Смеси хумана состав: Смесь Humana Эксперт 1 350г с 0месяцев

Содержание

Смесь Humana Эксперт 1 350г с 0месяцев

Заменитель молока Humana Expert 1 — это специально разработанная молочная смесь, которая по составу и полезности максимально приближена к грудному молоку. Заменитель хорошо растворяется и имеет приятный вкус, поэтому ребенок будет есть его с удовольствием. Продукт отлично усваивается и будет укреплять организм ребенка, помогая рему правильно развиваться.

Особенности продукта:

Изготовлен из свежего (не порошкового) ВIO-молока.
Содержит пребиотики для поддержания здоровой микрофлоры кишечника, что способствует хорошему пищеварению, мягкому стулу и естественному укреплению иммунитета.
Обогащен Омега-3 (DHA) и Омега-6 (ARA) жирными кислотами, которые обеспечивают правильное формирование головного мозга и органов зрения малыша.
Входящие в состав нуклеотиды повышают сопротивляемость организма инфекциям.
Содержит Таурин, Инозитол, L-карнитин, Холин, а также Антиоксидантный комплекс (селен, йод, вит. A, E).
Аминокислотный профиль и соотношение жирных кислот схожи с составом грудного молока.
Смесь сбалансирована в соответствии с потребностями ребенка данной возрастной группы.
Состав соответствует 88-ФЗ и требованиям ЕврАзЭС.

Состав: обезжиренное молоко, сухая деминерализованая молочная сыворотка, растительные масла (пальмовое, рапсовое, подсолнечное), лактоза, сироп галактоолигосахаридов, кальция карбонат, натрия цитрат, калия хлорид, рыбий жир, кальция ортофосфат, калия цитрат, L-фенилаланин, L-тирозин, магния карбонат, таурин, L-триптофан, витамины (C, E, A, B1, B2, B6, B12, D3, K, фолиевая кислота, пантотеновая кислота, биотин, ниоцин), железа сульфат, L-молочная кислота нуклеотиды (цитидин-5-монофосфат, уридин-5-монофосфат, аденозин-5-монофосфат, инозин-5-монофосфат, гуанозин-5-монофосфат), цинка сульфат, холина гидроген тартрат, медь-лизиновый комплекс, марганца сульфат, калий йодит, натрий селенат.

Энергетическая ценность в 100 г. порошка: 512 ккал.

Humana 1 с 0 мес. картон 300гр. » Humana Baby

Описание

Смесь Humana 1 cпециально создана для удовлетворения пищевых потребностей новорожденного. Идеальна для смешанного или искусственного вскармливания, при невозможности грудного вскармливания.

Полезно знать:

C рождения до 6 месяцев.
Из свежего (не порошкового) молока, которое поступает на производство с 29 собственных молочных ферм в течение 2 часов после дойки.
Смесь производится исключительно в Германии – гарантия стабильного высокого качества продукции.
Содержит пребиотики – ГОС для лучшего пищеварения.
По составу приближена к грудному молоку – обогащена сывороточными белками и незаменимыми аминокислотами.
Содержит витаминно-минеральный комплекс, соответствующий возрастным потребностям, включая витамин D.
Подходит для приготовления каш.
Без глютена.
Без крахмала.

В состав Humana 1 входят:

Белок высокого качества, который легко переваривается и усваивается. Высокое качество белка обеспечивается уникальной технологией бережной обработки сырья при щадящих температурах. В результате чего достигается меньшая денатурация белка и высокая пищевая ценность смеси. Непрерывный контроль на всех этапах производства включает в себя около 600 анализов и обеспечивает соответствие смеси европейским и международным стандартам качества. Соотношение казеина к белкам молочной сыворотки приближено к грудному молоку, что способствует успешному перевариванию и усвоению смеси, а также снижает риск развития ожирения.

Содержит только лактозy.

Омега-3 и Омега-6 полиненасыщенные жирные кислоты способствуют правильному формированию головного мозга, нервной системы и зрения.

Пребиотики галактоолигосахариды (ГОС): способствуют здоровому развитию микрофлоры кишечника, способствуют укреплению иммунитета, улучшают всасывание минеральных веществ, являются средством профилактики запоров.

Важно!

Для детей раннего возраста предпочтительно грудное вскармливание. Перед началом применения смеси обязательно проконсультируйтесь с педиатром.

Способ приготовления:

Точно следуйте рекомендациям по способу приготовления и дозировке, руководствуясь таблицей кормления

Таблица кормления

Количество на 1 кормление

Возраст

Вода (мл)

Мерных ложек

Готовое питание (мл)

Кол. кормлений в сутки

1 неделя

По рекомендации врача

2-8 недель

100

7-8

С 4 до 6 месяцев

180

200

4-5

В соответствии с индивидуальными потребностями ребенка порция может отличаться от рекомендованной. Необходимо использовать только прилагаемую мерную ложку Humana. 1 мерная ложка без «горки» содержит около 4,5 г порошка

Условия хранения

До и после вскрытия банки продукт хранить в сухом прохладном месте при температуре от +5°С до +25°С и относительной влажности воздуха не более 75%. После вскрытия продукт хранить плотно закрытым, содержимое использовать в течение 3х недель.

Внимание! Неправильное хранение и приготовление смеси Humana 1 могут неблагоприятно влиять на здоровье Вашего малыша. Важно! Для детей раннего возраста предпочтительно грудное вскармливание.

Состав

Обезжиренное молоко, деминерализованный порошок молочной сыворотки, растительные масла (пальмовое, рапсовое, подсолнечное), лактоза, сироп галактоолигосахаридов, карбонат кальция, эмульгатор (соевый лецитин), хлорид калия, цитрат натрия, цитрат калия, комплекс витаминов (аскорбиновая кислота, ниацин, пантотеновая кислота, альфа-токоферола ацетат, ретинол, тиамин, пиридоксин, рибофлавин, фолиевая кислота, фитоменадион, биотин, холекальциферол, цианокобаламин), L-тирозин, фосфат кальция, карбонат магния, таурин, L-триптофан, инозит, лактат железа, оксид цинка, сульфат цинка, cульфат меди, йодат калия, сульфат марганца, селенат натрия.

Пищевая ценность:

Среднее содержание

Единица измерения

Кол-во на 100г порошка

Кол-во на 100 мл готового к употреблению продукта

Энергетическая ценность

кДж/ккал

2036/275

486/66

Жиры

3,1

из которых насыщенные жирные кислоты

8,4

1,1

из которых мононенасыщенные жирные кислоты

9,8

1,3

из которых полиненасыщенные жирные кислоты

4,8

0,7

Линолевая кислота (ω-6)

мг

4180

564

Альфа-линоленовая кислота (ω-3)

мг

594

Линолевая кислота / линоленовая кислота

Углеводы

7,8

Лактоза

56,7

7,6

Декстрины

0,4

0,1

Пищевые волокна

3,4

0,5

Галактоолигосахариды

3,4

0,5

Белки

10,1

1,3

Натрий

мг

145

Калий

мг

510

Хлориды

мг

330

Кальций

мг

435

Фосфор

мг

240

Магний

мг

Железо

мг

4,5

0,6

Цинк

мг

4,9

0,7

Медь

мкг

345

Йод

мкг

Селен

мкг

1,9

Марганец

мкг

6,9

Витамин А

мкг

480

Витамин D

мкг

1,1

Витамин В1 (Тиамин)

мкг

475

Витамин В2 (Рибофлавин)

мкг

840

113

Ниацин

мкг

5110

690

Пантотеновая кислота

мкг

2960

400

Витамин В6

мкг

425

Биотин

мкг

2,3

Фолиевая кислота

мкг

Витамин В12

мкг

1,33

0,18

Витамин С

мг

Витамин К

мкг

5,3

Витамин Е

мг

5,8

0,8

L-карнитин

мг

Холин

мг

130

Инозит

мг

8,5

Таурин

мг

5,1

Осмоляльность

мОсм/кг

300

Обзор детских молочных смесей «Хумана» для новорожденных

Смеси «Хумана» относятся к детскому питанию премиум класса и производятся немецкой компанией Humana Gmbh. В России ее представляет ООО «Хумана Раша», выступающая как торговый представитель. Собственного производства в России Humana не имеет. Свою первую смесь выпустила в 1950 г. Ее разработчиком был немецкий врач-педиатр Хайнц Лемке. С тех пор ассортимент продукции значительно расширился. Кроме заменителей молока, учитывающих потребности, как здоровых детей, так и детей с проблемами пищеварения, Humana стала выпускать каши, а в ближайшее время планирует производить смеси с гречневыми хлопьями и яблоком.

Состав и виды смесей «Хумана»

Все смеси «Хумана» созданы для вскармливания детей в случае невозможности кормления материнским молоком и имеют традиционное деление по возрасту ребенка и назначению. Почему следует выбрать питание «Хумана»?

Данное детское питание хорошо адаптировано под нужды детского организма, отличается качественными ингредиентами.
Молоко поступает исключительно из семейных фермерских хозяйств вблизи г. Херфорд, которые тщательно следят за животными и качеством их питания.

Используются компоненты только премиального качества, а сырье сразу после поступления идет на переработку.
Более 600 тестов гарантируют строгий контроль качества и безопасность.
Производитель – концерн DMK GMBH входит в ТОП 10 ведущих компаний молочной отрасли Европы.
Единственное питание по-настоящему немецкого качества, так как производится исключительно в Германии.
Наличие многочисленных сертификатов качества.

Молочные смеси для здоровых детей

Выпускаются в упаковках по 350 г. Из содержимого одной банки «Хумана Эксперт 1» можно приготовить 2,7 л готового питания, «Хумана Эксперт 2» – 2,5 л. Рекомендованы в качестве основного питания в случае отсутствия грудного молока или для дополнительного при его недостатке.

«Хумана Эксперт 1» («Humana Expert 1») для здоровых детей с рождения и до 6 месяцев.

«Хумана Эксперт 2» («Humana Expert 2») для здоровых детей с 6 и до 12 месяцев.
«Хумана Эксперт 3» («Humana Expert 3») для здоровых детей с 12 месяцев.

Питание содержит жизненно необходимый набор питательных веществ, витаминов и микроэлементов. В составе присутствуют омега-3 и омега-6 жирные кислоты, необходимые для мозга и зрения малыша, пребиотики (галактоолигосахариды) для питания полезной микрофлоры кишечника, нуклеотиды, способствующие формированию иммунитета.

Важно! Все смеси «Хумана» не содержат искусственных консервантов, красителей, подсластителей и ГМО.

Детские смеси для новорожденных с проблемами пищеварения

Помимо обязательных компонентов, которые должна содержать смесь для обеспечения пищевых и энергетических потребностей растущего организма, она имеет свои особенности состава, которые нацелены на устранение и профилактику нарушений пищеварения.

«Хумана ГА 1 гипоаллергенная» («Humana НА 1») с рождения и до 6 месяцев

Относится к профилактическому детскому питанию. Содержит частично гидролизованные белки молочной сыворотки, которые снижают риск возникновения аллергии. Питание обогащено пребиотиками, нуклеотидами, жирными кислотами. Для детей старше 6 месяцев выпускается «Хумана ГА 2 гипоаллергенная» («Humana НА 1»). Масса нетто 300 г.

Гипоаллергенное питание для новорожденных

«Хумана низколактозная ЛП» («Humana HN») с рождения

Лечебное детское питание. Используется при нарушениях пищеварения различного генеза, в том числе лактазной недостаточности. Терапевтическое действие связано с наличием в составе пребиотиков, волокон банана, низкого содержания лактозы (1,5 г на 100 мл питания) и жира. Обладает приятным банановым вкусом. Если ребенок маленький, то используется как смесь, а для детей постарше как каша (содержит рисовую муку, картофельный крахмал). Из минусов – в составе нет нуклеотидов, рыбьего жира (источник омега-3 и омега-6 жирных кислот). Масса нетто 300 г.

Низколактозное питание для детей

«Хумана низколактозная ЛП+СЦТ» («Humana HN+МСТ») с рождения

Лечебное детское питание со вкусом банана. Рекомендовано при кишечных расстройствах, лактазной недостаточности, целиакии, муковисцидозе. Обогащено среднецепочечными триглицеридами, которые хорошо всасываются даже при дефиците липазы и желчных кислот. Пищевые волокна из банана (пребиотики фруктоолигосахариды) поддерживают здоровую микрофлору и сорбируют вредные токсины. Сниженное содержание лактозы (0,5 г на 100 мл питания) и жира. Если ребенок маленький, то используется как смесь, а для детей постарше как каша (содержит рисовую муку). Из минусов – в составе нет нуклеотидов, рыбьего жира. Масса нетто 300 г.

«Хумана антиколики» («Humana AntiColic») с рождения

Сухая молочная смесь для детей, склонных к коликам, запорам, вздутию живота, срыгиваниям. Содержит частично гидролизованные белки молочной сыворотки, которые меньше задерживаются в желудке и легко усваиваются. В составе присутствует β-пальмитат (жир, в котором пальмитиновая кислота находится в положении 2 в триглицеридах, как и в грудном молоке), полученный на основе молочного коровьего жира, предупреждающий образование кальциевых мыл. Тем самым увеличивается усвояемость жирных кислот, кальция, устраняются запоры и колики. Низкое содержание лактозы позволяет использовать питание при лактазной недостаточности. Содержит галактоолигосахариды, обладающие пребиотическим эффектом, нуклеотиды, рыбий жир. Масса нетто 300 г.

Питание при запорах и коликах

«Хумана бифидус» («Humana Bifidus») с рождения и до 6 месяцев

Лечебная и лечебно-профилактическая молочная смесь с пребиотиком лактулозой, обладающим бифидогенными свойствами при дисбактериозе и запорах. Из минусов – не содержит нуклеотиды и рыбий жир. Масса нетто 300 г.

«Хумана антирефлюксная» («Humana AR») с рождения

Сухая молочная смесь для кормления детей, склонных к срыгиванию. Способствует снижению частоты и интенсивности срыгиваний за счет наличия натурального загустителя – камеди бобов рожкового дерева. Данный компонент также снижает интенсивность колик, делает стул более мягким, уменьшая вероятность запоров. Смесь не содержит пребиотиков, нуклеотидов. Масса нетто 400 г.

Антирефлюксное питание

«Хумана соя» («Humana SL») с рождения

Безмолочная безлактозная смесь на основе концентрата соевого белка. Рекомендована для детей с аллергией на белок коровьего молока, нарушениями углеводного обмена (непереносимость галактозы, лактозы, фруктозы, сахарозы). Из минусов – смесь не содержит пребиотиков, нуклеотидов, рыбьего жира. Масса нетто 500 г.

Соевые смеси

Преимущества и недостатки по отзывам педиатров и родителей

Мамы и врачи-педиатры выделяют ряд преимуществ смеси «Хумана» для детей от 0 до 6 месяцев:

адаптирована под возрастные особенности детей;
легко готовится, приятная на вкус.

К недостаткам относят:

наличие в составе пальмового масла;
найти питание можно далеко не в каждом магазине;
цена сравнительно высокая и сильно зависит от валютного курса, так как заводы по изготовлению продукта находятся за границей РФ.

Смесь обычно хорошо переносится детьми и большинство родителей ею довольны. Однако, в истории производителя этого детского питания, как и, впрочем, некоторых других, были и черные полосы. Например в 2003 году, когда недостаток витамина В1 в соевой смеси «Хумана» привел к смерти нескольких младенцев из Израиля и запрету ввоза продукции данного производителя в Россию. Через некоторое время запрет сняли, так как никаких нарушений в отношении смесей, поставляемых на российский рынок, обнаружено не было. Далее продукция Humana еще раз запрещалась к ввозу в 2013 году уже в связи с низким качеством. Сегодня никаких ограничений по ввозу на территорию РФ нет.

Важно! Перед тем как покупать продукт проконсультируйтесь со специалистом для выбора наиболее оптимального вида смеси «Хумана» для вашего ребенка.

Как развести смесь ребенку – пошаговая инструкция

Важно точно следовать инструкции по применению, указанной на упаковке.
Руки должны быть хорошо вымытыми с мылом.
Приготовление питания необходимо вести в чистой, бутылочке, которую вместе с соской и кольцом надо простерилизовать.
Воду нужно предварительно вскипятить и остудить до 50°С.

Мерную ложечку из упаковки с продуктом перед первым использованием ополосните водой и высушите.
Набирая порошок, следите, чтобы не было горки. Излишки можно убрать ножом.
В бутылочку сначала налейте воду, а затем, используя таблицу кормления для дозирования, насыпьте необходимое количество порошка. Если сделать наоборот, на дне может образоваться трудно растворимый сгусток.
Хорошо перемешайте содержимое бутылочки.
Температура смеси не должна превышать 37°С.
Если смесь слишком сильно остыла, не подогревайте ее в микроволновой печи. Из-за неравномерного прогрева жидкости может обжечь ребенка.
Если ребенок съел не весь объем детского питания, остатки хранить больше одного часа нельзя.
Вскрытую банку следует хранить в прохладном, достаточно сухом месте. Холодильник для этой цели не подходит.

Переводить ребенка на смесь “Хумана” следует постепенно, небольшими порциями, начав с утреннего кормления. В течение недели надо увеличивать объем питания и количество кормлений пока ребенок полностью не перейдет на новый заменитель молока.

Как понять, что смесь не подходит

Очень редко бывает так, что смесь не подходит ребенку. В большинстве случаев это обусловлено индивидуальными особенностями детского организма. Проявления носят следующий характер:

сыпь или покраснение на коже;
понос или запор:
срыгивание;
беспокойство ребенка.

При обнаружении одного или нескольких упомянутых признаков следует прекратить давать смесь «Хумана» ребенку и обратиться за консультацией по подбору смеси к специалисту.

Купить смесь “Хумана” в магазине Акушерство

Сухая молочная смесь Humana expert 0-6 месяцев — рейтинг 3,52 по отзывам экспертов ☑ Экспертиза состава и производителя

Отзывы на Humana expert

В оценке товаров мы используем исключительно отзывы экспертов, которые основаны на лабораторных исследованиях. Мы не собираем отзывы пользователей, так как ими легко манипулировать. Однако вы можете оставить отзыв о нашем исследовании.

Сухая адаптированная молочная смесь для детского питания с рождения до 6 месяцев под торговой маркой Humana Expert произведена «Хумана ГмбХ» в Германии. Образец был приобретен в интернет-магазине Ozon.ru.
Эта смесь безопасна. В ее составе не было обнаружено антибиотиков, тяжелых металлов и токсичных элементов. Микробиологические показатели соответствуют установленным требованиям. Консерванты (в числе которых сорбиновая, пропионовая и бензойная кислоты) в составе отсутствуют. Смесь хорошо растворяется в воде. Уровень кислотности (pH) соответствует опережающему стандарту Роскачества. Это значит, что смесь будет хорошо усваиваться. Она нормальной влажности. Содержание белков, жиров и углеводов соответствует заявленному в маркировке.

Она богата аминокислотами (такими как линолевая, лауриновая, миристиновая), оказывающими благотворное влияние на развитие ребенка. Однако содержание галактоолигосахаридов (пребиотиков) – питательных веществ, необходимых для поддержания здоровой микрофлоры организма, – выше заявленного в маркировке. В смеси достаточно таких минеральных веществ, как фосфор, магний, медь, железо, цинк, йод и селен. Однако содержание кальция и марганца в ней ниже заявленного в маркировке, а калия и натрия – выше. Кроме того, содержание калия и натрия в разведенной смеси выше необходимой ребенку суточной нормы. Смесь богата витаминами A, E, D3, PP, однако в ней недостаточно витамина С (аскорбиновой кислоты), а также витамина B2. Следует отметить, что витамин С является летучим веществом, по этой причине его содержание могло уменьшиться в процессе хранения. Несмотря на отклонения от информации, заявленной в маркировке, продукция обеспечит здорового ребенка в необходимых количествах всеми веществами, содержание которых нормируется в молочных смесях. Крахмала в составе смеси не обнаружено.
Смесь представляет собой мелкий однородный сухой порошок. В восстановленном виде жидкость однородная. Она лимонно-кремового цвета. В восстановленном виде имеет приятный запах пастеризованного обезжиренного молока; вкус нежный, слегка сладковатый; без посторонних привкусов и запахов. Фактическая масса нетто соответствует указанной в маркировке.

Производитель
МСК Ритейл
Изготовитель
«Хумана ГмбХ», 32051 Херфорд, Билефельдер ш. 66
Год изготовления
2018
Вес
350 г
Состав
Обезжиренное молоко, сухая деминерализованная молочная сыворотка, смесь масел (растительные масла (пальмовое, рапсовое, подсолнечное), масло из Morterella alpina), лактоза, сироп галактоолигосахаридов, кальция карбонат, натрия цитрат, калия хлорид, рыбий жир, кальция ортофосфат, L-тирозин, калия цитрат, L-фенилаланин, таурин, L-триптофан, магния карбонат, витамины (С, Е, А, В1, В2, В6, В12, D3, К, фолиевая кислота, пантотеновая кислота, биотин, ниацин), сульфат железа, стабилизатор: L (+) молочная кислота, нуклеотиды (цитидин-5′-монофосфат, уридин-5′-монофосфат, аденозин-5′-монофосфат, инозин-5′-монофосфат, гуанозин-5′-монофосфат), цинка сульфат, холин гидрогентартрат, медь-лизиновый комплекс, калия йодат, марганца сульфат, натрия селенат.
Штрихкод
4031244777867

состав детского питания, виды и фото

Основная цель всех детских молочных смесей – заменить грудное молоко. Использование смеси Humana не ограничивается одним искусственным вскармливанием. Ими кормят детей со сбоями в функционировании пищеварительной системы, а также в случае аллергии. Детское питание фирмы Humana представлено широким ассортиментом смесей, оказывающих лечебное действие при разнообразных нарушениях. Продукция легко усвояема и является гарантией полноценного развития ребенка. Найти отзывы о продукции и фото можно из нашего обзора.

Состав и виды смесей «Хумана»

Данное детское питание хорошо адаптировано под нужды детского организма, отличается качественными ингредиентами.
Молоко поступает исключительно из семейных фермерских хозяйств вблизи г. Херфорд, которые тщательно следят за животными и качеством их питания.
Используются компоненты только премиального качества, а сырье сразу после поступления идет на переработку.
Более 600 тестов гарантируют строгий контроль качества и безопасность.
Производитель – концерн DMK GMBH входит в ТОП 10 ведущих компаний молочной отрасли Европы.
Единственное питание по-настоящему немецкого качества, так как производится исключительно в Германии.
Наличие многочисленных сертификатов качества.

Лучшая детская смесь на козьем молоке

Этот вариант детского питания появился на отечественных рынках не так давно, но уже завоевал большую популярность. Связано это с теорией о том, что козье молоко усваивается незрелым детским организмом легче, чем коровье и по своим свойствам приравнивается к грудному молоку матери. Также она подходит для питания новорожденных, у которых аллергия на коровье молоко. При этом выбор мам, решивших перейти на такой продукт, невелик – на рынке представлено только 4 подобные марки, которые и будут подробно описаны.

Нэнни

Новозеландский продукт, который по праву считается лучшей молочной смесью на козьем молоке. Главное его отличие от продуктов других марок состоит в высоком содержании казеиновых белков, которые легче переварить незрелому организму. Другая особенность заключаются в отсутствии дополнительной обработки молока, что обеспечивает максимальное сохранение его полезных качеств. Кроме того, в продукте этой марки не содержится пальмовое масло

Все это в совокупности обеспечивает минимальный риск возникновения аллергии, что очень важно, когда речь идет о новорожденном ребенке

Достоинства:

высокое качество продукции
отсутствие пальмового масла и сывороточного белка
минимальный риск возникновения аллергии

Недостатки:

высокая стоимость

Детская смесь от испанского производителя содержит казеиновые и сывороточные белки в равных пропорциях. Продукт не успел завоевать большую популярность, так как появился на прилавках относительно недавно. Тем не менее, мамы, попробовавшие его, отмечают, что у молока на его основе приятный сладкий вкус, который нравится детям. Статистика аллергических реакций также минимальна.

Достоинства:

пропорциональное соотношение сывороточных и казеиновых белков
насыщена пребиотиками

Недостатки:

сложно найти (продается не во всех магазинах)

Кабрита

Детское питание из Голландии, содержащая комплекс жиров Digest X, патент на который принадлежит производителю. Этот вид жиров призван улучшать пищеварение, а также способствовать повышению усвояемости кальция. Такие показатели являются очень важными для детского питания в первые месяцы после рождения. По отзывам большинства мам, Кабрита – это лучшее соотношение цены и качества среди смесей на козьем молоке.

Достоинства:

содержание специального комплекса жиров
оптимальное соотношение стоимости и качества продукции

Недостатки:

сложно найти в магазинах

MDмил SP Козочка

Детская смесь с хорошим составом совместного производства Швейцарии и Испании. В отличие от других марок детского питания, насыщенность молока белками и солями находится в пределах нормы (в других продуктах она либо превышает допустимые пределы, либо находится на их верхней границе). Такое оптимальное сочетание позволяет избежать излишней нагрузки на такие детские органы, как кишечник и почки. Кроме того, здесь соотношение омега-кислот, наиболее приближенное к грудному молоку, что положительно влияет на развитие детской нервной системы.

Достоинства:

оптимальный состав с минимальным риском возникновения аллергии
нормализация стула и отсутствие колик при употреблении

Недостатки:

высокая цена

Важно знать! Никогда не храните сухую смесь в открытом виде, так как в воздухе находятся микроорганизмы, которые также могут попасть в питание. Рекомендуем к просмотру видео Контрольной закупки о детской смеси!

Рекомендуем к просмотру видео Контрольной закупки о детской смеси!

Молочные смеси для здоровых детей

«Хумана Эксперт 1» («Humana Expert 1») для здоровых детей с рождения и до 6 месяцев.
«Хумана Эксперт 2» («Humana Expert 2») для здоровых детей с 6 и до 12 месяцев.
«Хумана Эксперт 3» («Humana Expert 3») для здоровых детей с 12 месяцев.

Важно! Все смеси «Хумана» не содержат искусственных консервантов, красителей, подсластителей и ГМО.

Лучшие профилактические смеси с пребиотиками от запоров

Самый важный компонент в детском питании, предназначающемся для профилактики и устранения запоров – это пребиотики. Эти компоненты направлены на размягчение каловых масс, а также улучшение микрофлоры кишечника. Улучшить его перистальтику помогут лакто- и бифидобактерии, натуральные пищевые волокна. Какие смеси лучше для новорожденных при запорах подскажет педиатр, отзывы опытных родителей и рекомендации экспертов в текущем обзоре.

Нестожен 1 Prebio

Бюджетный продукт с профилактическим действием против дискомфорта в животе. Предназначается для малышей с первых дней жизни, помимо основной функции регулирует стул, а также снижает интенсивность колик. Богатый состав является источником деминерализованной молочной сыворотки и обезжиренного молока, лактозы, мальтодекстрина, соевого лецитина, пребиотиков, лактобактерий. Дополнительные полезные компоненты – это комплекс витаминов и минералов, L-карнитин, таурин для поддержания иммунитета. Пищевые волокна облегчают процесс пищеварения, что в свою очередь приводит в норму каловые массы. Противопоказанием выступает только гиперчувствительность к составу.

Достоинства

Отсутствие пальмового масла;
Многокомпонентный состав;
Пребиотики и лактобактерии для кишечника;
Проверенный годами производитель;
Приятный вкус;
Удобная упаковка;
Недорого.

Недостатки

Вероятность развития аллергии;
Неточные дозировки в инструкции.

