбудитель —
Т. brucei подвид gambiense). Возбудители
морфологически и серологически идентичны. Видовая
идентификация возможна лишь по биологическим
(заражение восприимчивых животных и насекомыхпереносчиков) и биохимическим (сбраживание
углеводов) признакам.
Гамбийский трипаносомоз
Гамбийский трипаносомоз переносят мухи цеце glossina
palpalis и G. tachinoides, обитающие в зарослях по
берегам рек и озер. Природный резервуар возбудителя
— больной человек. С наибольшей частотой
заболевание регистрируют в пунктах, расположенных
около водоемов. Больные составляют 2-3% всей
заболеваемости в регионах, исключая эпидемические
вспышки болезни. Хроническое течение обусловливает
длительное пребывание больного среди здоровых лиц,
что повышает риск переноса возбудителя мухами.
Родезийский трипаносомоз
Родезийский трипаносомоз переносят мухи цеце G.
morsitans, G. pallipides и G. swynnertoni, обитающие в
саваннах Восточной Африки. Основной природный
резервуар — различные мелкие антилопы (газели
Томпсона, дукёры и др. ). Наиболее часто заражение
происходит при выпасе скота или охоте. Выделены пути
передачи от человека человеку и от человека
домашним животным.
Стадии Жизненного цикла
Трипоносомы
Эпимастиготы (критидиальная стадия). В форме эпимастигот трипаносомы
существуют в кишечнике насекомых-переносчиков. Эпимастиготы можно
получить, культивируя паразитов на искусственных средах. Клетки
вытянутые, жгутик начинается в передней части тела (близко от ядра),
ундулируюая мембрана не выражена.
Трипомастиготы (трипаносомная стадия) циркулируют в крови человека и
прочих чувствительных животных. Тело паразита удлинённое, жгутик
начинается в задней части тела, ундулирующая мембрана выражена
чётко. Исключение — Т. cruzi, образующая в организме человека
амастиготы (лейшманиальные формы). Клетки овальные, небольших
размеров, кинетопласт имеется, но жгутик отсутствует, либо есть только
его внутриклеточная часть. Следует отметить, что размеры всех
трипаносом превосходят размеры лейшманий, а кинетопласт и жгутик
зрелых форм расположены в задней части тела.
Виды стадий Жизненного цикла
Жизненный цикл
При кровососании трипомастиготы проникают в организм мух
цеце, превращаются в эпимастиготы и размножаются в кишечнике
и слюнных железах. Через несколько недель в организме
насекомого скапливаются дочерние популяции трипомастигот и
оно становится способным переносить их чувствительным
организмам.
Передачу возбудителя осуществляют исключительно мухи цеце.
Больные люди и иногда животные составляют природный
резервуар.
Американский трипаносомоз
Американский трипаносомоз (южноамериканский трипаносомоз, Шагаса-Круза болезнь)
— инфекция, вызываемая Trypanosoma cruzi; переносчики — клопы-хищнецы рода
triatoma (семейство reduviidae) — Т. dimidiala, Т. infestans и Т. megistus. Заболевание
протекает остро у детей и носит хронический характер у взрослых; характерны
лихорадка и осложнения со стороны ЖКТ и ССС.
Жизненный цикл
Напоминает цикл прочих трипаносом, критидиальную стадию паразит проходит в
организме переносчиков (эпимастиготы развиваются в средней кишке клопа-редувида).
Паразиты особенно распространены на Атлантическом побережье стран Вест-Индии и
Бразилии.
Основная особенность trypanosoma cruzi — отсутствие трипаносомальной стадии, для
размножения возбудитель обязательно должен проникнуть в клетки теплокровных и
образовать амастиготы.
Клопы переносят возбудителя при кровососании, при укусе клоп наносит достаточно
большое повреждение кожных покровов, обеспечивающее проникновение значительной
инфекционной дозы.
Влияние на организм человека
сопровождается лихорадкой, гепатоспленомегалией, лимфаденопатиями, отёками и
рецидивирующей сыпью.
Инфекция у новорождённых часто приводит к менингоэнцефалиту. Характерны поражения
миокарда и головного мозга. В нелеченых случаях смертность достигает 90%.
Хроническая форма характерна только для взрослых, обычно болевших в детстве. Проявляется
хронической деструкцией внутренних органов.
Наиболее частая форма — сердечно-сосудистая патология (аритмии, экстрасистолии),
выявляемая у 10% населения эндемичных сельских районов.
Реже встречается патология ЖКТ, обычно мегаколон (расширение части или всей ободочной
кишки с гипертрофией её стенки) и мегаэзофагус (увеличение нижней части пищевода).
Иногда могут преобладать проявления со стороны эндокринной (микседема) и нервной
(параличи) систем.
Сонная болезнь
Африканский трипаносомоз,
или сонная болезнь —
паразитическое заболевание
людей и животных. Его
вызывают простейшие,
трипаносомы Trypanosoma
brucei.
Действие на организм человека
Инкубационный период продолжается 2-3 недели. Для болезни
характерны паразитемия и диссеминированные поражения.
Через 2-3 дня на месте укуса мухи цеце иногда образуется изъязвляющаяся
папула (трипано-сомидный шанкр), но возможно и отсутствие каких-либо
значительных внешних поражений. Клинические проявления отсутствуют, но
паразит бурно размножается в месте проникновения и диссеминирует по
лимфатической системе в кровоток У некоторых пациентов можно наблюдать
регионарную лимфаденопатию, особенно шейных и затылочных
лимфатических узлов, где можно обнаружить скопления трипаносом (признак
Уинтерботтома) ( на рис. Представлен скопление трипаносом в тканях)
циркуляция возбудителя в кровотоке достигает своего пика через 2-3 нед и
вызывает развитие характерного симптомокомплекса. Пациенты испытывают
приступы неправильно интермиттирующей лихорадки с постоянно
ускоренным пульсом, болезненной лимфаде-нопатией, кожной сыпью и
головной болью. Возможны психические расстройства. Цикличность
проявлений опосредована элиминацией AT паразитов, вызвавших
предшествующий приступ, и появлением дочерних популяций с абсолютно
новыми поверхностными Аг. Установлено, что генетический аппарат
трипаносом кодирует вероятность появления 22 вариантоспецифических
поверхностных Аг у каждого штамма
Влияние паразита на ЦНС
Поражения, вызванные гамбийской трипаносомой,
развиваются медленно, и вовлечение ЦНС наблюдают по
истечении нескольких лет после начала заболевания.
Родезийская трипаносома вызывает прогрессирующую
болезнь с поражениями мозга и миокарда,
развивающимися уже через 3-6 нед после начала
заболевания. Характерны кома, судороги, острая
сердечная недостаточность и сильное истощение,
приводящие к смерти больного в течение 6-9 мес.
Лабораторная Диагностика
Чрезвычайно важно провести поясничную пункцию для выявления
трипаносом в спинномозговой жидкости (СМЖ) и наличия поражений ЦНС.
В начальной стадии заболевания возбудителя можно обнаружить в месте
укуса, в крови (родезийский тип) или шейных лимфатических узлах
(гамбийский тип).
Микроскопия. Обследованию подлежат кровь, биоптаты лимфатических
узлов и СМЖ. Концентрирование центрифугированием облегчает
обнаружение паразитов в крови и СМЖ. Следует помнить, что при
симптомах поражения ЦНС, кровь и лимфатические узлы трипаносом не
содержат. Готовят препараты методом толстой капли и мазки,
окрашенные по Райту или Романовскому-Гимзе (цитоплазма голубая, ядро
красное).
При отрицательном результате микроскопии исследуемый материал вводят
белым мышам или крысам (подкожно или внутримышечно). На 2-3 сут в
крови появляются паразиты.Возможно получение культур трипаносом на
искусственных средах, например агаре Нёллера
Лечение и профилактика
Лечение. В первой и второй стадиях (без поражений ЦНС)
назначают сурамин и пентадион, обеспечивающие хороший
клинический эффект. При поражениях ЦНС применяют
меларзопрол — токсичное соединение мышьяка, легко
проникающее через гематоэнцефалический барьер.
Эффективность лечения третьей стадии болезни значительно
ниже.
Профилактика включает профилактический приём лекарственных
препаратов, уничтожение мест выплода мух цеце (прибрежные
заросли) и отстрел инфицированных животных.
Спасибо за внимание!
CDC — Африканский трипаносомоз — Диагноз
Trypanosoma brucei ssp. в жидком мазке крови, окрашенном Гимза. Кредит: DPDx
Ранняя диагностика затруднена, потому что признаки и симптомы на первой стадии неспецифичны, а диагностические меры нечувствительны. Диагностика требует подтверждения присутствия паразита в любой жидкости организма. С т. Б. gambiense , может быть трудно обнаружить трипомастиготы в обычных мазках крови, поскольку уровни паразитемии обычно низкие и изменчивые.Классический подход к диагностике т. Б. gambiense заражение паразитом с помощью светового микроскопа в аспирате лимфатического узла (обычно из заднего шейного узла). Для крови могут использоваться методы концентрирования и серийные исследования (центрифугирование с последующим исследованием лейкоцитарной пленки, метод мини-анионообменного центрифугирования или метод центрифугирования микрогематокрита). С т. Б. rhodesiense , паразитемия обычно выше, чем у Т. b. gambiense и у пациентов с симптомами в крови обычно обнаруживаются паразиты.Паразит также может быть обнаружен в жидкости шанкра или аспиратах костного мозга.
Надежный серологический тест на T. b. rhodesiense недоступен, и микроскопическое обнаружение паразита является окончательным диагнозом.
Серологическое тестирование T. b. gambiense используется только для целей скрининга, и окончательный диагноз основывается на микроскопическом исследовании паразита. Недавно проведены экспресс-тесты на т. Б. gambiense были разработаны и внедрены для использования в полевых условиях в эндемичных странах: HAT Sero- K -SeT (Coris BioConcept, Gembloux, Бельгия) и SD Bioline HAT 1.0 (Стандартная диагностика, Йонгин, Южная Корея). Эти тесты больше подходят для пассивного скрининга и эпиднадзора в стационарных медицинских центрах в эндемичных странах, где часто отсутствует электричество и лабораторная инфраструктура.
Стадия для обоих Т. б. gambiense и T. b. rhodesiense (т.е. оценка неврологической инфекции) выполняется путем микроскопического исследования спинномозговой жидкости, собранной с помощью люмбальной пункции на влажном препарате, в поисках подвижных трипомастигот и лейкоцитов (WBC).Пациенты с пятью или менее лейкоцитами на микролитр и без трипомастигот считаются находящимися на первой стадии, а пациенты с более чем пятью лейкоцитами на микролитр или с трипомастиготами — на второй стадии. Исследование спинномозговой жидкости проводится после постановки паразитологического диагноза путем микроскопического исследования крови, аспиратов лимфатических узлов, шанкра или костного мозга или при наличии признаков инфекции, оправдывающих люмбальную пункцию (например, клинические признаки и симптомы сонной болезни или сильное серологическое подозрение).Изоляция паразита путем прививки крыс или мышей является чувствительным методом диагностики, но его использование ограничено т. Б. rhodesiense .
Подробнее о: Ресурсы для медицинских работников: Диагностика
Imaging Африканские трипаносомы
Parasite Immunol. 2013 сен; 35 (9-10): 283–294.
L MacLean
1 Центр иммунологии и инфекций, Департамент биологии / Медицинская школа Халл-Йорка, Йоркский университет, Хеслингтон, Йорк, Великобритания
E Myburgh
2 Wellcome Trust Центр молекулярной паразитологии, Институт Института инфекций, иммунитета и воспаления, Медицинский, ветеринарный колледж и естественные науки, Университет Глазго, Глазго, Великобритания
Дж. Роджерс
3 Институт инфекции, иммунитета и воспаления, Колледж медицинских, ветеринарных и биологических наук, Университет of Glasgow, Glasgow, UK
HP Price
1 Центр иммунологии и инфекций, Департамент биологии / Медицинская школа Халл-Йорка, Йоркский университет, Хеслингтон, Йорк, Великобритания
1 Центр иммунологии и инфекций, Департамент биологии / Медицинская школа Халл-Йорка, Йоркский университет, Хеслингтон, Йорк, Великобритания
2 Wellcome Trust Center for Molecular Parasito logy, Институт инфекции, иммунитета и воспаления, Колледж медицинских, ветеринарных и биологических наук, Университет Глазго, Глазго, Великобритания
3 Институт инфекций, иммунитета и воспаления, Колледж медицинских, ветеринарных и биологических наук, Университет Глазго, Глазго, Великобритания
Для корреспонденции: Лорна Маклин, Центр иммунологии и инфекций, Департамент биологии / Медицинская школа Халл-Йорка, Йоркский университет, Хеслингтон, Йорк, YO10 5YW, Великобритания, (электронная почта: [email protected]).Текущий адрес: Лорна Маклин, Отдел по обнаружению наркотиков, Колледж наук о жизни, Университет Данди Данди, DD1 5EH, Великобритания
Получено 29 апреля 2013 г .; Принято 18 июня 2013 г.
Copyright © 2013 Авторы. Parasite Immunology, опубликованная John Wiley & Sons Ltd. Это статья в открытом доступе в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.
Эта статья цитируется в других статьях в PMC.- Дополнительные материалы
Фильм S1: Форма кровотока (BSF) T. b. brucei в крови человека.
GUID: B1F85BF1-E6A4-49E6-9D7E-59B42AB01045
Movie S2: Анализ FRAP плазматической мембраны Leishmania HASPB18-GFP.
GUID: 54E6295E-10E1-4AAE-AF0D-E6F479F90E85
Movie S3: FRAP-анализ целых клеток тела Leishmania HASPB18-GFP.
GUID: B4C16F3D-5C86-44A8-9009-93C5085BD8F1
Abstract
Trypanosoma brucei — внеклеточные кинетопластидные паразиты, передающиеся кровососущей мухой цеце. Они ответственны за смертельное заболевание африканский трипаносомоз человека (HAT), также известное как сонная болезнь. На поздней стадии инфекции трипаносомы проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и проникают в центральную нервную систему (ЦНС), что при отсутствии лечения неизменно приводит к коме и смерти.Вакцины нет, и текущая химиотерапия HAT на поздних стадиях состоит либо из меларсопрола, который является высокотоксичным, вызывая до 8% смертей, либо из комбинированной терапии нифуртимоксом и эфлорнитином (NECT), которая является дорогостоящей и трудной в применении. Таким образом, существует острая необходимость в выявлении новых кандидатов на лекарство от HAT на поздней стадии. Здесь мы рассмотрим, как современные инструменты визуализации, от флуоресцентной конфокальной микроскопии живых иммобилизованных клеток в культуре до визуализации всего животного, позволяют получить представление о T.brucei биология, взаимодействие паразит-хозяин, инвазия трипаносом в ЦНС и прогрессирование заболевания. Мы также рассматриваем, как инструменты визуализации могут быть использованы для целей скрининга кандидатов на лекарственные препараты, которые могут привести к новым химиотерапевтическим препаратам.
Ключевые слова: модель животных , электронная микроскопия, in vivo, визуализация , интерференция РНК, инструменты и методы, Trypanosoma spp
Введение
Африканский трипаносомоз человека (HAT) вызывается инфекцией африканскими трипаносомами ( Trypanosoma brucei ), которые передаются кроветворной мухой цеце ( Glossina spp.). Два подвида являются инфекционными для человека: Trypanosoma brucei gambiense , которая присутствует в Западной и Центральной Африке, и Trypanosoma brucei rhodesiense , которая встречается в Восточной и Южной Африке. Африканский трипаносомоз человека характеризуется двумя стадиями: ранней, или гемолимфатической, стадией, когда трипаносомы размножаются в месте укуса, перемещаются в местные лимфатические узлы и вызывают инфекцию в кровотоке, и поздней, или менингоэнцефалитической стадией, на которой трипаносомы проникают через гематоэнцефалический барьер ( BBB) вторгается в центральную нервную систему (ЦНС).Эта поздняя стадия неизменно приводит к коме и смерти, если ее не лечить. 1 , 2 . Африканский трипаносомоз человека оказал серьезное социальное и экономическое воздействие на страны Африки к югу от Сахары: около 70 миллионов человек подвергаются риску заражения. Инвестиции в стратегии борьбы за последнее десятилетие привели к значительному сокращению зарегистрированных случаев HAT: в 2009 г. в ВОЗ было зарегистрировано <10 000 случаев, впервые за 50 лет 3 . Эта тенденция сохранялась в 2010 и 2011 годах, и достижение цели дорожной карты ВОЗ по ликвидации африканского трипаносомоза (<1 случай на 10 000 населения) прогнозируется на 2020 год. 4 .Однако исторически HAT характеризовалась эпизодическими эпидемиями и возрождениями; поэтому меры контроля, такие как наблюдение, ранняя диагностика и лечение домашних животных, для сокращения резервуаров T. brucei и борьба с мухой цеце, должны быть продолжены для предотвращения нового возрождения HAT. В 2009 году 76% зарегистрированных случаев HAT были обнаружены в Демократической Республике Конго (ДРК) 5 . В ДРК и других регионах, переживающих войну и гражданские беспорядки, точное сообщение о HAT проблематично, и это может привести к значительной недооценке распространенности заболевания. 6 .Необходимо продолжить исследовательские усилия по разработке более безопасной и эффективной химиотерапии для борьбы с этим заболеванием. Поздняя стадия Т. б. rhodesiense HAT в настоящее время лечат высокотоксичным меларсопролом, вызывая 8,4% смертей при новом 10-дневном режиме 7 . Поздняя стадия Т. б. gambiense в настоящее время преимущественно лечится комбинированной терапией нифуртимоксом и эфлорнитином (NECT), более безопасным вариантом 8 , но дорогим и сложным в применении 9 .Кроме того, необходимо усовершенствовать диагностику поздних стадий, поскольку в настоящее время для микроскопического анализа спинномозговой жидкости требуется инвазивная люмбальная пункция, и нет единого мнения по критериям, определяющим позднюю стадию инфекции. Клинические особенности, диагностика и лечение HAT недавно были рассмотрены 10 .
Помимо своей клинической значимости, африканские трипаносомы также являются мощным модельным организмом для исследований биологии эукариотических клеток, включая механизмы клеточного деления, внутриклеточного переноса и биогенеза органелл 11 — 14 .Особый интерес представляет высокоподвижный жгутик, который состоит из аксонемных микротрубочек (9 + 2 дублетная организация), отходящих от базального тела, покрытого мембраной 15 — 17 . Жгутик очень похож по строению и белковому составу на первичные реснички других эукариот. Этот обзор будет посвящен тому, как технология визуализации продвинула наше понимание африканских трипаносом как модельной системы, так и важного патогена для человека.