Это один из самых популярных продуктов в своем сегменте, что будет по карману большинству покупателей. Педиатры хвалят состав, родители – вкусовые качества, добавки в виде витаминов и минералов, удобную упаковку, отсутствие пальмового масла. Недостатком отмечают неточные дозировки к приготовлению, для получения подробной информации потребуется консультация врача. Редко, но все же состав вызывает аллергию.

Агуша 1

Для пока еще неокрепшего желудочно-кишечного тракта новорожденных компания Агуша предлагает профилактическую смесь от запоров и колик. Цифра «1» на упаковке говорит о том, что ее можно применять с самого рождения. В составе такого продукта не входит сахар, крахмал, глютен, консерванты. Помимо молочного адаптированного сырья производитель включил в формулу пребиотики, они размягчают каловые массы, улучшают перистальтику кишечника и его микрофлору. Также здесь наблюдается премикс минералов, витаминов, нуклеотидов. Приятный молочный вкус и запах придется по душе ребенку. В продаже можно видеть несколько пачек с разным объемом. Противопоказанием выступает только индивидуальная непереносимость какого-либо компонента в составе.

Достоинства

Продуманный состав;
Наличие витаминов, минералов, пребиотиков;
Приятный вкус, запах;
Экономичный расход;
Недорого.

Недостатки

Пальмовое масло;
Мягкая непрактичная упаковка.

Отечественная продукция широко используется во многих городах России в качестве питания на бесплатных молочных кухнях. Это говорит о ее качестве, надежности.

Бибиколь Нэнни 1 с пребиотиками

При вопросе в кабинете педиатра, как подобрать смесь для новорожденного при запорах, лучшей рекомендацией будет смесь на козьем молоке с пребиотиками от Бибиколь. Первое, чем она преимущественно отличается от предыдущих номинантов – отсутствие коровьего молока в составе. Также ее предпочитают многие родители, потому что – это абсолютно гипоаллергенный продукт. В нем не содержится синтетических добавок, пальмового масла, все компоненты на 100% натуральные. Для профилактики застойных процессов в кишечнике Бибиколь Ненни 1 включает в себя уникальный комплекс пребиотиков Orafti. В продаже можно видеть два объема банок – 400 и 800 г. Казеин демонстрирует хороший процент жирности, высокую биодоступность, отличную переносимость организмом. Для поддержания пищеварения в комплекс внесен мальтодекстрин, олигофруктоза, инулин, макроэлементы, масла, витамины и жирные кислоты. Подойдет для детей с диспепсическими расстройствами.

Достоинства

На козьем молоке;
Только натуральные компоненты;
Гипоаллергенно;
Источник ценных нутриентов;
Устранение синдрома диспепсии;
Удобство приготовления.

Недостатки

Цена;
Нужно запивать из-за высокой жирности.

Качественное питание, которое устраняет запоры у новорожденных, не вызывает аллергии и подходит детям с непереносимостью молочного белка. Покупатели в минусах отмечают цену выше среднего уровня, но готовы платить за 100% натуральный состав без синтетических компонентов

Важно учесть, что из-за высокой жирности Бибиколь требует питья воды

Детские смеси для новорожденных с проблемами пищеварения

«Хумана ГА 1 гипоаллергенная» («Humana НА 1») с рождения и до 6 месяцев

Гипоаллергенное питание для новорожденных

«Хумана низколактозная ЛП» («Humana HN») с рождения

Низколактозное питание для детей

«Хумана низколактозная ЛП+СЦТ» («Humana HN+МСТ») с рождения

«Хумана антиколики» («Humana AntiColic») с рождения

Питание при запорах и коликах

«Хумана бифидус» («Humana Bifidus») с рождения и до 6 месяцев

«Хумана антирефлюксная» («Humana AR») с рождения

Антирефлюксное питание

«Хумана соя» («Humana SL») с рождения

Соевые смеси

Когда назначают смесь «Хумана Низколактозная»?

В основном низколактозные смеси назначают при вторичной (частичной, приобретенной) лактазной недостаточности, но также и в других случаях:

Диарея различного генеза,
Наличие острых кишечных инфекций,
Целиакия,
Муковисцидоз,
Другие функциональные нарушения работы желудочно-кишечного тракта, в том числе сопровождающиеся гипотрофией – обильные срыгивания, метеоризм и колики.

Читайте — почему младенец часто срыгивает?

Внимание: назначить низколактозную смесь может только врач, мама не должна сама принимать решение о переходе на подобное лечебное питание!

Преимущества и недостатки по отзывам педиатров и родителей

Мамы и врачи-педиатры выделяют ряд преимуществ смеси «Хумана» для детей от 0 до 6 месяцев:

адаптирована под возрастные особенности детей;
легко готовится, приятная на вкус.

К недостаткам относят:

наличие в составе пальмового масла;
найти питание можно далеко не в каждом магазине;
цена сравнительно высокая и сильно зависит от валютного курса, так как заводы по изготовлению продукта находятся за границей РФ.

Важно! Перед тем как покупать продукт проконсультируйтесь со специалистом для выбора наиболее оптимального вида смеси «Хумана» для вашего ребенка.

Отзывы родителей и врачей о детском питании Хумана

Самые разнообразные комментарии молодых родителей, которые покупали данную продукцию, и педиатров можно встретить на форумах.

Положительные

Оптимальный состав, который учитывает все потребности организма любого малыша в разный период;
Отличное усвоение организмом карапуза;
Высокая питательность;
Удобная упаковка и спец ложка;
Имеет приятный вкус, нравится младенцам.

Отрицательные

Пальмовое масло в составе;
Сложности с приобретением;
Высокая цена;
Отсутствие пробиотиков;
Редко советуют педиатры из-за скандала десятилетней давности. Два ребенка из Израиля умерли, а десятки пострадали из-за соевого питания Хумана, в котором отсутствовало нужное количество витамина В1. Производителем была выплачена компенсация, а меры по контролю над качеством производимой продукции усилены.

Вывод от нашего сайта: Продукция компании Humana Gmbh — не очень подходящий выбор для ребенка искусственника.

По

Как развести смесь ребенку – пошаговая инструкция

Важно точно следовать инструкции по применению, указанной на упаковке.
Руки должны быть хорошо вымытыми с мылом.
Приготовление питания необходимо вести в чистой, бутылочке, которую вместе с соской и кольцом надо простерилизовать.
Воду нужно предварительно вскипятить и остудить до 50°С.
Мерную ложечку из упаковки с продуктом перед первым использованием ополосните водой и высушите.
Набирая порошок, следите, чтобы не было горки. Излишки можно убрать ножом.
В бутылочку сначала налейте воду, а затем, используя таблицу кормления для дозирования, насыпьте необходимое количество порошка. Если сделать наоборот, на дне может образоваться трудно растворимый сгусток.
Хорошо перемешайте содержимое бутылочки.
Температура смеси не должна превышать 37°С.
Если смесь слишком сильно остыла, не подогревайте ее в микроволновой печи. Из-за неравномерного прогрева жидкости может обжечь ребенка.
Если ребенок съел не весь объем детского питания, остатки хранить больше одного часа нельзя.
Вскрытую банку следует хранить в прохладном, достаточно сухом месте. Холодильник для этой цели не подходит.

Как понять, что смесь не подходит

сыпь или покраснение на коже;
понос или запор:
срыгивание;
беспокойство ребенка.

Купить смесь “Хумана” в магазине Акушерство

Какими бывают?

К детскому питанию возможно применить следующую классификацию:

Максимально приближенные к грудному молоку (адаптированные) и частично.
Предназначенные для кормления:

Кисломолочные – содержащие полезные микроорганизмы, и пресные. Сухие и жидкие. Казеиновые и сывороточные. Причем казеин менее благоприятен для грудничка.

Состав детских смесей, таблица:

Наименование	Адаптация	Основа	Предназначение	Витамины, микроэлементы	Пребиотики	Глютен	Сахар	Вредные вещества
Малютка 1	Адаптированная	Деминерализованная сыворотка	Для детей 0+	Комплекс	есть	Может содержаться	Нет	Пальмовое масло
Малютка 2	Адаптированная	Деминерал-ная сыворотка	Для детей 2 -6 мес.	Комплекс	есть	Может содержаться	нет	Пальм. масло
Малютка 3	Частично	Молоко обезжиренное	Для детей после 12+	Комплекс	Есть	Может содержаться	нет	Пальм. масло
Малютка с рождения	Частично	Молоко обезжиренное	Для здоровых детей 0+,	Комплекс	Да	Может содержаться	нет	Пальм. масло
Малютка премиум	Адаптированная	Деминерал-ная сыворотка	Для здоровых детей 0-6 мес.	Комплекс	Да	Может содержаться	нет	нет
НАН 1	Адаптированная	Деминерал-ная сыворотка	Для здоровых детей 0-6 мес.	Комплекс	Есть	нет	нет	Пальмовое масло
НАН 2	Адаптированная	Молоко обезжиренное	Для здоровых детей 6-12 мес.	Комплекс	Есть	нет	нет	Пальмовое масло
НАН 3	Адаптированная	Молоко обезжиренное	Для здоровых детей 12+	Комплекс	Есть	нет	нет	Пальмовое масло
НАН премиум	Адаптированная	Деминерал-ная сыворотка	Для здоровых детей	Комплекс	Есть	нет	нет	Пальмовое масло
НАН комфорт состав смеси	Адаптированная	Деминерал-ная сыворотка	Для здоровых детей	Комплекс	Есть	нет	нет	Пальмовое масло
НАН гиппоалергенный	Адаптированная	Деминерал-ная сыворотка	Для детей с аллергией	Комплекс	Есть	нет	нет	Пальмовое масло
НАН безлактозный	Адаптированная	Деминерал-ная сыворотка	Для детей с аллергией	Комплекс	Есть	нет	нет	Пальмовое масло
Детская смесь Нестожен	Адаптированная	Деминерал-ная сыворотка	Для детей с хорошим здоровьем 0-12 мес.	Комплекс	Есть	нет	нет	нет
Смесь Малыш состав(г. Истра)	Адаптированная	Деминерализованная сыворотка	Для детей без особенностей, связанных со здоровьем 0-12+	Есть ограниченное количество	Нет	Есть (не во всех смесях)	нет	нет
Смесь Хумана состав	Адаптированная	Деминерализованная сыворотка, Молоко обезжиренное	Для здоровых детей 0-12+	Комплекс	Есть	Нет	нет	Пальмовое масло
Детская смесь Нутрилон состав	Адаптированная	Казеин, Деминерализованная сыворотка	Для здоровых детей 0-12+	Комплекс	Есть	нет	нет	Пальмовое масло
Фрисолак	Адаптированная	Казеин, Деминерализованная сыворотка	Для здоровых детей 0-12+, аллергиков	Комплекс	Есть	нет	нет	Пальм. масло
Симилак	Адаптированная	Деминерализованная сыворотка	Для здоровых 0-12+, аллергиков	Комплекс	Да	нет	нет	нет
Хипп	Адаптированная	Деминерализованная сыворотка	Для здоровых 0-12+, аллергиков	Комплекс	Есть	нет	нет	Пальм. масло
Матерна	Адаптированная	Деминерализованная сыворотка	Для здоровых 0-12+, аллергиков и с незначительными расстройствами пищеварения	Комплекс	Есть	нет	нет	нет
Нутрилак	Адаптированная	Деминерализованная сыворотка	Для здоровых 0-12+, аллергиков, с незначительными расстройствами пищеварения, с патологиями 0-12+	Комплекс	Да	нет	нет	нет
Беллакт	Адаптированная	Деминерализованная сыворотка	Для здоровых детей, лечебно-профилактические смеси 0-12+	Комплекс	Есть	нет	нет	Соя, пальм. масло
Фруто Няня	Частично	Натуральные злаки, фрукты, овощи, мясо	Для здоровых малышей и аллергиков (4) 6+	Есть	Есть	Присутствует в зависимости от вида продукта	Нет, присутствует фруктоза	нет
Агуша	Адаптированная	Деминерализованная сыворотка	Для здоровых малышей, аллергиков 0-12+	Комплекс	да	Может содержаться	нет	Пальмовое масло

При выборе питания для своего малыша прислушайтесь к рекомендациям вашего педиатра и изучите состав детских смесей. Только врач, основываясь на результатах анализов и общем состоянии малыша, может правильно подобрать смесь. Кроме того, реакция вашего чада не заставит себя ждать

Обращайте на неё внимание

Конечно, хочется надеяться, что для детей производится все самое лучшее. Но на деле иногда случается иначе. Если вы столкнулись с отсутствием качества, не молчите – действуйте. Добивайтесь справедливости. Информацию о том, что предпринять и как себя вести, вы сможете найти на нашем сайте.

Низколактозная смесь «Хумана»: состав и особенности ~

Низколактозные смеси обычно назначаются детям с разными формами пищевой аллергии или непереносимости лактозы.

Молочная смесь для диетического питания младенцев «Хумана» давно зарекомендовала себя на российском рынке, а на мировом рынке это питание присутствует уже более 40 лет.

Бренд «Хумана» принадлежит немецкой торговой марке, для изготовления конечного продукта используется исключительно свежее коровье молоко, от коров, живущих на собственных фермах производителя.

Особенности питания «Хумана Низколактозная»:

Может использоваться уже с рождения.
Может быть использовано как единственный источник питания. Обычно низколактозные или гипоаллергенные смеси не выступают единственным источником питания, а лишь назначаются доктором в дополнение к основному рациону ребенка. Эта же смесь способна обеспечить суточную потребность ребенка в веществах и полезных элементах.
В составе есть пребиотики, помогающие нормализовать микрофлору кишечника после перенесенного расстройства.
Может быть приготовлено как в виде детской смеси, так и каши – все зависит от консистенции разведения. Смесь подходит для младенцев, а каша – для малышей постарше.

Применение этой смеси в короткий срок избавляет кроху от неприятных симптомов пищевых расстройств – диареи, частых срыгиваний, коликов, метеоризма. Кроме того, особый питательный состав питания помогает младенцу скорее набрать вес, это актуально для недоношенных или маловесных малышей.

Благодаря включенному в состав банану в виде хлопьев – эта смесь более вкусная, чем подобные смеси от других производителей и поэтому малыши кушают ее охотнее.

Чем низколактозная смесь отличается от обычной?

Пониженное содержание лактозы – молочного сахара – делает такое питание более подходящим для младенцев, организм которых по той или иной причине не может переварить лактозу. Благодаря кормлению ребенка низколактозной смесью у него исчезают симптомы недостаточности лактазы и других видов пищевых аллергий – диарея, вздутие живота, частые срыгивания.

Низколактозные смеси: список производителей

Когда назначают смесь «Хумана Низколактозная»?

Диарея различного генеза,
Наличие острых кишечных инфекций,
Целиакия,
Муковисцидоз,
Другие функциональные нарушения работы желудочно-кишечного тракта, в том числе сопровождающиеся гипотрофией – обильные срыгивания, метеоризм и колики.

Читайте — почему младенец часто срыгивает?

Состав смеси «Хумана Низколактозная»

Каков же состав низколактозной смеси и в чем его особенности?

В основе состава обезжиренное молоко собственного производства с низким содержанием жира – 2,1гр на 100 мл смеси.

Пребиотики. Уникальный пребиотический состав этого питания обусловлен наличием банана в составе. Пребиотики в виде фруктоолигосахаридов и галактоолигосахаридов (0,5 гр на 100 мл смеси) отлично «уживаются» с клетчаткой из банана и получается уникальный «пребиотический коктейль».

Благодаря ему ускоряется заживление слизистой кишечника после перенесенных расстройств и восстанавливается естественная микрофлора кишечника малыша, увеличивается количество полезных бифидобактерий в кишечнике.

Пищевые волокна. Здесь есть лингин, целлюлоза, гемицеллюлоза, они отлично связывают воду, благодаря чему уменьшается количество воды в кале – исчезает диарея, нормализуется перистальтика кишечника.

Углеводный компонент: лактоза, мальтодекстрин, глюкоза, картофельный крахмал.

Содержащийся в банане пектин также способствует правильной работе кишечника.

Минералы –калий (74 мг), кальций (58мг), медь (49мг), натрий (30 мг), фосфор и марганец (по 35 мг), а также другие вещества в меньшем количестве – железо, цинк, селен и тд.

Витамины — С, Е, А, В2, В6 (70мг!), В1, В12, D3, K.

Комплекс растительных масел: пальмовое, рапсовое, подсолнечное.

Читайте — Пальмовое масло в детском питании — польза и вред

Рапсовое масло в детском питании — польза и вред

Главное отличие состава низколактозных смесей от обычных – пониженное содержание молочного сахара – лактозы.

Сколько же лактозы в низколактозной смеси «Хумана»?

Здесь ее всего 1,5 грамма на 100 мл готового питания и 3 грамма на 100 мл каши.

Производитель утверждает, что пониженное количество лактозы в питании стимулирует кишечник ребенка вырабатывать больше фермента лактаза самостоятельно.

Осмоляльность смеси «Хумана» составляет 247 мОсм.

А вот чего НЕТ в этой смеси: ГМО, ароматизаторов, красителей, консервантов, глютена.

Внимание: смесь подходит для крох с непереносимостью глютена!

Плюсы и минусы

В чем же преимущества и недостатки этого питания?

Плюсы лечебной смеси «Хумана низколактозная» (Humana HN):

Особый состав углеводного комплекса делает это питание очень сытным, оно очень хорошо усваивается и переваривается. Кроме того, благодаря ему же употребление этой смеси уменьшает количество срыгиваний у малыша.
Приятный вкус благодаря наличию в составе банана в виде хлопьев.
Пищевые волокна в большом количестве способствуют скорейшей нормализации работы кишечника.
Низкое содержание лактозы и жиров делает это питание легкоусвояемым.
Подходит для деток, как на искусственном, так и на грудном вскармливании.
Может быть использовано в качестве единственного источника питания.

Есть у низколактозной смеси и недостатки. Минусы смеси со сниженным количеством лактозы:

В составе нет рыбьего жира – основного источника полиненасыщенных жирных кислот Омега-3 и Омега-6.
В составе нет нуклеотидов – элемента, особенно важного для развития ребенка до года.

Как приготовить низколактозную смесь?

Способ приготовления низколактозной смеси всегда указан на упаковке, пожалуйста, строго следуйте инструкции!

Перед приготовлением этого питания следует прокипятить все части бутылочки в течение 5 минут.

Воду стоит вскипятить и остудить до 50С. Налить в бутылочку.

В бутылочку с налитой в нее водой добавить смесь в том количестве, которое прописано на упаковке. Ложки должны быть без горки.

Закрыть бутылочку и хорошенько встряхнуть ее, перемешивая смесь.

Температура готового питания должна быть примерно 37С.

Производитель рекомендует использовать специальные соски «для каш» или с переменным потоком.

Внимание: готовить смесь стоит прямо перед кормлением малыша, нельзя давать крохе недоеденную им в прошлый раз смесь, нельзя разогревать питание в микроволновой печи.

HUMANA 3 350 гр детская смесь : общая информация и описание, свойства, показания к применению, инструкция, противопоказания, способ применения и дозировка, условия хранения, побочные действия

Для питания детей от 10 месяцев и старше
Последующая смесь
 Для основного питания или дополнительно при нехватке грудного молока
 С 10 месяцев
 Галактоолигосахариды: важные пребиотики, схожие с олигосахаридами грудного молока, способствуют развитию здоровой кишечной флоры
 Жирные кислоты омега-3: содействуют развитию мозга и нервных клеток
 Витамин D: способствует усвоению кальция для укрепления костей
 Легкий ванильный вкус
 Тип упаковки / содержимое:
■ пакеты в коробке: 300, 600 г
Описание
Смесь Humana 3 состоит из молочных компонентов, ценных растительных масел и легкоусвояемых углеводов. Содержит сбалансированное сочетание незаменимых жирных кислот: линолевой и альфа-линоленовой. Из содержащихся в смеси углеводов 46 % относятся к сложным углеводам (декстринам). Соотношение белков молочной сыворотки и казеина составляет 20:80. Смесь Humana 3 также содержит галактоолигосахариды (ГОС).
Состав   Обезжиренное молоко, лактоза, мальтодекстрин, растительные масла (пальмовое, рапсовое, подсолнечное), сироп галактоолигосахаридов (из молочных продуктов), кальция карбонат, кальциевые соли ортофосфорной кислоты, калия цитрат, витаминный комплекс (витамин C, ниацин, пантотеновая кислота, витамин E, витамин A, тиамин, витамин B6, рибофлавин, фолиевая кислота, витамин K1, витамин D3, биотин, витамин B12), натрия цитрат, магния карбонат, калия хлорид, L-триптофан, железа дифосфат, натуральный ароматизатор «Бурбонская ваниль», цинка оксид, меди сульфат, марганца сульфат, калия иодат, натрия селенат.
Показания к применению
• Питание детей, достигших 10-месячного возраста, в рамках сбалансированного вскармливания
• Содержит легкоусвояемые углеводы. В случаях нарушения переносимости глюкозы применять только при постоянном контроле обмена веществ.
• При использовании в составе специальной диеты в случае непереносимости фруктозы и / или сахарозы требуется постоянное наблюдение врача
Противопоказания
• Непереносимость коровьего молока (аллергия на белок коровьего молока, непереносимость лактозы, галактоземия)
• Глюкозо-галактозная мальабсорбция

Подробную информацию о товаре просим уточнять у продавца, связавшись с ним по указанному выше телефону или посредством электронного запроса через форму обратной связи.

РНК: ДНК-гибриды в геноме человека имеют отличительные характеристики нуклеотидов, состав хроматина и транскрипционные отношения | Эпигенетика и хроматин

Ван Дж., Чжуан Дж., Айер С., Лин Х, Уитфилд Т.В., Гревен М.К., Пирс Б.Г., Донг Х, Кундаже А., Ченг Й и др. Особенности последовательности и структура хроматина вокруг участков генома, связанных 119 факторами транскрипции человека. Genome Res. 2012; 22: 1798–812.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

Neph S, Vierstra J, Stergachis AB, Reynolds AP, Haugen E, Vernot B, Thurman RE, John S, Sandstrom R, Johnson AK, et al. Обширный человеческий регуляторный лексикон, закодированный в следах факторов транскрипции. Природа. 2012; 489: 83–90.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

Натараджан А., Ярдимчи Г.Г., Шеффилд, Северная Каролина, Кроуфорд Г.Е., Олер У. Прогнозирование экспрессии генов, специфичных для клеточного типа, из областей открытого хроматина.Genome Res. 2012; 22: 1711–22.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

Yip KY, Cheng C, Bhardwaj N, Brown JB, Ленг Дж., Kundaje A, Rozowsky J, Birney E, Bickel P, Snyder M, Gerstein M. Классификация участков генома человека на основе экспериментально определенных сайтов связывания более 100 факторов, связанных с транскрипцией. Genome Biol. 2012; 13: R48.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

Ху С, Ван Дж, Су И, Сонг Кью, Зенг Й, Нгуен Х.Н., Шин Дж, Кокс Э, Ро Х.С., Вудард С. и др. Метилирование ДНК представляет собой отдельные сайты связывания для факторов транскрипции человека. eLife. 2013; 2: e00726.

Медведева Ю.А., Хамис А.М., Кулаковский И.В., Ба-Алави В., Бхуян М.С., Каваджи Х., Лассманн Т., Харберс М., Форрест А.Р., Баджич В.Б. Влияние метилирования цитозина на сайты связывания факторов транскрипции. BMC Genom. 2014; 15: 119.

Артикул Google ученый

Шлик Т. Вопросы структуры нуклеиновых кислот: неканонические спирали и структура РНК. В: Молекулярное моделирование и моделирование: междисциплинарное руководство. Междисциплинарная прикладная математика, т. 21. Нью-Йорк: Спрингер; 2010. С. 205–36.

Чжоу Т., Шен Н., Ян Л., Абэ Н., Хортон Дж., Манн Р.С., Бассемейкер Г.Дж., Гордан Р., Роос Р. Количественное моделирование специфичности связывания транскрипционных факторов с использованием формы ДНК. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112: 4654–9.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

Райбер Э.А., Кранастер Р., Лам Э., Никан М., Баласубраманиан С. Неканоническая структура ДНК является связывающим мотивом для фактора транскрипции SP1 in vitro. Nucleic Acids Res. 2012; 40: 1499–508.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

10.

Храпунов С., Уоррен С., Ченг Х., Берко Э.Р., Грелли Дж. М., Бреновиц М. Необычные характеристики ДНК-связывающего домена эпигенетического регуляторного белка MeCP2 определяют его специфичность связывания.Биохимия. 2014; 53: 3379–91.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

11.

Агилера А., Гарсия-Муза Т. R-петли: от побочных продуктов транскрипции до угроз стабильности генома. Mol Cell. 2012; 46: 115–24.

CAS Статья PubMed Google ученый

12.

Робертс Р.В., Кротерс DM. Стабильность и свойства двойных и тройных спиралей: драматические эффекты состава основной цепи РНК или ДНК.Наука. 1992; 258: 1463–6.

CAS Статья PubMed Google ученый

13.

Рой Д., Ю К., Либер М.Р. Механизм образования R-петли в последовательностях переключения класса иммуноглобулинов. Mol Cell Biol. 2008; 28: 50–60.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

14.

Рой Д., Либер MR. Кластеризация G важна для инициации индуцированных транскрипцией R-петель in vitro, тогда как после этого достаточно высокой плотности G без кластеризации.Mol Cell Biol. 2009. 29: 3124–33.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

15.

Мурат П., Баласубраманян С. Существование и последствия G-квадруплексных структур в ДНК. Curr Opin Genet Dev. 2014; 25: 22–9.

CAS Статья PubMed Google ученый

16.

Ginno PA, Lott PL, Christensen HC, Korf I, Chedin F. Образование R-петли является отличительной характеристикой неметилированных промоторов островков CpG человека.Mol Cell. 2012; 45: 814–25.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

17.

Данн К., Гриффит Дж. Д.. Присутствие РНК в двойной спирали подавляет ее взаимодействие с гистоновым белком. Nucleic Acids Res. 1980; 8: 555–66.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

18.

Рой Д., Чжан З., Лу З., Се К.Л., Либер MR.Конкуренция между транскриптом РНК и нитью ДНК, не являющейся шаблоном, во время образования R-петли in vitro: разрыв может служить сильным сайтом инициации R-петли. Mol Cell Biol. 2010; 30: 146–59.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

19.

Ginno PA, Lim YW, Lott PL, Korf I, Chedin F. GC перекос на 5′- и 3′-концах генов человека связывает образование R-петли с эпигенетической регуляцией и прекращением транскрипции.Genome Res. 2013; 23: 1590–600.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

20.

Ратмейер Л., Винаяк Р., Чжун Ю. Ю., Зон Дж., Уилсон В. Д.. Последовательностные термодинамические и структурные свойства дуплексов ДНК.РНК. Биохимия. 1994; 33: 5298–304.

CAS Статья PubMed Google ученый

21.

Ванрой Ф., Улер Дж. П., Ши Й., Вестерлунд Ф., Фалькенберг М., Густафссон С. М..Гибридная структура G-квадруплекса, образованная между РНК и ДНК, объясняет необычайную стабильность митохондриальной R-петли. Nucleic Acids Res. 2012; 40: 10334–44.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

22.

Лумис Э. У., Санз, Лос-Анджелес, Чедин Ф, Хагерман П. Дж. Связанное с транскрипцией образование R-петли в области CGG-повторов FMR1 человека. PLoS Genet. 2014; 10: e1004294.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

23.

Трейси РБ, Либер MR. Зависимое от транскрипции образование R-петли в последовательностях переключения класса млекопитающих. EMBO J. 2000; 19: 1055–67.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

24.

Wahba L, Gore SK, Koshland D. Аппарат гомологичной рекомбинации модулирует образование гибридов РНК-ДНК и связанную с этим нестабильность хромосом. eLife. 2013; 2: e00505.