In vitro Визуализация африканских трипаносомМорфология и ультраструктура африканских трипаносом были тщательно изучены с помощью классической световой микроскопии, просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).Эти исследования показали, что T. brucei представляют собой изогнутые удлиненные клетки длиной от 12 до 35 мкм и шириной от 1,5 до 3,5 мкм в зависимости от стадии жизненного цикла. 18 . Трипаносомы и другие виды кинетопластид характеризуются дискообразным кинетопластом, сетью митохондриальной кольцевой ДНК внутри одной большой митохондрии. Рядом с кинетопластом находится карман жгутика, инвагинация плазматической мембраны, которая является основным местом экзо- и эндоцитоза из-за ограничений, налагаемых плотно упакованными субпелликулярными микротрубочками 19 , 20 .Одиночный подвижный жгутик берет начало в базальном теле и выходит из жгутикового кармана, простирающегося кпереди на всю длину трипаносомы. Фильм S1 показывает движение формы кровотока (BSF) T. brucei , инкубированной с человеческой кровью. Архитектура трипаносомных клеток рассмотрена в работе. 21, и протоколы визуализации T. brucei были описаны в работе. 22.
В течение своего жизненного цикла T. brucei чередует среду обитания между млекопитающим-хозяином и переносчиком мухи цеце.Это требует множества изменений в развитии, которые точно запрограммированы и взаимосвязаны, включая изменения размера и формы, поверхностной оболочки, развития митохондрий и положения кинетопластов 21 , 23 , 24 . Иммунофлуоресцентный анализ с использованием специфичных для стадии клеточного цикла маркеров цитоскелета позволил получить представление о процессе дифференцировки от стадии проциклических трипомастигот в средней кишке мухи цеце до стадии эпимастиготы слюнных желез.Это требует асимметричного цикла клеточного деления, который приводит к генерации одной длинной и одной короткой дочерних клеток с полным ремоделированием субпелликулярных микротрубочек перед делением. Короткий эпимастигот способен размножаться и прикрепляться к эпителию при достижении слюнных желез, тогда как длинный эпимастигот, по-видимому, является тупиковой морфологической стадией 25 , 26 . Особый интерес представляет механизм, с помощью которого T. brucei уклоняется от иммунного ответа млекопитающего-хозяина путем переключения их оболочки с вариабельным поверхностным гликопротеином (VSG) с помощью процесса, известного как антигенная вариация, что позволяет им поддерживать хроническую инфекцию 27 — 30 .Эта умная стратегия уклонения серьезно помешала разработке защитной вакцины против HAT 31 .
Морфологические различия между стадиями паразита могут быть четко продемонстрированы с помощью электронной микроскопии (ЭМ). Сканирующие электронные микрофотографии млекопитающих BSF T. b. brucei и более удлиненная проциклическая форма (ПКФ), характерная для кишечной формы мухи цеце, показаны на 32 . Электронную микроскопию можно использовать для изучения морфологического фенотипа после молекулярных манипуляций, таких как РНК-интерференция (РНКи) и делеция гена путем гомологичной рекомбинации.Это проиллюстрировано на микрофотографиях, сделанных в просвечивающем электронном микроскопе T. b. brucei BSF клетки из Lister 427 дикого типа 33 (b слева 34 ) и мутантной линии RNAi после индуцированного тетрациклином нокдауна ARF1 (фактор ADP-рибозилирования 1) в течение 24 часов (b справа, H. Цена неопубликованные данные). Экспрессия гена ARF1 важна для жизнеспособности кровотока T. brucei , и ТЕМ была использована для демонстрации того, что паразиты, лишенные белка ARF1, демонстрируют ряд морфологических аномалий до гибели клетки, включая увеличенный карман жгутика, множественные ядра и внутренние жгутики 35 .Совсем недавно трехмерная визуализация с помощью томографии под электронным микроскопом (трехмерные реконструкции, основанные на последовательных электронных микрофотографиях сечения) предоставила обширную информацию о ключевых процессах и структурах органелл, таких как механизмы, управляющие митозом и цитокинезом (см. Ссылку 36). , структура жгутика и понимание его двухспирального движения 37 , 38 , цикл дупликации кинетопластов 39 и клеточная архитектура кармана жгутика и базального тела 40 .
In vitro Визуализация африканских трипаносом. (а) Сканирующие электронные микрофотографии формы кровотока (BSF) Trypanosoma brucei brucei , штамм Lister 427 дикого типа (вверху) и проциклической формы (PCF) T. b. brucei штамм EATRO 1125, (внизу). Пруток 2 мкм. Эти изображения были первоначально опубликованы в Ref. 32. (b) Микрофотографии, сделанные в просвечивающем электронном микроскопе T. b. brucei BSF паразиты дикого типа (слева) (первоначально опубликовано в ссылке 34) и после индуцированного тетрациклином нокдауна ARF1 в течение 24 часов (справа).FL, жгутик; FP, карман для жгутика; N — ядро; К — кинетопласт; Г.А., Аппарат Гольджи. Пруток 1 мкм. (c) T. b. brucei BSF паразитов зондировали с помощью анти-α-тубулина (зеленый) и определяли с помощью DAPI. Дикий тип (вверху) и последующий нокдаун РНКи, индуцируемой тетрациклином, малой GTPase ARL2 (внизу). Пруток 5 мкм. (d) Иммунофлуоресцентный анализ T. b. brucei BSF для определения субклеточной локализации ARL6. На этих изображениях показана делящаяся клетка (одно ядро и два кинетопласта), зондированная анти-TbARL6 (красный) и анти-альфа-тубулин (зеленый), содержащая DAPI (синий).Пруток 5 мкм. (e) Незаконный оборот липофильного красителя FM4-64 в T. b. brucei PCF. Клетки промывали PBS и обрабатывали 40 мкМ FM4-64 (Life Technologies Ltd, Пейсли, Великобритания) перед иммобилизацией CyGEL. Образцы визуализировали с помощью конфокальной микроскопии, при этом FM4-64 возбуждали на длине волны 543 нм, а излучение собирали через фильтр с длинным проходом 560 нм. Краситель был виден на плазматической мембране и в кармане жгутика в момент времени 0. К 15 мин в эндосомной системе появился сигнал, достигающий терминальной лизосомы к 90 мин.Эти изображения были первоначально опубликованы в Ref. 48. (f) Анализ трансгенных T. brucei , экспрессирующих флуоресцентные белки. Анализ проточной цитометрии и визуализация с помощью конфокальной микроскопии T. b. brucei GVR35, экспрессирующий eGFP и поддерживаемый DAPI (левая панель). Девяносто девять процентов клеток экспрессируют высокие уровни eGFP. Анализ проточной цитометрии и визуализация с помощью конфокальной микроскопии T. b. rhodesiense IL1852, экспрессирующий pHD1034 td Tomato, полученный с помощью DAPI (правая панель).98% клеток экспрессируют высокий уровень tdTomato. Трансформанты отбирали с использованием пуромицина 0,1–1 мкг / мл. Пруток 5 мкм. (g) Визуализация трансмиграция гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) T. brucei in vitro . Трансгенные флуоресцентные паразиты, пересекающие ГЭБ в модели in vitro с трансвеллером [монослой иммортализованных эндотелиальных клеток микрососудов человеческого мозга (HBMEC)] могут быть захвачены в режиме реального времени с помощью многофотонной микроскопии с использованием коллагенового геля для закупорки базолатеральной камеры.
Эпифлуоресцентная микроскопия и конфокальная микроскопия в настоящее время обычно используются для визуализации трансгенных паразитов, экспрессирующих флуоресцентные репортерные белки (живые, иммобилизованные или фиксированные) и клеток, меченных специфическими антителами.Эти инструменты очень информативны для определения фенотипа после делеции РНКи или гена, а также для исследований субклеточной локализации. Анализ DAPI-окрашенных клеток T. brucei можно использовать в сочетании с проточной цитометрией и SEM, чтобы определить, на какой стадии специфические белки играют роль в клеточном цикле 41 , 42 . (c) показаны конфокальные изображения ARL2 дикого типа и ARL2 (ADP-подобный фактору рибозилирования 2) RNAi BSF T. brucei , меченный DAPI и антителом против α-тубулина (H.Цена, неопубликованные данные). Данные иммунофлуоресценции и SEM показали, что нокдаун малой GTPase ARL2 вызывает дефект цитокинеза, приводящий к многоядерным, мультифлагеллированным клеткам 43 . Методы непрямой иммунофлуоресценции и трансмиссионной иммуноэлектронной микроскопии были использованы для обнаружения субклеточной локализации другой малой GTPase ARL6 в BSF T. b. brucei (d; H. Price, неопубликованные данные) 44 . У человека ARL6 кодируется BBS3 , одним из 17 генов, участвующих в генетическом заболевании синдрома Барде-Бидла.ARL6 связывается непосредственно с белковым комплексом BBSome и необходим для рекрутирования этого комплекса на первичные реснички 45 . Неожиданно визуальные исследования у T. brucei показали, что ARL6 у паразита не связан со жгутиком, а вместо этого располагается на электронно-плотных пузырьках по всему телу клетки паразита 44 .
Визуализация живых клеток
Визуализация живых клеток — бесценный инструмент для анализа фундаментальных процессов в реальном времени, включая молекулярный трафик.Теперь можно подвергать живых кинетопластидных паразитов передовым методам микроскопии, таким как восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) и резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) для анализа молекулярной диффузии и образования комплексов с белками 46 . Разработка методов визуализации в реальном времени позволила изучать высокодинамичные процессы в паразите в режиме реального времени, такие как внутрижгутиковый транспорт (IFT), специфический для жгутика / ресничек механизм передачи молекул к и от дистального конца этой органеллы в определенных пределах. частицы.FRAP и микроскопия с вращающимся диском недавно были использованы для измерения скорости движения IFT-частиц в жгутиках проциклических клеток T. brucei , экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP) с меткой IFT52 47 . Это элегантное исследование продемонстрировало, что движение IFT чрезвычайно быстрое в трипаносомных жгутиках, и показало наличие по крайней мере двух независимых популяций антероградных поездов IFT, путешествующих на одиночных жгутиках, с общими событиями слияния между ними. Математическое моделирование с использованием этих данных предсказало, что только 45% пула белков IFT активно используется в жгутичном транспорте 47 , указывая на то, что эти белки могут иметь другие функции в клетке.
Одна очевидная проблема с живым изображением трипаносом состоит в том, что клетки имеют очень подвижные жгутики, и для большинства типов изображений они должны быть прочно иммобилизованы без ущерба для жизнеспособности. Недавно мы проверили новый экспресс-метод иммобилизации паразитов T. brucei и Leishmania с использованием термообратимого геля CyGEL (Biostatus Ltd, Шепшед, Великобритания) 48 . CyGEL является жидким, когда ледяной, но образует твердую матрицу при нагревании до 15 ° C и выше. Leishmania major и PCF T. b. brucei сохранял высокий уровень жизнеспособности клеток (> 95%) после 2-часовой инкубации в CyGEL. К сожалению, иммобилизация BSF T. brucei в CyGEL вызвала 90% гибели в течение 1 часа 48 , подтверждая другие исследования, которые показали, что подвижность важна для жизнеспособности BSF T. brucei 13 . Однако этот метод позволяет воспроизводить изображения живых клеток в L. major и PCF T.brucei, , тем самым облегчая захват в реальном времени фундаментальных клеточных процессов эукариот на уровне отдельных клеток.
Мы использовали визуализацию живых клеток и анализ FRAP в родственном кинетопластиде Leishmania для изучения пути экспорта гидрофильного ацилированного поверхностного белка B (HASPB). Гидрофильный ацилированный поверхностный белок B экспрессируется только на стадиях инфекционного паразита 49 , 50 и вместе с небольшим гидрофильным белком, ассоциированным с эндоплазматическим ретикулумом (SHERP), важен для метациклогенеза в векторе песчаных мух 51 .Гидрофильный ацилированный поверхностный белок B также иммуногенен и является многообещающим кандидатом в вакцины 52 , 53 . Гидрофильный ацилированный поверхностный белок B представляет собой «неклассически» секретируемый белок, требующий двойного N-концевого ацилирования для доставки к плазматической мембране 54 . Чтобы обратиться к задействованному механизму, мы использовали FRAP для исследования латеральной диффузии репортерного слитого белка HASPB18-GFP, который обнаруживается на теле паразита, плазматической мембране, кармане жгутика и жгутике.Небольшие интересующие области (ROI) внутри плазматической мембраны были фотообесцвечены, а скорость подвижности и процент восстановления использовались в качестве показателя скорости движения и процента подвижных молекул по сравнению с неподвижными. Кроме того, соответствующая потеря флуоресценции, вызванная фотообесцвечиванием (FLIP) в дополнительных областях за пределами обесцвеченной области интереса, позволила проанализировать направление движения HASPB18-GFP. FRAP небольшой области интереса на плазматической мембране тела клетки показал восстановление через 6 · 4 ± 4 · 8 с, а соответствующие FLIP, обнаруженные с обеих сторон области интереса, показали, что HASPB18-GFP может совершать двунаправленное движение внутри внутреннего листка мембраны [ Фильм S2; 55 ].Интересно, что FRAP над основным телом клетки (оставляя внешнюю часть жгутика неотбеленной) выявляет быстрое восстановление флуоресценции (6 с) в короткой области жгутика внутри жгутикового кармана, в то время как флуоресценция в плазматической мембране не восстанавливается через 37 секунд. мин после фотообесцвечивания. Это предполагает наличие диффузионного барьера в основании жгутика Leishmania , который ограничивает перемещение белков жгутиков к мембране тела клетки [Movie S3; 55 ].Иммобилизация паразитов CyGEL в сочетании с анализом FRAP будет ценным инструментом для изучения этого барьера и лучшего понимания механизма жгутикового транспорта у T. brucei и Leishmania .
CyGEL может также действовать как система контролируемой доставки для ряда флуоресцентных зондов для PCF T. brucei и L. major . К ним относятся интеркалирующий агент иодид пропидия (максимумы возбуждения / испускания: 535/617 нм) для оценки жизнеспособности клеток и субклеточные маркеры Lysotracker, Mitotracker и FM4-64 [N- (3-триэтиламмонийпропил) -4- (6- (4- ( диэтиламино) фенил) гексатриенил) пиридиний дибромид] 48 900 48.Мы отслеживали поглощение липофильного стирилового красителя FM4-64 (максимумы возбуждения / излучения: 515/640 нм; Life Technologies, Пейсли, Великобритания) PCF T. brucei . Клетки иммобилизовали в CyGEL и инкубировали с 40 мкМ FM4-64 в течение 90 минут. Изображение Trypanosoma brucei получали с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM510 Meta. За это время краситель перемещается из мембраны клеточного тела и жгутикового кармана в лизосому через эндосомную систему (e; 48 ).
Многофотонная микроскопия особенно полезна для визуализации живых клеток, поскольку лазеры с более длинными волнами и низкоэнергетическими возбуждающими лазерами менее вредны, позволяя визуализировать клетки в течение более длительных периодов времени, чем при конфокальной микроскопии.Обычно используемый в 2-фотонном режиме, этот подход имеет значительное преимущество, так как он возбуждает флуорофоры только в фокусе возбуждающего луча, что исключает необходимость наличия точечного отверстия и повышает эффективность мощности возбуждения / излучения 56 . Эти преимущества в сочетании с уменьшенным светорассеянием и адсорбцией возбуждающего света в ближнем инфракрасном спектре улучшают визуализацию на глубине в сложных (например, органоидных) культурах 56 . Сочетание этой передовой технологии визуализации с поколением трансгенных флуоресцентных ламп T.brucei и in vitro Модель BBB 57 , 58 позволяет нам решить проблему имитации и исследования вторжения в ЦНС африканскими трипаносомами in vitro , критического события при болезни HAT. Мало что известно о механизме инвазии трипаносом в ЦНС. Доступ к посмертным тканям головного мозга человека очень ограничен; Таким образом, большая часть работы в этой области была проведена с моделями мышей и исследований in vitro, исследований.ГЭБ состоит из эндотелиальных клеток, выстилающих микрососуды головного мозга, окруженных базальной пластинкой и периваскулярными концами астроцитов. Эндотелиальные клетки микрососудов головного мозга (BMEC) образуют более сложные плотные контакты, чем эндотелиальные клетки в периферических тканях, тем самым ограничивая движение даже небольших молекул 59 . Считается, что факторы паразита и хозяина влияют на целостность ГЭБ. На основе исследований с использованием модели in vitro BBB было предположено, что бруципаин, цистеиновая протеаза трипаносомы, индуцирует сигналы активации кальция в BMEC через рецепторы, активируемые протеазой (PAR), тем самым вызывая дисфункцию эндотелиального барьера мозга, которая делает возможной трансмиграцию трипаносомы BBB 58 .
Возможно использование стабильно трансфицированных T. brucei 60 как инструмент для изучения трансмиграции T. brucei BBB в реальном времени. Мы использовали конструкции ДНК на основе плазмидного вектора pHD1034 61 , 62 (который интегрируется в геном паразита ниже промотора рибосомной РНК), чтобы получить трансгенные линии, конститутивно экспрессирующие флуоресцентные белки на всех стадиях жизненного цикла паразита. . Используя эффективный протокол трансфекции нуклеофекции AMAXA 63 , мы получили T.б. brucei GVR35 (штамм, использованный в модели HAT мыши на поздней стадии 64 ), экспрессирующий eGFP (максимумы возбуждения / эмиссии: 488/507 нм) и Т. b. rhodesiense IL1852 (первоначально выделенный из спинномозговой жидкости пациента в Кении), экспрессирующий pHD1034 tdTomato (максимумы возбуждения / эмиссии: 554/581 нм) (f; Л. Маклин, неопубликованные данные; плазмида pHD1034, подарок З. Макки, Вирджиния Tech, США). Текущая работа включает инкубацию этих флуоресцентных паразитов в кровяной части модели трансвелла BBB (состоящей из монослоя иммортализованного BMEC человека, подаренного К.С. Ким, Д. Граб, Университет Джона Хопкинса, США), добавление коллагенового геля для закупоривания базолатеральной камеры и визуализация трансмиграции паразитов в реальном времени с использованием многофотонной микроскопии (g). Создание таких систем моделей in vitro важно для понимания этого малоизученного, но критического события HAT, ведущего к заболеваемости и смертности.