25.

Вахба Л., Амон Дж. Д., Кошланд Д., Вуйка-Росс М.РНКаза Н и множество факторов биогенеза РНК взаимодействуют, чтобы предотвратить создание нестабильности генома гибридами РНК: ДНК. Mol Cell. 2011; 44: 978–88.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

26.

Mischo HE, Gomez-Gonzalez B, Grzechnik P, Rondon AG, Wei W, Steinmetz L, Aguilera A, Proudfoot NJ. Геликаза Sen1 дрожжей защищает геном от нестабильности, связанной с транскрипцией. Mol Cell. 2011; 41: 21–32.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

27.

Tuduri S, Crabbe L, Conti C, Tourriere H, Holtgreve-Grez H, Jauch A, Pantesco V, De Vos J, Thomas A., Theillet C, et al. Топоизомераза I подавляет нестабильность генома, предотвращая вмешательство между репликацией и транскрипцией. Nat Cell Biol. 2009; 11: 1315–24.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

28.

Чан Ю.А., Аристизабал М.Дж., Лу П.Й., Луо З., Хамза А., Кобор М.С., Стирлинг П.С., Хиетер П. Полногеномное профилирование дрожжевой ДНК: сайты гибридов РНК с DRIP-чипом. PLoS Genet. 2014; 10: e1004288.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

29.

Reaban ME, Griffin JA. Индукция РНК-стабилизированных конформеров ДНК путем транскрипции области переключения иммуноглобулина. Природа. 1990; 348: 342–4.

CAS Статья PubMed Google ученый

30.

Daniels GA, Lieber MR. РНК: образование комплексов ДНК при транскрипции областей переключения иммуноглобулинов: влияние на механизм и регуляцию рекомбинации переключения классов. Nucleic Acids Res. 1995; 23: 5006–11.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

31.

Sun Q, Csorba T, Skourti-Stathaki K, Proudfoot NJ, Dean C. Стабилизация R-петли подавляет антисмысловую транскрипцию в локусе Arabidopsis FLC.Наука. 2013; 340: 619–21.

CAS Статья PubMed Google ученый

32.

Пфайффер В., Криттин Дж., Гролимунд Л., Лингнер Дж. Комплексный компонент THO Thp2 противодействует теломерным R-петлям и укорочению теломер. EMBO J. 2013; 32: 2861–71.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

33.

Castellano-Pozo M, Santos-Pereira JM, Rondon AG, Barroso S, Andujar E, Perez-Alegre M, Garcia-Muse T, Aguilera A.Петли R связаны с фосфорилированием гистона h4 S10 и конденсацией хроматина. Mol Cell. 2013; 52: 583–90.

CAS Статья PubMed Google ученый

34.

Накама М., Каваками К., Кадзитани Т., Урано Т., Мураками Ю. Образование гибрида ДНК-РНК опосредует РНК-направленное образование гетерохроматина. Гены Клетки. 2012; 17: 218–33.

CAS Статья PubMed Google ученый

35.

Сольер Дж., Сторк К.Т., Гарсия-Рубио М.Л., Паульсен Р.Д., Агилера А., Симприх К.А. Связанные с транскрипцией факторы эксцизионной репарации нуклеотидов способствуют индуцированной R-петлей нестабильности генома. Mol Cell. 2014; 56: 777–85.

CAS Статья PubMed Google ученый

36.

Hatchi E, Skourti-Stathaki K, Ventz S, Pinello L, Yen A, Kamieniarz-Gdula K, Dimitrov S, Pathania S, McKinney KM, Eaton ML, et al. Рекрутирование BRCA1 в сайты транскрипционной паузы необходимо для репарации повреждений ДНК, управляемых R-петлей.Mol Cell. 2015; 57: 636–47.

CAS Статья PubMed Google ученый

37.

Bhatia V, Barroso SI, Garcia-Rubio ML, Tumini E, Herrera-Moyano E, Aguilera A. BRCA2 предотвращает накопление R-петли и связывается с фактором экспорта мРНК TREX-2 PCID2. Природа. 2014; 511: 362–5.

CAS Статья PubMed Google ученый

38.

Чен Ю.З., Беннет К.Л., Хьюн Х.М., Блэр И.П., Пульс И., Ироби Дж., Диерик И., Абель А., Кеннерсон М.Л., Рабин Б.А. и др.Мутации гена ДНК / РНК-геликазы в форме ювенильного бокового амиотрофического склероза (БАС4). Am J Hum Genet. 2004. 74: 1128–35.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

39.

Gunther C, Kind B, Reijns MA, Berndt N, Martinez-Bueno M, Wolf C, Tungler V, Chara O, Lee YA, Hubner N, et al. Неправильное удаление рибонуклеотидов из ДНК способствует развитию системного аутоиммунитета. J Clin Invest. 2015; 125: 413–24.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

40.

Lin Y, Dent SY, Wilson JH, Wells RD, Napierala M. Петли R стимулируют генетическую нестабильность повторов CTG.CAG. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107: 692–7.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

41.

Колак Д., Занинович Н., Коэн М.С., Розенвакс З., Ян В.Й., Герхардт Дж., Дисней М.Д., Джаффри С.Р. Связанная с промотором мРНК тринуклеотидного повтора управляет эпигенетическим молчанием при синдроме ломкой Х-хромосомы. Наука. 2014; 343: 1002–5.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

42.

Groh M, Lufino MM, Wade-Martins R, Gromak N. R-петли, связанные с экспансией триплетных повторов, способствуют подавлению гена при атаксии Фридрейха и синдроме ломкой Х-хромосомы. PLoS Genet. 2014; 10: e1004318.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

43.

Haeusler AR, Donnelly CJ, Periz G, Simko EA, Shaw PG, Kim MS, Maragakis NJ, Troncoso JC, Pandey A, Sattler R, et al.Структуры нуклеотидных повторов C9orf72 инициируют молекулярные каскады заболеваний. Природа. 2014; 507: 195–200.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

44.

Грох М., Громак Н. Несбалансированность: R-петли в болезнях человека. PLoS Genet. 2014; 10: e1004630.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

45.

Skourti-Stathaki K, Proudfoot NJ.Палец о двух концах: петли R как угроза целостности генома и мощные регуляторы экспрессии генов. Genes Dev. 2014; 28: 1384–96.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

46.

Богуславски SJ, Smith DE, Michalak MA, Mickelson KE, Yehle CO, Patterson WL, Carrico RJ. Характеристика моноклональных антител к ДНК.РНК и ее применение для иммунодетекции гибридов. J Immunol Methods. 1986; 89: 123–30.

CAS Статья PubMed Google ученый

47.

Chadwick LH. Ресурс данных программы эпигеномики дорожной карты NIH. Эпигеномика. 2012; 4: 317–24.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

48.

Zhang ZZ, Pannunzio NR, Hsieh CL, Yu K, Lieber MR. Сложности из-за одноцепочечной РНК при обнаружении антител геномных гибридов РНК: ДНК.BMC Res Notes. 2015; 8: 127.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

49.

Пархомчук Д., Бородина Т., Амстиславский В., Банару М., Халлен Л., Кробич С., Лехрах Н., Солдатов А. Анализ транскриптома с помощью специфичного для нити секвенирования комплементарной ДНК. Nucleic Acids Res. 2009; 37: e123.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

50.

Yu K, Chedin F, Hsieh CL, Wilson TE, Lieber MR. R-петли на участках переключения класса иммуноглобулинов в хромосомах стимулированных В-клеток. Nat Immunol. 2003. 4: 442–51.

CAS Статья PubMed Google ученый

51.

Йео А.Дж., Бешерел О.Дж., Лафф Д.Е., Каллен Дж.К., Вонгсурават Т., Дженджароенпун П., Кузнецов В.А., Маккиннон П.Дж., Лавин М.Ф. R-петли в пролиферирующих клетках, но не в головном мозге: последствия для AOA2 и других аутосомно-рецессивных атаксий.PLoS One. 2014; 9: e

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

52.

Ку С.Х., Кобияма К., Шен Й.Дж., Леберт Н., Ахмад С., Кхату М., Аоши Т., Гассер С., Исии К.Дж. РНК-полимераза III регулирует цитозольную РНК: гибриды ДНК и внутриклеточную экспрессию микроРНК. J Biol Chem. 2015; 290: 7463–73.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

53.

Браун Т.А., Ткачук А.Н., Клейтон Д.А. Нативные R-петли сохраняются по всему геному митохондриальной ДНК мыши. J Biol Chem. 2008. 283: 36743–51.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

54.

Гонсалес И.Л., Сильвестр Дж. Э. Полная последовательность повтора рибосомной ДНК человека размером 43 т.п.н.: анализ межгенного спейсера. Геномика. 1995. 27: 320–8.

CAS Статья PubMed Google ученый

55.

Zentner GE, Saiakhova A, Manaenkov P, Adams MD, Scacheri PC. Интегративный геномный анализ рибосомной ДНК человека. Nucleic Acids Res. 2011; 39: 4949–60.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

56.

Skourti-Stathaki K, Proudfoot NJ, Gromak N. Человеческий сенатаксин разделяет гибриды РНК / ДНК, образованные в сайтах транскрипционной паузы, чтобы способствовать Xrn2-зависимой терминации. Mol Cell. 2011; 42: 794–805.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

57.

Белоцерковский Б.П., Лю Р., Торналетти С., Красильникова М.М., Миркин С.М., Hanawalt PC. Механизмы и последствия блокировки транскрипции богатыми гуанином последовательностями ДНК. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107: 12816–21.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

58.

Неллакер С., Кин Т.М., Ялчин Б., Вонг К., Агам А., Белгард Т.Г., Флинт Дж., Адамс Д.Д., Франкель В.Н., Понтинг С.П. Геномный ландшафт сформирован путем отбора на мобильных элементах 18 линий мышей.Genome Biol. 2012; 13: R45.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

59.

Medstrand P, van de Lagemaat LN, Mager DL. Распределение ретроэлементов в геноме человека: вариации, связанные с возрастом и близостью к генам. Genome Res. 2002; 12: 1483–95.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

60.

Core LJ, Waterfall JJ, Lis JT.Секвенирование зарождающейся РНК выявляет широко распространенные паузы и дивергентную инициацию на промоторах человека. Наука. 2008. 322: 1845–8.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

61.

Ким Т.К., Хемберг М., Грей Дж.М., Коста А.М., Медведь Д.М., Ву Дж., Хармин Д.А., Лаптевич М., Барбара-Хейли К., Куэрстен С. и др. Широко распространенная транскрипция энхансеров, регулирующих активность нейронов. Природа. 2010; 465: 182–7.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

62.

De Santa F, Barozzi I, Mietton F, Ghisletti S, Polletti S, Tusi BK, Muller H, Ragoussis J, Wei CL, Natoli G. Большая часть сайтов транскрипции экстрагенной РНК pol II перекрывается энхансерами. PLoS Biol. 2010; 8: e1000384.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

63.

Core LJ, Martins AL, Danko CG, Waters CT, Siepel A, Lis JT. Анализ формирующейся РНК определяет единую архитектуру инициирующих областей на промоторах и энхансерах млекопитающих.Нат Жене. 2014; 46: 1311–20.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

64.

Mao X, Miesfeldt S, Yang H, Leiden JM, Thompson CB. Онкобелки FLI-1 и химерные EWS-FLI-1 обладают сходной специфичностью связывания ДНК. J Biol Chem. 1994; 269: 18216–22.

CAS PubMed Google ученый

65.

Фаззари MJ, Greally JM. Эпигеномика: за пределами CpG-островов.Nat Rev Genet. 2004. 5: 446–55.

CAS Статья PubMed Google ученый

66.

Тибширани Р. Регрессионное сжатие и выбор с помощью лассо. J R Stat Soc. 1996. 58: 267–88.

Google ученый

67.

Эфрон Б., Хасти Т. Джонстон И. Тибширани Р: наименьшая угловая регрессия; 2004. С. 407–99.

Google ученый

68.

Локхарт Р., Тейлор Дж. Тибширани Р.Дж. Тибширани Р: тест значимости для лассо; 2014. с. 413–68.

Google ученый

69.

Chakraborty P, Grosse F. Геликаза DHX9 человека предпочтительно разматывает РНК-содержащие петли смещения (R-петли) и G-квадруплексы. Ремонт ДНК (Amst). 2011; 10: 654–65.

CAS Статья Google ученый

70.

Торецкий Ю.А., Эркизан В., Левенсон А., Абаан О.Д., Парвин Д.Д., Крипе Т.П., Райс А.М., Ли С.Б., Урен А.Активность онкопротеина EWS-FLI1 усиливается РНК-геликазой A. Cancer Res. 2006; 66: 5574–81.

CAS Статья PubMed Google ученый

71.

Stein U, Jurchott K, Walther W, Bergmann S, Schlag PM, Royer HD. Вызванная гипертермией ядерная транслокация фактора транскрипции YB-1 приводит к усилению экспрессии переносчиков ABC, связанных с множественной лекарственной устойчивостью. J Biol Chem. 2001; 276: 28562–9.

CAS Статья PubMed Google ученый

72.

Аоки Й, Чжао Г, Цю Д., Ши Л., Као П. CsA-чувствительный пуриновый регулятор транскрипции в эпителиальных клетках бронхов содержит NF45, NF90 и Ku. Am J Physiol. 1998; 275: L1164–72.

CAS PubMed Google ученый

73.

Kao PN, Chen L, Brock G, Ng J, Kenny J, Smith AJ, Corthesy B. Клонирование и экспрессия циклоспорина A- и FK506-чувствительного ядерного фактора активированных Т-клеток: NF45 и NF90. J Biol Chem. 1994; 269: 20691–9.

CAS PubMed Google ученый

74.

Langland JO, Kao PN, Jacobs BL. Ядерный фактор-90 активированных Т-клеток: двухцепочечный РНК-связывающий белок и субстрат для двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы PKR. Биохимия. 1999; 38: 6361–8.

CAS Статья PubMed Google ученый

75.

Боева В., Сурдез Д., Гийон Н., Тирод Ф., Фейес А.П., Делаттре О, Барилло Э.Идентификация мотивов de novo повышает точность прогнозирования сайтов связывания факторов транскрипции при анализе данных ChIP-Seq. Nucleic Acids Res. 2010; 38: e126.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

76.

Пимкин М., Косенков А.В., Мишра Т., Моррисси К.С., Ву В., Келлер К.А., Блобель Г.А., Ли Д., Бир М.А., Хардисон Р.С., Вайс М.Дж. Дивергентные функции факторов гемопоэтической транскрипции в клональном примировании и дифференцировке во время эритромегакариопоэза.Genome Res. 2014; 24: 1932–44.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

77.

Li Y, Luo H, Liu T, Zacksenhaus E, Ben-David Y. Фактор транскрипции ets Fli-1 в развитии, раке и болезни. Онкоген. 2015; 34: 2022–31.

CAS Статья PubMed Google ученый

78.

Erkizan HV, Schneider JA, Sajwan K, Graham GT, Griffin B, Chasovskikh S, Youbi SE, Kallarakal A, Chruszcz M, Padmanabhan R, et al.Активность РНК-геликазы A ингибируется онкогенным фактором транскрипции EWS-FLI1. Nucleic Acids Res. 2015; 43: 1069–80.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

79.

Erkizan HV, Kong Y, Merchant M, Schlottmann S, Barber-Rotenberg JS, Yuan L, Abaan OD, Chou TH, Dakshanamurthy S, Brown ML, et al. Небольшая молекула, блокирующая взаимодействие онкогенного белка EWS-FLI1 с РНК-геликазой А, подавляет рост саркомы Юинга.Nat Med. 2009. 15: 750–6.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

80.

Riggi N, Knoechel B, Gillespie SM, Rheinbay E, Boulay G, Suva ML, Rossetti NE, Boonseng WE, Oksuz O, Cook EB, et al. EWS-FLI1 использует дивергентные механизмы ремоделирования хроматина для прямой активации или репрессии энхансерных элементов в саркоме Юинга. Раковая клетка. 2014; 26: 668–81.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

81.

Щелькун М.Д., Тихомирова М.С., Синкунас Т., Гасюнас Г., Карвелис Т., Пшера П., Сикснис В., Зайдель Р. Прямое наблюдение образования R-петли с помощью одиночных РНК-управляемых Cas9 и каскадных эффекторных комплексов. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111: 9798–803.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

82.

Чжэн Р., Шен З, Трипати В., Суан З, Фрейер С.М., Беннетт К.Ф., Прасант С.Г., Прасант К.В. РНК, содержащие полипуриновые повторы: новый класс длинных некодирующих РНК в клетках млекопитающих.J Cell Sci. 2010; 123: 3734–44.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

83.

Баколла А., Купер Д. Н., Васкес К. М.. Структура ДНК, отличная от B, и мутации, вызывающие генетические заболевания человека. В: eLS. Нью-Йорк: John Wiley & Sons Ltd; 2001.

84.

Montagna C, Andrechek ER, Padilla-Nash H, Muller WJ, Ried T. Аномалии центросом, повторяющиеся делеции хромосомы 4 и геномная амплификация HER2 / neu определяют аденокарциномы молочной железы мыши, индуцированные мутантом HER2 / neu.Онкоген. 2002; 21: 890–8.

CAS Статья PubMed Google ученый

85.

Миллер С.А., Дайкс Д.Д., Полесский ХФ. Простая процедура высаливания для извлечения ДНК из ядерных клеток человека. Nucleic Acids Res. 1988; 16: 1215.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

86.

Zhang Y, Liu T, Meyer CA, Eeckhoute J, Johnson DS, Bernstein BE, Nusbaum C, Myers RM, Brown M, Li W, Liu XS.Модельный анализ ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 2008; 9: R137.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

87.

Диас А., Неллор А., Сонг Дж. С.. ШАНС: комплексное программное обеспечение для контроля качества и проверки данных ChIP-seq. Genome Biol. 2012; 13: R98.

PubMed Central Статья PubMed Google ученый

88.

Searle BC. Scaffold: биоинформатический инструмент для валидации протеомных исследований на основе МС / МС.Протеомика. 2010; 10: 1265–9.

CAS Статья PubMed Google ученый

Виром человека: сборка, состав и взаимодействия с хозяином

Breitbart, M. et al. Метагеномный анализ некультивируемого вирусного сообщества из человеческих фекалий. J. Bacteriol. 185 , 6220–6223 (2003).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Zhang, T. et al. Вирусное сообщество РНК в кале человека: преобладание патогенных вирусов. PLoS Biol. 4 , 0108–0118 (2006).

CAS Google ученый

Reyes, A. et al. Вирусы фекальной микробиоты однояйцевых близнецов и их матерей. Nature 466 , 334–338 (2010).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Minot, S. et al. Быстрая эволюция вирома кишечника человека. Proc. Natl Acad. Sci. США 110 , 12450–12455 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Майнот, С., Ву, Г. Д., Льюис, Дж. Д. и Бушман, Ф. Д. Сохранение кассет генов среди различных вирусов кишечника человека. PLoS ONE 7 , e42342 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Minot, S. et al. Виром кишечника человека: индивидуальная изменчивость и динамический ответ на диету. Genome Res. 21 , 1616–1625 (2011).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Майнот, С., Грюнберг, С., Ву, Г. Д., Льюис, Дж. Д. и Бушман, Ф. Д. Гипервариабельные локусы в вироме кишечника человека. Proc. Natl Acad. Sci. США 109 , 3962–3966 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Breitbart, M. et al. Геномный анализ некультивируемых морских вирусных сообществ. Proc. Natl Acad. Sci. США 99 , 14250–14255 (2002).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Аггарвала В., Лян Г. и Бушман Ф. Д. Вирусные сообщества кишечника человека: метагеномный анализ состава и динамики. Моб. ДНК 8 , 12 (2017).

PubMed PubMed Central Google ученый

10.

Шкопоров, А. Н. и Хилл, С. Бактериофаги кишечника человека: «известный, известный» микробиом. Клеточный микроб-хозяин 25 , 195–209 (2019).

CAS PubMed Google ученый

11.

Fernandes, M. A. et al. Кишечный виром и бактериальная микробиота у детей с язвенным колитом и болезнью Крона. J. Pediatr. Гастроэнтерол. Nutr. 68 , 30–36 (2019).

PubMed PubMed Central Google ученый

12.

Liang, G. et al. Динамика вирома стула при очень раннем воспалительном заболевании кишечника. Колит Дж. Крона 14 , 1600–1610 (2020).

CAS Google ученый

13.

Clooney, A. G. et al. Цельновиромный анализ проливает свет на вирусную темную материю при воспалительном заболевании кишечника. Cell Host Microbe 26 , 764–778.e5 (2019).

CAS PubMed Google ученый

14.

Norman, J. M. et al. Специфические изменения кишечного вирома при воспалительном заболевании кишечника. Ячейка 160 , 447–460 (2015).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

15.

Zuo, T. et al. Виромные изменения слизистой оболочки кишечника при язвенном колите. Кишечник 68 , 1169–1179 (2019).

CAS PubMed Google ученый

16.

Zhao, G. et al. Изменения кишечного вирома предшествуют развитию аутоиммунитета у детей с диабетом I типа. Proc. Natl Acad. Sci. США 114 , E6166 – E6175 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

17.

Kim, K. W. et al. Отчетливый профиль вирома кишечника беременных женщин с диабетом 1 типа в исследовании ENDIA. Заражение открытого форума. Дис. 6 , оф025 (2019).

Google ученый

18.

Хан, М., Ян, П., Чжун, К. и Нин, К. Виром кишечника человека при гипертонии. Фронт. Microbiol. 9 , 3150 (2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

19.

Nakatsu, G. et al. Изменения кишечного вирома связаны с колоректальным раком и результатами выживания. Гастроэнтерология 155 , 529–541.e5 (2018).

PubMed Google ученый

20.

Sender, R., Fuchs, S. & Milo, R. Пересмотренные оценки количества человеческих и бактериальных клеток в организме. PLoS Biol. 14 , 1–14 (2016).

Google ученый

21.

Кифт, Т.Л. и Симмонс, К.А. Аллометрия взаимодействий между животными и микробами и глобальная перепись микробов, ассоциированных с животными. Proc. Королевский. Soc. Б. 282 , 20150702 (2015).

Google ученый

22.

Sherrill-Mix, S. et al. Аллометрия и экология микробиома кишечника билатеральных животных. m Bio 9 , e00319-18 (2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

23.

Джейкоб Ф., Сассман Р. и Монод Дж. О природе репрессора, обеспечивающего иммунитет лизогенных бактерий [французский язык]. C. R. Acad. Sci. 254 , 4214–4216 (1962).

CAS Google ученый

24.

Nishizawa, T. et al. Новый ДНК-вирус (TTV), связанный с повышенным уровнем трансаминаз при посттрансфузионном гепатите неизвестной этиологии. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 241 , 92–97 (1997).

CAS PubMed Google ученый

25.

Такахаши К., Иваса Ю., Хидзиката М. и Миширо С. Идентификация нового вируса ДНК человека (TTV-подобного мини-вируса, TLMV), промежуточно связанного с вирусом TT и вирусом куриной анемии. Arch. Virol. 145 , 979–993 (2000).

CAS PubMed Google ученый

26.

Ninomiya, M. et al. Идентификация и геномная характеристика нового тено-вируса крутящего момента человека размером 3,2 т.п.н. J. Gen. Virol. 88 , 1939–1944 (2007).

CAS PubMed Google ученый

27.

Freer, G. et al. Виром и его главный компонент, анелловирус, сложная система, формирующая иммунную защиту человека и, возможно, влияющая на развитие астмы и респираторных заболеваний в детстве. Фронт. Microbiol. 9 , 686 (2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

28.

Спандоле, С., Чимпонериу, Д., Берка, Л. М. и Михэеску, Г. Анелловирусы человека: обновленная информация о молекулярных, эпидемиологических и клинических аспектах. Arch. Virol. 160 , 893–908 (2015).

CAS PubMed Google ученый

29.

Young, J. C. et al. Вирусная метагеномика выявляет цветение анелловирусов в дыхательных путях реципиентов легкого. Am. J. Transpl. 15 , 200–209 (2015).

CAS Google ученый

30.

Monaco, C. L. et al. Измененный виром и бактериальный микробиом при синдроме приобретенного иммунодефицита, связанном с вирусом иммунодефицита человека. Клеточный микроб-хозяин 19 , 311–322 (2016).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

31.

Li, L. et al. СПИД изменяет комменсальный виром плазмы. J. Virol. 87 , 10912–10915 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

32.

Abbas, A. A. et al. Redondoviridae, семейство небольших кольцевых ДНК-вирусов орально-респираторного тракта человека, связанных с пародонтитом и критическими заболеваниями. Клеточный микроб-хозяин 25 , 719–729.e4 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

33.

Spezia, P. G. et al. ДНК редондовируса в образцах респираторных органов человека. J. Clin. Virol. 131 , 104586 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

34.

Lázaro-Perona, F. et al. Метагеномное обнаружение двух виентовирусов в образце мокроты человека. Вирусы 12 , 327 (2020).

PubMed Central Google ученый

35.

Мирзаи, М. К. и Морис, К. Ф. Ménage à trois в кишечнике человека: взаимодействие между хозяином, бактериями и фагами. Нат. Rev. Microbiol. 15 , 397–408 (2017).

CAS PubMed Google ученый

36.

Лим, Э. С., Ван, Д. и Хольц, Л. Р. Бактериальный микробиом и виромные вехи развития младенцев. Trends Microbiol. 24 , 801–810 (2016).

CAS PubMed Google ученый

37.

Virgin, H. W. Виром в физиологии и болезнях млекопитающих. Cell 157 , 142–150 (2014).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

38.

Рейес, А., Семенкович, Н. П., Уайтсон, К., Ровер, Ф. и Гордон, Дж. И. Становление вируса: секвенирование следующего поколения применительно к популяциям фагов в кишечнике человека. Нат. Rev. Microbiol. 10 , 607–617 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

39.

Шкопоров А.Н. и др. Виром кишечника человека очень разнообразен, стабилен и индивидуален. Клеточный микроб-хозяин 26 , 527–541.e5 (2019).

CAS PubMed Google ученый

40.

Abeles, S. R. et al. Вирусы полости рта человека индивидуальны, устойчивы и зависят от пола. ISME J. 8 , 1753–1767 (2014).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

41.

Абелес, С. Р., Ли, М., Сантьяго-Родригес, Т. М. и Прайд, Д. Т. Влияние длительной антибактериальной терапии на оральные и фекальные виромы человека. PLoS ONE 10 , e0134941 (2015).

PubMed PubMed Central Google ученый

42.

Dutilh, B.E. et al. Очень распространенный бактериофаг, обнаруженный в неизвестных последовательностях фекальных метагеномов человека. Нат. Commun. 5 , 1–11 (2014).

Google ученый

43.

Guerin, E. et al. Биология и таксономия crAss-подобных бактериофагов, самого распространенного вируса в кишечнике человека. Cell Host Microbe 24 , 653–664.e6 (2018).

CAS PubMed Google ученый

44.

Эдвардс, Р. А. и др. Глобальная филогеография и древняя эволюция широко распространенного вируса кишечника человека crAssphage. Нат. Microbiol. 4 , 1727–1736 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

45.

Ютин Н. и др. Открытие обширного семейства бактериофагов, которое включает самые распространенные вирусы из кишечника человека. Нат. Microbiol. 3 , 38–46 (2018).

CAS PubMed Google ученый

46.

Шкопоров, А.N. et al. ΦCrAss001 представляет собой наиболее многочисленное семейство бактериофагов в кишечнике человека и инфицирует Bacteroides Кишечник . Нат. Commun. 9 , 1–8 (2018).

CAS Google ученый

47.

Саттон, Т. Д. С. и Хилл, К. Кишечный бактериофаг: современное понимание и проблемы. Фронт. Эндокринол. 10 , 784 (2019).

Google ученый

48.

Rascovan, N., Duraisamy, R. & Desnues, C. Метагеномика и виром человека у бессимптомных лиц. Annu. Rev. Microbiol. 70 , 125–141 (2016).

CAS PubMed Google ученый

49.

Liang, G. et al. Поэтапная сборка неонатального вирома модулируется грудным вскармливанием. Nature 581 , 470–474 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

50.

Lim, E. S. et al. Динамика вирома кишечника человека и бактериального микробиома у младенцев в раннем периоде жизни. Нат. Med. 21 , 1228–1234 (2015).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

51.

Бушман, Ф. Д., Маккормик, К. и Шерилл-Микс, С. Структуры вирусов ограничивают способы передачи. Нат. Microbiol. 4 , 1778–1780 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

52.

Запор, М. Постоянное обнаружение и инфекционный потенциал вируса SARS-CoV-2 в клинических образцах от пациентов с COVID-19. Вирусы 12 , 1384 (2020).

CAS PubMed Central Google ученый

53.

Роблес-Сикисака, Р. и др. Связь между окружающей средой обитания и экологией вирусов ротовой полости человека. ISME J. 7 , 1710–1724 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

54.

Найду М., Роблес-Сикисака Р., Абелес С. Р., Бём Т. К. и Прайд Д. Т. Характеристика сообществ бактериофагов и профилей CRISPR из зубного налета. BMC Microbiol. 14 , 1–13 (2014).

Google ученый

55.

Pride, D. T. et al. Доказательства устойчивой резидентной популяции бактериофагов выявлены посредством анализа вирома слюны человека. ISME J. 6 , 915–926 (2012).

CAS PubMed Google ученый

56.

Перес-Брокаль В. и Мойя А. Анализ вирома ДНК полости рта показывает, какие вирусы широко и редко встречаются среди здоровых молодых людей в Валенсии (Испания). PLoS ONE 13 , e01

(2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

57.

Бейкер, Дж. Л., Бор, Б., Аньелло, М., Ши, В. и Хе, X. Экология микробиома полости рта: за пределами бактерий. Trends Microbiol. 25 , 362–374 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

58.

Willner, D. et al. Метагеномный анализ вирусных сообществ ДНК респираторного тракта у людей с муковисцидозом и без муковисцидоза. PLoS ONE 4 , e7370 (2009 г.).

PubMed PubMed Central Google ученый

59.

Уайли, К. М., Михиндукуласурия, К. А., Содергрен, Э., Вайншток, Г. М. и Сторч, Г. А. Анализ последовательности человеческого вирома у детей с лихорадкой и лихорадкой. PLoS ONE 7 , e27735 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

60.

Clarke, E. L. et al. Микробные линии при саркоидозе — метагеномный анализ, специально разработанный для образцов с низким содержанием микробов. Am. J. Respir.Крит. Care Med. 197 , 225–234 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

61.

Abbas, A. A. et al. Периоперационный виром трансплантата легкого: вирусы крутящего момента тено повышены в легких доноров и демонстрируют дивергентную динамику при первичной дисфункции трансплантата. Am. J. Transplant. 17 , 1313–1324 (2017).

CAS PubMed Google ученый

62.

Abbas, A.A. et al. Двунаправленный перенос клонов Anelloviridae между трансплантатом и хозяином во время трансплантации легкого. Am. J. Transplant. 19 , 1086–1097 (2019).

CAS PubMed Google ученый

63.

Брейтбарт, М. и Ровер, Ф. Метод обнаружения новых ДНК-вирусов в крови с использованием отбора вирусных частиц и секвенирования дробовика. Biotechniques 39 , 729–736 (2005).

CAS PubMed Google ученый

64.

Moustafa, A. et al. Виром ДНК крови у 8000 человек. PLoS Pathog. 13 , e1006292 (2017).

PubMed PubMed Central Google ученый

65.

Liu, S. et al. Геномный анализ неинвазивного пренатального тестирования выявляет генетические ассоциации, характер вирусных инфекций и историю населения Китая. Ячейка 175 , 347–359.e14 (2018).

CAS PubMed Google ученый

66.

Кастильо, Д. Дж., Рифкин, Р. Ф., Коуэн, Д. А., Потгитер, М. Здоровый микробиом крови человека: факт или вымысел? Фронт. Клетка. Заразить. Microbiol. 9 , 148 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

67.

Zárate, S., Taboada, B., Yocupicio-Monroy, M. & Arias, C.F. Виром человека. Arch. Med. Res. 48 , 701–716 (2017).

PubMed Google ученый

68.

Nguyen, S. et al. Трансцитоз бактериофага обеспечивает механизм пересечения слоев эпителиальных клеток. m Bio 8 , 1874–1891 (2017).

Google ученый

69.

Foulongne, V. et al. Микробиота кожи человека: большое разнообразие ДНК-вирусов, идентифицированных на коже человека с помощью высокопроизводительного секвенирования. PLoS ONE 7 , e38499 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

70.

Hannigan, G.D. et al. Виром двухцепочечной ДНК кожи человека: топографическое и временное разнообразие, генетическое обогащение и динамические ассоциации с микробиомом хозяина. m Bio 6 , e01578-15 (2015).

PubMed PubMed Central Google ученый

71.

Тирош О. и др. Расширенный кожный виром у пациентов с дефицитом DOCK8. Нат. Med. 24 , 1815–1821 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

72.

Сантьяго-Родригес, Т. М., Ли, М., Бонилья, Н.И Прайд, Д. Т. Виром мочи человека в связи с инфекциями мочевыводящих путей. Фронт. Microbiol. 6 , 14 (2015).

PubMed PubMed Central Google ученый

73.

Гарретто А., Миллер-Энсмингер Т., Вулф А. Дж. И Путонти С. Бактериофаги нижних мочевыводящих путей. Нат. Преподобный Урол. 16 , 422–432 (2019).

PubMed PubMed Central Google ученый

74.

Якобсен, Р. Р. и др. Характеристика вирома влагалищной ДНК в состоянии здоровья и дисбактериоза. Вирусы 12 , 1143 (2020).

CAS PubMed Central Google ученый

75.

Li, Y. et al. Виром спермы мужчин с ВИЧ, получающих или не получающих антиретровирусное лечение. AIDS 34 , 827–832 (2020).

CAS PubMed Google ученый

76.

Ghose, C. et al. Виром спинномозговой жидкости: вирусы, которых, как мы когда-то думали, не было. Фронт. Microbiol. 10 , 2061 (2019).

PubMed PubMed Central Google ученый

77.

Meyding Lamade, U. & Strank, C. Герпесвирусные инфекции центральной нервной системы у пациентов с ослабленным иммунитетом. Ther. Adv. Neurol. Disord. 5 , 279–296 (2012).

PubMed PubMed Central Google ученый

78.

МакГэверн, Д. Б. и Канг, С. С. Освещение вирусных инфекций в нервной системе. Нат. Rev. Immunol. 11 , 318–329 (2011).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

79.

Aagaard, K. et al. Плацента содержит уникальный микробиом. Sci. Transl Med. 6 , 237ra65 (2014).

PubMed PubMed Central Google ученый

80.

Antony, K. M. et al. Микробиом преждевременной плаценты варьируется в зависимости от избыточной прибавки в весе матери во время беременности. Am. J. Obstet. Гинеколь. 212 , 653.e1–653.e16 (2015).

Google ученый

81.

Prince, A. L. et al. Микробиом плацентарной мембраны изменяется у субъектов со спонтанными преждевременными родами с хориоамнионитом и без него. Am. J. Obstet. Гинеколь. 214 , 627.e1–627.e16 (2016).

Google ученый

82.

Collado, M.C., Rautava, S., Aakko, J., Isolauri, E. & Salminen, S. Колонизация кишечника человека может быть инициирована внутриутробно различными микробными сообществами в плаценте и околоплодных водах. Sci. Отчет 6 , 1–13 (2016).

Google ученый

83.

Martinez, K. A. et al. Бактериальная ДНК присутствует в кишечнике плода и перекрывается с ДНК в плаценте мышей. PLoS ONE 13 , e0197439 (2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

84.

Theis, K. R. et al. Есть ли в доношенной плаценте человека микробиота? Результаты культивирования, количественная ПЦР в реальном времени, секвенирование гена 16S рРНК и метагеномика. Am. J. Obs. Гинеколь. 220 , 267.e1–267.e39 (2019).

CAS Google ученый

85.

Lauder, A. P. et al. Сравнение образцов плаценты с контрольными контрольными образцами не дает доказательств наличия отдельной микробиоты плаценты. Микробиом 4 , 29 (2016).

PubMed PubMed Central Google ученый

86.

Лим, Э. С., Родригес, К. и Хольц, Л. Р. Амниотическая жидкость от здоровых доношенных беременностей не содержит обнаруживаемого микробного сообщества. Микробиом 6 , 87 (2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

87.

Leiby, J. S. et al. Отсутствие обнаружения микробиома плаценты человека в образцах от преждевременных и доношенных родов. Микробиом 6 , 196 (2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

88.

de Goffau, M. C. et al. Плацента человека не имеет микробиома, но может содержать потенциальные патогены. Nature 572 , 329–334 (2019).

PubMed PubMed Central Google ученый

89.

Эппс, Р. Э., Питтелькоу, М. Р. и Даниэль Су, В. П. Синдром TORCh. Семин. Кутан. Med. Surg. 14 , 179–186 (1995).

CAS Google ученый

90.

Липер, К. и Луцканин, А. Инфекции во время беременности. Prim.Уход 45 , 567–586 (2018).

PubMed Google ученый

91.

Карлсон, А., Норвиц, Э. Р. и Стиллер, Р. Дж. Цитомегаловирусная инфекция во время беременности: следует ли обследовать всех женщин? Rev. Obstet. Гинеколь. 3 , 172–179 (2010).

PubMed PubMed Central Google ученый

92.

Арора Н., Садовский Ю., Дермоди Т.С. и Койн, С. Б. Вертикальная передача микробов во время беременности человека. Клеточный микроб-хозяин 21 , 561–567 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

93.

Breitbart, M. et al. Вирусное разнообразие и динамика в кишечнике младенца. Res. Microbiol. 159 , 367–373 (2008).

CAS PubMed Google ученый

94.

Maqsood, R. et al. Несогласованная передача бактерий и вирусов от матери ребенку при рождении. Микробиом 7 , 156 (2019).

PubMed PubMed Central Google ученый

95.

Bäckhed, F. et al. Динамика и стабилизация микробиома кишечника человека в течение первого года жизни. Клеточный микроб-хозяин 17 , 690–703 (2015).

PubMed Google ученый

96.

Бауман-Дуденхёффер, А. М., Д’Суза, А. В., Тарр, П. И., Уорнер, Б. Б. и Дантас, Г. Диета для младенцев и прибавка в весе во время беременности у матери прогнозируют раннее метаболическое созревание микробиомов кишечника. Нат. Med. 24 , 1822–1829 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

97.

Sausset, R., Petit, M. A., Gaboriau-Routhiau, V. & De Paepe, M. Новые взгляды на кишечные фаги. Mucosal Immunol. 13 , 205–215 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

98.

Нанда, А. М., Торманн, К. и Фрунцке, Дж. Влияние спонтанной индукции профага на приспособленность бактериальных популяций и взаимодействия между хозяином и микробом. J. Bacteriol. 197 , 410–419 (2015).

PubMed PubMed Central Google ученый

99.

Кортес, М. Г., Крог, Дж. И Балажи, Г. Оптимальность скорости спонтанной индукции профага. J. Theor. Биол. 483 , 110005 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

100.

Jubelin, G. et al. Модуляция энтерогеморрагической Escherichia coli выживаемости и вирулентности в желудочно-кишечном тракте человека. Микроорганизмы 6 , 115 (2018).

CAS PubMed Central Google ученый

101.

De Paepe, M. et al. Носительство латентного λ-вируса дорого обходится его бактериальному хозяину из-за частой реактивации в моноксенном кишечнике мыши. PLOS Genet. 12 , e1005861 (2016).

PubMed PubMed Central Google ученый

102.

Reyes, A. et al. Виромы ДНК кишечника малавийских близнецов несовместимы с тяжелым острым недоеданием. Proc. Natl Acad. Sci. США 112 , 11941–11946 (2015).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

103.

McCann, A. et al. Виромы годовалых младенцев показывают влияние способа рождения на разнообразие микробиома. PeerJ 6 , e4694 (2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

104.

Черный, М., Бхаттачарья, С., Филип, С., Норман, Дж. Э. и МакЛернон, Д. Дж. Запланированное кесарево сечение в срок и неблагоприятные исходы для здоровья детей. J. Am. Med. Доц. 314 , 2271–2279 (2015).

CAS Google ученый

105.

Kuhle, S., Tong, O. S. & Woolcott, C.G. Связь между кесаревым сечением и детским ожирением: систематический обзор и метаанализ. Obes. Ред. 16 , 295–303 (2015).

CAS PubMed Google ученый

106.

Адлеркрейц, Э. Х., Вингрен, К. Дж., Винсенте, Р. П., Мерло, Дж. И Агард, Д. Факторы перинатального риска повышают риск развития диабета 1 типа и целиакии. Acta Paediatr. 104 , 178–184 (2015).

PubMed Google ученый

107.

Рутаисире, Э., Хуанг, К., Лю, Ю. и Тао, Ф. Способ доставки влияет на разнообразие и структуру колонизации кишечной микробиоты в течение первого года жизни младенцев: систематический обзор. BMC Gastroenterol. 16 , 86 (2016).

PubMed PubMed Central Google ученый

108.

Ной, Дж. И Рашинг, Дж. Кесарево сечение по сравнению с вагинальными родами: долгосрочные исходы для новорожденных и гигиеническая гипотеза. Clin. Перинатол. 38 , 321–331 (2011).

PubMed PubMed Central Google ученый

109.

Хуг, Л., Александер, М., Ю, Д. и Алкема, Л. Национальные, региональные и глобальные уровни и тенденции неонатальной смертности в период с 1990 по 2017 год с прогнозами на основе сценариев до 2030 года: систематический анализ. Lancet Glob. Лечить. 7 , e710 – e720 (2019).

Google ученый

110.

Оуде Маннинк, Б. Б., Хук, Л. и ван дер Хук, Л. Вирусы, вызывающие гастроэнтерит: известные, новые и неосуществимые. Вирусы 8 , 42 (2016).

PubMed Central Google ученый

111.

Турин, К. Г. и Очоа, Т. Дж. Роль материнского грудного молока в предотвращении детской диареи в развивающихся странах. Curr. Троп. Med. Отчет 1 , 97–105 (2014).

PubMed PubMed Central Google ученый

112.

Ламберти, Л. М., Фишер Уокер, К. Л., Нойман, А., Виктора, К. и Блэк, Р. Е. Грудное вскармливание и риск заболеваемости и смертности от диареи. BMC Public Health 11 , S15 (2011).

PubMed PubMed Central Google ученый

113.

Вакабаяси, Х., Ода, Х., Ямаути, К. и Абэ, Ф. Лактоферрин для профилактики распространенных вирусных инфекций. J. Infect. Chemother. 20 , 666–671 (2014).

CAS PubMed Google ученый

114.

Lang, J. et al. Подавление проникновения в клетки псевдовируса SARS путем связывания лактоферрина с гепарансульфат-протеогликанами. PLoS ONE 6 , e23710 (2011).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

115.

Witkowska-Zimny, M. & Kaminska-El-Hassan, E. Клетки грудного молока человека. Cell. Мол. Биол. Lett. 22 , 11 (2017).

PubMed PubMed Central Google ученый

116.

Simister, N. E. Плацентарный транспорт иммуноглобулина G. Vaccine 21 , 3365–3369 (2003).

CAS PubMed Google ученый

117.

Pou, C. et al. Репертуар материнских антивирусных антител у новорожденных. Нат. Med. 25 , 591–596 (2019).

CAS PubMed Google ученый

118.

Альбрехт, М. и Арк, П. С. Вертикально переданный иммунитет у новорожденных: матери, механизмы и медиаторы. Фронт. Иммунол. 11 , 555 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

119.

Wiciński, M., Sawicka, E., Gębalski, J., Kubiak, K. & Malinowski, B. Олигосахариды грудного молока: польза для здоровья, потенциальное применение в детских смесях и фармакология. Питательные вещества 12 , 266 (2020).

PubMed Central Google ученый

120.

Berlutti, F. et al. Противовирусные свойства лактоферрина — молекулы естественного иммунитета. Молекулы 16 , 6992–7012 (2011).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

121.

Conesa, C. et al. Выделение лактоферрина из молока разных видов: калориметрические и антимикробные исследования. Комп. Biochem. Physiol. B Biochem. Мол. Биол. 150 , 131–139 (2008).

PubMed Google ученый

122.

Pannaraj, P. S. et al. Общие и отличительные особенности виромов грудного молока и детского стула. Фронт. Microbiol. 9 , 1162 (2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

123.

Duranti, S. et al. Материнская наследственность бифидобактериальных сообществ и бифидофагов у младенцев посредством вертикальной передачи. Микробиом 5 , 66 (2017).

PubMed PubMed Central Google ученый

124.

Goodrich, J. K. et al. Человеческая генетика формирует микробиом кишечника. Ячейка 159 , 789–799 (2014).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

125.

Goodrich, J. K. et al. Генетические детерминанты микробиома кишечника британских близнецов. Клеточный микроб-хозяин 19 , 731–743 (2016).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

126.

Xie, H. et al. Метагеномика 250 взрослых близнецов показывает генетическое и экологическое влияние на микробиом кишечника. Cell Syst. 3 , 572–584.e3 (2016).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

127.

Rothschild, D. et al. В формировании микробиоты кишечника человека окружающая среда доминирует над генетикой хозяина. Природа 555 , 210–215 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

128.

Moreno-Gallego, J. L. et al. Разнообразие вирома коррелирует с разнообразием кишечного микробиома у взрослых монозиготных близнецов. Клеточный микроб-хозяин 25 , 261–272.e5 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

129.

Орт, Г. Генетика бородавчатой эпидермодисплазии: понимание защиты хозяина от вирусов папилломы. Семин. Иммунол. 18 , 362–374 (2006).

CAS PubMed Google ученый

130.

Clarke, E. L. et al. Динамика Т-клеток и ответ микробиоты после генной терапии для лечения Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита. Genome Med. 10 , 70 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

131.

Zuo, T. et al. Вариации вирома человека – кишечника – ДНК в зависимости от географии, этнической принадлежности и урбанизации. Клеточный микроб-хозяин 28 , 741–751.e4 (2020).

CAS PubMed Google ученый

132.

Holtz, L. R. et al. Географические вариации эукариотического вирома диареи человека. Вирусология 468 , 556–564 (2014).

PubMed Google ученый

133.

Gregory, A.C. et al. База данных кишечных виромов раскрывает возрастные закономерности разнообразия виромов в кишечнике человека. Клеточный микроб-хозяин 28 , 724–740.e8 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

134.

Rampelli, S. et al. Характеристика вирома кишечника ДНК человека среди популяций с различными стратегиями существования и географическим происхождением. Environ. Microbiol. 19 , 4728–4735 (2017).

CAS PubMed Google ученый

135.

Нил, Дж. А. и Кэдвелл, К. Кишечный виром и иммунитет. J. Immunol. 201 , 1615–1624 (2018).

CAS PubMed Google ученый

136.

Сео, С. У. и Квеон, М. Н. Взаимодействия Вирома-хозяина при здоровье и болезнях кишечника. Curr.Opin. Virol. 37 , 63–71 (2019).

PubMed Google ученый

137.

Moghadam, M. T. et al. Как фаги преодолевают проблемы устойчивых к лекарствам бактерий при клинических инфекциях. Заражение. Устойчивость к наркотикам. 13 , 45–61 (2020).

Google ученый

138.

Кортрайт, К. Э., Чан, Б. К., Кофф, Дж. Л. и Тернер, П. Е. Фаговая терапия: обновленный подход к борьбе с устойчивыми к антибиотикам бактериями. Клеточный микроб-хозяин 25 , 219–232 (2019).

CAS PubMed Google ученый

139.

Galtier, M. et al. Бактериофаги, нацеленные на прикрепленные инвазивные штаммы Escherichia coli , в качестве многообещающего нового метода лечения болезни Крона. J. Crohns Colitis 11 , 840–847 (2017).

PubMed Google ученый

140.

Тейлор В. Л., Фицпатрик А. Д., Ислам З. и Максвелл К. Л. Различное влияние идиотов-фагов на приспособленность и вирулентность бактерий. Adv. Virus Res. 103 , 1–31 (2019).

CAS PubMed Google ученый

141.

Моди, С. Р., Ли, Х. Х., Спина, С. и Коллинз, Дж. Дж. Лечение антибиотиками расширяет резервуар устойчивости и экологическую сеть метагенома фага. Природа 499 , 219–222 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

142.

Boling, L. et al. Диетические индукторы профага и противомикробные препараты: к улучшению микробиома кишечника человека. Кишечные микробы 11 , 721–734 (2020).

PubMed PubMed Central Google ученый

143.

Sweere, J. M. et al. Бактериофаг запускает противовирусный иммунитет и препятствует избавлению от бактериальной инфекции. Наука 363 , eaat9691 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

144.

Гогохия Л. и др. Распространение бактериофагов связано с обострением кишечного воспаления и колита. Cell Host Microbe 25 , 285–299.e8 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

145.

Lindfors, K. et al. Метагеномика фекального вирома указывает на кумулятивный эффект энтеровируса и количества глютена на риск аутоиммунитета целиакии у детей из группы генетического риска: исследование TEDDY. Кишечник 69 , 1416–1422 (2019).

PubMed Google ученый

146.

Хан Мирзаи, М. и др. Бактериофаги, выделенные у детей с задержкой роста, могут регулировать бактериальные сообщества кишечника в зависимости от возраста. Клеточный микроб-хозяин 27 , 199–212.e5 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

147.

Desai, C. et al. Скорость роста у детей с экологической кишечной дисфункцией связана со специфическими бактериальными и вирусными таксонами желудочно-кишечного тракта у малавийских детей. PLoS Negl. Троп. Дис. 14 , e0008387 (2020).

PubMed PubMed Central Google ученый

148.

Ли, С. и Болдридж, М. Т. Вирусы повышают иммунитет кишечника. Нат. Иммунол. 20 , 1563–1564 (2019).

CAS PubMed Google ученый

149.

Kernbauer, E., Ding, Y. & Cadwell, K. Кишечный вирус может заменить полезную функцию комменсальных бактерий. Nature 516 , 94–98 (2014).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

150.

Ingle, H. et al. Вирусное дополнение иммунодефицита обеспечивает защиту от кишечных патогенов через интерферон-λ. Нат. Microbiol. 4 , 1120–1128 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

151.

Liu, L. et al. Комменсальные вирусы поддерживают интраэпителиальные лимфоциты кишечника посредством неканонической передачи сигналов RIG-I. Нат. Иммунол. 20 , 1681–1691 (2019).

CAS PubMed Google ученый

152.

Pérez-Brocal, V. et al. Метагеномный анализ пациентов с болезнью Крона выявляет изменения в вироме и микробиоме, связанные со статусом болезни и терапией, и выявляет потенциальные взаимодействия и биомаркеры. Inflamm. Кишечник. 21 , 2515–2532 (2015).

PubMed Google ученый

153.

Ma, Y., You, X., Mai, G., Tokuyasu, T. и Liu, C. Каталог кишечных фагов человека коррелирует фагом кишечника с диабетом 2 типа. Микробиом 6 , 24 (2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

154.

Ungaro, F. et al. Метагеномный анализ слизистой оболочки кишечника выявил специфическую сигнатуру вирома эукариотического кишечника при раннем диагностированном воспалительном заболевании кишечника. Кишечные микробы 10 , 149–158 (2019).

CAS PubMed Google ученый

155.

Legoff, J. et al. Виром кишечника эукариот в трансплантации гемопоэтических стволовых клеток: новые ключи к разгадке кишечной реакции «трансплантат против хозяина». Нат. Med. 23 , 1080–1085 (2017).

CAS PubMed Google ученый

156.

oś, M. & Wegrzyn, G. в Достижения в вирусных исследованиях Vol.82 339–349 (Academic Press, 2012).

157.

Дрю, Х. Р. и др. Структура додекамера B-ДНК: конформация и динамика. Proc. Natl Acad. Sci. США 78 , 2179–2183 (1981).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

158.

Schulz, F. et al. Гигантское разнообразие вирусов и взаимодействия с хозяевами посредством глобальной метагеномики. Nature 578 , 432–436 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

159.

Wang, Y., Hammes, F., Düggelin, M. & Egli, T. Влияние размера, формы и гибкости на прохождение бактерий через микропористые мембранные фильтры. Environ. Sci. Technol. 42 , 6749–6754 (2008).

CAS PubMed Google ученый

160.

Weil, A. A., Becker, R.Л. и Харрис, Дж. Б. Vibrio cholerae на пересечении иммунитета и микробиома. м Сфера 4 , e00597-19 (2019).

PubMed PubMed Central Google ученый

161.

Райан М. П. и Пембрук Дж. Т. Brevundimonas spp: новые глобальные условно-патогенные микроорганизмы. Вирулентность 9 , 480–493 (2018).

PubMed PubMed Central Google ученый

162.

Roux, S. et al. К количественной вирусомике для двухцепочечных и одноцепочечных ДНК-вирусов. PeerJ 2016 , e2777 (2016).

Google ученый

163.

Ким, К. Х. и Бэ, Дж. У. Методы амплификации смещают метагеномные библиотеки некультивируемых одноцепочечных и двухцепочечных ДНК-вирусов. Заявл. Environ. Microbiol. 77 , 7663–7668 (2011).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

164.

Кришнамурти, С. Р., Яновски, А. Б., Чжао, Г., Баруш, Д. и Ван, Д. Гиперэкспансия разнообразия РНК-бактериофагов. PLOS Biol. 14 , e1002409 (2016).

PubMed PubMed Central Google ученый

165.

Callanan, J. et al. Расширение известных фаговых геномов оцРНК: с десятков до более тысячи. Sci. Adv. 6 , eaay5981 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

166.

Salter, S.J. et al. Загрязнение реагентов и лабораторий может критически повлиять на анализ микробиома, основанный на последовательностях. BMC Biol. 12 , 87 (2014).

PubMed PubMed Central Google ученый

167.

Kim, D. et al. Оптимизация методов и устранение ошибок в исследовании микробиома. Microbiome 5 , 1–14 (2017).

Google ученый

168.

Zolfo, M. et al. Обнаружение контаминации виромов с помощью ViromeQC. Нат. Biotechnol. 37 , 1408–1412 (2019).

CAS PubMed Google ученый

169.

Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S. & Li, W. CD-HIT: ускорен для кластеризации данных секвенирования следующего поколения. Биоинформатика 28 , 3150–3152 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

170.

Тейлор, Л. Дж., Аббас, А. и Бушман, Ф. Д. grabseqs: простая загрузка считываний и метаданных из нескольких репозиториев данных секвенирования следующего поколения. Биоинформатика 36 , 3607–3609 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

171.

Roux, S., Enault, F., Hurwitz, B. L. и Sullivan, M. B. VirSorter: извлечение вирусного сигнала из данных микробного генома. PeerJ 3 , e985 (2015).

PubMed PubMed Central Google ученый

172.

Рен, Дж., Альгрен, Н. А., Лу, Й. Ю., Фурман, Дж. А. и Сан, Ф. VirFinder: новый инструмент на основе k-мер для идентификации вирусных последовательностей на основе собранных метагеномных данных. Микробиом 5 , 69 (2017).

PubMed PubMed Central Google ученый

173.