Получение изображений in situ трансгенных линий T. brucei , экспрессирующих флуоресцентные белки, стало ценным инструментом для изучения развития паразита в векторе мухи цеце.Исследования на мухах, коинфицированных двумя линиями паразитов, экспрессирующими либо GFP, либо красный флуоресцентный белок, показали, что субпопуляция желтых гибридов продуцируется в слюнных железах вектора. Это предоставило первое свидетельство, показывающее сайт, на котором происходит генетический обмен T. brucei , знание, имеющее прямое отношение к нашему пониманию популяционной генетики паразита 65 , 66 .
In vivo Африканская визуализация трипаносомХотя модели in vitro являются бесценным инструментом, необходимы исследования in vivo , чтобы получить представление о взаимодействии паразита и хозяина и раскрыть детали механизмов, задействованных в T.brucei Инвазия ЦНС и последующее прогрессирование заболевания. Данные, полученные на моделях мышей HAT, показывают, что нейровоспалительный ответ хозяина играет роль в определении входа трипаносомы в ЦНС. В г.р. brucei -инфицированных мышей, IFN-γ, как было показано, облегчает пересечение Т-клетками и паразитами glia limitans (базальная мембрана), и паразиты были захвачены между двумя наборами базальных мембран в рецепторе IFN-γ или IFN-γ. –Дефицитные мыши 67 . Кроме того, наша работа по патогенезу HAT в Уганде показала, что высокие уровни системного IFN-γ у пациентов были связаны с повышением тяжести заболевания 68 .В недавнем исследовании использовалась магнитно-резонансная томография (МРТ) с контрастным усилением, чтобы показать, что целостность ГЭБ нарушена во время поздней стадии трипаносомоза на модели мышей, и это не связано с наличием тяжелой нейровоспалительной реакции 69 . До этого момента влияние инфекции трипаносомами на целостность ГЭБ оставалось неоднозначным с одним исследованием на крысиной модели инфекции на поздней стадии, не обнаружившей ни потери белков плотного соединения occludin или zona occludens-1, ни утечки альбумина в мозг 70 .Напротив, второе исследование обнаружило значительную и прогрессирующую утечку ГЭБ, продемонстрированную присутствием флуоресцентного красителя в паренхиме мозга после периферической внутривенной инъекции 71 . МРТ имеет несколько преимуществ по сравнению с этими более традиционными гистологическими или биохимическими методами. Например, МРТ позволяет визуализировать весь мозг и может идентифицировать определенные области измененной целостности ГЭБ. Кроме того, поскольку процесс проводится in vivo , это исключает возникновение артефактов, которые могут возникнуть после смерти животного.Однако, возможно, самым большим преимуществом МРТ является способность метода контролировать целостность барьера у одного животного в течение заранее определенного периода времени при инфекции или лечении. Эта методология была успешно применена для демонстрации быстрого восстановления функции ГЭБ после лечебного курса новой пероральной рецептуры трипаноцидного препарата меларсопрол 72 . Поскольку МРТ показала значительное снижение целостности ГЭБ после трипаносомной инфекции, было бы логично предположить, что лекарства на ранних стадиях могут проникать в ЦНС и эффективно лечить болезнь на поздних стадиях.К сожалению, это не так, поскольку, хотя лечение препаратами на ранних стадиях действительно снижает количество паразитов в головном мозге (Дж. Роджерс, неопубликованные данные), после лечения сохраняется популяция паразитов. Комбинируя МРТ с современными методами микроскопии, подробно описанными в этом обзоре, можно определить области в ЦНС, в которых находится эта остаточная популяция, и выбрать эти области в качестве конкретных областей интереса при анализе МРТ. Кроме того, отслеживая трансмиграцию паразита в ЦНС, можно определить, является ли утечка ГЭБ, связанная с трипаносомными инфекциями, прямым продуктом прохождения трипаносомами барьера или продуктом продолжающейся периферической воспалительной реакции.
На данный момент имеется мало данных о маршруте первичной инвазии T. brucei в ЦНС, а также о последовательном перемещении и поддержании паразитов в головном мозге по мере прогрессирования заболевания. В предыдущем всестороннем морфологическом исследовании экспериментального церебрального трипаносомоза 73 была проанализирована гистопатология серийных срезов мозга мышей от животных, инфицированных T. b. brucei LUMP 227 в течение 1–9 недель с использованием окрашивания гематоксилином и эозином. Иммунофлуоресценцию также проводили на замороженных срезах мозга, где паразитов метили антитрипаносомными антителами (против антигенов LUMP227) и выявляли вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцеином.Гистопатология показала, что паразиты впервые обнаруживаются в сосудистых сплетениях (латеральных и четвертых) на 3–4 неделях, в основном в интерстиции в просвете и стенках сосудов, а небольшое количество паразитов обнаруживается в мозговых оболочках обычно на 6 неделе. Путем иммунофлуоресценции паразиты были обнаружены несколько раньше в сосудистых сплетениях со 2-й недели и в мозговых оболочках с 4-й недели. В запущенных случаях большое количество паразитов обнаруживалось в сосудистых сплетениях, в периваскулярных пространствах и иногда в белом веществе.Полтера и др. . поэтому предположили, что путь паразитарной инвазии в мозг может быть путем миграции из сосудистого компартмента в интерстиции сосудистого сплетения, чему способствует повышенная проницаемость сосудов сосудистого сплетения по сравнению с церебральными сосудами 74 , с последующей инвазией дополнительных структур мозга после инициирование местной воспалительной реакции в сосудистом сплетении.
Теперь можно использовать трансгенный флуоресцентный T.brucei в сочетании с цельной маркировкой срезов толстых тканей (100–200 мкм), вырезанных с помощью вибрационного лезвия (вибратома) и конфокальной микроскопии, в качестве чувствительного метода обнаружения T. brucei в головном мозге. Клоны GVR35 eGFP сначала оценивали с помощью проточной цитометрии для количественной оценки уровня флуоресценции. В лучшем клоне 99% популяции GVR35 eGFP экспрессировали высокий уровень eGFP (f), и после установления инфекции в течение 28 дней паразиты GVR35 eGFP были обнаружены во влажной пленке крови с помощью флуоресцентной микроскопии (J.Роджерс, неопубликованные данные). Выраженность неврологического ответа на Т . brucei определяли по шкале невропатологии от 0 до 4, как описано ранее 75 . GVR35 дикого типа и трансгенные паразиты eGFP продемонстрировали сопоставимые уровни невропатологии на 7–28 дни после инфицирования, причем оба они показали увеличение со временем и умеренный менингит с некоторым периваскулярным наложением манжет на 28 день (a; J. Rodgers, неопубликованные данные). Следовательно, трансгенная линия является действенным инструментом для анализа инфекции ЦНС.Паразитарную нагрузку определяли во всем мозге с помощью количественной ПЦР в реальном времени, как описано ранее 72 , путем амплификации гена парафлагеллярной палочки ( PFR ) 2, который специфичен для кинетопластид. Аналогичные тенденции увеличения количества паразитов с течением времени были обнаружены после заражения линиями паразитов GVR35 дикого типа и экспрессирующими eGFP (b; Дж. Роджерс, неопубликованные данные).
Обнаружение Trypanosoma brucei brucei GVR35 eGFP в центральной нервной системе (ЦНС). т. Б. brucei , экспрессирующий GVR35 eGFP, пассировали через самку мыши CD-1 путем внутрибрюшинной инокуляции 1 × 10 5 паразитов в среде HMI-9. На 10 день после инфицирования трипаносомы собирали и 4 × 10 4 паразитов пассировали через вторую мышь. Через 28 дней у мыши обескровливали сердечную пункцию и вырезали мозг [все экспериментов in vivo были разрешены в Соединенном Королевстве в соответствии с Законом о животных (научные процедуры) 1986 года и одобрены Комитетом по этике Университета Глазго].(a) Графическое изображение степени невропатологии в течение 7–28 дней после инфицирования T. b. brucei GVR35 дикого типа (серый) и трансгенных паразитов eGFP (зеленый). Тяжесть неврологической реакции на инфекцию T. brucei определяли по шкале невропатологии от 0 до 4. Вкратце, исследовали окрашенные гематоксилином и эозином срезы в области мозга гиппокампа. Нормальный мозг классифицировался как степень 0, легкий менингит как степень 1, умеренный менингит с некоторыми периваскулярными наручниками как степень 2, более тяжелый менингит и периваскулярные наручники с некоторыми воспалительными клетками в нейропиле как степень 3 и тяжелый менингоэнцефалит с воспалительными клетками по всей паренхиме как степень тяжести. 4 класс.(Прямоугольники представляют средние значения, а усы — стандартную ошибку.) (b) Графическое изображение паразитарной нагрузки в головном мозге мышей в течение 7–28 дней после заражения T. b. brucei GVR35 дикого типа (серый) и трансгенных паразитов eGFP (зеленый). Паразитарная нагрузка определялась методом Taqman-PCR для обнаружения гена парафлагеллярной палочки T. brucei ( PFR ) 2 с использованием всего мозга. (c) Конфокальный микроскопический анализ целых срезов мозга на 28 день после инфицирования.После фиксации в 0,4% параформальдегиде весь мозг помещали в 8% агарозу в PBS и получали аксиальные срезы (толщиной 200 мкм) с использованием вибратома Leica VT 1000S. Срезы тканей блокировали в 5% козьей сыворотке / 0,15% Triton X-100 / PBS в течение 60 мин, а затем инкубировали с первичными антителами, мышиным антигладким мышечным актином (Sigma-Aldrich Co Ltd) для обнаружения сосудистой сети и кроличьими антинейрофиламентами 200 ( Sigma-Aldrich) в разведении 1: 500 в течение 24 ч. Срезы промывали 0 · 15% Triton PBS × 3 и оставляли на ночь в промывочном буфере при 4 ° C.Вторичные антитела козьего антимышиного Alexa 594 (розовые) и козлиных антикроличьих Alexa 488 (зеленые) добавляли в разведении 1: 500 и инкубировали в течение 24 часов. Срезы промывали, как указано выше, и блокировали в 5% кроличьей сыворотке / 0,15% Triton X-100 / PBS в течение 60 мин, затем инкубировали с кроличьим антизеленым флуоресцентным белком (GFP) Alexa 647 (красный) при разведении 1: 500 ( Life Technologies) на 24 часа. Срезы снова промывали, как указано выше, фиксировали в 4% PFA в течение 15 минут при комнатной температуре и трижды промывали в течение 30 минут. Срезы постепенно обезвоживали в последовательных концентрациях метанола в PBS-Triton X-100 и затем инкубировали в бензиловом спирте / бензилбензоате (Sigma-Aldrich Co Ltd) (BABB) с MeOH до разбавления 50% BABB и 50% MeOH в течение 10 дней. –15 мин при комнатной температуре в стеклянной таре.Наконец, срезы оставляли в 100% BABB на 25 мин и устанавливали на металлических предметных стеклах, сделанных с большим отверстием, просверленным в центре, к которому с одной стороны было прикреплено покровное стекло с помощью лака для ногтей. Углубление заполняли свежим BABB, и образец переносили на предметное стекло. Сверху поместили еще одно покровное стекло и заклеили лаком для ногтей. Срезы анализировали с использованием инвертного конфокального микроскопа Zeiss LSM710 Meta с использованием линзы объектива EC Plan-Neofluar 10 × / 0,3 и LD C-Apochromat 40 × / 1 · 1W.Белый прямоугольник на левом изображении представляет область, показанную с большим увеличением на четырех изображениях справа. т. Б. brucei GVR35, экспрессирующий eGFP, как было показано, присутствует в мозговых оболочках переднего мозга (ci) и мозжечка (cii) и в паренхиме головного мозга (ciii) на 28-й день после инфицирования. Это было подтверждено маркировкой кроличьего анти-GFP Alexa 647 (красный). (d) Конфокальный микроскопический анализ целых срезов мозга на 2-й день после инфицирования. Осевые толстые срезы головного мозга получали как в c; однако срезы были помечены одним кроличьим антителом против GFAP, обнаруженным Alexa 594 (розовый) для визуализации астроцитов. т. Б. brucei GVR35, экспрессирующие eGFP, были обнаружены в паренхиме мозжечка на 2 день после инфицирования.
Используя маркировку антител против нейрофиламентов головного мозга, обнаруженных козьим антикроличьим Alexa 488 (зеленый), можно было получить обзор аксиальных срезов головного мозга на 28 день после инфицирования с помощью конфокальной микроскопии (c левая панель, белое поле представляет увеличенную область в правая панель; Л. Маклин, неопубликованные данные). При большем увеличении, обнаруженном eGFP (также возбуждение: 488 нм, зеленый) и подтвержденном маркировкой анти-GFP / Alexa 647 (красный), было очевидно, что eGFP-экспрессирующий T.brucei , особенно в мозговых оболочках переднего мозга (c i) и мозжечка (c ii), а также в паренхиме мозжечка (c iii). Предварительный анализ мозга, выделенного от мышей на 2-й день после инфицирования, меченного кроличьим анти-GFAP 594 (розовый) для обнаружения глиального фибриллярного кислого белка, основного промежуточного белка филаментов, экспрессируемого астроцитами, выявил паразитов GVR35 eGFP в паренхиме мозжечка (d ), предполагая, что инвазия трипаносомы в ЦНС происходит до обнаружения неврологических признаков.В настоящее время проводятся исследования для более подробного анализа ранней инвазии и определения кинетики распространения паразитов во время прогрессирования заболевания с использованием мышей, инфицированных GVR35 eGFP. После маркировки тонкие срезы мозга визуализируются с помощью полностью автоматизированного слайд-сканера, который позволяет быстро анализировать последовательные срезы мозга в нескольких временных точках. Обнаружение паразитов в головном мозге очень быстро после заражения подтверждает работу Frevert et al. с использованием прижизненной конфокальной микроскопии. В данном исследовании использовался зеленый флуоресцентный краситель-трекер клеток PKH67, меченный T.brucei (максимумы возбуждения / испускания: 490/502 нм; Sigma-Aldrich Co Ltd, Дорсет, Великобритания) и мономерный mOrange-экспрессирующий T. brucei (максимумы возбуждения / испускания: 548/562 нм; 61 , 76 ) были обнаружены в паренхиме мозга мышей в течение 24 часов после инфицирования, прежде чем было обнаружено значительное микрососудистое воспаление 77 . Эти результаты представляют особый интерес, поскольку мы недавно сообщили о неврологических симптомах у пациентов с ранней стадией T.б. rhodesiense инфекции 78 900 48.
Эти исследования демонстрируют, что флуоресцентные паразиты, такие как GVR35 eGFP, будут бесценным инструментом для дальнейшего исследования африканских трипаносом у их млекопитающих-хозяев, включая живые in vivo визуализации поздней стадии HAT и, после пассирования, у мухи цеце. вектор передачи.
Целое животное
In vivo (IVIS) ВизуализацияРазработка визуализации живых животных и трансгенных мышей была особенно полезной для визуализации T.brucei диссеминация в хозяине от места инокуляции до местных лимфатических узлов, вызывая инфекцию кровотока, а затем инфекцию ЦНС. Визуализирующие исследования, которые позволяют нам изучить реакцию хозяина на инфекцию на уровне всего животного, имеют большое значение. Различные репортерные линии трипаносом, экспрессирующие биолюминесцентные белки, были созданы за последние несколько лет, чтобы сделать возможным неинвазивную визуализацию трипаносомных инфекций у мышей. Claes и др. . 79 и Жиру и др. . 80 описано поколение т. Б. brucei 427, Т. б. brucei AnTat1.1 и T. b. gambiense , экспрессирующие люциферазу Renilla. С помощью биолюминесцентной визуализации можно было отследить прогрессирование и распространение инфекции in vivo , а локализацию в конкретных органах показать с помощью визуализации ex vivo . Совсем недавно вариант люциферазы светлячков LUC2 (Promega) также был использован для визуализации T. b. brucei инфекции.
Мониторинг острых инфекций обеспечивает быстрый метод тестирования соединений против трипаносомоза первой стадии, но наиболее срочно требуются новые лекарства против второй стадии или стадии заболевания ЦНС. Текущая модель трипаносомных инфекций ЦНС использует штамм GVR35 T. b. brucei , который устанавливает инфекцию ЦНС на 21 день после инфицирования 64 . В исходной модели мышей обрабатывают тестируемыми соединениями через 21 день после инфицирования и наблюдают в течение 180 дней после лечения путем оценки паразитемии в крови.Мы модифицировали Т. б. brucei GVR35 для стабильной экспрессии люциферазы светлячков (LUC2), что позволяет контролировать инфекции на стадии ЦНС и химиотерапию с помощью визуализации in vivo (). Субстрат люциферазы светлячков, D-люциферин, легко пересекает ГЭБ, что делает этот репортер лучшим выбором для высокочувствительной биолюминесцентной визуализации мозга. Обработка мышей, инфицированных GVR35-LUC2, лечебной дозой меларсопрола 81 полностью устраняла биолюминесценцию. Напротив, у мышей, получавших DB75 [2,5-бис (4-амидинофенил) фуран], соединение, неэффективное против трипаносом ЦНС 82 , биолюминесценция была обнаружена в головах обработанных мышей, где она увеличивалась и распространилась на шейные лимфатические узлы и, в конечном итоге, остальное тело.С помощью новой модели визуализации биолюминесцентные трипаносомы были обнаружены за несколько недель до обнаружения в крови, что позволило значительно сократить время после лечения, необходимое для определения того, является ли многообещающее соединение эффективным при трипаносомозе стадии 2 (ЦНС) (E. Myburgh et al. al ., рукопись представлена).
Биолюминесцентная визуализация для оценки химиотерапии трипаносомоза 2 стадии. Мышам внутрибрюшинно вводили 3 × 10 4 Паразитов в форме кровотока (BSF) Trypanosoma brucei brucei GVR35-LUC2 и лечили через 21 день после инфицирования (а) меларсопролом (местное применение 3 · 6 мг в течение трех последовательных дней. ) и (b) DB75 (20 мг / кг в течение пяти дней подряд внутрибрюшинно).Мышей визуализировали в указанные сроки после заражения с помощью IVIS Spectrum (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). D-Люциферин (150 мг / кг) вводили внутрибрюшинно за 10 минут до визуализации. Биолюминесценция показана как общий поток в фотонах в секунду (п / с), а паразитемия каждой мыши показана под изображением с ND, указывающим на то, что трипаносомы не были обнаружены в образцах крови. На протяжении всего периода показаны одни и те же две репрезентативные мыши. Две цветовые шкалы используются для обеих обработок, чтобы указать сильное (а) и более слабое (б) биолюминесцентное излучение в фотонах / с / см 2 / стерадиан.
Выводы
За счет использования последних достижений в технологии визуализации в сочетании с разработками в молекулярной и клеточной биологии был достигнут быстрый прогресс в нашем понимании биологии этих смертельных патогенов. Новые методы микроскопии сверхвысокого разрешения, включая истощение стимулированного излучения (STED), фотоактивированную световую микроскопию (PALM) и микроскопию стохастической оптической реконструкции (STORM), позволят изучать детальную структуру с более высоким разрешением с помощью световой микроскопии (LM), тем самым сокращая разрыв между LM и EM.Многофотонную визуализацию также можно улучшить за счет использования новейших производных флуоресцентных белков, которые имеют красный сдвиг и, следовательно, могут отображаться на большей глубине. Их можно возбуждать более длинными проникающими длинами волн, а излучаемый свет может возвращаться обратно в детектор с большей глубины. Кроме того, для визуализации и молекулярного фенотипирования интактной ткани недавно был использован новый метод Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging / Immunostaining / In situ -совместимый с гибридизацией Tissue-hYdrogel (CLARITY) недавно был использован для визуализации и молекулярного фенотипирования интактной ткани 83 .Использование этих новых инструментов визуализации позволит по-новому взглянуть на клеточные и молекулярные основы поздней (ЦНС) стадии HAT и может способствовать развитию будущих программ разработки лекарств и скрининга.
Благодарности
Мы с благодарностью признаем вклад следующих коллег: Питера О’Тула (Технологический факультет, Йоркский университет, Великобритания) за технические советы и полезные обсуждения, Приянка Наранг (Лондонская школа гигиены и тропической медицины, иммунологии и инфекций, Великобритания) за помощь в маркировке тканей, Захари Макки (Департамент биохимии, Политехнический институт и университет штата Вирджиния, США) для плазмиды pHD1034 и Деннису Грэбу и Квангу Сику Киму (Департамент патологии Медицинской школы Университета Джонса Хопкинса, Балтимор, США) для HBMEC и технических рекомендаций по модели BBB.Мы также благодарим Дебору Смит, Джеймса Брюэра и Джереми Моттрама за критическое прочтение рукописи. Визуализация in vitro и визуализация срезов мозга финансировались Wellcome Trust [077503] и стипендией факультета Йоркского университета, финансируемой VIP Wellcome Trust [092430 / Z / 10 / Z]. Работа по визуализации in vivo (IVIS) финансировалась Фондом Билла и Мелинды Гейтс [OPPGH5337]. Центр молекулярной паразитологии Wellcome Trust финансируется фондом Wellcome Trust [085349].
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Дополнительную вспомогательную информацию можно найти в онлайн-версии этой статьи:
Movie S1
Bloodstream form (BSF) T. b. brucei в крови человека.
Movie S2
FRAP-анализ плазматической мембраны Leishmania HASPB18-GFP.
Movie S3
FRAP-анализ целых клеток тела Leishmania HASPB18-GFP.
Ссылки
1. Блюм Дж., Шмид К., Бурри К.Клинические аспекты 2541 пациента с африканским трипаносомозом человека второй стадии. Acta Trop. 2006; 97: 55–64. [PubMed] [Google Scholar] 3. Симарро П.П., Чекки Дж., Франко Дж. Р. и др. Оценка и составление карты населения, подверженного риску сонной болезни. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6: e1859. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 4. Кромптон DWT, редактор. КТО. Поддержание стремления преодолеть глобальное воздействие забытых тропических болезней. КТО; 2012. Второй доклад ВОЗ о забытых тропических болезнях. ВОЗ / HTM / NTD / 2013.1.2013. [Google Scholar] 5. Симарро П.П., Чекки Г., Паоне М. и др. Атлас африканского трипаносомоза человека: вклад в глобальное картирование забытых тропических болезней. Int J Health Geogr. 2010; 9: 57. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6. Hasker E, Lutumba P, Chappuis F, et al. Африканский трипаносомоз человека в Демократической Республике Конго: надвигающаяся чрезвычайная ситуация? PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6: e1950. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Куэпфер И., Шмид С., Аллан М. и др.Безопасность и эффективность 10-дневного режима приема меларсопрола для лечения второй стадии родезийской сонной болезни. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6: e1695. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Алирол Э., Шрампф Д., Амичи Херади Дж. И др. Комбинированная терапия нифуртимоксом и эфлорнитином для лечения африканского трипаносомоза человека gambiense второй стадии: опыт лечения без границ в демократической республике конго. Clin Infect Dis. 2013; 56: 195–203. [PubMed] [Google Scholar] 9. Симарро П.П., Франко Дж., Диарра А., Постиго Дж. А., Джаннин Дж.Обновленная информация о полевом использовании имеющихся препаратов для химиотерапии африканского трипаносомоза человека. Паразитология. 2012; 139: 842–846. [PubMed] [Google Scholar] 10. Кеннеди PG. Клинические особенности, диагностика и лечение африканского трипаносомоза человека (сонной болезни) Lancet Neurol. 2013; 12: 186–194. [PubMed] [Google Scholar] 11. Воан С., Гулл К. Структурная механика деления клеток в Trypanosoma brucei . Biochem Soc Trans. 2008; 36: 421–424. [PubMed] [Google Scholar] 12. Энгстлер М., Пфол Т., Хермингхаус С. и др.Сортировка белков на клеточной поверхности трипаносом, опосредованная гидродинамическим потоком. Клетка. 2007. 131: 505–515. [PubMed] [Google Scholar] 13. Бродхед Р., Доу Х. Р., Фарр Х. и др. Подвижность жгутиков необходима для жизнеспособности трипаносомы кровотока. Природа. 2006; 440: 224–227. [PubMed] [Google Scholar] 15. Тайлер К.М., Фридберг А., Ториелло К.М. и др. Локализация жгутиковой мембраны через ассоциацию с липидными рафтами. J Cell Sci. 2009. 122: 859–866. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Воан С.Сборка жгутика и его роль в морфогенезе клеток у Trypanosoma brucei . Curr Opin Microbiol. 2010. 13: 453–458. [PubMed] [Google Scholar] 18. Хоар CA. Трипаносомы млекопитающих: зоологическая монография. Оксфорд: Научные публикации Блэквелла; 1972. [Google Scholar] 19. Overath P, Engstler M. Эндоцитоз, рециклинг мембран и сортировка GPI-заякоренных белков: Trypanosoma brucei в качестве модельной системы. Mol Microbiol. 2004. 53: 735–744. [PubMed] [Google Scholar] 20.Филд-МС, Кэррингтон М. Трипаносомный жгутиковый карман. Nat Rev Microbiol. 2009. 7: 775–786. [PubMed] [Google Scholar] 22. Field MC, Allen CL, Dhir V и др. Новые подходы к микроскопической визуализации Trypanosoma brucei . Microsc Microanal. 2004. 10: 621–636. [PubMed] [Google Scholar] 23. Портман Н., Гулл К. Протеомика и цитоскелет Trypanosoma brucei : достижения и возможности. Паразитология. 2012; 139: 1168–1177. [PubMed] [Google Scholar] 24. Мэтьюз KR. Развитие дифференциации Trypanosoma brucei .Паразитол сегодня. 1999; 15: 76–80. [PubMed] [Google Scholar] 25. Ротюро Б, Субота И., Бастин П. Молекулярные основы пластичности цитоскелета во время паразитарного цикла Trypanosoma brucei . Cell Microbiol. 2011; 13: 705–716. [PubMed] [Google Scholar] 26. Шарма Р., Пикок Л., Глуенц Э., Гулл К., Гибсон В., Кэррингтон М. Асимметричное деление клеток как путь к сокращению длины клеток и изменению морфологии клеток в трипаносомах. Протист. 2008. 159: 137–151. [PubMed] [Google Scholar] 27. Викерман К., Лукинс А.Г.Локализация вариабельных антигенов в поверхностном слое Trypanosoma brucei с использованием антитела, конъюгированного с ферритином. Природа. 1969; 224: 1125–1126. [PubMed] [Google Scholar] 28. Викерман К. Антигенная изменчивость трипаносом. Природа. 1978; 273: 613–617. [PubMed] [Google Scholar] 29. Руденко Г. Африканские трипаносомы: геном и адаптации для уклонения от иммунитета. Очерки Биохимии. 2011; 51: 47–62. [PubMed] [Google Scholar] 30. Horn D, McCulloch R. Молекулярные механизмы, лежащие в основе контроля антигенной изменчивости африканских трипаносом.Curr Opin Microbiol. 2010. 13: 700–705. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 31. Грека Ла Ф, Магез С. Вакцинация против трипаносомоза: можно ли это сделать или трипаносома действительно является окончательным разрушителем иммунитета и искусством побега? Hum Vaccin. 2011; 7: 1225–1233. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 32. Прайс HP, Hodgkinson MR, Curwen RS и др. Ортолог ядерного аутоантигена 1 синдрома Шегрена (SSNA1) в Trypanosoma brucei представляет собой иммуногенную самособирающуюся молекулу.PLoS One. 2012; 7: e31842. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Виртц Э., Леал С., Очатт С., Кросс Г.А. Строго регулируемая индуцибельная система экспрессии для условных нокаутов генов и доминантно-отрицательной генетики в Trypanosoma brucei . Мол Биохим Паразитол. 1999; 99: 89–101. [PubMed] [Google Scholar] 34. Цена HP, Goulding D, Smith DF. ARL1 играет важную роль в Trypanosoma brucei . Biochem Soc Trans. 2005. 33: 643–645. [PubMed] [Google Scholar] 35. Цена HP, Старк М, Смит Д.Ф. Trypanosoma brucei ARF1 играет центральную роль в эндоцитозе и перемещении лизосом гольджи. Mol Biol Cell. 2007; 18: 864–873. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Фарр Х., Чайка К. Цитокинез в трипаносомах. Цитоскелет (Хобокен) 2012; 69: 931–941. [PubMed] [Google Scholar] 37. Койфман А.Ю., Шмид М.Ф., Гейратманд Л. и др. Строение жгутика Trypanosoma brucei объясняет его двухспиральное движение. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108: 11105–11108. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38.Hoog JL, Bouchet-Marquis C., McIntosh JR, Hoenger A, Gull K. Криоэлектронная томография и трехмерный анализ интактного жгутика у Trypanosoma brucei . J Struct Biol. 2012; 178: 189–198. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 39. Gluenz E, Povelones ML, Englund PT, Gull K. Цикл дупликации кинетопластов в Trypanosoma brucei организован клеточным морфогенезом, опосредованным цитоскелетом. Mol Cell Biol. 2011; 31: 1012–1021. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 40.Лакомбл С., Воган С., Гадельха С. и др. Трехмерная клеточная архитектура жгутикового кармана и ассоциированного цитоскелета в трипаносомах, выявленная с помощью электронной томографии. J Cell Sci. 2009; 122: 1081–1090. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 41. Hammarton TC, Monnerat S, Mottram JC. Цитокинез у трипаносоматид. Curr Opin Microbiol. 2007. 10: 520–527. [PubMed] [Google Scholar] 42. Хаммартон ТК, Кларк Дж., Дуглас Ф., Босхарт М., Моттрам Дж. С.. Стадийно-специфические различия в контроле клеточного цикла у Trypanosoma brucei , выявленные с помощью РНК-интерференции митотического циклина.J Biol Chem. 2003; 278: 22877–22886. [PubMed] [Google Scholar] 43. Цена HP, Peltan A, Stark M, Smith DF. Малая GTPase ARL2 необходима для цитокинеза у Trypanosoma brucei . Мол Биохим Паразитол. 2010. 173: 123–131. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Прайс HP, Hodgkinson MR, Wright MH и др. Роль ассоциированного с везикулами тубулинсвязывающего белка ARL6 (BBS3) в удлинении жгутика у Trypanosoma brucei . Biochim Biophys Acta. 2012; 1823: 1178–1191. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 45.Джин Х., Уайт С.Р., Шида Т. и др. Консервативные белки синдрома Барде-Бидла собирают оболочку, которая транспортирует мембранные белки к ресничкам. Клетка. 2010. 141: 1208–1219. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 46. Ван И, Шайи Дж., Чиен С. Флуоресцентные белки, визуализация живых клеток и механобиология: увидеть — значит поверить. Annu Rev Biomed Eng. 2008; 10: 1–38. [PubMed] [Google Scholar] 47. Buisson J, Chenouard N, Lagache T, Blisnick T, Olivo-Marin JC, Bastin P. Внутрилагеллярные транспортные белки проходят цикл между жгутиком и его основанием.J Cell Sci. 2013; 126: 327–338. [PubMed] [Google Scholar] 48. Цена HP, Маклин Л., Маррисон Дж., О’Тул П.Дж., Смит Д.Ф. Валидация нового метода иммобилизации кинетопластидных паразитов для визуализации живых клеток. Мол Биохим Паразитол. 2010. 169: 66–69. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 49. Флинн Х.М., Рангараджан Д., Смит Д.Ф. Экспрессия гидрофильного поверхностного белка на инфекционных стадиях Leishmania major . Мол Биохим Паразитол. 1994; 65: 259–270. [PubMed] [Google Scholar] 50. Depledge DP, MacLean LM, Hodgkinson MR, et al.Поверхностные антигены, специфичные для лейшмании, обнаруживают вариабельность последовательностей подродов и иммунное распознавание. PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4: e829. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 51. Садлова Дж., Прайс Х.П., Смит Б.А., Вотипка Дж., Вольф П., Смит Д.Ф. Регулируемые по стадиям белки HASPB и SHERP необходимы для дифференциации простейшего паразита Leishmania major в его векторе песчаных мух Phlebotomus papatasi . Cell Microbiol. 2010; 12: 1765–1779. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 52.Стаджер С., Смит Д.Ф., Кэй П.М. Иммунизация рекомбинантным регулируемым поверхностным белком из Leishmania donovani индуцирует защиту от висцерального лейшманиоза. J Immunol. 2000; 165: 7064–7071. [PubMed] [Google Scholar] 53. Маруф А., Браун Н., Смит Б. и др. Терапевтическая вакцинация рекомбинантным аденовирусом снижает количество паразитов в селезенке при экспериментальном висцеральном лейшманиозе. J Infect Dis. 2012; 205: 853–863. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 54. Денни П.У., Гокул С., Рассел Д.Г., Филд-МС, Смит Д.Ф.Зависимый от ацилирования экспорт белка у Leishmania. J Biol Chem. 2000; 275: 11017–11025. [PubMed] [Google Scholar] 55. Маклин Л.М., О’Тул П.Дж., Старк М. и др. Торговля и выпуск метациклического HASPB Leishmania при инвазии макрофагов. Cell Microbiol. 2012; 14: 740–761. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 56. Squirrell JM, Wokosin DL, White JG, Bavister BD. Долгосрочная двухфотонная флуоресцентная визуализация эмбрионов млекопитающих без ущерба для жизнеспособности. Nat Biotechnol. 1999; 17: 763–767. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 57.Хватай DJ, Никольская О., Ким Ю.В. и др. Взаимодействие африканских трипаносом с моделью in vitro гематоэнцефалического барьера человека. J Parasitol. 2004; 90: 970–979. [PubMed] [Google Scholar] 58. Grab DJ, Гарсия-Гарсия JC, Никольская О.В. и др. Передача сигналов рецептора, активируемого протеазой, необходима для прохождения африканскими трипаносомами эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга человека. PLoS Negl Trop Dis. 2009; 3: e479. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 59. Abbott NJ, Ronnback L, Hansson E. Взаимодействие астроцитов и эндотелия на гематоэнцефалическом барьере.Nat Rev Neurosci. 2006; 7: 41–53. [PubMed] [Google Scholar] 60. Беверли С.М., Клейтон С.Э. Трансфекция Leishmania и Trypanosoma brucei путем электропорации. Методы Мол биол. 1993; 21: 333–348. [PubMed] [Google Scholar] 61. Балмер О., Тостадо С. Новые флуоресцентные маркеры для распознавания коинфекции штаммов Trypanosoma brucei при экспериментальных множественных инфекциях. Acta Trop. 2006; 97: 94–101. [PubMed] [Google Scholar] 62. Quijada L, Guerra-Giraldez C, Drozdz M, et al. Экспрессия человеческого РНК-связывающего белка HuR в Trypanosoma brucei увеличивает количество мРНК, содержащих регуляторные элементы, богатые AU.Nucleic Acids Res. 2002; 30: 4414–4424. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 63. Буркард Г., Фрагосо С.М., Родити И. Высокоэффективная стабильная трансформация форм кровотока Trypanosoma brucei . Мол Биохим Паразитол. 2007. 153: 220–223. [PubMed] [Google Scholar] 64. Дженнингс Ф.В., Грей Г.Д. Рецидив паразитемии после химиотерапии хронических инфекций T. brucei у мышей и ее связь с церебральными трипаносомами. Contrib Microbiol Immunol. 1983; 7: 147–154. [PubMed] [Google Scholar] 65.Павлин Л., Феррис В., Бейли М., Гибсон В. Внутриклональное спаривание происходит во время передачи цеце Trypanosoma brucei . Векторы паразитов. 2009; 2: 43. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 66. Павлин Л., Феррис В., Бейли М., Гибсон В. Динамика заражения и конкуренции между двумя штаммами Trypanosoma brucei brucei у мухи цеце, наблюдаемая с использованием флуоресцентных маркеров. Kinetoplastid Biol Dis. 2007; 6: 4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 67. Масоча В., Робертсон Б., Роттенберг М.Э., Мланга Дж., Сорокин Л., Кристенссон К.Ламинины сосудов головного мозга и IFN-гамма определяют проникновение Trypanosoma brucei brucei через гематоэнцефалический барьер. J Clin Invest. 2004. 114: 689–694. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 68. Маклин Л., Одиит М., Маклеод А. и др. Пространственно и генетически различные варианты вирулентности африканских трипаносом, определяемые ответом хозяина на интерферон-γ. J Infect Dis. 2007; 196: 1620–1628. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 69. Роджерс Дж., Маккейб С., Геттинби Дж., Брэдли Б., Кондон Б., Кеннеди П. Г..Магнитно-резонансная томография для оценки повреждения гематоэнцефалического барьера при трипаносомозе мышей. Am J Trop Med Hyg. 2011; 84: 344–350. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 70. Mulenga C, Mhlanga JDM, Kristensson K, Robertson B. Trypanosoma brucei brucei пересекает гематоэнцефалический барьер, в то время как белки плотного соединения сохраняются в модели хронического заболевания крысы. Neuropathol Appl Neurobiol. 2001. 27: 77–85. [PubMed] [Google Scholar] 71. Филип К.А., Даскомб М.Дж., Фрейзер П.А., Пентрит Ф.В. Повреждение гематоэнцефалического барьера при экспериментальном африканском трипаносомозе.Ann Trop Med Parasitol. 1994; 88: 607–616. [PubMed] [Google Scholar] 72. Роджерс Дж., Джонс А., Гибо С. и др. Комплексы включения циклодекстрина меларсопрол как многообещающие пероральные кандидаты для лечения африканского трипаносомоза человека. PLoS Negl Trop Dis. 2011; 5: e1308. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 73. Полтера А.А., Хохманн А., Рудин В., Ламберт PH. Trypanosoma brucei brucei : модель церебрального трипаносомоза у мышей — иммунологическое, гистологическое и электронно-микроскопическое исследование.Clin Exp Immunol. 1980; 40: 496–507. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 74. Джонсон RT, Грин DE, Hirsch RL. Избегайте иммунного надзора со стороны центральной нервной системы. В: Miescher PA, Bolis L, Gorini S, Lambo TA, Nossal GJV, Torrigiani G, редакторы. Иммунопатология центральной и периферической нервной системы. Базель: Швабе; 1979. С. 113–121. [Google Scholar] 75. Кеннеди П.Г., Роджерс Дж., Дженнингс Ф.В., Мюррей М., Лиман С.Е., Берк Дж. Антагонист вещества P, RP-67 580, улучшает менингоэнцефалитный ответ мышей на Trypanosoma brucei brucei .Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 4167–4170. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 76. Shaner NC, Lin MZ, McKeown MR, et al. Повышение фотостабильности ярких мономерных оранжевых и красных флуоресцентных белков. Нат методы. 2008. 5: 545–551. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 78. Маклин Л., Райбер Х, Кеннеди П. Г., Штернберг Дж. М.. Стадия прогрессирования и неврологические симптомы в сонной болезни Trypanosoma brucei rhodesiense : роль воспалительной реакции ЦНС. PLoS Negl Trop Dis.2012; 6: e1857. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 79. Клас Ф., Воднала С.К., Рит ван Н. и др. Биолюминесцентное изображение Trypanosoma brucei показывает преимущественное распространение семенников, что может снизить эффективность лекарств при сонной болезни. PLoS Negl Trop Dis. 2009; 3: e486. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 80. Жиру С., Оттон Ф., Кусту В. и др. Мышиные модели для Trypanosoma brucei gambiense прогрессирование болезни: от тихой до хронической инфекции и раннего тропизма мозга.PLoS Negl Trop Dis. 2009; 3: e509. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 81. Атугиа Дж. М., Дженнингс Ф. В., Мюррей М. Успешное лечение инфекции экспериментальных мышей Trypanosoma brucei с помощью местного геля меларсопрола. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1995; 89: 531–533. [PubMed] [Google Scholar] 82. Wenzler T, Boykin DW, Ismail MA, Hall JE, Tidwell RR, Brun R. Новый вариант лечения второй стадии африканской сонной болезни: in vitro, и in vivo, эффективность аза-аналогов DB289.Антимикробные агенты Chemother. 2009. 53: 4185–4192. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 83. Чанг К., Уоллес Дж., Ким С.И. и др. Структурный и молекулярный опрос интактных биологических систем. Природа. 2013; 497: 332–337. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Более прямые трипаносомы более ориентированы
В этой работе мы стремимся не только охарактеризовать различия, наблюдаемые в плавательном поведении в пределах одной популяции, но также связать это поведение с микроскопическими физическими процессами, которые могут объяснить эти наблюдения.С этой целью мы исследовали подвижность одиночных трипаносом в квазидвумерной среде. Модель случайного блуждания Пирсона [8], [18], [19] используется для описания траекторий плавания трипаносом. Мы также предполагаем, что наблюдаемое разнообразие траекторий плавания может быть связано с различной жесткостью клеток.