Тити, С. С., Эйлуорд, Ф.О., Дженсен, Р. В. и Чжан, Л. FastViromeExplorer: конвейер для идентификации вирусов и фагов и профилирования численности в данных метагеномики. PeerJ 2018 , e4227 (2018).

Google ученый

174.

Roux, S., Tournayre, J., Mahul, A., Debroas, D. & Enault, F. Metavir 2: новые инструменты для сравнения вирусных метагеномов и анализа собранных виромов. BMC Bioinforma. 15 , 76 (2014).

Google ученый

175.

Юрц, В. И., Вильярроэль, Дж., Лунд, О., Волдби Ларсен, М. и Нильсен, М. MetaPhinder — идентификация последовательностей бактериофагов в наборах метагеномных данных. PLoS ONE 11 , e0163111 (2016).

PubMed PubMed Central Google ученый

176.

Rampelli, S. et al. ViromeScan: новый инструмент для профилирования метагеномного вирусного сообщества. BMC Genomics 17 , 165 (2016).

PubMed PubMed Central Google ученый

177.

Bolduc, B. et al. vConTACT: инструмент iVirus для классификации вирусов с двухцепочечной ДНК, поражающих археи и бактерии. PeerJ 2017 , e3243 (2017).

Google ученый

178.

Hatcher, E. L. et al. Вариант вируса — улучшенный ответ на возникающие вирусные вспышки. Nucleic Acids Res. 45 , D482 – D490 (2017).

CAS PubMed Google ученый

179.

Бейтман, A. UniProt: всемирный центр знаний о белках. Nucleic Acids Res. 47 , D506 – D515 (2019).

Google ученый

180.

Грацциотин, А. Л., Кунин, Э. В. и Кристенсен, Д. М. Ортологические группы прокариотических вирусов (pVOG): ресурс для сравнительной геномики и аннотации семейств белков. Nucleic Acids Res. 45 , D491 – D498 (2017).

CAS PubMed Google ученый

181.

El-Gebali, S. et al. База данных семейств белков Pfam в 2019 году. Nucleic Acids Res. 47 , D427 – D432 (2019).

CAS PubMed Google ученый

182.

Скьюс-Кокс, П., Шарптон, Т. Дж., Поллард, К. С., ДеРизи, Дж.L. Профиль скрытых марковских моделей для обнаружения вирусов в данных метагеномной последовательности. PLoS ONE 9 , e105067 (2014).

PubMed PubMed Central Google ученый

183.

Clarke, E. L. et al. Sunbeam: расширяемый конвейер для анализа экспериментов по метагеномному секвенированию. Микробиом 7 , 46 (2019).

PubMed PubMed Central Google ученый

184.

Tisza, M. J. et al. Открытие нескольких тысяч очень разнообразных кольцевых ДНК-вирусов. eLife 9 , e51971 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

185.

Zhao, G. et al. VirusSeeker, вычислительный конвейер для обнаружения вирусов и анализа виромного состава. Вирусология 503 , 21–30 (2017).

CAS PubMed Google ученый

186.

Макнейр, К., Бейли, Б. А. и Эдвардс, Р. А. ФАКТЫ, вычислительный подход к классификации образа жизни фагов. Биоинформатика 28 , 614–618 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

187.

Arndt, D. et al. PHASTER: улучшенная и быстрая версия инструмента поиска фагов PHAST. Nucleic Acids Res. 44 , W16 – W21 (2016).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Сравнение ДНК шимпанзе, бонобо и человека

Шимпанзе и бонобо — ближайшие живущие родственники людей.

Фото: Адриан Самнер / Stone / Getty Images СЭМ-изображение человеческих хромосом, показывающее центромеры и хроматиды (увеличение: x6 100)

Эти три вида во многом похожи, как телом, так и поведением.Но для четкого понимания того, насколько они связаны между собой, ученые сравнивают их ДНК, важную молекулу, которая является инструкцией по созданию каждого вида. У людей и шимпанзе 98,8% общей ДНК. Как мы можем быть такими похожими — и в то же время такими разными?

Так много похожих …

ДНК человека и шимпанзе так похожи, потому что эти два вида очень близки. Люди, шимпанзе и бонобо произошли от одного вида-предка, который жил шесть или семь миллионов лет назад.По мере того как люди и шимпанзе постепенно эволюционировали от общего предка, их ДНК, передаваемая из поколения в поколение, также менялась. Фактически, многие из этих изменений ДНК привели к различиям между внешностью и поведением человека и шимпанзе.

Изучите доказательства

Соответствие ДНК? ДНК человека и шимпанзе почти идентична, если сравнить полосы на хромосомах, связки ДНК внутри почти каждой клетки.Какие две хромосомы более похожи?

Образцы полос

Светлые и темные полосы на этих хромосомах, созданные лабораторным красителем, показывают сходства и различия между ДНК человека, шимпанзе и мыши.

Х-хромосомы человека и шимпанзе содержат около 1100 различных генов или наборов инструкций. Каждый ген влияет на определенную черту тела.

HEM B — свертывание крови, гемофилия
CPX — развитие лица, волчья пасть
SMC1L1 — поддержание хромосом
OPN1LW — зрение красного цвета

Seeing Red

Большинство генов человека и шимпанзе почти идентичны.У обоих видов есть ген OPN1LW, который позволяет им обоим видеть красный цвет. Но у мышей отсутствует OPN1LW — и они плохо видят красный цвет.

… И все же такие разные

Если ДНК человека и шимпанзе на 98,8% идентичны, почему мы такие разные? Числа рассказывают часть истории. Каждая клетка человека содержит примерно три миллиарда пар оснований или битов информации. Всего 1,2 процента от этой суммы равняется примерно 35 миллионам различий. Некоторые из них имеют большое влияние, другие — нет. И даже два одинаковых участка ДНК могут работать по-разному — они могут быть «включены» в разном количестве, в разных местах или в разное время.

Фото: Ник Кудис / Photodisc Green / Getty Images Человеческие глаза

Одни и те же гены, но ведут себя по-разному

Хотя люди и шимпанзе имеют много идентичных генов, они часто используют их по-разному.Активность или экспрессию гена можно увеличить или уменьшить, как в радио. Таким образом, один и тот же ген может иметь высокий уровень у людей, но очень низкий у шимпанзе.

Одни и те же гены экспрессируются в одних и тех же областях мозга человека, шимпанзе и гориллы, но в разных количествах. Тысячи подобных различий влияют на развитие и функции мозга и помогают объяснить, почему человеческий мозг больше и умнее.

Немного разные гены

Иммунная система шимпанзе удивительно похожа на нашу — большинство вирусов, вызывающих такие заболевания, как СПИД и гепатит, могут заразить и шимпанзе.Но шимпанзе не заражаются малярийным паразитом Plasmodium falciparum , который комар может передать через укус в кровь человека. Небольшая разница в ДНК делает человеческие эритроциты уязвимыми для этого паразита, в то время как клетки крови шимпанзе устойчивы.

Биоактивные клеточно-подобные гибриды из дендримерсом с клеточной мембраной человека и ее компоненты

Значение

Грамотрицательные бактериальные клетки, такие как Escherichia coli , содержат относительно жесткую внешнюю мембрану и сшитый пептидогликан в их периплазме, что дает их жесткость и стабильность, позволяющие самостоятельно выживать в суровых условиях.Чтобы разрушить эти прочные оболочки бактериальных клеток, необходимо использовать ферментативные процессы. Напротив, мембраны клеток человека гораздо более хрупкие, что позволяет легче их демонтировать с помощью относительно легкого механического разрушения. После демонтажа этих мембран их можно объединить с синтетическими имитаторами фосфолипидов, названными дендримерами Януса, в клеточно-подобные гибриды. Этот метод стабилизирует хрупкие клеточные мембраны человека, открывая возможности для изучения клеточных мембран человека и их составляющих in vitro в более устойчивой среде.

Abstract

Клеточно-подобные гибриды природных и синтетических амфифилов обеспечивают платформу для разработки функций синтетических клеток и протоклеток. Клеточные мембраны и везикулы, полученные из мембран клеток человека, относительно нестабильны in vitro и поэтому их трудно изучать. Толщина биологических мембран и везикул, самоорганизующихся из амфифильных дендримеров Януса, известных как дендримерсомы, сопоставима. Эта особенность облегчила совместную сборку функциональных клеточно-подобных гибридных везикул из гигантских дендримерсом и бактериальных мембранных везикул, образованных из очень стабильной бактериальной клетки Escherichia coli после ферментативной деградации ее внешней мембраны.Человеческие клетки хрупки и требуют лишь легкого центрифугирования для разборки и последующего восстановления в пузырьки. Здесь мы сообщаем о совместной сборке мембранных везикул человека с дендримерсомами. Полученные гигантские гибридные везикулы, содержащие мембраны клеток человека, их компоненты и дендримеры Януса, стабильны в течение как минимум 1 года. Чтобы продемонстрировать полезность клеточно-подобных гибридных везикул, были приготовлены гибриды из дендримерсом и бактериальных мембранных везикул, содержащих YadA, бактериальный белок адгезина.Последние клеточно-подобные гибриды распознаются человеческими клетками, что делает возможным адгезию и проникновение гибридных бактериальных пузырьков в человеческие клетки in vitro.

Мембраны клеток человека механически хрупкие и химически нестабильны in vitro (1). Таким образом, исследование функций биологических мембран вне естественной клеточной среды in vivo представляет собой серьезную проблему. Липосомы, собранные из природных фосфолипидов (2) и их химически модифицированных версий (3, 4), также нестабильны.Исключением являются скрытые липосомы (5, 6), которые представляют собой везикулы, состоящие из фосфолипидов и водорастворимых полимеров, конъюгированных с фосфолипидами. Первая серия везикул, собранных из синтетических липидов (7, 8), не решила эту проблему стабильности. Амфифильные блок-сополимеры (9) были первыми амфифилами, которые собрались в стабильные везикулы, названные полимерсомами. Однако блок-сополимеры не всегда биосовместимы, а толщина полимерсомных бислоев больше, чем у липосом и природных биологических мембран.Амфифильные дендримеры Януса (JD) (10, 11) самоорганизуются в стабильные и монодисперсные везикулы с толщиной бислоя, аналогичной толщине липосом (12). Поскольку JD получают из природных фенольных кислот (13), они также являются биосовместимыми (10, 11).

Фосфолипиды и амфифильные блок-сополимеры могут самоорганизовываться в смешанные гибридные везикулы фосфолипид / блок-сополимер (14⇓⇓ – 17). Ограниченная смешиваемость и разная толщина фосфолипидов и гидрофобной части блок-сополимеров создают сложную морфологию везикул, иногда с разными двухслойными мембранами, полученными разделением фаз.Положительным результатом отсутствия смешиваемости и сходства длины между фосфолипидами и гидрофобными частями блок-сополимеров является то, что разделенные по фазе фрагменты фосфолипида могут вмещать трансмембранные белки в монослоях, содержащих фосфолипиды и блок-сополимер (18, 19). Также могут быть получены трехкомпонентные гибридные везикулы из смесей блок-сополимер-фосфолипид-гликолипид (20). Отрицательный аспект этой проблемы заключается в том, что несмешиваемость между фосфолипидами и блок-сополимерами не способствует стабилизации фосфолипидных фрагментов гибридных везикул, и поэтому происходит постоянная реорганизация структуры гибридных везикул (19, 21).Ни в одной из этих гибридных сборок не использовались мембраны клеток бактерий или млекопитающих, содержащие нативные компоненты (17). Трансмембранные белки, такие как аквапорин, были включены в полимерсому, полученную из одного блок-сополимера, а не в везикулу гибридного фосфолипида и блок-сополимера (22). Единственная попытка нашей лаборатории объединить бактериальные мембраны с блок-сополимерами не удалась (23).

Дендримерсомы (DS) (10, 11) и гликодендримерсомы (GDS) (24), самоорганизующиеся из монодисперсных, амфифильных JD и гликодендримеров Януса, недавно были предложены в качестве моделей биологических мембран с регулируемым размером (25) и структурной организацией (26, 27) и функциональные поверхности (28).DS и GDS позволяют исследовать специфические взаимодействия, такие как связывание гликан-лектина, без вмешательства других функциональных групп, присутствующих на биологической мембране (29). DS и GDS демонстрируют толщину бислоя, аналогичную толщине липосом (~ 4 нм), собранных из фосфолипидов (8, 9), и превосходную стабильность в буфере при комнатной температуре в течение нескольких лет (10). Для сравнения, липосомы на основе фосфолипидов или скрытые липосомы стабильны в одних и тех же условиях менее 1 недели, а фосфолипиды необходимо хранить при -20 ° C, в то время как наши JD можно хранить при комнатной температуре.DS и GDS были успешно объединены в гигантские гибридные везикулы с мембраной и мембранными компонентами грамотрицательной бактерии Escherichia coli (23). Трансмембранные белки, такие как канальные белки и липиды из E. coli , а также флуоресцентные метки и гликаны из DS или GDS, были включены путем совместной сборки в эти гибридные клеточно-подобные везикулы. Следовательно, этот метод преодолевает проблемы, связанные с включением клеточных компонентов, включая фосфолипиды и трансмембранные белки, в полимерсомы или другие синтетические мембраны с несоответствующей толщиной или другие проблемы биосовместимости (30).Хотя ожидается, что мембраны клеток человека будут подвержены подобной совместной сборке с синтетическими компонентами из DS или GDS, они никогда не включались в синтетические везикулы, несмотря на большой интерес к выяснению функций клеток человека. Действительно, из-за отсутствия клеточных стенок и сшитых гликанов, таких как пептидогликан, доступных в бактериальных мембранах и клетках (31), эта совместная сборка должна быть не только более простой, чем для грамотрицательных бактериальных мембран, но также, как ожидается, обеспечит платформу для стабилизации клеточных мембран человека и, таким образом, обеспечения возможности применения клеточных мембран человека in vitro.

Результаты и обсуждение

Совместная сборка гигантских DS с мембранными везикулами человека.

Гигантские DS (диаметр от ∼2 мкм до 50 мкм) были приготовлены с использованием ранее описанных методов путем гидратации амфифильных пленок JD на тефлоновых листах сверхчистой водой или PBS (рис. 1) (10, 23, 32, 33). Было показано, что выбранные JD, содержащие гидрофобные минидендроны 3,5-дидодецилбензойного эфира и гидрофильные минидендроны 3,4,5-трис-триэтилгликольбензойного эфира, образуют стабильные гигантские DS в воде или буфере (10, 23, 32, 33).Гигантские DS, полученные этим методом, были объединены с мембранными везикулами человека (HMV) с помощью техники дегидратации-регидратации, аналогичной описанной недавно для бактериальных мембранных везикул (BMV), полученных из грамотрицательной бактерии E. coli , за исключением того, что ферментативная деградация лизосома / ЭДТА и обработка ультразвуком внешней поперечно-сшитой мембраны E. coli не требуется (23, 34). Для приготовления HMV требуется лишь слабое механическое вмешательство, такое как центрифугирование.Мембраны эукариот, в том числе плазматические мембраны человека, отличаются от мембран E. coli составом фосфолипидов, а также отсутствием липополисахаридов (32). Мембраны клеток эукариот / млекопитающих содержат холестерин и гликолипиды, которые модулируют текучесть мембраны (35–38) и могут влиять на их способность объединяться с DS. Чтобы проверить возможность этого процесса совместной сборки, были приготовлены HMV из зеленых флуоресцентно меченных клеток HEK293, выращенных в культуре клеток.Метка на клетки HEK293 была добавлена посредством экспрессии белка GFP-CAAX, где CAAX представляет собой мотив пренилирования белка Ras GTPase (CMSCKCVLS) (39, 40), который направляет белок GFP-CAAX на плазматическую мембрану. Эти HMV, обогащенные GFP-CAAX, вместе с красными флуоресцентными DS позволяют контролировать процесс совместной сборки с помощью флуоресцентной микроскопии.

Рис. 1.

Схематическое изображение ( A ) приготовления гигантских DS, ( B ) препарата HMV из клеток почек человека 293 (HEK293) и ( C ) совместной сборки гигантских гибридных везикул из гигантские DS и HMV из HEK293, помеченные GFP.

Визуализация гигантских DS и их совместной сборки с HMV, меченными GFP, с помощью двухцветной визуализации.

Для независимой визуализации DS и GFP, объединенные DS из (3,5) 12G1-PE- (3,4,5) -3EO-G1- (OCH ₃) ₃ ( JD ) (23, 32, 33) и 1% (вес. / Вес.) Красного флуоресцентно-меченого (3,5) 12G1- Tris (3,4,5) -3EO-G1- (OCH ₃) ₃ -RhB ( JD-RhB ) (32, 33), сокращенно DS-RhB. Гигантские гибридные везикулы были успешно собраны из DS-RhB и HMV, содержащих GFP-CAAX, по протоколу дегидратации-регидратации (массовое соотношение DS-RhB и HMV 25 ~ 100: 1) и сопоставимы по размеру с гигантскими DS, о которых сообщалось ранее (23). ).Эти гибридные везикулы обнаруживают устойчивые зеленые и красные сигналы флуоресценции вдоль границы, от GFP и JD-RhB , соответственно, указывая на то, что эти везикулы состоят как из амфифильных JD, так и из компонентов мембран человека (Рис. 2). Механизм совместной сборки и структура гибридных бислоев неизвестны, поэтому на рис. 1 и 3 показана возможная внутрислойная сегрегация фосфолипидов и фрагментов JD. Кроме того, эти гигантские везикулы стабильны по крайней мере в течение 1 года, что основано на незначительном изменении их размеров, локализации флуоресценции и интенсивности флуоресценции, определяемых с помощью микроскопии.

Рис. 2.

Совместная сборка гигантских гибридных везикул из DS-RhB и HMV, полученных из GFP, меченного HEK293. ( A ) JD с 1% JD-RhB объединяется в DS-RhB. Репрезентативные микроскопические изображения гигантских гибридных везикул, содержащих ( B ) CAAX-GFP HEK293 и ( C ) HEK293 без CAAX-GFP. Сначала было получено фазово-контрастное изображение, а затем флуоресцентное изображение путем последовательных экспозиций одного и того же пузырька. Масштаб идентичен у B и C .

Рис. 3.

Иллюстрация ( A ) получения гигантских DS, ( B ) препарата BMV, экспрессирующего бактериальный белок адгезина YadA, и ( C ) совместной сборки гигантских гибридных везикул из гигантских DS и E. coli BMV, экспрессирующая бактериальный белок адгезина YadA.

Биоактивные гибридные везикулы, содержащие бактериальный адгезионный белок (YadA), связываются с клетками HeLa.

Патогенные бактерии обычно экспрессируют на своей поверхности белки, обладающие сродством к белкам внеклеточного матрикса (ЕСМ) млекопитающих, такие как коллагены, ламинин, фибронектин и т. Д.(34). YadA принадлежит к семейству белков внешней мембраны, называемых тримерными аутотранспортерами адгезинов, которые обычно обнаруживаются у грамотрицательных бактерий (41–43). Адгезины-переносчики играют важную роль в вирулентности многих бактериальных патогенов, опосредуя адгезию к клеткам и тканям хозяина. YadA из Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica имеет решающее значение для адгезии и поглощения клеткой-хозяином посредством связывания с компонентами ЕСМ млекопитающих фибронектином, ламинином и коллагеном (41–43).Чтобы продемонстрировать полезность гибридных DS в качестве потенциального нацеленного на клетки агента, был экспрессирован YadA из Y. pseudotuberculosis на внешней мембране E. coli (32). Как описано ранее (23), внешняя мембрана E. coli была разобрана с помощью ферментативной лизосомы / ЭДТА с последующей обработкой ультразвуком. YadA-содержащие BMV (BMV-YadA) и гигантские DS затем были объединены с образованием гигантских гибридных клеточно-подобных пузырьков (Fig. 3).

Предыдущие исследования с помощью флуоресцентной микроскопии совместной сборки DS, меченных кумарином, и BMV, меченных mCherry, продемонстрировали их совместную сборку в гигантские гибридные везикулы (23), которые были аналогичны гигантским гибридным клеточно-подобным пузырькам, собранным из DS и HMV и обсуждавшимся ранее ( Инжир.2). Для лучшей визуализации местоположения гигантских гибридных DS используется кумарин голубого цвета, обозначенный JD (3,5) 12-2G1-coumarin- Tris (3,4,5) -3EO-G2- (OCH ₃). ₆ ( JD-Coumarin ) (23) было выбрано для самостоятельной сборки DS.

Клетки HeLa, выращенные в культуре клеток, обрабатывали совместно собранными гибридными DS и визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. После инкубации в течение ночи клетки HeLa тщательно промывали раствором PBS для удаления любых несвязавшихся везикул перед микроскопией.Гигантские DS, полученные гидратацией пленки JD-Coumarin , кратко называются DS-Coumarin. Было обнаружено, что гигантские гибридные везикулы, собранные путем гидратации из гигантских DS-кумарина и BMV-YadA, специфически связываются с клетками HeLa, как показано голубой флуоресценцией (рис. 4 B ), тогда как контрольные гигантские гибридные везикулы из DS-кумарина и BMV без YadA не связывался с клетками HeLa и не наблюдалось голубой флуоресценции (фиг. 4 C ).

Рис. 4.

Гигантские гибридные везикулы, объединенные из DS-Coumarin с BMV или BMV-YadA.BMV-YadA представляет собой BMV, содержащий белок бактериальной адгезии YadA. ( A ) Структура JD-Coumarin , которая самостоятельно собирается в DS-Coumarin. ( B ) Инкапсуляция гигантских гибридных везикул (DS-кумарин + BMV-YadA) в клетки HeLa. ( C ) Отсутствие инкапсуляции гигантских гибридных везикул (DS-Coumarin + BMV) в клетки HeLa из-за отсутствия YadA в качестве контрольного эксперимента для B . Масштаб идентичен у B и C .

Чтобы проверить, являются ли циановые DS потенциально токсичными для клеток, мы оценили жизнеспособность клеток с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым, широко используемого метода оценки цитотоксичности лекарств (44). Жизнеспособность клеток измеряли для клеток, обработанных гигантскими гибридными везикулами, содержащими либо BMV-YadA, либо только BMV, а также только гигантские DS. Мы не наблюдали значительных различий в жизнеспособности клеток между обработанными и необработанными контрольными клетками (рис. 5), что указывает на то, что гибридные везикулы, а также голубые DS сами по себе проявляют незначительную цитотоксичность.

Рис. 5.

Анализ цитотоксичности кристаллическим фиолетовым. Клетки HEK293 обрабатывали либо гигантскими гибридными везикулами (только DS-кумарин + BMV-YadA, DS-кумарин + BMV), либо только DS-кумарином. Относительную жизнеспособность клеток измеряли количественным определением кристаллического фиолетового. Данные представляют собой средние и стандартные отклонения шести независимых измерений.

Локализация гигантских гибридных пузырьков в клетках человека в выращенной культуре.

Эксперименты с конфокальной микроскопией использовали для определения того, могут ли гигантские гибридные везикулы (DS-Coumarin + BMV-YadA), связанные с клетками HeLa, проникать в цитоплазму.Клетки HeLa, выращенные в культуре клеток, инкубировали в течение ночи с собранными гибридными везикулами и промывали перед экспериментами под микроскопом. Голубые флуоресцентные гигантские гибридные везикулы (DS-Coumarin + BMV-YadA) визуализировали через канал зеленой флуоресценции, а мембраны / границы клеток HeLa визуализировали путем окрашивания красным красителем FM4-64. Зеленая флуоресценция в цитоплазме клеток HeLa наблюдалась с помощью конфокальной микроскопии (рис. 6). Это указывает на то, что гигантские гибридные везикулы (DS-Coumarin + BMV-YadA) не только связываются с клетками HeLa, но также способны проникать в клетки.С помощью конфокальной микроскопии невозможно установить, остается ли везикула неповрежденной после того, как она попала в клетку. Интересно, что зеленая флуоресценция в ядре (изображенная пунктирными линиями на рис. 6) не наблюдалась, что указывает на то, что ядерная мембрана может быть непроницаемой для этих гигантских гибридных везикул. На основании клеточной архитектуры клеток, обработанных гигантскими гибридными везикулами и необработанных клеток, оказалось, что клетки HeLa были живыми и способны делиться.

Рис. 6.

Типичные изображения конфокальной микроскопии гигантских гибридных везикул (DS-Coumarin + BMV-YadA), локализованных в цитоплазме клеток HeLa.Мембрану клеток HeLa окрашивали красным FM4-64.

Кроме того, мы использовали LysoTracker Red в качестве зонда для мечения лизосом (и других кислых органелл) в живых клетках вместе с локализацией гигантских гибридных везикул в клетках HEK293. Голубые флуоресцентные гигантские гибридные везикулы визуализировали через канал зеленой флуоресценции, а лизосомы, помеченные красителем LysoTracker Red, визуализировали через красную флуоресценцию с помощью конфокальной микроскопии. Как показано на фиг. 7, красная флуоресценция была распределена по цитоплазме.Голубая флуоресценция гигантских гибридных везикул также была только в цитоплазме и всегда казалась колокализованной с красной флуоресценцией, что позволяет предположить, что гибридные DS локализуются в лизосомах.

Рис. 7.

Типичные изображения конфокальной микроскопии гигантских гибридных везикул (DS-Coumarin + BMV-YadA), локализованных в цитоплазме в клетках HEK293. Лизосомы в цитоплазме клеток окрашивали красителем LysoTracker Red DND-99.

Биоактивные гибридные везикулы, содержащие мембраны клеток человека, связывают бактериальные клетки, экспрессирующие белок адгезии YadA.

Взаимодействия белка YadA с клетками человека также можно использовать для демонстрации биоактивности гибридной клеточно-подобной совместной сборки с DS и HMV, а не BMV. Гигантские гибридные везикулы (DS-Coumarin + HMV), состоящие из голубого JD, объединенного с везикулами мембран клеток человека HEK293, были смешаны с бактериальными клетками E. coli , экспрессирующими белок YadA ( E. coli -YadA ⁺) в виде 1 : 1 (об. / Об.) Смесь (рис.8 A ). В качестве контроля гигантские гибридные везикулы (DS-Coumarin + HMV) смешивали с E.coli , лишенные YadA ( E. coli -YadA ^—) (фиг.8 B ). Клетки и везикулы E. coli контролировали в светлых полях и флуоресцентных изображениях соответственно. Контрольные эксперименты с E. coli -YadA ^— не показали какого-либо заметного взаимодействия с гигантскими гибридными везикулами (DS-Coumarin + HMV) (фиг. 8 B ). Напротив, клеток E. coli -YadA ⁺, смешанных с гигантскими гибридными везикулами (DS-Coumarin + HMV), показали значительное скопление с флуоресцентными везикулами (рис.8 A ), аналогично реакции агглютинации, наблюдаемой для взаимодействий антиген-антитело. Дополнительные контрольные эксперименты (фиг.8 C и D ), состоящие из флуоресцентных гигантских везикул (DS-кумарин), смешанных с E. coli YadA ⁺ или E. coli YadA ^— , не показали взаимодействия между бактериальными клетками и гигантскими пузырьками.

Рис. 8.

Репрезентативные изображения конфокальной микроскопии E. coli , инкубированных с ( A и B ) гигантскими гибридными везикулами (DS-Coumarin + HMV) или ( C и D ) гигантскими везикулами ( DS-Coumarin) E.coli , экспрессирующие YadA ( E. coli -YadA ⁺, в A и C ) или контрольные клетки E. coli без YadA ( E. coli -YadA ^—, в B и D ). HMV были получены из человеческих клеток HEK293. Клетки и везикулы E. coli контролировали в светлых полях и флуоресцентных изображениях соответственно.