Трипаносомные траектории
Записи плавающих клеток в культуральной среде были сделаны с частотой 7 Гц и обработаны для получения траекторий отдельных клеток, которые следуют за центром масс клетки.Характерные покадровые траектории приведены на рис. 1b, а соответствующие фильмы приведены в дополнительной информации (видео S1 и видео S2). Клетки находятся в гомогенной среде без химических градиентов, поэтому в данном исследовании можно исключить специфическое хемопривлечение в качестве основы для передвижения клеток. Стоит отметить, что хотя хемотаксис трипаносом не был продемонстрирован, вполне вероятно, что они на него способны [20].
Как видно на примере траекторий на рис.1c, трипаносомы из одной и той же популяции, взятые из одной и той же культуры клеток, которые подвергаются идентичным условиям окружающей среды, очевидно, не следуют единому режиму подвижности .
Около четверти трипаносом «кувыркаются» без сохранения направления (показано красным на рис. 1 c). Эти клетки, обозначаемые как акробатика (TW), по-видимому, не имеют четко определенной ориентации, следовательно, наиболее часто описываемое плавание с ведомым концом жгутика не различимо.
Во-вторых, около половины пловцов обладают высокой направленностью ( настойчивых ходунков, — PW) с полным отсутствием акробатических движений в пределах интервала наблюдения. Ориентация клеток этих пловцов остается постоянной, кончик жгутика направлен в направлении плавания.
Оставшаяся популяция состоит из клеток, которые направленно плавают с постоянной ориентацией клеток, но иногда останавливаются, падают и переориентируются, а затем снова перемещаются в указанном направлении.Эти траектории напоминают траектории E.coli , в которых устойчивое поступательное движение прерывается кувырком [8]. Мы называем эти клетки промежуточными ходунками (IW).
Плавание клетокбыло охарактеризовано с использованием среднеквадратичного смещения (MSD), выраженного как, где — MSD, r — это положение, а это временной интервал, ограниченный только временным разрешением эксперимента — см. Рис. 2 a. Масштабный показатель, где — коэффициент подвижности [21], [22], дает меру степени направленной корреляции.Тамблеры характеризуются близким средним показателем масштабирования, что указывает на некоррелированное движение. У промежуточных ходунков больше корреляции, а у настойчивых ходячих — обычно больше единицы, что указывает на более длительные корреляции в направлении плавания [21], [23]. См. Сводку в таблице 1.
Рис. 2. Сходство и разнообразие движений трипаносом.
(a) Среднеквадратичное смещение типичных пловцов для каждого режима (b) Распределение скорости в популяции практически одинаково для всех режимов подвижности (получено из времени профилирования 1/7 с).Средняя скорость отображается зеленым цветом. (c) Средняя косинусоидальная корреляционная функция для каждого режима подвижности, экспоненциальная аппроксимация времени выдержки, показанная зеленым цветом.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002058.g002
Интересно, что, как показано в распределении на рис. 2b, все три типа пловцов имеют практически одинаковую среднюю скорость плавания, что свидетельствует о возникновении этих режимов моторики. в первую очередь за счет направленного движения. Обратите внимание, что здесь скорость определяется расстоянием, пройденным центром масс от кадра до кадра экспериментальной записи.Таким образом, опрокидывающаяся ячейка также демонстрирует скорость, даже если нет чистого смещения. Отличительной особенностью режимов моторики является упорное движение.
Временной масштаб, при котором теряется устойчивость направления, характеризуется косинусоидальной корреляционной функцией, (1)
, где v — вектор скорости, — угол между двумя соседними векторами, разделенными временным интервалом, и обозначает среднее по ансамблю. В случае TW корреляция быстро спадает и остается близкой к нулю, как показано на рис.2 в. Как для стойких, так и для пешеходов среднего уровня также наблюдается быстрое ослабление корреляции, за которым следует второе более медленное ослабление. Резкое падение корреляции при малых задержках во времени, вероятно, является следствием сильных искажений тела, упомянутых ранее. Экспоненциальная подгонка ко второму более медленному спаду (показано зеленым на рис. 2 c) средней косинусной корреляционной функции для настойчивых ходячих людей показывает, что время устойчивости составляет. Для клеток, чередующихся между кувырком и направленным плаванием, мы обнаружили, что среднее время устойчивости значительно меньше,.Средний интервал переворачивания — намного больше, чем время переворачивания 0,1 с, наблюдаемое у E.coli [8]. Здесь «интервал кувырка» был получен как максимальное время, в течение которого пройденное расстояние остается практически постоянным по отношению ко времени. Интересно, что все три корреляции, по-видимому, остаются выше нуля в интервале наблюдений, указывая на еще одну более долгосрочную корреляцию.
Акробатики, у которых все углы поворота имеют равную вероятность, характеризуются плоским распределением углов поворота, в то время как люди, которые устойчивы в направлении, используют довольно узкое распределение углов поворота.Мы используем разброс распределений углов поворота, связанных с каждой траекторией, для систематической классификации людей по их соответствующим режимам плавания.
Таблица 1 суммирует количественные различия между режимами подвижности, подчеркивая поразительное разнообразие подвижности в одной популяции трипаносом.
На рис. 3а показано типичное смещение, вычисленное между каждыми 100 кадрами записи для каждого режима подвижности. Это ясно демонстрирует, что в то время как TW и PW поддерживают низкие и высокие значения смещения соответственно на протяжении всего интервала наблюдений, IW чередуются или переключаются между двумя «состояниями», таким образом оправдывая разделение подвижности трипаносомы на три различных режима.Физические различия, связанные с этими режимами моторики, обсуждаются ниже.
Рисунок 3. Отличительные особенности режимов моторики.
(a) Типичное смещение, рассчитанное между каждыми 100 кадрами записи для каждого режима подвижности. В то время как TW и PW поддерживают низкие и высокие значения смещения соответственно, IW, кажется, чередуются между этими двумя режимами. (б) Распределение ширины клеток (измеренной в самой широкой точке) для клеток каждого режима подвижности.
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1002058.g003
Характеристика режимов моторики
Мы описываем имитационную модель, с помощью которой мы можем восстановить движение трех режимов моторики. Используется модель случайного блуждания Пирсона [8], [18], [19], в которой размер шага и угол поворота определяются двумя независимыми распределениями и соответственно. Случайное блуждание Пирсона — одна из простейших мыслимых моделей, которая учитывает стохастическое, но направленное движение. Он использовался в качестве парадигматической модели передвижения у животных, широко используемых, например, у микроорганизмов, но также и у бабочек.Следовательно, это подходящая минимальная модель передвижения в трипаносомах. К счастью, мы обнаружили, что эта минимальная модель очень удовлетворительно описывает движение в трипаносомах. Угол поворота определяется предыдущим направлением смещения и случайно выбранным углом поворота. Размеры шага взяты из экспоненциального распределения с характерным смещением [18] (эквивалентным для каждого режима подвижности) — см. Дополнительную информацию в тексте S1. Модель фиксирует движение трипаносом, в частности их различия в постоянстве трансляционного движения, см. Рис.1 d и таблица 1. Однако он не улавливает «зубчатость» меньшего масштаба, наблюдаемую на траекториях. Эта неровность возникает из-за быстрого изгиба и скручивания тела клетки трипаносомы во время плавания. Чтобы дополнительно охарактеризовать динамику подвижности трипаносом в этих меньших временных масштабах, мы использовали высокоскоростную микроскопию.
Микроскопическое происхождение двигательных мод
Чтобы исследовать физические механизмы наблюдаемого подвижного поведения, мы исследуем трипаносомы при большем увеличении и с гораздо более высокой частотой дискретизации (см. Дополнительную информацию, видео S3 и видео S4).Недавняя работа с высокоскоростной микроскопией продемонстрировала удивительно высокую скорость кончика жгутика, в 25 раз превышающую среднюю скорость плавания клеток [15], что дополнительно подчеркивает необходимость высокого временного разрешения для получения физического понимания подвижности этого паразита.
Жгутик проходит вдоль тела клетки, что приводит к сложным деформациям тела во время плавания, и хотя количественные описания движений жгутиков были сделаны для других видов [24], для T.brucei brucei .
Мы выбрали простой подход и исследовали изменения расстояния между двумя концами ячейки (здесь и далее называемое расстоянием от конца до конца) с течением времени. За трипаносомами отслеживали режим их подвижности, а затем проводили высокоскоростные записи их движения с большим увеличением. Записанные изображения обрабатывались, как описано в разделе методов. Была получена линия скелета, проходящая через центр тела клетки, как показано на рис.4 а. Расстояние от конца до конца, обозначенное желтой стрелкой на рис. 4a, было вычислено и нормализовано по длине самой ячейки (представленной длиной линии одного пикселя красным цветом). В результате получается временной ряд нормализованного сквозного расстояния, который позволяет сравнивать режимы подвижности, как показано на рис. 4b (см. Дополнительные информационные видеоролики S3 и S4). На рис. 4b показано, что стойкая ячейка постоянно более растянута или удлинена, чем тумблер.
Рисунок 4.Сквозное расстояние.
(a) Обработка изображения для получения линии скелета и, таким образом, извлечения сквозного расстояния. (b) Типичный временной ряд сквозного расстояния (нормализованный к длине ячейки) (c) Распределение совокупности сквозного расстояния у постоянных и акробатических ходунков (d) Снимки из фильмов, показывающие, что постоянные ячейки действительно более растянуты (черные ящики), чем акробатики (красные ящики).
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002058.g004
Гистограммы сквозных расстояний [25], [26] показывают четкие различия в поведении при плавании (рис.4 в). Более высокое среднее расстояние от конца до конца для PW указывает на то, что постоянство направления коррелирует с удлиненной формой ячейки. Моментальные снимки высокоскоростных фильмов людей демонстрируют, как показано на рис. 4d, что клетки, плавающие с направленным постоянством, по-видимому, принимают более вытянутую форму тела. Действительно, среднее расстояние от конца до конца устойчивых клеток составляет 0,6 — более чем в 1,5 раза больше, чем у тумблеров, для которых оно составляет 0,38.
Мы приписываем форму трипаносомы червеобразной цепочке [25], [27].Среднеквадратичное расстояние от конца до конца дается формулами [27], [28]. Где — длина цепи, а — безразмерная переменная, зависящая от жесткости на изгиб, и использования энергии для подвижности,. Предполагая равное использование энергии для самоходного движения в обоих режимах подвижности, то есть отношение расстояний от конца до конца двух режимов подвижности определяется выражением (2)
Основываясь на сделанном выше предположении о равном использовании энергии, мы обнаружили, что устойчивые клетки имеют в три раза большую жесткость при изгибе, чем клетки акробатического ходунка.Направленные клетки могут быть более жесткими из-за реорганизации моторных белков и сшивания внутри микротрубочек, обнаруженных как в теле клетки, так и в жгутике. Деление клеток связано с ростом второго жгутика рядом со старым, что также может вносить вклад в различия в жесткости клеток (см. Ниже). Предположение о равном использовании энергии для подвижности от одной клетки к другой подтверждается, но не подтверждается тем фактом, что распределение скоростей для всех режимов подвижности одинаково.Не исключено, что эти наблюдения являются следствием взаимодействия различий в жесткости на изгиб, а также использования энергии для движения клетки, которое может зависеть от длины клетки [29]. Точные различия в жесткости при изгибе и использовании энергии между режимами подвижности еще предстоит подтвердить прямыми измерениями в дальнейших исследованиях.
Тем не менее, эти результаты качественно согласуются с теоретической работой Wada и Netz [30] о подвижности бактерии Spiroplasma , в которой более мягкие клетки, как было показано, более значительно изгибаются из-за случайных тепловых флуктуаций и, следовательно, менее эффективны в направленном движении. . Ранее сообщалось, что спироплазма плавает с использованием механизма изгиба спирали [31], подобного тому, который недавно был предложен Rodriguez et al. [15] для плавания с трипаносомами. Дальнейшая теоретическая работа предполагает, что изменения жесткости при изгибе ячейки имеют прямое влияние на шаг спирального движения [32].
Деление клеток для кровотока из трипаносом начинается с роста нового жгутика. Тело клетки начинает расширяться, в то время как кинетопласт, прикрепленный к базальному телу, реплицируется.Митоз ядра начинается, в то время как второй жгутик продолжает расти. Ширина клетки может использоваться как индикатор расширения, связанного с делением клетки. Для этого исследования, хотя были отобраны только отдельные клетки, которые, по-видимому, имели один жгутик, точную стадию клеточного цикла можно было оценить только путем измерения ширины клетки в этом эксперименте. На рис. 3b показано распределение ширины клетки (измеренной в самой широкой точке) для клеток в каждом режиме подвижности. В среднем, настойчивые ходунки шире, чем два других режима подвижности, что указывает на то, что они уже участвуют в делении клеток и росте второго жгутика.Как влияет на подвижность клеток, когда цитокинез прогрессирует и другие клетки начинают рассасываться, требует дальнейшего изучения.
Помимо того, что они дают нам ключ к разгадке микроскопического происхождения наблюдаемых режимов подвижности, эти данные также позволяют нам изучать динамику движения клеток, чтобы углубить наше понимание механизма плавания трипаносом. Мы отслеживаем движение основания и кончика жгутика относительно центра масс клетки, что позволяет нам изолировать движение всего тела от движения только концов клетки.Типичные траектории, показанные на рис. 5, показывают, что кончик жгутика движется быстрее, чем основание клетки.
Рис. 5. Траектории конца ячейки.
Траектории кончика (серый) и основания (черный), а также центра масс (зеленый) показаны в течение 9 с (единицы измерения). На трех верхних панелях показано движение кончика и основания жгутика, а также центра масс. На нижних панелях показаны соответствующие траектории конца ячейки с поправкой на центр масс, что позволяет отделить движения центра масс от движений конца ячейки.Левая и правая панели: настойчивые ходунки, средняя панель: акробатики — настойчивость не очевидна в этой временной шкале.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002058.g005
Распределения скоростей концов ячеек, извлеченные из траекторий концов ячеек, показаны на рис. 6 a и b. Мы получили средние скорости на концах жгутиков и для акробатических и персистентных клеток соответственно, в то время как скорости на концах основания намного ниже как для TW, так и для PW и соответственно) — все в хорошем согласии с [15].Это открытие указывает на «градиент скорости» вдоль тела клетки, который является самым низким у основания клетки и увеличивается к концу жгутика. Градиент, который кажется более крутым у постоянных ходунков, в свою очередь может происходить из-за постепенного увеличения эластичности из-за сужающейся формы тела и из-за смещения гидродинамического центра масс к основанию клетки. Изменения в общей жесткости клеток, следовательно, д. Влиять не только на скорости жгутиков, но также и на направленность движения конца клетки, тем самым определяя режим подвижности клетки.
Рис. 6. Скорость и корреляция движений на концах ячеек.
Типичные распределения скоростей для (а) настойчивых ходунков и (б) акробатиков (показаны относительно центра масс), вставки представляют собой пройденное расстояние в зависимости от времени для типичных людей — средние значения уклона использовались для расчета скоростей на концах ячеек, перечисленных в текст. В обоих режимах плавания кончик движется намного быстрее, чем основание. (c) Типичная автокорреляция скоростей концов ячеек. И настойчивые, и акробатические ходунки демонстрируют более быстрое затухание автокорреляции скорости для основания, чем для кончика жгутика (экспоненциальное совпадение — пунктирная черная линия).На вставке: линейный график корреляции, показывает периодичность скорости при.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002058.g006
Примечательно, что мы находим чрезвычайно быструю динамику клеточного тела; кончик жгутика настойчивого шагающего движется более чем в 40 раз быстрее, чем средняя зарегистрированная скорость плавания целых клеток. У акробатика разница между скоростью наконечника и скоростью всей камеры составляет 20 раз. Вместе эти результаты подтверждают представление о том, что режимы подвижности являются следствием удлинения клеток и могут быть коррелированы с их жесткостью.Линия из одного пикселя, представляющая тело клетки, обеспечивает простой метод для дальнейших исследований движений клетки и может пролить свет на механизм изгиба, недавно предложенный для движения трипаносомы [15].
Наконец, используя функцию автокорреляции скорости [33] для каждого конца ячейки, мы можем извлечь быстрые временные шкалы, относящиеся к движению ячейки. Корреляционная функция имеет вид (3)
где скорость — временное разрешение, — время профиля или запаздывание, — среднее значение и стандартное отклонение скорости.Уравнение (3) показывает, насколько быстро корреляция скорости теряется (временное затухание), и раскрывает любую лежащую в основе периодичность скорости. На рис. 6с показана типичная функция автокорреляции скорости для основания и вершины ячейки.
Экспоненциальная аппроксимация корреляционной функции показывает, что время затухания составляет и для основания и острия соответственно. Эти времена распада, по-видимому, не сильно различаются между тремя режимами подвижности и указывают на удивительно быструю динамику клеточной подвижности из-за быстрых искажений тела.Обратите внимание, что первое быстрое затухание связано в основном с эффектами разрешения и поэтому игнорируется при подгонке. Кроме того, на автокорреляционных функциях наблюдается более длительная периодичность (вставка на рис. 6в). Эта периодичность, вероятно, возникает из-за повторяющихся движений тела клетки «сгибание и освобождение», которые можно ясно увидеть на траектории, показанной на средней панели рис.
Хотя бег и опрокидывание трипаносом сообщалось ранее [14], [34], различные режимы подвижности у T.brucei brucei никогда не описывались подробно. Направленность может придавать способность проникать в ткани — последняя стадия сонной болезни характеризуется вторжением паразитов через гематоэнцефалический барьер [35], или это может быть эффективной стратегией поиска питательных веществ [36]. С другой стороны, было показано, что плавание клеток важно для удаления антител хозяина, и один из этих режимов подвижности может увеличивать локальное гидродинамическое сопротивление поверхностным белкам [10]. Наши результаты показывают, что режимы макроскопической подвижности могут быть коррелированы с изменением жесткости клеток.Для подтверждения этой гипотезы необходимы прямые измерения жесткости клеток. Анализ межклеточного расстояния обеспечивает быстрый скрининг для выявления различий в микроскопических свойствах клеток. Наконец, наш анализ указывает на удивительно быструю динамику подвижности клеток, влияющую как на собственное вращательное, так и на поступательное движение клеток. Расширение настоящих экспериментов для включения потока для дальнейших исследований биологической значимости режимов подвижности может, таким образом, помочь определить важность плавания клеток на различных инфекционных стадиях.
Структура Trypanosoma brucei flagellum объясняет его двухспиральное движение
Abstract
Trypanosoma brucei — паразитическое простейшее, вызывающее африканскую сонную болезнь. Он содержит жгутик, необходимый для передвижения и жизнеспособности. Помимо микротрубочковой аксонемы, жгутик содержит кристаллический парафлагеллярный стержень (PFR) и соединительные белки. Мы показываем здесь с помощью криоэлектронной томографии структуру жгутика в трех состояниях изгиба.Решетка PFR в прямых жгутиках повторяется каждые 56 нм по длине аксонемы, что соответствует расстоянию между соединяющими белками. Во время изгиба жгутиков длины кристаллографических элементарных ячеек PFR остаются постоянными, в то время как межосевые углы меняются, как у винтового домкрата. Аксонема управляет расширением и сжатием решетки PFR. Мы предполагаем, что PFR изменяет движение аксонемы в плоскости для создания характерной биспиральной подвижности трипаносомы, зафиксированной с помощью видеографии с помощью высокоскоростного светового микроскопа.
T rypanosoma brucei веками опустошала африканский континент, заражая людей и домашних животных, и препятствовала экономическому развитию в странах Африки к югу от Сахары (1). Текущие методы лечения сонной болезни неадекватны, а используемые лекарства очень токсичны (2). В последние годы было обнаружено, что подвижность жгутика T. brucei имеет важное значение для выживания паразитов, инфекций и патогенеза болезней (3) и стала многообещающей мишенью для лекарств (4).Жгутики со сходной структурной организацией и белковым составом также были обнаружены у эвгленоидов (5) и других кинетопластидных паразитов, включая Leishmania spp. и Trypanosoma cruzi , которые вызывают лейшманиоз и болезнь Шагаса соответственно (6).
Жгутик трипаносомы является более сложным, чем большинство других эукариотических жгутиков, основанных на микротрубочках (7–9), и полностью отличается от жгутиков бактерий, основанных на роторно-моторных (10). Каждая клетка T. brucei содержит один жгутик, который перемещает тело клетки попеременно вправо и влево, что приводит к двухспиральному движению (11) (фильм S1).Окруженный мембраной жгутик, состоящий из аксонемы, парафлагеллярного стержня (PFR) (12) и соединительных белков, прикрепляется к телу клетки (рис. 1). PFR был идентифицирован как решетчатая ультраструктура у T. brucei flagellum (13). Такая периодическая и кристаллическая природа PFR была подтверждена у T. brucei (14) и родственных видов (15, 16). Скрининг на моноклональные антитела (17) и протеомные исследования (18–20) выявили не менее 40 белков PFR. Среди них PFR1 (73 кДа) и PFR2 (69 кДа), содержащие области coiled-coil (21), являются основными структурными компонентами PFR (22).Истощение этих белков приводит к нарушению сборки PFR и дефектам подвижности клеток (17, 23) (Fig. S1 и Movie S2). У патогенной формы кровотока T. brucei удаление PFR2 вызывает гибель паразита (18). Эти результаты демонстрируют критическую роль PFR в подвижности и жизнеспособности T. brucei . Мы использовали криоэлектронную томографию (крио-ЭТ) для определения структуры биохимически изолированных жгутиков T. brucei (18). Мы описываем здесь модель, которая объясняет, как структура и расположение компонентов жгутика вызывает биспиральное движение жгутика.
Рис. 1.Trypanosoma brucei flagellum. ( A ) Схема трипаносомной клетки (синий) с прикрепленным жгутиком (желтый). ( B ) Срез томографической реконструкции изолированного прямого жгутика. Жгутик, состоящий из аксонемы, PFR (12) и связывающих белков, прикреплен к телу клетки.
Рис. 1 B — это проекция через 30 срезов (33 нм) томограммы жгутика T. brucei , показывающая три компонента прямого жгутика: кристаллический PFR, аксонему и белки, соединяющие PFR. к аксонеме.Кристалличность PFR демонстрируется расчетной дифракционной картиной одиночного изображения (рис. S2), которая показывает дифракционные пятна, ожидаемые для кристалла. На других томограммах мы наблюдали жгутики в изогнутых конформациях, подобных тем, которые наблюдаются при движении жгутиков. Поскольку эти три компонента жгутиков (PFR, аксонема и связывающие белки) демонстрируют разную периодичность и симметрию, нам пришлось использовать разные стратегии для выравнивания и усреднения каждого из них по отдельности ( Materials and Methods ).Было обнаружено, что PFR содержит несколько регионов (24). Мы наблюдаем эти отчетливые области PFR в неусредненных необработанных поперечных сечениях томограммы (Рис. S3 C и Movie S3). Однако в нашем методе выравнивания кристалличность самой большой и наиболее упорядоченной части PFR (дистальной части) сильно влияет на общее среднее значение PFR. Проксимальная область PFR после усреднения не наблюдалась, поскольку она не обладает такой кристалличностью.
Окончательная усредненная структура всего жгутика (рис.2 A и Movie S3) был восстановлен из усредненных компонентов прямых жгутиков.
Рис. 2.T. brucei компонентов жгутика. ( A ) Поперечный разрез жгутика. Аксонема радиально окрашена: центральный парный комплекс (желтый), радиальные спицы (светло-зеленый), дублеты микротрубочек (синий). Красная пунктирная линия (делающая пополам центральную пару) представляет собой плоскость изгиба аксонемы. PFR смещен от этой плоскости (пунктирная фиолетовая линия через середину PFR).( B ) Диагональ (показана горизонтальной белой стрелкой) кристаллографической элементарной ячейки PFR (зеленая) повторяется с тем же интервалом (56 нм), что и у соединяющих белков (красный и розовый), вдоль оси аксонемы. . ( C ) Слоистая природа PFR. Скелетонизированная (27) плотность PFR показана серым цветом, кристаллографические элементарные ячейки показаны зелеными параллелограммами, соединительные белки представлены сферами, а микротрубочки — цилиндрами. ( D ) Т.brucei внутренние компоненты аксонемы.
Усредненная плотность PFR была получена из пяти различных томограмм (рис. 2 A и B ). PFR представляет собой трехмерную белковую решетку, которая имеет пересекающиеся плотности и большую долю пустого объема, оба из которых напоминают кристаллическую структуру тропомиозина (25, 26). Линейные плотности параллельны осям кристаллографических элементарных ячеек и могут соответствовать одному или нескольким параллельным спиральным пучкам основных белков PFR.Диагональ кристаллографической элементарной ячейки PFR повторяется с интервалами 56 нм в направлении, параллельном аксонеме (рис. 2 B ). Мы использовали алгоритм скелетонизации (27), чтобы обеспечить упрощенное представление плотностей в решетке PFR (рис. 2 C ). Зеленый параллелограмм, проходящий через самые высокие плотности PFR, представляет четыре кристаллографические элементарные ячейки на плоскости (рис. S4). Рис. 2 C показывает слоистую природу PFR и ее пространственное отношение к аксонеме (Movie S3).Расстояние между соседними слоями соответствует расстоянию между кристаллографическими ячейками c (22 нм). Обратите внимание, что ни одна из кристаллографических осей не параллельна или перпендикулярна оси аксонемы.
Среднее значение аксонемы (Рис. 2 D и Movie S3) было получено из одной томограммы, которая имела наиболее хорошо сохранившуюся структуру. Он содержит характерные девять внешних дублетов микротрубочек (28–30) (синие), расположенных вокруг центральной пары микротрубочек (желтые), аналогичные тем, которые обнаруживаются в сперматозоидах морского ежа (8).Все девять дублетов микротрубочек и связанные с ними структуры были выровнены и усреднены, предполагая, что они структурно эквивалентны, тем самым компенсируя искажения, вызванные ограниченным диапазоном углов наклона ( Materials and Methods ). В нашей аннотации дублет микротрубочек 1 (Fig. 2 A и Movie S3) дистальнее PFR (31) и радиальные спицы (светло-зеленые) соединяют внешние дублеты микротрубочек с центральной парой. Обычно аксонемы изгибаются в плоскости, разделяющей две микротрубочки центральной пары (32) с частотой 10-20 Гц (33).Здесь крио-ЭТ обеспечивает прямое наблюдение на том же замороженном образце этой ортогональной взаимосвязи между центральной парой и плоскостью изгиба (рис. S3 A и B ). На наших томограммах плоскость, разделяющая пополам две микротрубочки центральной пары (рис.2 A , красная пунктирная линия), и плоскость, проходящая через соединительные белки (рис.2 A , фиолетовая пунктирная линия), пересекаются под углом, соответствующим с предыдущими измерениями (34–36). Чтобы статистически подтвердить наше наблюдение, мы измерили угол, который PFR составляет с серединным перпендикуляром центральной пары для восьми различных жгутиков (рис.S3 B — H , в дополнение к томограмме для рис. 2). Мы нашли 20 ± 7 °. Некоторые особенности аксонемы (Fig. 2 D ), такие как девять дублетов, радиальные спицы и центральная пара микротрубочек, кажутся похожими на аксонемы от других организмов (7, 8, 37-40). Однако такие структуры, как внешние динеиновые ветви, могли быть частично удалены во время экстракции 1 М KCl.
Были идентифицированы два ряда соединяющих белков (красный и розовый на рис. 2 A — C ) между PFR и аксонемой.Мы наблюдаем существенные связи с дублетами 5 и 6, но не с 4 и 7, как ранее визуализировалось и сообщалось (3, 41). Соединения с дублетами 4 и 7 не такие громоздкие, как соединения с дублетами 5 и 6. Они длиннее и, возможно, более гибкие, и поэтому их трудно увидеть на необработанных томограммах. Действительно, было показано, что связи с дублетами 4 и 7 представляют собой тонкие линейные структуры (13, 14, 16, 24, 42). Из-за сложности визуализации соединителей к дублетам 4 и 7 они не были выбраны для усреднения из наших реконструкций.Связующие белки, которые мы действительно наблюдаем (для дублетов 5 и 6), повторяются каждые 56 нм в прямых жгутиках, расстояние, соответствующее семи димерам тубулина вдоль аксонемы (Рис. 2 B ). Это расстояние такое же, как и у PFR-повторов вдоль аксонемы, а также похоже на периодические прикрепления, наблюдаемые в аксонеме Euglena (5). Каждый из двух рядов соединяющих белков усредняли по длине жгутиков. Средние значения связывающих белков в двух рядах близки по размеру (рис.2 B и Movie S3) и схематично представлены сферами на рис. 2 C . Вероятно, что каждая связующая плотность представляет собой комплекс из нескольких белков.
В то время как прямые жгутики использовались для определения средней структуры, изогнутые жгутики могут предложить модель их движения. Рис. 3 A — F показывают виды сверху и сбоку томограммных срезов PFR трех по-разному изогнутых жгутиков. Средние значения PFR показаны разными цветами. Кристаллографические длины элементарных ячеек изогнутого и прямого ФФП совпадают в пределах 5%: a = 52 ± 2, b = 46 ± 2 и c = 22 ± 1 нм (всего В эти средние значения вошли 7000 элементарных ячеек) (рис.3 G , рис. S5 и Movie S3). Поскольку линейные плотности белков PFR параллельны осям кристаллографических элементарных клеток скорее, чем оси аксонемы, белки PFR не сжимаются или не изгибаются (Рис. 3), когда аксонема изгибается. Скорее, плотности PFR вращаются, как если бы на шарнирах в углах кристаллографической элементарной ячейки с ножничным движением, приводя к межосевым угловым изменениям от 85 ° до 112 ° (рис. 3 G и H ).
Рис. 3.Модель T.brucei flagellum действует как биологический домкрат. Виды сбоку ( A, C, и E ) и виды сверху ( B, D, и F ) томограммы PFR, изогнутого внутрь ( A и B ), прямо ( C и D ) и загнутые наружу ( E и F ). Срезы томограммы показаны серым цветом. Выровненные и усредненные субтомограммы показаны цветом. (Шкала: 100 нм.) ( G ) Вид сверху на оси кристаллографической элементарной ячейки.В то время как осевые расстояния остаются постоянными, угол γ изменяется по мере изгиба PFR. ( H ) Модели с домкратом для PFR, представляющие угол 85 ° изогнутой внутрь (расширенной) кристаллографической элементарной ячейки; Угол прямой кристаллографической элементарной ячейки 106 °; Угол изгиба кристаллографической ячейки наружу (сжатого) составляет 112 °. Связующие белки представлены розовыми сферами.
Организация и структурная гибкость отдельных компонентов жгутика и их взаимоотношения друг с другом предполагают механизм движения трипаносомы, приводимый в действие биением аксонемы.Хорошо известно, что аксонема обеспечивает движение жгутиков (32, 43, 44). Изгиб аксонемы заставляет соединительные белки изгибаться вместе с ней, вызывая сокращение или удлинение их расстояния по сравнению с расстоянием 56 нм в прямых жгутиках (рис. 3 H и 4 A ). Это изменение расстояния между соединяющими белками, в свою очередь, сжимает или растягивает PFR в направлении аксонемы (Fig. 3). Наши наблюдения показывают, что каждая кристаллографическая элементарная ячейка PFR аналогична автомобильному домкрату (рис.3 H и Movie S4). Оси кристаллографических элементарных ячеек, соответствующие жестким плечам винтовой домкраты и составленные из структурных белков спиральной спирали, остаются постоянной по длине, тогда как межосевые углы меняются. Соединительные белки растягивают и сжимают петли PFR и, таким образом, соответствуют винту в домкрате (фиг. 3 H, и 4, и Movie S4). Изменение углов кристаллографической элементарной ячейки аналогично результатам действия винта на домкрат.Скоординированное действие элементарных ячеек, проиллюстрированное параллелограммами на фиг. 3 G , производит общее растяжение и сжатие PFR аналогично вентилю расширения (фиг. S6). Интересно, что использование гибкого белкового кристалла как части клеточно-механического устройства наблюдалось ранее (45). Акросомальный пучок на основе актина, предложенный в качестве биологической пружины (46), является еще одним примером внутриклеточного трехмерного белкового кристалла, выполняющего биомеханическую функцию.
Фиг.4.Преобразование нормального плоского движения аксонемы (пурпурный) в наблюдаемое двухспиральное волновое движение T. brucei . ( A ) Относительное скользящее движение дублетов микротрубочек будет иметь тенденцию сжимать и расширять соединительные белки (розовый) ( X 1> X 2> X 3). ( B ) Наличие PFR (зеленого цвета), смещенного на 20 °, препятствует этой тенденции, что приводит к двухспиральному изгибу прикрепленного жгутика и T.brucei ячейка.