Выводы

Методология получения биоактивных гигантских гибридных везикул, собранных из DS и E.coli BMVs (23) был адаптирован для значительно упрощенной совместной сборки DS и HMV. Отсутствие пептидогликана в мембране клеток человека (млекопитающих) (клетки почек HEK293) позволило легко разрушить их без необходимости ферментативной обработки лизоцимом с образованием HMV, которые были объединены с DS упрощенными методами. Гигантские гибридные везикулы подтверждали визуализацией меток GFP (зеленые) на клетках человека и меток RhB (красные) на DS. Как продемонстрировала флуоресцентная микроскопия, эти гигантские гибридные везикулы стабильны в течение по крайней мере 1 года и представляют собой существенный прогресс в направлении простого приготовления гибридных клеток и протоклеток, содержащих компоненты клеток млекопитающих.Экспрессируя YadA, бактериальный белок адгезина на внутренней мембране E. coli , гигантские гибридные везикулы, содержащие гигантские DS и BMV, могут распознаваться живыми клетками человека (клетками HeLa). Изображения конфокальной микроскопии показали, что гигантские гибридные везикулы были доставлены в цитоплазму клеток HeLa. Аналогичным образом, в обратном эксперименте гигантские гибридные везикулы, содержащие DS и HMV, связывают и агрегируют бактериальных клеток E. coli , экспрессирующих белок YadA, демонстрируя биоактивность гибридных везикул с мембранами клеток человека.Этот подход может быть применен к адресной доставке и наномедицине (45⇓⇓⇓ – 49). Ожидается, что продемонстрированные здесь методологии позволят разработать синтетические и гибридные (синтетические-природные) протоклеточные капсулы для выполнения клеточных функций распознавания, передачи сигналов и доставки.

Методы

Подготовка DS.

Раствор или смешанный раствор JD (10 мг · мл ^-1, 200 мкл) в ТГФ был нанесен на верхнюю поверхность шероховатого тефлонового листа (1 см ²), помещенного во флакон с плоским дном. с последующим упариванием растворителя в течение 12 ч в темноте.PBS (1 ×, pH = 7,4, 2,0 мл) добавляли, чтобы погрузить пленку JDs на тефлоновый лист, и флакон помещали в печь при 60 ° C на 12 часов для гидратации. Затем образец перемешивали с использованием вихревой мешалки в течение 30 с до конечной концентрации 1 мг · мл ^-1.

Культура клеток и трансфекция.

Клетки HEK293 и HeLa выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (с 4,5 г / л глюкозы, 25 мМ Hepes от Gibco) с добавлением 10% FBS / глутамакс / пенициллин-стрептомицин (Gibco) при 37 ° C в увлажненной атмосфере 5% CO ₂, 95% воздуха.Клетки HEK293 трансфицировали плазмидой pEGFP-CAAX с использованием реагента Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) и отбирали с использованием Geneticin (сульфат G418; Sigma-Aldrich). CAAX представляет собой мотив пренилирования белка Ras GTPase (CMSCKCVLS), который направляет белок GFP-CAAX на плазматическую мембрану человека. Трансфицированные клетки идентифицировали путем визуализации зеленого флуоресцентного белка.

клеток HEK293 и LysoTracker Red DND-99 (ThermoFisher Scientific) были подарками от Дэджиан Рен, Университет Пенсильвании; Клетки HeLa и плазмида pEGFP-CAAX были подарками от Майкла Лэмпсона и Вэй Го, соответственно, из Пенсильванского университета в Филадельфии.

Бактериальные штаммы и питательные среды.

E. coli K-12 штамм MG1655 трансформировали плазмидой pPD284, экспрессирующей белок адгезина YadA из Y. pseudotuberculosis . YadA — это белок наружной мембраны бактерий, который способствует прикреплению к поверхности эукариотических клеток и последующей интернализации в эукариотические клетки. Единственную колонию штамма MG1655 / pPD284 инокулировали в среду LB (бульон Lysogeny; Fisher Scientific) для роста в течение ночи при 37 ° C на роликовом барабане для аэрации.Насыщенную культуру этого штамма разводили 1: 200 в 50 мл среды LB с добавлением ампициллина (100 мкг · мл ^-1) в культуральной колбе на 250 мл. После роста в течение 1,5 ч при 37 ° C с аэрацией экспрессию YadA индуцировали добавлением арабинозы до конечной концентрации 0,5%. Индукцию белка проводили в течение 3,5 часов, а затем клетки собирали при 7,500 × г в течение 10 минут при 4 ° C. Осадки клеток промывали буфером Трис (гидроксиметил) аминометан · HCl (Трис · HCl) (50 мМ, pH 8.0), а затем заморозили при -80 ° C. Плазмида pPD284 была подарком Петры Дерш, Центр исследования инфекций им. Гельмгольца, Брауншвейг, Германия.

Получение мембран клеток человека и бактерий.

Для получения HMV клетки HEK293, экспрессирующие GFP-CAAX, трипсинизировали, используя 0,05% трипсин-ЭДТА (Gibco), и собирали центрифугированием при 300 × g в течение 5 минут. Клетки ресуспендировали в 1 мл раствора сахарозы (20%) и Трис · HCl (30 мМ, pH 8,0) и гомогенизировали с использованием 1 мл измельчителя тканей Dounce (Fisher Scientific).Клетки центрифугировали при 4 ° C в течение 5 минут при 7500 × g , и супернатант переносили в свежую микроцентрифужную пробирку, чтобы изолировать мембраны от цитоплазматической фракции и клеточного дебриса. Затем этот супернатант центрифугировали при 4 ° C в течение 30 мин при 40000 × г . Мембранную фракцию получали в виде осадка после высокоскоростного центрифугирования, а супернатант отбрасывали. Мембранные везикулы ресуспендировали в 500 мкл буфера, состоящего из трис · HCl (30 мМ, pH 8,0), сахарозы (20%) и EDTA (0.1 мМ). Для BMV клетки выращивали и собирали, как описано выше. Замороженные клетки обрабатывали и готовили мембранные везикулы, как описано, с использованием ранее описанных протоколов (23).

Совместная сборка гигантских гибридных DS с мембранами клеток человека и бактерий.

Красные флуоресцентные DS ( JD + 1% JD-RhB ) были объединены с мембранами клеток человека, производными HEK293, обогащенными либо GFP (GFP-CAAX-HEK293 HMV), либо отсутствием контроля GFP (только HMV). Голубые флуоресцентные DS ( JD-кумарин ) были объединены с E.coli , обогащенные либо белком адгезии клеток YadA (BMV-YadA), либо отсутствием контроля белка (только BMV). Была выполнена совместная сборка, и совместно собранные гигантские гибридные DS, содержащие мембраны клеток человека или бактерий, были визуализированы, как описано ранее (23).

Связывание собранных гигантских гибридных везикул с клетками человека.

Для адгезии / поглощения BMV монослои клеток HeLa или HEK293 выращивали до ~ 50% слияния (от 24 до 48 часов) в 35-миллиметровых фторсодержащих пластинах, обработанных культурой клеток (ThermoFisher Scientific), затем трижды осторожно промывали 1 × PBS. pH 7.4 и инкубировали в связывающем буфере (среда 1640 Roswell Park Memorial Institute с добавлением 20 мМ Hepes pH 7,0, 5% FBS и 0,4% BSA) в течение 1 ч перед добавлением гигантских гибридных DS, содержащих бактериальные везикулы (42). Затем 4 мкл гигантских гибридных везикул, объединенных с голубыми флуоресцентными DS ( JD-Coumarin ) и мембранами E. coli , обогащенными либо ( i ) белком клеточной адгезии YadA (BMV-YadA), либо ( ii ). без контроля белка (только BMV) инкубировали с клетками HeLa или HEK293 от 18 до 24 часов при 37 ° C в связывающем буфере.Затем клетки тщательно промывали 1 × PBS Дульбекко, pH 7,4, и визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Для мембранного мечения с использованием красителя FM4-64 клетки, обработанные гигантскими гибридными DS, осторожно промывали три раза HBSS (Gibco). Затем к клеткам добавляли предварительно нагретую среду HBSS, содержащую FM4-64 до конечной концентрации 4 мкМ. Для мечения лизосом в живых клетках клетки, обработанные гибридными DS, промывали HBSS с последующим добавлением предварительно нагретого HBSS, содержащего краситель LysoTracker Red в рабочей концентрации 40 нМ.Для обеих процедур окрашивания клетки инкубировали при 37 ° C и 5% CO ₂ в течение ~ 30 минут, а затем отображали с помощью флуоресцентной микроскопии.

Анализ цитотоксичности кристаллического фиолетового.

Окрашивание кристаллическим фиолетовым для определения жизнеспособности клеток было адаптировано из опубликованного метода (44). Клетки высевали в 24-луночный планшет и выращивали, как указано в разделе «Культура клеток и трансфекция». Связывание гигантских гибридных DS выполняли, как описано в Связывание совместно собранных гигантских гибридных везикул с клетками человека .Затем в каждую лунку добавляли 0,5% раствор для окрашивания кристаллическим фиолетовым и клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем окрашивающий раствор отсасывали, каждую лунку дважды осторожно промывали 1 × PBS для удаления избытка пятен, и планшет сушили на воздухе без крышки в течение 3 часов. После сушки краситель кристаллического фиолетового солюбилизировали с использованием метанола в течение 20 мин при комнатной температуре, и оптическую плотность каждого образца измеряли при 570 нм с помощью спектрофотометра. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент, полученный из средней OD ₅₇₀ каждого образца относительно средней OD ₅₇₀ необработанных клеток.

Флуоресцентная микроскопия.

Для визуализации местоположения гигантских гибридных DS в клетках человека была проведена конфокальная микроскопия и получение изображений с использованием конфокального микроскопа с вращающимся диском DM4000 (Leica), оснащенного диодными лазерами 488 и 593 нм (Spectral Applied Research) под управлением Программное обеспечение MetaMorph (Molecular Devices), как описано ранее (50). Голубые флуоресцентные везикулы визуализировали через канал зеленой флуоресценции, а краситель FM4-64 использовали для окрашивания клеточной мембраны HeLa, что визуализировали по красной флуоресценции.Для окрашивания лизосом с использованием красителя LysoTracker Red и локализации гигантских гибридных DS в клетках человека получение изображений осуществляли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SP8 (Leica), оснащенного диодными лазерами 488- и 552-нм (Spectral Applied Research) с объективом 100 ×, управляемым программным обеспечением Leica Application Suite X. Голубые флуоресцентные везикулы визуализировали по зеленой флуоресценции, а краситель LysoTracker Red визуализировали по красной флуоресценции.

Переплет

E.Coli -YadA ⁺ клетки в гибридные DS + HMV.

клеток HEK293 выращивали в культуре клеток, и HMV получали, как описано в методах . Клетки E. coli , экспрессирующие YadA (YadA ⁺), и контрольные клетки (без YadA, YadA ^—) выращивали, как описано выше. Затем 500 мкл клеток собирали, промывали и ресуспендировали в 1 × PBS (pH 7,4). Клетки E. coli и HMV смешивали в соотношении 1: 1 в 1 × PBS (pH 7,4) и 0,4% BSA, а затем инкубировали при 37 ° C в течение ~ 1.За 5 ч до визуализации. Все контроли обрабатывались одинаково. Флуоресценцию наблюдали с помощью вертикального эпифлуоресцентного микроскопа Axioplan II (Carl Zeiss), объектив PlanApo 100 × 1,4 NA. Светлопольные и флуоресцентные изображения получали с помощью камеры устройства с зарядовой связью ORCA (Hamamatsu) и программного обеспечения iVision (Biovision Technologies).

Благодарности

Мы благодарим лабораторию М. Лэмпсона в Университете Пенсильвании, Основной центр конфокального микроскопа Ваксмана в Университете Рутгерса за доступ к конфокальному флуоресцентному микроскопу и лабораторию Кристофера Ронго в Университете Рутгерса за доступ к эпифлуоресцентному микроскопу Zeiss.Эта работа была поддержана грантами Национального научного фонда DMR-1066116 и DMR-1807127 (вице-президенту), кафедрой П. Роя Вагелоса в Университете Пенсильвании (вице-президент), Фондом Гумбольдта (вице-президент), Комплексной программой Вагелоса в области энергетических исследований ( WDH), гранты Национального научного фонда DMR-1120901 (для MLK, MG и VP) и DMR-1720530 (для MG и VP) и грант Национального института здравоохранения R01-GM080279 (для MG).

Сноски

Вклад авторов: С.S.Y., Q.X., M.L.K., M.G. и V.P. спланированное исследование; S.S.Y., Q.X. и S.E.S. проведенное исследование; S.S.Y., Q.X., M.L.K., M.G. и V.P. проанализированные данные; и S.S.Y., Q.X., S.E.S., W.D.H., M.L.K., M.G. и V.P. написал газету.
Рецензенты: L.P., Университет Экс-Марсель, CNRS; и D.A.T., NanoSynthons LLC.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Границы | Имитация органического и неорганического состава анаболической кости улучшает остеоиндукцию мезенхимальных стволовых клеток человека и механические свойства каркаса

Введение

Восстановление кости резюмирует несколько онтологических событий, которые происходят как во время развития скелета, так и во время послеродового роста кости (Dirckx et al., 2013; Эйнхорн и Герстенфельд, 2015). Анаболическая среда характеризуется привлечением клеток-предшественников и отложением ткани de novo , которая подвергается обширному ремоделированию (Gerstenfeld et al., 2003; Little et al., 2007; Dirckx et al., 2013; Einhorn and Gerstenfeld, 2015). Хотя коллаген I типа является основным компонентом органической фазы гомеостатической кости, существует ряд других типов коллагена, которые в относительном количестве обнаруживаются в эмбриональных и регенерирующих костях (Wälchli et al., 1994; Марвулли и Брессан, 1996; Ямазаки и др., 1997). Коллаген типов VI (Coll VI) и XII (Coll XII) активируется в развивающихся костях, где они играют решающую роль в регулировании роста костей (Wälchli et al., 1994; Kohara et al., 2015, 2016). Кроме того, примерно 70% сухой массы зрелой кости состоит из нечистого гидроксиапатита с низкой кристалличностью (ГА). Хотя HA обычно обозначается стехиометрически как Ca ₁₀ (PO ₄) ₆ (OH) ₂, катионные и анионные замещения в кристаллической структуре встречаются довольно часто (Landi et al., 2008). В частности, Mg ²⁺ присутствует в большом количестве в кости во время начальных фаз остеогенеза и исчезает в зрелой кости (Landi et al., 2008). Несмотря на известные различия в составе анаболической и гомеостатической кости, инженерные костные трансплантаты ранее не проектировались так, чтобы они напоминали органический и неорганический состав регенерирующей кости.

Катионный (например, Zn ²⁺, Mn ²⁺, Mg ²⁺) и анионный (например, CO ₃ ^2–, Fl ^—, Cl ^—, SiO ₄ ^4–) замены в решетчатой структуре костного минерала послужили стимулом для разработки широкого спектра ион-замещенной ГК для восстановления кости (Ratnayake et al., 2017). Среди этих ионов Mg уникален тем, что его относительно много в кости во время развития и восстановления. Mg-содержащие биоматериалы показали себя многообещающими при восстановлении костей. Керамика на основе магния усиливает остеогенные (Su, 2018) и резорбционные свойства каркасов (He et al., 2014). При фиксации переломов Mg стимулировал образование новой кости при включении в разлагаемые винты и пластины (Chaya et al., 2015). Однако изменение минерального состава каркасов может лишь воспроизвести неорганическую фракцию анаболической ниши.

ECM

, депонированные мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) крысы на титановую сетку (Datta et al., 2005) или человеческие МСК (hMSC) на пластике для тканевой культуры (Decaris et al., 2012), способствуют остеогенной дифференцировке только что засеянных МСК. Мы разработали протокол, который использует GW9662, ингибитор PPARγ, для индукции остеогенной дифференцировки hMSC, в течение которого клетки генерируют ECM, богатый Coll VI и XII (Zeitouni et al., 2012; Clough et al., 2015). Нанесение этого ЕСМ на пену из желатина с последующей децеллюляризацией приводит к образованию трансплантата, который ускоряет заживление костей у мышей (Clough et al., 2015; Sears et al., 2020). Перенос этой технологии в клинику будет облегчен с помощью стратегии, которая позволяет генерировать ECM после имплантации за счет устойчивой локальной доставки GW9662 в каркас.

В целях этого исследования мы использовали биологически вдохновленный остеоиндуктивный каркас — макропористый коллагеновый каркас, покрытый ГК с добавкой магния (Coll / MgHA), как сообщалось ранее (Minardi et al., 2015). Чтобы имитировать органическую фракцию растущей кости, засеянные hMSC стимулировали GW9662 для депонирования Coll VI и Coll XII на каркасе.Мы предположили, что включение системы доставки лекарств, способной к контролируемому высвобождению GW9662 в каркас Coll / MgHA, будет стимулировать засеянные hMSC откладывать такие же уровни анаболического костного ECM, что и индуцированный GW9662, добавленным непосредственно в среду. Для достижения пролонгированного высвобождения GW9662 использовалась элюирующая лекарство платформа, состоящая из пористых частиц диоксида кремния (pSi), инкапсулированных в микросферы поли (лактид-гликолевая кислота) (PLGA) (Fan et al., 2012; Minardi et al., 2014 ; Pandolfi et al., 2016). Более того, биореактор использовался для перфузии каркаса, чтобы имитировать среду транспорта газа и питательных веществ, наблюдаемую во время неоваскуляризации каллусной ткани (Dirckx et al., 2013).

Материалы и методы

Приготовление загруженных GW9662 микросфер PLGA / pSi

Композитные микросферы с лекарственным покрытием состоят из пористого кремнезема (pSi), суспендированного в сополимер молочно-гликолевых микросфер (PLGA) с использованием ранее описанных методов (Tsao et al., 2018). Если не указано иное, реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich (St.Луис, Миссури, США). Вкратце, 300 мкл тетраэтилортосиликата по каплям добавляли к смеси 0,36% (мас. / Об.) Дубильной кислоты, 66% (об. / Об.) Этанола и 33% (об. / Об.) Гидроксида аммония. Смесь непрерывно перемешивали в течение 3 ч перед промывкой pSi и трехкратным центрифугированием в растворе этанол: вода 1: 1. Затем частицы pSi лиофилизировали и хранили при -20 ° C до тех пор, пока они не потребовались. Чтобы загрузить pSi с GW9662, 5 мг лиофилизированного pSi инкубировали в 1 мл GW9662 (300 мкг / мл), растворенного в ДМСО, при постоянном перемешивании в течение 20 мин при 37 ° C.Загруженные GW9662 pSi промывали и лиофилизировали перед переходом к инкапсулированию в микросферы PLGA. Вкратце, pSi, нагруженный GW9662, добавляли к 5% (мас. / Об.) Раствору PLGA (50:50) (Lactel Absorbable Polymers, Pelham, AL, США), растворенному в дихлорметане (DCM). Затем смесь PLGA / pSi / DCM по каплям добавляли к 2,5% водному раствору поли (винилового спирта) (PVA) и непрерывно перемешивали в течение 6 часов. Затем полученные микросферы центрифугировали и несколько раз промывали деионизированной водой перед лиофилизацией и хранили при -20 ° C до тех пор, пока они не потребовались.

Характеристика частиц и оценка GW9662

in vitro Выпуск

Для проверки наличия pSi в микросферах PLGA меченный флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) pSi инкапсулировали в микросферы PLGA и отображали с помощью конфокальной микроскопии (Nikon D Eclipse C1, Nikon Corporation, Япония). Для измерения высвобождения GW9662 из микросфер PLGA-pSi, суспендированных в водном буфере, в течение 21 дня использовали жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию.

Производство строительных лесов

пористых каркасов Coll / MgHA с микросферами PLGA-pSi и без них были изготовлены, как описано ранее, с небольшими модификациями (Minardi et al., 2015) (дополнительный рисунок 1A). Бычий коллаген I типа (Nitta Casings, Бриджуотер, Нью-Джерси, США) был выбран в качестве органической матрицы, на которой будут зарождаться нанокристаллы ГК, легированные магнием, во время самосборки коллагеновых фибрилл. Вкратце, 200 мг коллагена растворяли в 20 мл уксусной кислоты, забуференной при pH 3.К раствору коллагена добавляли 190 мкл 85% H ₃ PO ₄ (Sigma-Aldrich) и 20 мл деионизированной воды. Коллагеновые фибриллы, содержащие HA и MgHA, восстанавливали путем добавления по каплям кислого раствора коллагена к основной суспензии, состоящей из 0,35 г Ca (OH) ₂ и 0,166 г MgCl ₂ ⋅6H ₂ O (Thermo Fisher, Waltham , Массачусетс, США) в 20 мл воды. Соотношение Ca (OH) ₂ и MgCl ₂ ⋅6H ₂ O в основной суспензии было установлено равным 15%, поскольку требовалось более высокое соотношение в растворе предшественника для достижения молярного замещения 5–6% Mg ²⁺ в окончательной структуре решетки.Смесь выдерживали в течение 24 часов при 37 ° C с последующим влажным сшиванием с 1,4-бутандиолдиглицидиловым эфиром (BDDGE) (2,5 мМ) (Sigma-Aldrich) при 4 ° C в течение 48 часов при pH 8. Смесь затем центрифугировали и несколько раз промывали деионизированной водой для удаления сшивающего раствора, оставляя после себя суспензионную смесь. В некоторых случаях добавляли микросферы, элюирующие лекарственное средство, для получения приблизительно 0,52 мкг GW9662 / каркас. Для изготовления пористой структуры суспензию разделяли на аликвоты в 96-луночные планшеты (70 мкл / лунку) и лиофилизировали после контролируемого замораживания (Minardi et al., 2015). Полученные в результате каркасы Coll / MgHA, обозначенные для краткости либо MgHA, либо MgHA / pSi, затем хранили при -20 ° C до тех пор, пока они не понадобились.

Структурные и композиционные характеристики каркасов

Инфракрасный анализ с преобразованием Фурье (FTIR) выполняли с использованием альфа-платинового спектрометра Bruker (Billerica, MA, США). Перед получением FTIR-спектров пористые каркасы расплющивали в тонкие диски, используя ступку и пестик, а затем выдерживали при 100 ° C в нагревательном блоке в течение часа для удаления остаточной воды.Термогравиметрический анализ (ТГА) выполняли на приборе Q50 (TA Instrument, New Castle, DE, США) путем нагревания каркасов (<10 мг) от 25 до 1000 ° C со скоростью 10 ° C / мин. Молярное отношение Mg ²⁺ к Ca ²⁺, присутствующему в минеральной фазе каркасов, определяли с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) (PerkinElmer NexION 300D, Уолтем, Массачусетс, США). с использованием многоэлементного эталона Ca ²⁺ и Mg ²⁺ (ICP CAL-STD EARTH ALKALI, Inorganic Ventures, Кристиансбург, Вирджиния, США) в 1% азотной кислоте.Для ICP-MS каркасы расщепляли в течение ночи в 1% азотной кислоте. Супернатант собирали после кратковременного центрифугирования, фильтровали с использованием шприцевого фильтра 0,22 мкм и разбавляли 1: 1200 в 1% азотной кислоте, чтобы гарантировать, что концентрация ионов находится в пределах стандартных кривых. Наконец, морфологию и распределение размеров пор на поверхности каркасов оценивали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) на JCM 5000 (JEOL, Пибоди, Массачусетс, США) и анализировали с помощью ImageJ (NIH Image). Лиофилизированные каркасы, хранящиеся при -20 ° C, выдерживали в течение ночи в эксикаторе, а затем покрывали золотым напылением (20 мА, 60 с) для удаления скопившейся воды перед визуализацией с помощью SEM.Приблизительно 146 и 119 пор были проанализированы для каркасов MgHA и MgHA / pSi соответственно.

Расширение и посев hMSC

hMSC, происходящие из костного мозга, были приобретены из центра распределения взрослых стволовых клеток в Институте регенеративной медицины Техасского центра медицинских наук A&M в соответствии с протоколами, утвержденными учреждениями. Полученные из костного мозга hMSC были размножены в полной культуральной среде (CCM), состоящей из альфа-минимальной эссенциальной среды (α-MEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, США), 20% (об. / Об.) FBS (Atlanta Biologicals, Flowery Branch, GA, США), 2 мМ L -глютамина (Invitrogen) и 100 Ед / мл пенициллина плюс 100 мкг / мл стрептомицина (HyClone ^TM Marlborough, MA, США) при плотности посева 500 клеток / см. ².Среду для культивирования меняли каждые 2–3 дня, пока клетки не достигли слияния 70–80%. Затем разросшиеся клетки выделяли путем кратковременной трипсинизации (Corning, Corning, NY, США) и высевали на верхнюю часть каждого каркаса (200000 клеток / каркас), используя аликвоту 20 мкл. После инкубации в течение 10 минут каркасы переворачивали на 180 ° и добавляли дополнительные 5 мкл CCM для достижения более равномерного распределения клеток. Затем скаффолды инкубировали в течение дополнительных 10 мин перед добавлением CCM в планшеты с лунками, отслеживая область, в которую клетки были первоначально засеяны.Клетки инкубировали в течение ночи перед тем, как каркасы заменяли на другие составы культуральных сред или помещали в перфузионный биореактор. Другие составы культуральных сред включали: (1) остеогенную базальную среду (OBM), состоящую из CCM с добавлением 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты и 5 мМ β-глицеринфосфата, (2) OBM с добавлением 10 мкМ GW9662, растворенного в DMSO в качестве положительный контроль и (3) OBM, дополненный равным объемом ДМСО в качестве контроля транспортного средства. Таблицу, изображающую состав каркаса / среды, используемые для остеогенных анализов, можно найти в Таблице 1.

Таблица 1. Состав каркаса и культуральная среда, используемые для остеогенных анализов.

Культивирование в статических и перфузионных условиях

Каркасы помещали в лунки биореактора (дополнительные рисунки 1B, C), располагая их так, чтобы поверхность, на которую первоначально были засеяны клетки, была обращена вниз к каналам. Сверху помещали прокладку из силиконовой резины с диаметром, аналогичным диаметру каркасов, чтобы препятствовать перфузату течь вокруг каркасов, а не через них.После помещения в перфузионный биореактор многоканальный перистальтический насос (Cole-Palmer, Vernon Hills, Иллинойс, США) использовали для регулировки скорости потока культуральной среды для достижения поверхностной скорости через каркасы примерно 116 мкм / с, в результате расчетное напряжение сдвига около 7 МПа. Напряжение сдвига, испытываемое клетками, оценивалось с использованием ранее описанного уравнения (Grayson et al., 2008):

τw = 8⁢μm⁢udp

, где τ _w — напряжение стенки жидкости в порах каркаса, μ _m — вязкость (∼0.77 сПа) питательной среды, u — интерстициальная скорость и d _p — средний диаметр пор, наблюдаемый в каркасах при визуализации SEM. Каркасы перфузировали до 21 дня, смена среды происходила каждые 2–3 дня.

Миграция клеток на каркасах

Эффективность посева была приблизительно определена путем извлечения hMSC, прикрепленных к планшетам с лунками, а не к каркасам на следующий день после посева с использованием стандартной процедуры подсчета клеток с помощью гемацитометра.Чтобы оценить жизнеспособность и миграцию hMSC в каркасы без влияния растворимых факторов, окрашивание живых мертвецов — 5 мкМ кальцеина AM и 0,1% пропидия йодида — проводили после 8 дней статической и перфузируемой культуры в каркасах MgHA / CCM. Конфокальные изображения Z-стека каркасов получали с помощью вертикального микроскопа Nikon D Eclipse C1 (Nikon Corporation, Япония) от передней поверхности каркаса до глубины 200 мкм с использованием срезов 10 мкм. Относительные единицы интенсивности флуоресценции для изображений с z-накоплением оценивали как функцию глубины с помощью ImageJ (NIH Image).Глубина, на которой сложенные изображения живого и мертвого уменьшились до 50% от максимальной интенсивности флуоресценции, была определена количественно как для статических, так и для перфузированных образцов. После этого каркасы были разрезаны, чтобы получить изображения в поперечном сечении.