Предпочтительная плоскость изгиба аксонемы (34) составляет приблизительно 20 ° угол с PFR (угол между пунктирными линиями на рис. 2 A и Movie S3). Ограничение на изгиб аксонемы, подобное тому, которое накладывается PFR, имеющим это смещение 20 °, будет вызывать вращение, скручивая жгутик в правую или левую спираль (Fig. 4 B and Movie S5). На рис. S7 показано это скручивание, измеренное геометрически вдоль слегка изогнутого жгутика на одном проекционном изображении.На рис. S8 показано скручивание, измеренное в 3D вдоль оси аксонемы на томограмме. Оба метода дают изгиб примерно 15 ° на 800 нм у слегка изогнутых жгутиков. Возможно, при замораживании жгутики пассивно изгибались. Однако независимо от того, что заставляет эти жгутики изгибаться, мы наблюдаем постоянное соотношение изгиба к скручиванию (Figs. S7 и S8). Таким образом, вероятно, что изолированные жгутики вынуждены изгибаться так же, как и в подвижной трипаносоме. Мы наблюдали длинные прямые жгутики на расстоянии до 15 мкм.С другой стороны, изогнутые жгутики возникают только на коротких расстояниях (менее 1 мкм) на сетке, возможно, потому, что сочетание изгиба и скручивания в конечном итоге приведет к их выходу из плоскости тонкого слоя льда. Фильмы S1 и S5 включают высокоскоростную световую микроскопию, демонстрирующую двухспиральное движение жгутиков T. brucei с частотой 19 ± 3 Гц (11). Напротив, аксонема сперматозоидов морского ежа изгибается вверх и вниз с помощью простого синусоидального движения с аналогичной частотой (32, 33) (Movie S5).В конце каждого полупериода биения аксонемы T. brucei направление скручивания меняется на противоположное, образуя спираль противоположной стороны (рис. 4 B и фильмы S1 и S5) (11). Таким образом, нормальное плоское движение аксонемы трансформируется в наблюдаемое двухспиральное волновое движение, характерное для T. brucei . Истощение сборки PFR (Рис. S1) жгутиков T. brucei с помощью RNAi (17, 23) изменяет двухспиральное движение в синусоидальное плоское движение с частотой 18 ± 1 Гц (Movie S2).Эксперименты с RNAi подтверждают критическую роль PFR в биспиральном волновом движении организма. В то время как другие структуры, включая тело клетки, могут влиять на биспиральное движение, относительная ориентация PFR по отношению к аксонеме, как наблюдали, была постоянной, в отличие от отношения жгутика к телу клетки (34).
Жгутик трипаносомы — самая сложная наномашина на основе микротрубочек, которая была исследована крио-ЭТ. Наши наблюдения подтверждают молекулярный механизм, с помощью которого свойства парааксонемных структур формируют движение Тл.brucei . Мы предлагаем простую модель трансдукции энергии от бьющейся аксонемы через связывающие белки до деформируемого кристалла PFR, что приводит к эффективному движению клетки к этой трипаносоме.
Материалы и методы
Выделение жгутиков T. brucei проводили, как описано ранее (18, 47). Приблизительно 2 × 10 9 проциклических клеток 29,13 (48) были последовательно экстрагированы буферами, содержащими 1% Nonidet P-40 и 1 M KCl.Изолированные жгутики хранили при 4 ° C. Сетки Quantifoil Copper 200 меш R 2/2 промывали в течение ночи этилацетатом. Сетки были предварительно обработаны наночастицами золота размером 15 нм для совмещения томограмм. Для приготовления замороженной гидратированной сетки на сетку наносили 2,5 мкл образца жгутиков, промокали и погружали в жидкий этан с помощью Vitrobot (FEI). Оптимальная толщина льда составляет около 300–400 нм, что немного больше диаметра жгутика, как видно на наших томограммах. Визуализацию проводили на микроскопах JEM2200FS и JEM2100 на 200 кВ, оборудованных камерами Gatan с 4 096 × 4096 пикселей CCD.JEM2200FS имеет автоэмиссионную пушку и энергетический фильтр в колонне, тогда как JEM2100 имеет пистолет LaB 6 . В зависимости от микроскопа и условий получения изображений эффективное увеличение варьировалось от 11 100 до 16 500. Серии наклона собирали с помощью SerialEM (49), нацеленного на недофокусировку 6–10 мкм. Каждая серия с углом наклона 120 ° содержала 60 изображений. Доза электронов на томограмму составляла от 60 до 74 электронов / Å 2 , что обычно используется для крио-ЭТ (50). Томограммы были восстановлены с помощью IMOD (51).Субобъемы, включающие сегменты PFR, связывающие белки и аксонему, были извлечены из реконструированных томограмм. Первоначальные модели для PFR и связывающих белков были созданы путем выравнивания и усреднения двух соседних подобъемов (52). Затем более дистальные сегменты были выровнены и итеративно усреднены с исходной моделью. Для создания окончательного среднего значения было выполнено окончательное выравнивание каждого подобъема по модели. PFR от изогнутых жгутиков, обнаруженных при визуальном осмотре, были точно выровнены друг с другом.Для аксонемы сегменты длиной 288 нм, представляющие три длины повтора 96 нм, экстрагировали вдоль каждого дублета микротрубочек. Сегменты перекрывали друг друга на 96 нм. Эти сегменты сначала выровняли по длине путем взаимной корреляции. Затем выровненные сегменты были усреднены, после чего девять усредненных дублетов были затем выровнены вращательно и поступательно и усреднены друг с другом, смягчая эффект отсутствующего клина. Наконец, исходная аксонема была повторно собрана путем правильного вращения и перевода среднего дублета микротрубочек обратно в исходный объем в девяти исходных ориентациях.Отдельно усредненные субтомограммы PFR, связывающих белков и аксонемы были снова подогнаны к исходной карте плотности томограммы. Визуализацию плотности проводили с помощью программы Chimera (53).
Благодарности
Мы благодарим Мэтью Догерти за помощь в подготовке фильмов, а также Сянган Лю и Райана Роша за помощь с иллюстрациями. Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения через Национальный центр исследовательских ресурсов (P41RR002250) и грантом на постдокторскую подготовку Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (T32 AI07471 — A.Y.K.) и C.Y.H. является научным сотрудником Сингапурского национального исследовательского фонда.
Сноски
Вклад авторов: A.Y.K., M.F.S., L.G., C.J.F., H.A.K., D.H., C.Y.H. и W.C. спланированное исследование; A.Y.K., L.G., C.J.F., H.A.K. и D.H. провели исследования; A.Y.K., M.F.S., C.Y.H. и W.C. проанализированные данные; и A.Y.K., M.F.S., C.Y.H. и W.C. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.
Размещение данных: средние значения трехмерной криоэлектронной томографии были депонированы в банке данных электронной микроскопии, www.emdatabank.org (инвентарные номера EMDB-5302, 5303, 5304, 5305 и 5306).
Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1103634108/-/DCSupplemental.
Доступно бесплатно в Интернете через опцию открытого доступа PNAS.
Классификация, характеристики, жизненный цикл и микроскопия
Обзор
Трипаносома — род, состоящий из простейших гемофлагеллят, которые существуют как обязательные паразиты растений, млекопитающих и других животных (рыб, птиц, рептилий и т. Д.).Члены этого рода, известные как трипаносомы, являются одноклеточными организмами, жизненный цикл которых зависит как от позвоночных, так и от беспозвоночных-хозяев.
Хотя некоторые из наиболее распространенных видов обитают в Африке (ответственные за африканский трипаносомоз в различных частях Африки к югу от Сахары), многие другие виды встречаются в различных частях мира (части Северной Америки, Канада и т. Д.).
В то время как некоторые виды этого рода ответственны за серьезные заболевания, большинство видов оказались непатогенными.Различные виды различаются по размеру, общей форме тела, а также расположению таких органелл, как ядро, что позволяет различать их.
Некоторые виды, принадлежащие к роду Trypanosoma, включают:
- T. brucei
- T. equiperdum
- T. cruzi
- T. bancrofti
- T. anguillicola
- T. Т. aulopi
Классификация рода Trypanosoma
· Домен: Eukaryota — Как члены домена Eukaryota, виды Trypanosoma имеют мембраносвязанные органеллы.Таким образом, они имеют более сложную структуру по сравнению с членами домена prokaryota.
· Королевство: Протиста — Также известное как Протоктиста, королевство Протиста в основном состоит из простых (одноклеточных или колоний) эукариотических организмов, которые существуют либо паразитами (например, представители рода Trypanosoma, которые зависят от хозяев). ) или как свободноживущие организмы в воде и на суше.
· Тип: Protozoa — В некоторых книгах простейшие классифицируются как царство в себе или подкоролевство.Он состоит из одноклеточных эукариотических организмов, которые существуют либо как паразиты, либо как свободноживущие организмы.
· Подтип: Sarcomastigophora — Подтип Sarcomastigophora относится к простейшим и включает ряд одноклеточных эукариотических организмов, которые характеризуются локомотивными структурами; жгутики или псевдоподии.
· Заказ: Kinetoplastida — Kinetoplastida — отряд жгутиковых простейших, характеризующийся кинетопластом (массой митохондриальной ДНК, расположенной близко к ядру).
· Семейство: Trypanosomatidae — Члены этого семейства, как и многие виды трипаносом, характеризуются одним жгутиком, который позволяет им плавать в жидкостях и крови. Название Trypanosomatidae происходит от греческих слов, которые описывают движение организмов в соответствующей среде, похожее на штопор.
Stercoraria and Salivaria
Помимо традиционной таксономии, различные роды трипаносомы (трипаносомы млекопитающих) также были классифицированы на основе способа передачи.В то время как Salivaria состоит из трипаносом, которые передаются африканскими мухами цеце, Stercoraria включает в себя роды, которые завершают свое развитие на задней станции.
Таким образом, их инфекционные формы можно найти в кале. По сравнению с организмами, описываемыми как stercoraria, роды, классифицируемые как salivaria, завершают свое развитие в слюнной системе (передняя станция).
Виды Stercoraria включают:
- T. rangeli
- T.cruzi
- T. musculi
- T. theleri
Виды Salivaria включают:
- T. suis
- T. congolense
- T. vivax
- Evans
- T. godfreyi 907
Характеристики (жизненный цикл и биология клетки)Жизненный цикл различных видов трипаносомы включает передачу паразита от одного хозяина к другому.
Согласно исследованиям, существует три основных способа передачи, к ним относятся:
· Циклическая передача — При циклическом режиме передачи паразит передается инфицированными мухами цеце.Здесь паразит развивается в насекомом, прежде чем передается, когда муха питается (через слюну). Это позволяет продолжить цикл от инфицированных хозяев к зараженным мухам цеце.
· Механическая передача — При этом способе передачи паразит передается несколькими кусающимися мухами, включая муху цеце. Согласно исследованиям, стомоксы и табаниды являются основными кусачими мухами, участвующими в передаче паразитов.
Было показано, что по сравнению с циклической передачей этот тип передачи продолжается у новых хозяев в группе животных. В результате паразит может по-прежнему распространяться в другие области, где данный переносчик мог быть полностью уничтожен.
· Пероральная и вертикальная передача — При пероральной передаче передача паразита происходит в результате проглатывания зараженных жидкостей. Например, когда теленок глотает зараженную жидкость, вероятно, произойдет инфекция.С другой стороны, вертикальная передача может произойти во время беременности или вскоре после рождения (передача от родителей к потомству).
Жизненный циклПо мере того, как паразиты трипаносомы передаются от одного хозяина к другому, они проходят несколько стадий развития, что позволяет паразиту успешно завершить свой жизненный цикл и позволить этому циклу продолжаться. В этом разделе рассматривается жизненный цикл Trypanosoma cruzi как представителя этой группы.
Можно сказать, что жизненный цикл этого паразита начинается, когда паразит в метациклической трипомастиготной стадии откладывается на коже хозяина (млекопитающее, например.грамм. человек). Вместо того, чтобы передавать паразита через укус во время кормления (как в случае с видами Salivaria), насекомое-переносчик (в данном случае клоп-редвиид) выделяет форму паразита вместе со своими экскрементами на поверхность кожи хозяина.
Здесь стоит отметить, что паразитическая форма развивается в задней части кишечника переносчика и в конечном итоге откладывается вместе с фекалиями. Учитывая, что паразит не может проникнуть через кожу, чтобы проникнуть в нижележащие клетки, их необходимо вводить механически, что может включать в себя трение или царапание раздраженной части (части кожи, где насекомое укусило хозяина).
* Метациклическая трипомастигота характеризуется тупой формой тела, а также коротким жгутиком.
Когда паразит механически проникает в кожу и попадает в кровоток, он фагоцитируется такими клетками, как макрофаги (являясь вторгающимся организмом в организм). Однако, чтобы избежать разрушения, он быстро превращается в форму амастиготы под воздействием лизосомального содержимого, которое вызывает низкий pH.
Эта новая форма паразита способна быстро мигрировать из вакуоли (которая содержит лизосомное содержимое) в цитоплазму.Здесь условия лизосомы влияют на драматическую трансформацию, характеризующуюся такой активностью, как инволюция жгутиков, формирующая поры, устойчивые к суровым условиям.
В цитоплазме / цитозоле клетки амастиготная форма (делящаяся форма паразита у млекопитающих) пролиферирует с образованием многих других форм, которые в конечном итоге заполняют инфицированную клетку. Затем за этим делением следует развитие амастиготы с образованием форм трипомастиготы с удлиненными жгутиками. Эти новые формы затем мигрируют и заражают соседние клетки, позволяя паразиту процветать.
Трипомастиготы, которые не проникают в соседние клетки, попадают в кровоток (лимфу), что позволяет им транспортироваться в другие ткани по мере того, как они продолжают дифференцироваться. Эта внеклеточная дифференцировка (по сравнению с дифференцировкой внутри клеток) приводит к образованию трипомастигот и амастиготных форм, которые захватываются вектором (редувидный микроб) во время кормления кровью.
После проглатывания (клопом) трипомастиготы дифференцируются с образованием амастигот, которые, в свою очередь, трансформируются в сферомастиготы (характеризующиеся расширением жгутиков).В свою очередь, сферомастиготы удлиняются, образуя эпимастиготы, которые продолжают развиваться, поскольку они потребляют питательные вещества, содержащиеся в кровяной муке насекомого.
По мере снижения уровня питательных веществ эти формы претерпевают дальнейшую трансформацию и в конечном итоге образуют метациклические трипомастиготы, которые являются инфекционной формой. После передачи этих форм соответствующему хосту жизненный цикл продолжается.
Некоторые из органов, уязвимых для заражения паразитом, включают:
- Печень
- Лимфатические железы
- Селезенка
- Кишечник
- Нервная система
* клетки хозяина (клетки хозяина) ), амастиготы размножаются бесполым путем посредством бинарного деления с образованием большего количества форм.Эта форма позволяет им делиться и создавать больше паразитов, которые в конечном итоге разрывают клетку. Однако после этого экстаза амастиготы должны превратиться в трипомастиготы, способные плавать в крови.
* В то время как первоначально считалось, что паразиты могут размножаться исключительно бесполым путем, новые открытия предполагают, что половое размножение также может быть частью их цикла размножения.
Как Т. Крузи вызывает болезнь Шагаса* Разрушение клеток делящимися формами паразитов — одно из негативных воздействий на хозяина.
Хотя весь механизм еще полностью не изучен, развитие болезни у млекопитающих связано с метаболизмом паразита.
В организме хозяина паразит зависит от различных питательных веществ (углеводов, липидов, белков и т. Д.) Для их выживания. По мере того как паразиты делятся и продолжают увеличиваться в количестве в организме (как в клетках, так и в крови), они продолжают использовать питательные вещества хозяина, высвобождая метаболиты, которые негативно влияют на хозяина.
Согласно исследованиям, у паразита очень маленькие запасы полисахаридов. По этой причине они должны продолжать использовать запасы хозяина для своей энергии. С другой стороны, паразиты в крови постоянно используют глюкозу для получения энергии. Здесь продукты обмена веществ, в том числе углекислый газ и ацетат, оказывают негативное влияние на хозяина.
Симптомы болезни Шагаса включают:
- Увеличение лимфатических узлов
- Общая утомляемость
- Высокая температура
- Кожная сыпь
- Тошнота и рвота
- 9202 9209 9202 9209 9202 9202 9202 также были связаны с сердечными заболеваниями (хроническая кардиомиопатия Шагаса).
Некоторые другие болезни, вызываемые видами трипаносомы, включают:
- Сонная болезнь — вызывается T. brucei
- Nagana у различных животных — вызывается T. congolense
- Дурин у лошадей — вызывается T. equiperdum
- Сурра у ряда животных — по данным T. suis и T. evansi
Морфологические характеристики трианосомных клетокКак члены домена Eukaryota, виды Trypanosoma характеризуются родовыми признаками, присущими типичным эукариотическим клеткам.
Например, как и нормальные эукариотические клетки, трипаносомная клетка имеет мембраносвязанное ядро, аппарат Гольджи, E.R., а также плазматическую мембрану среди других важных органелл. С другой стороны, как члены отряда Kinetoplastida, трипаносомы обладают рядом уникальных особенностей, включая кинетопласт, гликозомы, а также ацидокальцисомы (место хранения минералов).
Было также показано, что клетки трипаносомы обладают уникальным цитоскелетом, который в основном состоит из микротрубочек.В нем также отсутствуют центриоли, которые играют важную роль в репликации клеток. В результате плохо определенные структуры в клетке ответственны за производство веретен микротрубочек, которые способствуют закрытому митозу у этих паразитов.
Что касается отличительной общей морфологии паразита, она определяется отдельными микротрубочками, которые действуют против плазматической мембраны.
Трипаносомы также характеризуются одним жгутиком (от 2 до 20 мкм в длину), который поддерживается базальными и пробазальными тельцами внутри клетки.Как и в случае с подвижными ресничками и жгутиками, обнаруженными в различных эукариотических клетках, жгутики трипаносомных клеток характеризуются конфигурацией 9 + 2, состоящей из параллельных микротрубочек.
Структура, известная как парафлагеллярный стержень, также простирается по длине жгутика и, как было показано, обеспечивает поддержку (за счет увеличения жесткости) аксонемы жгутика, а также способствует подвижности.
* В точке, где жгутик входит в клетку, существует щель, известная как карман жгутика.Считается, что этот разрыв является точкой, в которой происходит везикулярный перенос и поглощение питательных веществ.
МикроскопияДля подготовки и наблюдения клеток трипаносомы под микроскопом можно использовать ряд методов, в том числе:
1. Метод мини-анионообменного центрифугирования (mAECT)Требования
Процедура
С помощью микропипетки возьмите около 400 мкл крови пациента и добавьте ее в миниколонку, содержащую диэтиламиноэтил.
В течение 15 минут центрифугируйте образец на низкой скорости.
Наблюдайте за образцом под микроскопом при малом увеличении (специальный держатель используется для удержания колонки при наблюдении под микроскопом).
Наблюдение
Когда кончик колонки исследуется под микроскопом, можно увидеть, что клетки трипаносомы в образце случайным образом покачиваются (движутся).
2. Центрифугирование с капиллярной трубкой (CTC)
Этот метод включает использование капиллярных трубок для сбора и наблюдения за образцом под микроскопом:
Требования
- Капиллярные пробирки
- Образец крови
- Пластилин micro- центрифуги)
- Составной микроскоп
Процедура
- Используя дезинфицирующее средство, протрите кончик пальца (пациента) и проколите ланцетом
- Сначала протрите ватный тампон, затем протрите drop
- Нажмите пальцем (не касаясь уколованной части) и с помощью капиллярного тампона соберите свежую кровь — Заполните капилляр (содержащий ЭДТА) кровью
- Поверните капиллярную трубку несколько раз, чтобы убедиться, что кровь стекает. правильно смешанный с антикоагулянтом (ЭДТА)
- С помощью пасты герметика закройте открытый конец капилляра ry tube
- Используя центрифугу для микрогематокрита, центрифугируйте пробирку на максимальной скорости около 10 минут
- Установите капиллярную трубку и наблюдайте за клетками при малой мощности — Это достигается за счет использования держателя для удерживания капиллярных пробирок на микроскопе предметного стекла и заполнения смотровых камер дистиллированной водой и закрытия камер покровным стеклом
Наблюдение
При просмотре под микроскопом клетки можно увидеть на стыке плазмы и крови клетки.
3. Окрашивание мазка крови пятном РайтаТребования
- Wright’s Stain
- Составной микроскоп
- Метанол
- Стойка для окрашивания
- Буферная вода
- Чистые стеклянные предметные стекла
- 65 9000
- Чистые предметные стекла Процедура
- Поместите каплю образца крови на чистое предметное стекло и сделайте тонкую пленку с помощью другого предметного стекла / покровного стекла
- Дайте пленке высохнуть на воздухе и погрузите предметное стекло в метанол (фиксация)
- Разрешите Слайд высохнуть на воздухе и покрыть пятном Райта и дать слайду постоять в течение 2 минут на штативе для окрашивания
- Добавьте несколько капель забуференной воды на слайд и дайте слайду постоять примерно 5 минут
- Залейте слайд с забуференной водой, а затем дайте слайду высохнуть (вытрите излишки воды под слайдом)
- Наблюдайте за слайдом под микроскоп
Подробнее о окрашивании клеток
Наблюдение
Окрашивание позволяет лучше визуализировать клетки трипаносомы, которые будут выглядеть как голубовато-лиловые тонкие организмы с тонким жгутиком на одном конце.
См. Также: Leishmania
Вернуться в Королевство Protista
Вернуться на главную страницу Eukaryotes
Вернуться на главную страницу Protozoa
Вернуться к паразитам под микроскопом
Вернуться из Trypanosoma в MicroscopeMaster home
Список литературыFnu Nagajyothi et al. (2013). Механизмы персистенции Trypanosoma cruzi при болезни Шагаса. ncbi.
Дж. Д. Смит и Дерек Вакелин.(1994). Введение в паразитологию животных. Google Книги.
Джон Л. Капинера. (2008). Энциклопедия энтомологии.
Жюльен Бонне, Клотильда Будо и Бертран Куртьу. (2015). Обзор методов диагностики, используемых в полевых условиях для африканского трипаносомоза человека: что может измениться в ближайшие годы? BioMed Research International
Том 2015, идентификатор статьи 583262, 10 страниц.
К. М. Тайлер, К. Л. Олсон и Д. М. Энгман. (2001). Жизненный цикл Trypanosoma Cruzi.
Ссылки
https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/chagas-disease-(american-trypanosomiasis)
https: // www. researchgate.net/figure/Classification-of-trypanosomes_fig3_41562855
Криоэлектронная микроскопия с высоким разрешением: структура рибосомы Trypanosoma brucei
- 1
Ben-Shem, A. et al. Кристаллическая структура эукариотической рибосомы. Наука 330 , 1203–1209 (2010)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 2
Бен-Шем, А.и другие. Структура эукариотической рибосомы с разрешением 3,0 Å. Наука 334 , 1524–1529 (2011)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 3
Armache, J. P. et al. Локализация эукариот-специфических рибосомных белков на крио-ЭМ карте 5,5 Å 80S эукариотической рибосомы. Proc. Natl Acad. Sci. США 107 , 19754–19759 (2010)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 4
Армаш, Дж.P. et al. Крио-ЭМ структура и модель рРНК транслирующейся эукариотической 80S рибосомы с разрешением 5,5 Å. Proc. Natl Acad. Sci. США 107 , 19748–19753 (2010)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 5
Rabl, J., Leibundgut, M., Ataide, SF, Haag, A. & Ban, N. Кристаллическая структура эукариотической 40S рибосомной субъединицы в комплексе с фактором инициации 1. Science 331 , 730–736 (2011)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 6
Клинге, С., Фойгтс-Хоффманн, Ф., Лейбундгут, М., Арпагаус, С. и Бан, Н. Кристаллическая структура эукариотической 60S рибосомной субъединицы в комплексе с фактором инициации 6. Science 334 , 941–948 (2011)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 7
Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M. & Ban, N. Атомные структуры эукариотической рибосомы. Trends Biochem.Sci. 37 , 189–198 (2012)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 8
Уилсон, Д. Н. и Дудна Кейт, Дж. Х. Структура и функция эукариотической рибосомы. Cold Spring Harb. Перспектива. Биол. 4 , a011536 (2012)
Артикул CAS PubMed PubMed Central Google ученый
- 9
Ёкояма, Т.& Suzuki, T. Рибосомные РНК толерантны к генетическим вставкам: эволюционное происхождение сегментов экспансии. Nucleic Acids Res. 36 , 3539–3551 (2008)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 10
White, T.C., Rudenko, G. & Borst, P. Три малых РНК в пределах единицы транскрипции трипаносомной рРНК размером 10 т.п.н. аналогичны домену VII другой 28S рРНК эукариот. Nucleic Acids Res. 14 , 9471–9489 (1986)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 11
Cordingley, J. S. & Turner, M. J. 6.5 S РНК; предварительная характеристика необычных малых РНК в Trypanosoma brucei . Мол. Biochem. Паразитол. 1 , 91–96 (1980)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 12
Кэмпбелл Д.A., Kubo, K., Graham Clark, C. & Boothroyd, J. C. Точная идентификация сайтов расщепления, участвующих в необычном процессинге рибосомной РНК трипаносомы. J. Mol. Биол. 196 , 113–124 (1987)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 13
Berriman, M. et al. Геном африканской трипаносомы Trypanosoma brucei . Наука 309 , 416–422 (2005)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 14
Гао, Х., Юри Аюб, М., Левин, М. Л. и Франк, Дж. Структура 80S рибосомы из Trypanosoma cruzi обнаруживает уникальные компоненты рРНК. Proc. Natl Acad. Sci. США 102 , 10206–10211 (2005)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 15
Clayton, C. & Shapira, M. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов в трипаносомах и лейшманиозах. Мол.Biochem. Паразитол. 156 , 93–101 (2007)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 16
Михаэли, С. Транс-сплайсинг в трипаносомах: механизм и его влияние на транскриптом паразита. Future Microbiol. 6 , 459–474 (2011)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 17
Сиганда, М.И Уильямс, Н. Характеристика новой ассоциации между двумя специфическими для трипаносомы белками и 5S рРНК. PLoS ONE 7 , e30029 (2012)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 18
Ivens, A.C. et al. Геном кинетопластидного паразита Leishmania major . Наука 309 , 436–442 (2005)
Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 19
Zhang, Q., Bettadapura, R. & Bajaj, C. Моделирование макромолекулярной структуры из трехмерной ЭМ с использованием VolRover 2.0. Биополимеры 97 , 709–731 (2012)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 20
Пинтили, Г., Чжан, Дж., Годдард, Т., Чиу, В. и Госсард, Д. Количественный анализ сегментации крио-ЭМ карты плотности с помощью фильтрации водораздела и масштабного пространства, а также подгонка структур по выравниванию по регионам. J. Struct. Биол. 170 , 429–438 (2010)
Артикул CAS Google ученый
- 21
Jossinet, F. & Westhof, E. От последовательности к структуре (S2S): отображение, управление и взаимосвязь данных РНК от последовательности к структуре. Биоинформатика 21 , 3320–3321 (2005)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 22
Жосине, Ф., Ludwig, T. E. и Westhof, E. Assemble: интерактивный графический инструмент для анализа и построения архитектур РНК на 2D и 3D уровнях. Биоинформатика 26 , 2057–2059 (2010)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 23
Трабуко, Л. Г., Вилья, Э., Митра, К., Франк, Дж. И Шультен, К. Гибкое приспособление атомных структур к картам электронной микроскопии с использованием молекулярной динамики. Структура 16 , 673–683 (2008)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 24
Ляо, Х. Й. и Франк, Дж. Классификация методом начальной загрузки в методах отдельных частиц. IEEE Int. Symp. Биом. Imaging 169–172 (2010)
- 25
Cannone, J. J. et al. Сайт сравнения РНК (CRW): онлайн-база данных сравнительной информации о последовательностях и структуре рибосомных, интронных и других РНК. Биоинформатика 3 , 2 (2002)
PubMed PubMed Central Google ученый
- 26
Ayub, M.J., Atwood, J., Nuccio, A., Tarleton, R. & Levin, M.J. Протеомный анализ рибосомных белков Trypanosoma cruzi . Biochem. Биофиз. Res. Commun. 382 , 30–34 (2009)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 27
Меюхас, О.Физиологические роли рибосомного белка S6: единственный в своем роде. Внутр. Rev. Cell Mol. Биол. 268 , 1–37 (2008)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 28
Srivastava, S., Verschoor, A. & Frank, J. Фактор инициации эукариот 3 не предотвращает ассоциации посредством физического блокирования интерфейса субъединица-субъединица рибосомы. J. Mol. Биол. 226 , 301–304 (1992)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 29
Сиридечадилок, Б., Fraser, C. S., Hall, R.J., Doudna, J. A. & Nogales, E. Структурные роли человеческого фактора трансляции eIF3 в инициации синтеза белка. Наука 310 , 1513–1515 (2005)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 30
Лескринье, Э. М. Х. П. и др. Структура богатой пиримидином внутренней петли в 30′-UTR полиовируса: важность поддержания псевдо-2-кратной симметрии в спиралях РНК, содержащих две соседние неканонические пары оснований. J. Mol. Биол. 331 , 759–769 (2003)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 31
Kaminsky, R., Beaudoin, E. & Cunningham, I. Выращивание стадий жизненного цикла Trypanosoma brucei sspp. Acta Trop. 45 , 33–43 (1988)
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
- 32
Гомес, Э.Б., Медина, Г., Баллеста, Дж. П., Левин, М. Дж. И Теллез-Иньон, М. Т. Кислые рибосомные белки Р фосфорилируются в Trypanosoma cruzi . Внутр. J. Parasitol. 31 , 1032–1039 (2001)
Артикул PubMed PubMed Central Google ученый
- 33
Грассуччи Р. А., Тейлор Д. Дж. И Франк Дж. Приготовление макромолекулярных комплексов для криоэлектронной микроскопии. Протоколы природы 2 , 3239–3246 (2007)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 34
Дубоше, Дж.и другие. Криоэлектронная микроскопия застеклованных образцов. Q. Rev. Biophys. 21 , 129–228 (1988)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 35
Wagenknecht, T., Frank, J., Boublik, M., Nurse, K. & Ofengand, J. Прямая локализация сайта взаимодействия тРНК-антикодон на рибосомной субъединице Escherichia coli 30 S электронным способом микроскопия и компьютерное усреднение изображений. J. Mol. Биол. 203 , 753–760 (1988)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 36
Lei, J. & Frank, J. Автоматическое получение криоэлектронных микрофотографий для реконструкции отдельных частиц на электронном микроскопе FEI Tecnai. J. Struct. Биол. 150 , 69–80 (2005)
Артикул PubMed PubMed Central Google ученый
- 37
Франк, Дж.и другие. SPIDER и WEB: обработка и визуализация изображений в 3D электронной микроскопии и смежных областях. J. Struct. Биол. 116 , 190–199 (1996)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 38
Shaikh, T. R. et al. Обработка изображений SPIDER для одночастичной реконструкции биологических макромолекул из электронных микрофотографий. Протоколы природы 3 , 1941–1974 (2008)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 39
Scheres, S.H. W. et al. Распутывание конформационных состояний макромолекул в 3D-EM посредством оптимизации правдоподобия. Nature Methods 4 , 27–29 (2007)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 40
Scheres, S.H. W., Nuñez-Ramirez, R., Sorzano, C.O. S., Carazo, J. M. & Marabini, R. Обработка изображений для анализа одиночных частиц с помощью электронной микроскопии с использованием Xmipp. Протоколы природы 3 , 977–990 (2008)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 41
Хейманн, Дж.B. Bsoft: обработка изображений и молекул в электронной микроскопии. J. Struct. Биол. 133 , 156–169 (2001)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 42
Хейманн, Дж. Б., Кардоне, Г., Винклер, Д. К. и Стивен, А. С. Вычислительные ресурсы для криоэлектронной томографии в Bsoft. J. Struct. Биол. 161 , 232–242 (2008)
Артикул PubMed PubMed Central Google ученый
- 43
Пинтили, Г., Чжан, Дж., Годдард, Т., Чиу, В. и Госсард, Д. Количественный анализ сегментации крио-ЭМ карты плотности с помощью фильтрации водораздела и масштабного пространства, а также подгонки структур путем выравнивания по регионам. J. Struct. Биол. 170 , 427–438 (2010)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 44
Петтерсен, Э. Ф. и др. UCSF Chimera — система визуализации для поисковых исследований и анализа. J. Comput. Chem. 13 , 1605–1612 (2004)
Артикул CAS Google ученый
- 45
Бейкер, М. Л., Ю, З., Чиу, В. и Баджадж, К. Автоматическая сегментация молекулярных субъединиц в картах плотности электронной криомикроскопии. J. Struct. Биол. 156 , 432–441 (2006)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 46
Ю.З.& Bajaj, C. Автоматическая сегментация ультраструктуры реконструированных криоЭМ-карт икосаэдрических вирусов. IEEE Trans. Процесс изображения. 14 , 1324–1337 (2005)
Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 47
Zhang, Q., Bettadapura, R. & Bajaj, C. Моделирование макромолекулярной структуры из 3D EM с использованием VolRover 2.0. Биополимеры 97 , 709–731 (2012)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 48
Zeyen, Y.& Bajaj, C. Вычислительные подходы для автоматического структурного анализа больших биомолекулярных комплексов. IEEE / ACM Trans. Comput. Биол. Биоинформ. 5 , 568–582 (2008)
Артикул CAS Google ученый
- 49
Penczek, P. A., Yang, C., Frank, J. & Spahn, C. M. Оценка дисперсии при одночастичной реконструкции с использованием метода бутстрапа. J. Struct. Биол. 154 , 168–183 (2006)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 50
Чжан, В., Киммель, М., Спан, К. М. и Пенчек, П. А. Неоднородность крупных макромолекулярных комплексов, выявленная с помощью трехмерного крио-ЭМ дисперсионного анализа. Структура 16 , 1770–1776 (2008)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 51
Ляо, Х. Й. и Франк, Дж. Классификация методом начальной загрузки в методах отдельных частиц. IEEE Int. Symp. Биом. Imaging 169–172 (2010)
- 52
Simonetti, A.и другие. Структура комплекса инициации трансляции 30S. Nature 455 , 416–420 (2008)
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 53
Pruesse, E. et al. SILVA: всеобъемлющий онлайн-ресурс для проверенных и согласованных данных о последовательностях рибосомных РНК, совместимых с ARB. Nucleic Acids Res. 35 , 7188–7196 (2007)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 54
Кэнноне, Дж.J. et al. Сайт Comparative RNA Web (CRW): онлайн-база данных сравнительной информации о последовательностях и структуре рибосомных, интронных и других РНК. Биоинформатика 3 , 2 (2002)
PubMed PubMed Central Google ученый
- 55
Уилл С., Джоши Т., Хофакер И. Л., Стадлер П. Ф. и Бакофен Р. LocARNA-P: точное предсказание границ и улучшенное обнаружение структурных РНК. РНК 18 , 900–914 (2012)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 56
Арнольд К., Бордоли, Л., Копп, Дж. И Шведе, Т. Рабочее пространство SWISS-MODEL: веб-среда для моделирования гомологии структуры белков. Биоинформатика 22 , 195–201 (2006)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 57
Кифер, Ф., Арнольд, К., Кюнцли, М., Бордоли, Л. и Шведе, Т. Репозиторий SWISS-MODEL и связанные ресурсы. Nucleic Acids Res. 37 , D387 – D392 (2009)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 58
Келли, Л.А. и Стернберг, М. Дж. Э. Прогнозирование структуры белка в сети: тематическое исследование с использованием сервера Phyre. Протоколы природы 4 , 363–371 (2009)
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 59
Chen, V. B. et al. MolProbity: проверка структуры всех атомов для кристаллографии макромолекул. Acta Crystallogr. Д 66 , 12–21 (2010)
КАС Статья PubMed PubMed Central Google ученый
- 60
Дэвис, И.W. et al. MolProbity: всеатомные контакты и проверка структуры белков и нуклеиновых кислот. Nucleic Acids Res. 35 , W375 – W383 (2007)
Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ PubMed PubMed Central Google ученый
- 61
Хамфри В., Далке А. и Шультен К. VMD: визуальная молекулярная динамика. J. Mol. График. Модель. 1 , 33–8–27-8 (1996)
Артикул Google ученый
- 62
Филлипс, Дж.
- Чистые предметные стекла Процедура