Иммуноокрашивание отложенных матричных белков

Ранее было показано, что обработанные

GW9662 hMSC откладывают уникальный ECM, богатый коллагенами, которые высоко экспрессируются в анаболической кости, в частности, Coll VI и Coll XII. Для оценки эффективности микросфер PLGA-pSi иммуноокрашивание на Coll VI и XII проводили на каркасах после 8 дней культивирования.Вкратце, каркасы фиксировали в течение ночи при 4 ° C в 4% формальдегиде в PBS и трижды промывали PBS. Затем скаффолды блокировали 5% козьей сывороткой (MP Biomedical) и 0,3% Triton-X (Sigma Aldrich) в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем инкубировали в течение ночи при 4 ° C в блокирующем буфере с добавлением кроличьих антител против человеческого Coll VI или Coll XII (1: 200, Novus Biological, Литтлтон, Колорадо, США). Затем скаффолды промывали PBS и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч в блокирующем буфере с козьим антителом против кролика, конъюгированным с флуоресцеином (1: 500, Millipore, Берлингтон, Массачусетс, США).Изображения Z-стека были получены, как описано выше. Прогнозы максимальной интенсивности выполнялись с помощью программы EZ-C1 (Nikon Corporation, Япония).

Экспрессия гена с помощью количественной ОТ-ПЦР (qRT-PCR)

Через 8 и 21 день культивирования суммарную РНК экстрагировали из каркасов с помощью RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) с добавлением Trizol (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). После количественного определения чистоты и концентрации РНК (Infinite M200 Pro, Tecan, Männedorf, Швейцария) выделили РНК с чистотой (A260 / A280) выше 1.9 использовали для синтеза кДНК в 21 мкл реакции (набор Superscript III, Invitrogen). Приблизительно 6,5 нг кДНК амплифицировали в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей мастер-смесь Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR с низким ROX (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США), на системе ПЦР в реальном времени Agilent Aria Mx. Список праймеров и их последовательности можно найти в дополнительной информации (дополнительная таблица 1). Относительную экспрессию рассчитывали с использованием метода ΔΔC _T, нормализованного к уровням глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) человека, с использованием hMSC, культивированных в течение 8 или 21 дня в 2D-монослое на планшете для тканевых культур с CCM в качестве контроля калибратора.Относительное кратное изменение экспрессии генов рассчитывали с использованием метода 2 ^–ΔΔCt, описанного Livak and Schmittgen (2001). Статистические сравнения выполняли в программе GraphPad Prism (Сан-Диего, Калифорния, США). Вкратце, тест Бартлетта выполняли для значений C _t для каждого гена для каждого каркаса / условия культивирования (дополнительная таблица 5), чтобы подтвердить гомогенность перед запуском двухфакторного дисперсионного анализа. Был проведен двухфакторный дисперсионный анализ рассчитанных значений ΔΔC _T с последующим тестом множественного сравнения Тьюки ( n = 3), результаты которого можно найти в дополнительной информации (дополнительные таблицы 5-17).Кроме того, количество hMSC, присутствующих в каркасах, измеряли по экспрессии GAPDH после 8 дней статического и перфузионного культивирования во всех условиях каркаса / культивирования с использованием известных стандартов количества клеток. РНК экстрагировали из клеточных стандартов в присутствии каркасов MgHA для имитации эффективности экстракции РНК из культивируемых каркасов. Статистическое тестирование, как описано выше, было выполнено на рассчитанном количестве клеток (дополнительные таблицы 2–4).

Анализ культивированных каркасов с помощью микрокомпьютерной томографии (μCT)

После 21 дня статических и перфузированных культур каркасы промывали PBS и фиксировали в течение ночи при 4 ° C 4% формальдегидом в PBS.После промывания и аспирации избытка PBS образцы оставляли сушиться в течение ночи в эксикаторе. До необходимости образцы хранили при -80 ° C. Невураженные каркасы использовали в качестве контролей и получали, как описано выше. Перед получением микротомографических снимков на рентгеновском микротомографе SkyScan 1275 (Bruker, Биллерика, Массачусетс, США) образцы были осторожно завернуты в парапленку для облегчения работы во время получения изображений на вращающемся столике SkyScan. Каркасы были получены на 360 градусов с разрешением камеры 18 мкм, причем изображения делались каждые 0.5 градусов с использованием пучка 28 кВ и усреднения кадров 3. Изображения поперечных сечений каркасов были восстановлены с помощью программного обеспечения NRecon (Micro Photonics), сохраняя настройки компенсации сглаживания и упрочнения пучка одинаковыми для образцов при 0 (ядро Гаусса ) и 41% соответственно. Пороговая обработка была сделана, чтобы лучше различать парафильм и каркасы. Фантомы гидроксиапатита кальция (0,25 и 0,75 г / см ³; Bruker) были отсканированы с использованием настроек, описанных выше, и проанализированы в программном обеспечении Bruker-MicroCT CT-Analyzer (CTan) для определения значений их коэффициентов ослабления для прогнозирования минералов кости. плотность (BMD) каркасов.После подтверждения равных дисперсий (дополнительная таблица 18), двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Тьюки был проведен для значений минеральной плотности кости ( n = 3). Как таблицу ANOVA, так и результаты теста множественного сравнения можно найти в дополнительной информации (дополнительные таблицы 19, 20). Программное обеспечение CTan также использовалось для измерения морфологических характеристик каркасов, в частности процентной пористости и удельной поверхности кости (BS / BV) (Bouxsein et al., 2010) строительных лесов. Программное обеспечение CTVox использовалось для восстановления изображений культивированных образцов. Для всех реконструкций использовалось одинаковое пороговое значение непрозрачности. Проекция максимальной интенсивности (MIP) была включена для выделения плотных областей минерализации.

Испытание на одноосное сжатие

После получения изображений с помощью микроконтроллера компьютерной томографии каркасы осторожно извлекали из парапленочной упаковки и хранили при -80 ° C до тех пор, пока они не потребовались для механических испытаний. Диаметр и толщину каркасов измеряли штангенциркулем и подвергали испытанию на одноосное сжатие до 15% деформации со скоростью 5 мкм / с на DMA 850 (TA Instruments).Модуль сжатия был рассчитан путем линейной подгонки уклона. Статистические сравнения были выполнены по модулю сжатия с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Тьюки ( n = 3). Таблицу ANOVA и соответствующие результаты множественного сравнения можно найти в дополнительной информации (дополнительные таблицы 22, 23).

Иммуноблоттинг

После 8 дней статического и перфузированного культивирования каркасы промывали теплом, а затем ледяным PBS.Белки экстрагировали ледяным буфером RIPA (50 мМ Tris HCl, 150 мМ NaCl, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 0,5% дезоксилхолат натрия, 1 мМ EDTA, 1 мМ пирофосфат натрия) с добавлением SIGMAFAST ^TM. ингибиторов протеаз (Sigma-Aldrich) путем встряхивания с последующим центрифугированием при 12000 г в течение 10 мин. Супернатант собирали и хранили при -80 ° C до тех пор, пока общее содержание белка не было определено количественно с помощью набора Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). Образцы белка (15 мкг) растворяли в отлитом вручную 10% геле SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, США) и переносили на мембрану PVDF (Millipore).Мембрану блокировали в 5% молоке в буфере TBST (20 мМ Трис-основание, 150 мМ NaCl, 0,2% Твин 20) в течение 1 ч перед инкубированием в течение ночи при 4 ° C с мышиным антителом против BMP2 человека (R&D Systems, Миннеаполис, США). MN, США) разводили (1: 500) в блокирующем буфере. После трех промывок в буфере TBST мембрану инкубировали в течение 1 ч с конъюгированным с HRP вторичным антителом козы против мыши (Protein Tech, Rosemont, IL, США). Мембрану проявляли в течение 5 минут в хемилюминесцентном субстрате WesternSure (LI-COR, Lincoln, NE, США) и отображали на сканере для блоттинга C-Digit (LI-COR).После визуализации мембрану удалили с помощью буфера для удаления восстановления (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Затем мембрану блокировали, инкубировали с мышиным античеловеческим GAPDH (1: 4000, Protein Tech) и визуализировали, как описано ранее.

Результаты

Морфология и состав каркасов

Микроструктуру каркасов MgHA и MgHA / pSi оценивали с помощью SEM и μCT. СЭМ-изображение поверхностей каркаса показало изотропную пористую структуру (рис. 1А).Поперечное сечение микроструктуры внутренней микроструктуры каркасов показало взаимосвязанные поры (рис. 1В). При количественном определении размера пор на поверхности наблюдалось широкое распределение диаметра пор 50–200 мкм (рис. 1C). Анализ морфологических характеристик показал, что включение микросфер с лекарственным покрытием не повлияло ни на удельное соотношение поверхности кости (рис. 1D), ни на пористость (рис. 1E).

Рисунок 1. Морфологическая характеристика каркасов MgHA и MgHA / pSi.Типичные изображения (A), , SEM и (B), , микрокомпьютерная томография (μCT) каркасов MgHA и MgHA / pSi. (C) Показано, что распределение пор по размерам одинаково для двух каркасов. (D) Удельное соотношение поверхности кости и (E) процентная пористость не были затронуты добавлением микросфер, элюирующих лекарственное средство.

TGA-анализ был проведен для количественной оценки соотношения минералов и белков в каркасах. Наблюдаемая начальная потеря массы, приблизительно 10%, была связана с остаточной водой в каркасах.Таким образом, коллагеновая матрица и минеральная фаза составляли примерно 33 и 66% от сухой массы каркасов (рис. 2А). Состав каркаса был дополнительно охарактеризован с использованием FTIR (рис. 2B). Большие полосы наблюдались в 550 см ^–1 и 1000 см ^–1, соответствующих фосфатам в гидроксиапатите. Для органического компонента колебательные полосы, характерные для амидных групп, наблюдались около 1250 см ^–1, 1540 см ^–1, 1650 см ^–1 и 3300 см ^–1.Замены карбонатных ионов в кристаллической структуре также были обнаружены, на что указывает небольшой одиночный пик на 870 см ^–1 и двойные полосы около 1430 см ^–1 и 1450 см ^–1, которые указывают на тип-B карбонизированное замещение в позиции PO ₄ ^3– (Landi et al., 2008; Kourkoumelis and Tzaphlidou, 2010). Рентгеноструктурный анализ показал, что оба каркаса имеют профиль, аналогичный профилю нативной костной ткани, описанному в литературе, в частности, большой пик при 32 градусах и меньший пик при 26 градусах (рис. 2С).Коэффициент замещения Mg / Ca составлял приблизительно 4,8 и 4,2% для каркасов MgHA и MgHA / pSi, соответственно (рис. 2D).

Рисунок 2. Характеристика состава каркасов MgHA и MgHA / pSi с помощью TGA (A) , FTIR (B) , XRD (C) и ICP-MS (D) .

Число ячеек и инфильтрация в статических и перфузионных условиях

Эффективность посева выше 93% наблюдалась для каждой композиции каркаса (рис. 3А).После 8 дней статического культивирования в каркасе MgHA с CCM окрашивание «живые-мертвые» выявляло плотно упакованные клетки вблизи поверхности каркасов, причем большинство клеток оставалось в пределах 100 мкм от поверхности каркасов. Напротив, hMSCs, перфузируемые в течение 8 дней, проникли более глубоко в каркас (рис. 3B). Полуколичественный анализ конфокальных изображений показал быстрое падение флуоресценции в статических образцах с 50% -ным уменьшением приблизительно 60 мкм в каркасе по сравнению со 150 мкм для перфузированных каркасов (рис. 3C).

Рис. 3. (A) Эффективность высева hMSC на строительные леса ( n = 3). (B) Репрезентативные изображения поперечных сечений окрашивания чМСК после 8 дней культивирования в каркасах MgHA в статических и перфузионных условиях, с направлением потока, указанным белой стрелкой. (C) Средняя глубина, на которой сложенные живые и мертвые изображения уменьшились до 50% от максимальной интенсивности флуоресценции (тест Стьюдента t , p <0.05, n = 3, столбцы ошибок обозначают стандартное отклонение). (D) Популяция hMSC, количественно определенная по экспрессии GAPDH с помощью qRT-PCR, показывает значительное увеличение числа клеток в ответ на перфузию в различных комбинациях каркаса и культуральной среды. Статистическое тестирование выполняли с помощью двустороннего дисперсионного анализа с последующим множественным сравнением Тьюки между всеми комбинациями каркас / среда. Столбцы с совпадающими буквами указывают на то, что сравнение не было значимым ( t -тест Стьюдента, ^∗ p <0.05, n = 3, столбцы ошибок обозначают стандартное отклонение).

Затем количество клеток определяли по экспрессии GAPDH для восьми условий культивирования (рис. 3D). Двусторонний дисперсионный анализ показал, что перфузия увеличивала среднее количество клеток во всех каркасах и отсутствие взаимодействия между перфузией и составом каркаса / культуральной среды (дополнительная таблица 3). Тестирование с множественным сравнением показало, что в перфузируемых культурах GW9662, вводимый местно, значительно увеличивал количество клеток по сравнению с контролем DMSO (дополнительная таблица 4).

Характеристика микросфер и

in vitro Выпуск GW9662

Флуоресцентно меченый pSi использовали для характеристики их распределения в микросферах PLGA (рис. 4A). Изображения показали, что pSi были равномерно распределены внутри отдельных микросфер и что содержание pSi оказалось однородным при сравнении различных микросфер PLGA.

Рис. 4. (A) Конфокальная визуализация FITC-меченных PLGA / pSi показывает, что pSi равномерно распределены в сферах PLGA. (B) Кумулятивное высвобождение GW9662 из микросфер PLGA / pSi демонстрирует контролируемое высвобождение GW9662 в течение до 21 дня ( n = 3, полосы ошибок отражают стандартное отклонение).

Скорость высвобождения GW9662 из композитных микросфер pSi / PLGA была определена количественно в течение 21-дневного периода, поскольку остеогенная дифференцировка hMSC с использованием GW9662 включает непрерывное применение GW9662 в течение этого периода (Krause et al., 2010). 14% всплеск высвобождения произошел в первые 24 часа, после чего следовала постоянная скорость высвобождения на протяжении оставшейся части эксперимента, при этом 82% лекарства высвобождалось через 21 день (рис. 4В).

Отложение анаболической кости ECM

Ранее было показано, что hMCS, обработанные GW9662, секретируют анаболический костный ECM, богатый Coll VI и XII, который не только улучшает удержание hMSC в месте повреждения, но также активирует различные остеогенные и ангиогенные факторы (Clough et al., 2015 ). Чтобы проверить эффективность контролируемого высвобождения GW9662 из микросфер PLGA / pSi и изучить влияние напряжения сдвига жидкости на экспрессию и отложение этого анаболического костного матрикса, был проведен анализ qRT-PCR и иммуноокрашивание для Coll VI и Coll XII. через 8 дней статической и перфузионной культуры.Продолжительность культивирования была выбрана так, чтобы совпадать с образованием фиброзно-хрящевой костной мозоли, наблюдаемой во время восстановления перелома (Wang and Yeung, 2017).

В соответствии с предыдущими результатами (Clough et al., 2015), hMSC, культивированные в статических условиях в средах с добавлением GW9662, экспрессировали Coll VI в значительно более высоких количествах, чем в отсутствие GW9662 и культур, в которых GW9662 был предоставлен с использованием микросфер (рис. 5A). . Интересно, что экспрессия Coll VI увеличивалась перфузионной культурой для каждого состояния, хотя это различие не было значительным в культурах, в которых GW9662 был добавлен непосредственно в среду.Кроме того, перфузия приводила к сопоставимым уровням экспрессии Coll VI между каркасами DMOS, GW-pSi и GW-media. Простое взаимодействие — уменьшение отдачи от обработки GW9662 на экспрессию гена Coll VI за счет перфузии — было подтверждено как значимое с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (дополнительная таблица 6). Иммуноокрашенные образцы показали сопоставимые количества Coll VI в культурах, в которых GW9662 вводили посредством контролируемого высвобождения (фигура 6B) или прямого добавления в среду (фигура 6C), в то время как Coll VI был едва обнаружен в культурах без GW9662 (фигура 6A). .Перфузия увеличивала количество Coll VI, обнаруживаемое иммуноокрашиванием в каждом состоянии, при этом уровни заметно выше для образцов, содержащих GW9662 (рисунки 6E, F), чем у образцов, не содержащих GW9662 (рисунок 6D).

Рис. 5. qRT-PCR анализ экспрессии анаболических компонентов костного ECM. (A) Coll VI и (B) Coll XII относительная кратность экспрессии в hMSC через 8 дней культивирования в различных комбинациях каркас / среда. Столбцы с совпадающими буквами указывают на то, что все возможные сравнения не были значимыми ( n = 3, планки ошибок отображают стандартное отклонение, p <0.05, двусторонний дисперсионный анализ, критерий множественного сравнения Тьюки).

Рис. 6. Иммуноокрашивание Coll VI (A – F) и XII (G – L) через 8 дней в статических условиях и в условиях перфузии для различных комбинаций каркаса / культуральной среды показывает одинаковые уровни отложения матрикса между GW- pSi и GW-media. Перфузия увеличивала отложение матрицы во всех комбинациях каркаса и культуральной среды по сравнению с их статическими аналогами.

В статических условиях экспрессия гена Coll XII была значительно выше в hMSC, культивируемых в среде с добавлением GW9662, чем в культурах без GW9662 (фиг. 5B).Кроме того, контролируемое высвобождение GW9662 из микросфер привело к уровням экспрессии, сравнимым с экзогенным введением GW9662, что подчеркивает полезность композитных микросфер в качестве платформы для высвобождения лекарственного средства in situ , способной заменить традиционные обработки средой. Также было отмечено, что, несмотря на отсутствие GW9662, экспрессия гена Coll XII была положительно экспрессирована в каркасах DMSO (фиг. 5B). Кроме того, в отличие от тенденции, наблюдаемой для экспрессии гена Coll VI, экспрессия гена Coll XII либо оставалась постоянной, либо снижалась в ответ на перфузию, что свидетельствует о супрессивном взаимодействии между перфузией и обработкой GW9662 на экспрессию гена Coll XII (дополнительная таблица 8).Иммуноокрашивание образцов, культивированных в статических условиях, подтвердило сравнимое отложение Coll XII между культурами, в которых GW9662 вводили непосредственно в среду (фиг.6I), и с контролируемым высвобождением (фиг.6H). Напротив, осаждение Coll XII было недостаточным в образцах без GW9662 (рис. 6G). Перфузия увеличивала количество Coll XII, обнаруживаемое посредством иммуноокрашивания во всех условиях, с заметно более высокими отложениями в образцах, обработанных GW9662 (Фигуры 6K, L), чем в образцах без GW9662 (Фиг.6J).

In vitro Остеогенная дифференцировка в остеоиндуктивных каркасах

Чтобы оценить остеоиндуктивную активность каркасов, относительную экспрессию ранних остеогенных маркеров ALP и BMP2 исследовали через 8 дней культивирования, в то время как поздние маркеры остеокальцина (OCN) и остеопонтина (OPN) исследовали через 21 день культивирования с помощью qRT-PCR анализ. Вкратце, не наблюдали значительной разницы в экспрессии ALP между GW-средой и каркасами DMSO в статических условиях.Напротив, экспрессия ALP значительно увеличивалась в каркасах GW-pSi по сравнению с каркасами как DMSO, так и GW-media (фиг. 7A). Перфузия дополнительно усиливала экспрессию ALP во всех композициях каркаса (фигура 7A). Не наблюдалось значительного взаимодействия между эффектами перфузии и состава среды / каркаса на экспрессию ALP (дополнительная таблица 10). Экспрессия гена BMP2 в отсутствие перфузии увеличивалась в ответ на обработку GW9662, причем каркасы GW-pSi и GW-media имели значительно более высокую экспрессию, чем каркасы DMSO (фиг. 7B).Значительное увеличение экспрессии гена BMP2 наблюдалось в контроле носителя в ответ на перфузию по сравнению с его статическим аналогом. Напротив, экспрессия гена BMP2 отрицательно влияла как в экзогенных, так и в элюированных лекарственным средством образцах GW9662 при перфузии (фигура 7B). Было обнаружено, что взаимодействие между перфузией и составом среды / каркаса является значительным (дополнительная таблица 12). Для дальнейшего изучения этих тенденций на уровне белка был проведен иммуноблоттинг против BMP2.Иммуноблоттинг показал, что обработка GW9662 и перфузия оказывали синергетический эффект на экспрессию BMP2 на уровне трансляции (дополнительный рисунок 2).

Рисунок 7. Анализ qRT-PCR на экспрессию остеогенных маркеров в hMSC через (A, B) 8 дней или (C, D) 21 день культивирования в различных комбинациях каркаса / среды. Складчатые изменения были нормализованы к уровням экспрессии неиндуцированных hMSC через 8 или 21 день 2D-культивирования. Столбцы с совпадающими буквами указывают на то, что все возможные сравнения не были значимыми ( n = 3, планки ошибок отображают стандартное отклонение, p <0.05, двусторонний дисперсионный анализ, критерий множественного сравнения Тьюки).

Торговым знаком терминально дифференцированных hMSC является экспрессия поздних остеогенных маркеров. Таким образом, экспрессия остеопонтина (OPN) и остеокальцина (OCN) на уровне транскрипции была исследована после 21 дня культивирования. OPN был положительно экспрессирован во всех каркасах и условиях среды, при этом самый низкий уровень выражался в каркасах ДМСО (фигура 7C). Хотя экспрессия OPN увеличивалась как в экзогенных каркасах микросфер, так и в каркасах микросфер, элюируемых GW9662, по сравнению с контролем ДМСО в статических условиях, тенденция не была значительной.Перфузия значительно усиливала экспрессию OPN в каркасах GW-pSi и GW-media по сравнению со статическими каркасами DMSO. Взаимодействие между перфузией и составом каркаса / среды и их влияние на экспрессию OPN не было значимым (дополнительная таблица 14). Экспрессия OCN положительно выражалась в каркасах DMSO и сильно зависела от дозы на обработку GW9662. Вкратце, GW-media и GW-pSi имели значительно более высокие уровни экспрессии по сравнению с контролем DMSO (фиг. 7D).Применение перфузии стимулировало более высокие уровни экспрессии OCN в каркасах GW-pSi и DMSO при одновременном снижении экспрессии OCN в каркасах GW-media. Однако кратность экспрессии в перфузируемых каркасах GW-media все еще была значительно выше, чем у статического контроля носителя. Было обнаружено, что взаимодействие между перфузией и составом каркаса / среды на OCN является значительным (дополнительная таблица 16).

In vitro Минерализация и прочность на сжатие каркаса

Минерализация в каркасах была обнаружена с помощью μCT.Степень радиопрозрачности реконструированных изображений микроконтактной томографии каркасов, собранных после 21 дня культивирования (рисунки 8A-F), суммирована на рисунке 8G. Каркасы из ДМСО (фиг. 8A), культивированные в статических условиях, были в значительной степени радиопрозрачными, в то время как был обнаружен больший объем каркасов GW-pSi (фиг. 8B) и GW-media (фиг. 8C). Кроме того, более плотные области, которые коррелируют со степенью минерализации, были обнаружены во всех перфузируемых образцах, с более крупными областями, обнаруженными в каркасах GW-pSi (Рисунок 8E) и GW-media (Рисунок 8F).При количественной оценке с использованием метода коэффициента ослабления значительно более высокие уровни минеральной плотности костной ткани были обнаружены в каркасах, культивируемых при перфузии, по сравнению с их статическими аналогами во всех трех условиях каркаса / среды (рис. 8G). Взаимодействие между перфузией и составом каркаса / среды и их влиянием на МПК не было значимым (дополнительная таблица 19). В статических условиях обработка GW9662 приводила к значительно более высоким уровням BMD по сравнению с каркасами DMSO, независимо от источника GW.Аналогичная тенденция наблюдалась при перфузии (рис. 8G).

Рис. 8. Репрезентативные μCT-реконструкции каркасов после 21 дня культивирования (A – F) (масштабная линейка 500 мкм). (G) Минеральная плотность кости увеличивается в ответ на перфузию и GW9662. Столбцы с совпадающими буквами указывают на то, что все возможные сравнения не были значимыми ( n = 3, планки ошибок отображают стандартное отклонение, p <0,05, двусторонний дисперсионный анализ ANOVA, критерий множественного сравнения Тьюки).

Затем мы оценили, трансформируется ли увеличенная минеральная плотность кости в улучшенные механические свойства. Хотя отклонения в модулях сжатия каркаса не были однородными, отчасти из-за выброса в перфузированных образцах GW-pSi, все же выполнялись двухфакторный дисперсионный анализ и тест множественного сравнения Тьюки, чтобы гарантировать, что подобный анализ может быть выполнен между анализами (дополнительная таблица 21). . Механические испытания выявили общую тенденцию к увеличению модуля сжатия в ответ на перфузию (Рисунки 9A – C).Хотя модуль сжатия увеличился в ответ на перфузию в каркасах DMSO и GW-media по сравнению с их статическими аналогами, тенденция не была значительной (рис. 9D). Напротив, значительная разница наблюдалась между перфузируемыми и статическими каркасами GW-pSi (рис. 9D). Кроме того, комбинированная обработка GW9662 с помощью экзогенных средств или микросфер и перфузии привела к получению более жестких на сжатие каркасов по сравнению со статическим каркасом MgHA / DMSO (рис. 9D).Наконец, сильная корреляция между минеральной плотностью кости и модулем сжатия наблюдалась для 18 объединенных образцов со значением корреляции Персона r 0,696 и двусторонним значением p 0,014 (рис. 9E).

Рис. 9. (A – C) Типичные тесты на сжатие каркасов после 21 дня культивирования. (D) Средний модуль сжатия каркасов после 21 дня культивирования. Столбцы с совпадающими буквами указывают на то, что все возможные сравнения не были значимыми ( n = 3, планки ошибок отображают стандартное отклонение, p <0.05, двусторонний дисперсионный анализ, критерий множественного сравнения Тьюки). (E) Высокая степень корреляции между наблюдаемой минеральной плотностью кости и модулем сжатия для собранных 18 образцов (корреляция Пирсона r , значение 0,695, p <0,05).

Обсуждение

Несколько ключевых морфогенетических путей, например, Wnts, BMP, активных во время эмбрионального развития скелета, наблюдаются во время восстановления кости, что позволяет костной ткани восстанавливать свое неповрежденное состояние (Bais et al., 2009; Эйнхорн и Герстенфельд, 2015). Во время анаболической фазы восстановления кости каллусная ткань откладывается рекрутированными клетками-предшественниками и частично минерализуется (Little et al., 2007; Einhorn and Gerstenfeld, 2015). Эта анаболическая костная ткань характеризуется высоким уровнем уникальных типов коллагенов, таких как Coll VI и XII, которые играют важную регулирующую роль (Izu et al., 2011; Kohara et al., 2016). Кроме того, формирующаяся окостеневшая костная ткань как в мозолях при переломах, так и в развивающейся кости содержит ионные замещения (Quint et al., 1980; Kakei et al., 1997), в частности Mg ²⁺, в кристаллической структуре гидроксиапатита, которая обеспечивает быстрый ионный обмен. Таким образом, ключ к разработке новых каркасов для восстановления костей заключается в повторении как неорганической, так и органической фаз анаболической костной ниши. Реакция hMSCs, культивируемых в макропористом каркасе Coll / MgHA с микросферами, элюирующими GW9662, с целью депонирования ECM, богатого Coll VI и XII, демонстрирует возможность получения каркаса, который по содержанию как минералов, так и коллагена в регенерирующей кости.

Создание каркасов было вдохновлено процессом биоминерализации губчатой кости, которую можно описать как слабокристаллический биологический апатит с ионными заменами, покрывающими лежащую в основе макропористую структуру белка (Landi et al., 2008; Figueiredo et al., 2012) . Благодаря контролируемому замораживанию и лиофилизации стало возможным изготовить высокопористый композитный каркас, который обеспечивает высокую инфильтрацию клеток в сочетании с перфузионным биореактором.При оценке каркасы показали близкое сходство по своей морфологии и минеральному составу с тканями губчатой кости. Вкратце, удельное соотношение поверхности кости (BS / BV) наших каркасов ( cf . Рисунок 1D) было аналогично значениям (17,03 ± 4,06 мм ^–1), указанным для губчатой кости бедренной кости человека (Teo et al. , 2006). Анализ состава каркасов выявил дополнительные замены в структуре апатита, отличные от Mg ²⁺, заменяющего Ca ²⁺.Заменители карбонатных ионов, особенно типа B (870 см ^–1), также были обнаружены в структуре решетки. Присутствие Mg ²⁺ и карбонат-ионов заслуживает особого внимания, поскольку они обычно обнаруживаются в более молодой, более реактивной кости, поскольку они обеспечивают обратимый обмен ионов (Landi et al., 2008; Rey et al., 2009; Figueiredo et al., 2012), который теряется по мере созревания кости. Таким образом, присутствие Mg ²⁺ и карбонат-ионов типа B подтверждает, что каркасы эффективно воспроизводят минеральные свойства незрелой кости, среды с высокой остеогенной активностью.

Хотя изготовленные каркасы имитировали ключевые минеральные особенности вновь сформированной кости, единственное использование Coll I в основной структуре белка не имитирует коктейль из редких коллагенов, которые активируются при развитии и регенерации кости. В частности, Coll XII в изобилии присутствует во внешнем и внутреннем слоях надкостницы развивающихся длинных костей (Wälchli et al., 1994), и было показано, что он играет важную регулирующую роль в дифференцировке остеобластов и формировании костного матрикса (Izu et al. ., 2011). Coll VI высоко экспрессируется в первичных остеонах диафиза бедренной кости, где он поддерживает пролиферацию и созревание преостеобластов (Kohara et al., 2015). Coll VI также высоко экспрессируется в среднем слое Groove of Ranvier и важной области окостенения в развитии длинных костей и помогает регулировать дифференцировку преостеобластов до созревания (Kohara et al., 2016). Ранее мы показали, что hMSC, обработанные GW9662, секретируют сложный коктейль ECM, который содержит высокие уровни Coll VI и Coll XII, которые можно использовать для увеличения удержания hMSC в месте поражения, что приводит к лучшему заживлению кости (Zeitouni et al. ., 2012). Хотя ECM, генерируемый из обработанных GW9662 hMSC, продемонстрировал замечательную способность к регенерации кости даже при введении в участки поражения без hMSC, его очистка и изготовление 3D-каркаса является дорогостоящим и трудоемким процессом. Стимулирование чМСК к отложению анаболического костного внеклеточного матрикса на установленных каркасах после имплантации позволило бы обойти некоторые из этих проблем и облегчить перевод в клинику. Однако GW9662 требует постоянного пополнения для достижения желаемых эффектов из-за короткого периода полураспада (Li et al., 2011). Мы предположили, что включение системы доставки лекарств, способной к контролируемому высвобождению GW9662 в пористую минерализованную основу, приведет к сравнимому отложению ЕСМ по сравнению с традиционными методами изготовления (10 мкМ каждые 2–3 дня). Хотя прямая имплантация hMSCs, культивируемых на каркасе, встроенном в микросферы, элюирующие GW9662, является возможным путем клинического применения, мы также исследовали использование перфузионного биореактора для улучшения отложения анаболического костного ECM по всему каркасу.Вместе микросферы, выделяющие лекарственное средство, и перфузионный биореактор могут быть использованы для изготовления клинически значимых каркасов для восстановления кости.

Чтобы полностью понять тенденции отложения Coll VI и Coll XII, экспрессия генов коррелировала с иммуноокрашиванием. В то время как экспрессия мРНК Coll VI и Coll XII увеличивалась в различной степени из-за GW9662 и микросфер, выделяющих лекарство, только экспрессия Coll VI увеличивалась в ответ на перфузию. Фактически, снижение экспрессии Coll XII наблюдалось после 8 дней культивирования в биореакторе.Иммуноокрашивание, однако, показало разительную разницу между статическими и перфузируемыми образцами, выявив заметное увеличение отложения как Coll VI, так и Coll XII с точки зрения однородности и плотности в каркасах GW-pSi и GW-media. Этот результат, по крайней мере, частично объясняется относительно высоким количеством hMSC и их более глубоким распределением в каркасе. Ранее сообщалось об увеличении отложения ECM с помощью hMSCs из-за напряжения сдвига жидкости (Grayson et al., 2011), предполагая другой механизм, с помощью которого перфузия способствует отложению ECM в каркасах.Насколько нам известно, это первый раз, когда перфузия использовалась в сочетании с системой с лекарственным покрытием для создания уникальной смеси матричных белков с целью имитации сложной микросреды анаболической кости. Более того, микросферы, элюирующие GW9662, были способны стимулировать отложение анаболического костного ЕСМ с использованием значительно меньшего количества GW9662 по сравнению с культуральной средой с экзогенными добавками; 0,52 мкг GW9662 в GW-pSi в течение 8 дней культивирования по сравнению с 5,5 мкг GW9662, добавляемым каждые 2 дня в каркасы GW-media.

Поскольку губчатая кость является основным резервуаром клеток-предшественников (Sakaguchi et al., 2004), мы первоначально количественно оценили инфильтрацию hMSC в каркасы как в статических, так и в перфузионных условиях без влияния GW9662. В соответствии с предыдущими исследованиями, клетки, культивируемые в статических условиях, образуют плотный слой, связанный с поверхностью каркаса (Grayson et al., 2008; Correia et al., 2013). Перфузия клеток, культивируемых в CCM, приводила к более равномерному распределению клеток в каркасе, но не приводила к значительному увеличению общего числа клеток, предполагая, что усиленное распределение клеток было в первую очередь связано с усиленной миграцией клеток в каркас.За исключением каркасов, культивируемых в CCM, рассчитанная популяция клеток в каркасах, культивируемых в статических условиях, была ниже, чем исходное число посева. Однако культивирование в перфузионных биореакторах позволило восстановить количество клеток в каркасах DMSO, GW-pSi, GW-media. Большая приверженность к остеогенному клону была связана со снижением скорости пролиферации hMSC, что могло объяснить причину, по которой каркасы DMSO, GW-pSi и GW-media имели более низкие клеточные популяции, чем каркасы, культивируемые в CCM (Banfi et al., 2002; Wagner et al., 2008; Бара и др., 2014). Кроме того, недостаточный транспорт газа и питательных веществ во время первоначального статического культивирования перфузированных образцов в течение ночи, вероятно, является причиной того, что количество клеток ниже, чем начальное количество посева в каркасах DMSO, GW-pSi и GW-media.

Было показано, что анаболический костный ЕСМ, полученный из обработанных GW9662 hMSC, усиливает экспрессию остеогенных маркеров и улучшает восстановление кости в моделях критических размеров дефектов на мышах (Clough et al., 2015, 2017). Использование микросфер с элюированием GW9662 и перфузионных биореакторов для подготовки каркасов с анаболическим костным ECM дает важную информацию для передачи этой технологии в клинику. Мы предположили, что контролируемое высвобождение GW9662 и последующее отложение ECM приведет к улучшенной остеогенной дифференцировке засеянных hMSC. В соответствии с предыдущей работой in vivo (Clough et al., 2015) мы наблюдали увеличение экспрессии гена BMP2 в ответ на GW9662 (экзогенный и из микросфер) в статических условиях.Хотя экспрессия гена BMP2 была ниже в образцах, обработанных GW9662 в условиях перфузии, иммуноблоттинг выявил синергетическую взаимосвязь между перфузией и обработкой GW9662. Ранее было показано, что экспрессия ALP в ответ на лечение GW9662 является двухфазной, становясь ингибирующей при более высоких концентрациях GW9662 (Krause et al., 2010). Таким образом, неудивительно видеть образцы GW-pSi, имеющие более высокую экспрессию ALP, чем как GW-среда, так и каркасы DMSO в статических условиях. Хотя статические каркасы DMSO и GW-media имели сопоставимые уровни экспрессии ALP, оба они все еще экспрессировались положительно.Кроме того, приложение напряжения сдвига жидкости значительно увеличивало экспрессию ALP во всех трех каркасах. Точно так же уровни экспрессии генов OPN и OCN увеличивались в ответ на перфузируемую культуру в каркасах GW-pSi и DMSO. Экспрессия этих двух поздних остеогенных маркеров в перфузируемых каркасах GW-media была более сложной. В то время как экспрессия OPN улучшалась за счет перфузии, экспрессия OCN снижалась. Однако следует отметить, что экспрессия OCN в перфузируемых каркасах GW-media все еще была высоко выражена.Для Coll VI, Coll XII, BMP2 и OCN взаимодействие оказалось значительным, поэтому эффекты одной переменной зависели от другой. В частности, повышающая регуляция экспрессии Coll VI, Coll XII и BMP2 с помощью GW9662 в статических условиях уменьшалась при перфузии ( cf. Фигуры 5, 6A, B). Однако при дальнейшем исследовании на уровне белка экспрессия Coll VI, Coll XII и BMP2 была усилена двойной обработкой GW9662 и перфузией. Несоответствие в экспрессии между уровнем транскрипции и белка подчеркивает ограничения использования данных экспрессии генов для понимания взаимодействия между перфузией и составами каркаса / культуральной среды.

Механизм, с помощью которого GW9662-индуцированный анаболический костный ECM опосредует повышающую регуляцию BMP2 и других остеогенных маркеров, не полностью изучен, равно как и влияние перфузии. Предыдущая работа, однако, показала, что в передаче сигнала в hMSCs, обработанных GW9662, преобладают интегрины и, предположительно, их взаимодействие с недавно депонированными ECM (Clough et al., 2015). Было показано, что у грызунов Coll VI опосредует дифференцировку остеобластов через нейральный / глиальный антиген 2 (NG2) рецептора клеточной поверхности и несколько типов интегринов (Kohara et al., 2015, 2016). Coll XII является критическим в регуляции поляризации остеобластов и межклеточного взаимодействия (Izu et al., 2011). Как показали др., Интегрин активированный MAPK / ERK играет решающую роль в индукции BMP2 (Lu and Zreiqat, 2010), и можно предположить, что подобный механизм отвечает за остеоиндуктивные свойства анаболического костного ECM. Интегрины (β1) и другие адаптерные белки также участвуют в обеспечении ответа hMSCs на механическую стимуляцию (Chen and Jacobs, 2013).Например, было показано, что приложение напряжения сдвига жидкости увеличивает активность ЩФ и экспрессию остеогенных маркеров, наряду с активацией киназы фокальной адгезии (FAK) (Chen and Jacobs, 2013). Кроме того, экспрессия гена Coll XII может напрямую стимулироваться механическим напряжением (Arai et al., 2008). Как ингибитор PPARγ, GW9662, как было показано, активирует различные маркеры ранней стадии остеогенеза путем ослабления негативных перекрестных помех на передачу сигналов cWnt, что делает возможным транслокацию β-catenin в ядро (Chen and Jacobs, 2013).Хотя существует несколько путей механотрансдукции, которые опосредуют остеогенную дифференцировку, воздействие напряжения сдвига жидкости также может приводить к транслокации β-катенина (Chen et al., 2019) в ядро hMSC, опосредованной передачей сигналов N -кадгерин, а не cWnt. (Арнсдорф и др., 2009). Тем не менее, эти исследования обычно выполняются в 2D-системе, что подчеркивает необходимость исследования и отделения стимулов, исходящих от окружающей среды остеогенной ниши, такой как анаболический костный ECM, представленный здесь, от механических стимулов.В настоящее время неизвестно, преобладают ли в нашей системе пути передачи сигналов от клетки к клетке ( N -кадгерин) или от клетки к ECM (интегрин), которая сочетает в себе напряжение сдвига жидкости от перфузионного биореактора через трехмерную среду. имитируя ECM анаболической кости, или как косвенная активация cWnt посредством ингибирования PPARγ вписывается в сложные адгезивные сигнальные сети.

Учитывая критическую функцию ALP и OPN в минерализации и мощную способность BMP2 вызывать эктопическое образование кости, мы оценили, были ли их благоприятный ответ на лечение GW9662 и перфузию связанным с аналогичным увеличением минерализации.Хотя микроструктура готовых каркасов могла быть различима, их минеральная плотность костной ткани не могла быть оценена, поскольку они были ниже пределов контраста калибровочных фантомов. Однако после 3 недель культивирования минеральная плотность костной ткани всех каркасов была в пределах предела обнаружения. В соответствии с результатами экспрессии генов мы обнаружили значительно повышенные уровни BMD в каркасах GW-pSi и GW-media по сравнению с каркасами DMSO. Перфузия увеличивала уровни BMD в каркасах DMSO, GW-pSi и GW-media.Кроме того, каркасы, обработанные экзогенным GW9662, были минерализованы в значительно большей степени, чем даже каркасы GW-pSi при перфузии, что дополнительно подтверждает существование синергетической взаимосвязи между обработкой GW9662 и перфузией. Показывая взаимосвязь между структурой и функцией, сжимающие механические свойства кости сильно коррелируют с минеральной плотностью (Follet et al., 2004; Teo et al., 2006). Учитывая, что восстановление функциональных возможностей поврежденной или больной кости является целью инженерии костной ткани, было крайне важно оценить, трансформируется ли увеличенная минеральная плотность кости, наблюдаемая в культивируемых каркасах, на улучшенные механические свойства.Хотя перфузия и обработка GW9662 по отдельности улучшили сжимающие свойства каркасов, вместе они привели к значительно более жесткому каркасу. Модули сжатия все еще были значительно ниже, чем сообщалось для нативной кости, но этого следовало ожидать от экспериментов, представляющих раннюю минерализацию каркасов.

Заключение

Несмотря на ограниченную доступность и связь с заболеваемостью донорского участка, аутологичные костные трансплантаты остаются золотым стандартом лечения костной пластики.Создание костных конструкций, достаточно больших для клинического применения, является сложной задачей, отчасти из-за нашего неполного понимания комбинированного воздействия растворимых факторов и напряжения сдвига жидкости на развитие костей. В этом исследовании мы изучили влияние контролируемого высвобождения GW9662, ингибитора PPARγ, и перфузии на отложение внеклеточного матрикса, богатого коллагенами, характерного для новообразованной кости, мезенхимальными стволовыми клетками человека, культивируемыми на остеоиндуктивном каркасе. Поразительное улучшение отложения анаболических костных ECM относительно статических контролей и контроля носителя показало синергетическую взаимосвязь между перфузией и обработкой GW9662, либо от микросфер, выделяющих лекарственное средство, либо от добавок среды, что привело к образованию каркаса, который воспроизводит как неорганическую, так и органическую фракцию возникающих кость.Необходима будущая работа с in vivo , чтобы определить, могут ли скаффолды Coll / MgHA, встроенные в микросферы, элюирующие GW9662, побуждать нативные клетки остеопрогениторов откладывать анаболический костный ЕСМ на уровнях, которые приводят к улучшенному заживлению кости. Кроме того, данные, представленные здесь, предполагают, что лечение GW9662 и система перфузионного культивирования могут быть использованы для депонирования анаболического костного ECM для увеличения остеорегенеративных свойств существующих каркасов.

Заявление о доступности данных

Все наборы данных, созданные для этого исследования, включены в статью / Дополнительные материалы.

Авторские взносы

RK, CG и ET были вовлечены в концепцию работы. FT и SM изготовили подмости для этой работы. EM участвовал в разработке экспериментов, сборе и анализе данных при содействии MC. CG и RK внесли свой вклад в интерпретацию данных. Э.М. и РК принимали участие в написании рукописи. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

RK и CG хотели бы поблагодарить за финансовую поддержку Национальный институт артрита, заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи (R01 AR066033 и R21 AR072292) и премию Национального научного фонда (NSF) (CBET 1264848 и 1264832).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Гордану Вуньяк-Новакович за использование системы перфузионного биореактора. Мы также выражаем нашу благодарность Техасской лаборатории элементного анализа A&M за их помощь в проведении анализа ICP-MS.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2020.00753/full#supplementary-material

Список литературы

Араи, К., Нагашима, Ю., Такемото, Т., и Нишияма, Т. (2008). Механическая деформация увеличивает экспрессию коллагена типа XII в мышиных остеобластических клетках MC3T3-E1. Cell Struct. Функц. 33, 203–210. DOI: 10.1247 / csf.08025

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Арнсдорф Э. Дж., Туммала П. и Джейкобс К. Р. (2009). Неканоническая передача сигналов wnt и связанная с N-кадгерином передача сигналов β-catenin играют роль в механически индуцированной судьбе остеогенных клеток. PLoS One 4: e5388. DOI: 10.1371 / journal.pone.0005388

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Байс, М., Маклин, Дж., Себастьяни, П., Янг, М., и Вигнер, Н. (2009). Транскрипционный анализ заживления переломов и индукции генов, связанных с эмбриональными стволовыми клетками. PLoS One 4: 5993. DOI: 10.1371 / journal.pone.0005393

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Банфи, А., Бьянки, Г., Нотаро, Р., Луццатто, Л., Канседда, Р., Куарто, Р. и др. (2002). Репликативное старение и экспрессия генов в долговременных культурах стромальных клеток костного мозга человека. TISSUE Eng. 8, 901–910. DOI: 10.1089 / 107632702320

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бара, Дж. Дж., Ричардс, Р. Г., Алини, М., и Стоддарт, М. Дж. (2014). Краткий обзор: полученные из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки меняют фенотип после культивирования in vitro: значение для фундаментальных исследований и клиники. Стволовые клетки 32, 1713–1723. DOI: 10.1002 / стержень.1649

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Букссейн, М. Л., Бойд, С. К., Кристиансен, Б. А., Гульдберг, Р. Э., Джепсен, К. Дж. (2010). Руководство по оценке микроструктуры костей у грызунов с помощью микрокомпьютерной томографии. J. Bone Miner. Res. 25, 1468–1486. DOI: 10.1002 / jbmr.141

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чая, А., Йошизава, С., Verdelis, K., Myers, N., Costello, B.J., Chou, D.T., et al. (2015). Исследование in vivo деградации магниевых пластин и винтов и заживления переломов костей. Acta Biomater. 18, 262–269. DOI: 10.1016 / j.actbio.2015.02.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chen, W.-T., Hsu, W. T., Yen, M. H., Changou, C. A., Han, C. L., Chen, Y. J., et al. (2019). Изменение полярности мезенхимальных стволовых клеток за счет ламинарной стимуляции сдвига, способствующее локализации β-катенина в ядре. Биоматериалы 190–191, 1–10. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2018.10.026

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Clough, B.H., McCarley, M.R., Krause, U., Zeitouni, S., Froese, J.J., McNeill, E.P., et al. (2015). Костная регенерация с помощью остеогенно усиленных мезенхимальных стволовых клеток и белков их внеклеточного матрикса. J. Bone Miner. Res. 30, 83–94. DOI: 10.1002 / jbmr.2320

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клаф, Б.Х., Макнил, Э. П., Палмер, Д., Краузе, У., Бартош, Т. Дж., Чапут, К. Д. и др. (2017). Аллотрансплантат, созданный из взрослых стволовых клеток и их секретируемых продуктов, эффективно соединяет позвонки у бестимусных крыс с ослабленным иммунитетом и подавляет местные иммунные ответы. Spine J. 17, 418–430. DOI: 10.1016 / j.spinee.2016.10.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коррейя К., Бхумиратана С., Соуза Р. А., Рейс Р. Л. и Вуньяк-Новакович Г. (2013).Последовательное применение постоянной и пульсирующей средней перфузии способствовало формированию искусственной кости. Tissue Eng. Часть A 19, 1244–1254. DOI: 10.1089 / ten.tea.2011.0701

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Датта, Н., Холторф, Х. Л., Сикавицас, В. И., Янсен, Дж. А., и Микос, А. Г. (2005). Влияние костного внеклеточного матрикса, синтезированного in vitro, на остеобластную дифференцировку стромальных клеток костного мозга. Биоматериалы 26, 971–977.DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2004.04.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Декарис, М. Л., Биндер, Б. Ю., Сойчер, М. А., Бхат, А., и Лич, Дж. К. (2012). Покрытия на основе клеточного матрикса для полимерных каркасов. Tissue Eng. Часть A 18, 2148–2157. DOI: 10.1089 / ten.tea.2011.0677

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Диркс, Н., Ван Хул, М., и Маес, К. (2013). Привлечение остеобластов к участкам образования кости при развитии скелета, гомеостазе и регенерации. Врожденные дефекты Res. Часть C «Эмбрион сегодня» Ред. 99, 170–191. DOI: 10.1002 / bdrc.21047

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фан, Д., Де Роса, Д., Мерфи, М. Б., Пэн, Ю., Смид, К. А., Чиаппини, К., и др. (2012). Мезопористые композитные микросферы кремний-PLGA для двойного контролируемого высвобождения биомолекул для ортопедической тканевой инженерии. Adv. Функц. Матер. 22, 282–293. DOI: 10.1002 / adfm.201100403

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фигейредо, М.М., Гамелас, Дж. А. Ф., и Мартинс, А. Г. (2012). «Определение характеристик костных и костных материалов для трансплантатов с помощью FTIR-спектроскопии», в Infrared Spectroscopy — Life and Biomedical Sciences , ed. Т. Феофанидес (Лондон: IntechOpen), 315–338. DOI: 10.5772 / 36379

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фолле, Х., Бойвин, Г., Румельхарт, К., Менье, П. Дж. (2004). Степень минерализации является определяющим фактором прочности костей: исследование пяточной кости человека. Кость 34, 783–789.DOI: 10.1016 / j.bone.2003.12.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Герстенфельд, Л. К., Куллинейн, Д. М., Барнс, Г. Л., Грейвс, Д. Т., и Эйнхорн, Т. А. (2003). Заживление переломов как постнатальный процесс развития: молекулярные, пространственные и временные аспекты его регуляции. J. Cell. Biochem. 88, 873–884. DOI: 10.1002 / jcb.10435

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грейсон, В. Л., Бхумиратана, С., Канниццаро, К., Чао, П.-Х. Г., Леннон, Д. П., Каплан, А. И. и др. (2008). Влияние начальной плотности посева и скорости перфузии жидкости на формирование тканевой костной ткани. Tissue Eng. Часть A 14, 1809–1820. DOI: 10.1089 / ten.tea.2007.0255

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Grayson, W. L., Marolt, D., Bhumiratana, S., Fröhlich, M., Guo, X. E., Vunjak-Novakovic, G., et al. (2011). Оптимизация средней скорости перфузии в биореакторах инженерии костной ткани. Biotechnol. Bioeng. 108, 1159–1170. DOI: 10.1002 / бит. 23024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хе Д., Донг В. и Тан С. (2014). Каркас тканевой инженерии из мезопористого силиката магния и композита поли (е -капролактон) — поли (этиленгликоль) — поли (е -капролактон). J. Mater. Sci. Матер. Med. 25, 1415–1424. DOI: 10.1007 / s10856-014-5183-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Идзу, Ю., Sun, M., Zwolanek, D., Veit, G., Williams, V., Cha, B., et al. (2011). Коллаген типа XII регулирует полярность и связь остеобластов во время формирования кости. J. Cell Biol. 193, 1115–1130. DOI: 10.1083 / jcb.201010010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Какей, М., Накахара, Х., Тамура, Н., Ито, Х., и Кумегава, М. (1997). Поведение ионов карбоната и магния в исходных кристаллитах на ранних стадиях развития свода черепа крысы. Ann. Анат. 179, 311–316. DOI: 10.1016 / s0940-9602 (97) 80065-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кохара Ю., Соэта С., Идзу Ю. и Амасаки Х. (2015). Накопление коллагена типа VI в первичном остеоне бедренной кости крысы во время постнатального развития. J. Anat. 226, 478–488. DOI: 10.1111 / joa.12296

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кохара Ю., Соэта С., Идзу Ю., Араи К. и Амасаки Х. (2016).Распределение коллагена типа VI в связи с клонами остеобластов в бороздке Ранвье во время постнатального развития крыс. Ann. Анат. 208, 58–68. DOI: 10.1016 / j.aanat.2016.07.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Куркумелис Н. и Цафлиду М. (2010). Спектроскопическая оценка нормальной кортикальной кости: различия в зависимости от места расположения кости и пола. Sci. Мир J. 10, 402–412. DOI: 10.1100 / tsw.2010.43

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Krause, U., Харрис, С., Грин, А., Илостало, Дж., Зейтуни, С., Ли, Н. и др. (2010). Фармацевтическая модуляция канонической передачи сигналов Wnt в мультипотентных стромальных клетках для улучшения остеоиндуктивной терапии. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, 4147–4152. DOI: 10.1073 / pnas.0

0107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Landi, E., Logroscino, G., Proietti, L., Tampieri, A., Sandri, M., Sprio, S., et al. (2008). Биомиметик Mg-замещенный гидроксиапатит: от синтеза к поведению in vivo. J. Mater. Sci. Матер. Med. 19, 239–247. DOI: 10.1007 / s10856-006-0032-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли Х., Иказа Дж. И Блумберг Б. (2011). Трибутилолова хлорид из окружающей среды, вызывающий ожирение, действует через гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом, и вызывает адипогенез в преадипоцитах 3T3-L1 мышей. J. Steroid Biochem. Мол. Биол. 127, 9–15. DOI: 10.1016 / j.jsbmb.2011.03.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Литтл, Д.Г., Рамачандран М. и Шинделер А. (2007). Анаболический и катаболический ответ при восстановлении костей. J. Bone Joint Surg. Br. 89, 425–433. DOI: 10.1302 / 0301-620x.89b4.18301

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ливак, К. Дж., И Шмитген, Т. Д. (2001). Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2-ΔΔCT. Методы 25, 402–408. DOI: 10.1006 / meth.2001.1262

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лу, З., и Зрейкат, Х. (2010). Остеокондуктивность биоматериалов регулируется аутокринной петлей костного морфогенетического белка 2, включающей интегрин α2β1 и пути передачи сигналов митоген-активируемой протеинкиназы / внеклеточной родственной киназы. Tissue Eng. Часть A 16, 3075–3084. DOI: 10.1089 / ten.tea.2010.0204

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марвулли Д. и Брессан Г. М. (1996). Пространственные и временные изменения коллагена типа VI во время развития мышей. Dev. Дин. 206, 447–454. DOI: 10.1002 / (sici) 1097-0177 (199608) 206: 4 <447 :: aid-aja10> 3.0.co; 2-u

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Минарди, С., Коррадетти, Б., Тарабалли, Ф., Сандри, М., Ван Эпс, Дж., Кабрера, Ф. Дж. И др. (2015). Оценка остеоиндуктивного потенциала биоиндуцированного каркаса, имитирующего остеогенную нишу для увеличения кости. Биоматериалы 62, 128–137. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2015.05.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Минарди, С., Сандри, М., Мартинес, Дж. О., Язди, И. К., Лю, X., Феррари, М., и др. (2014). Разномасштабное моделирование биомиметического каркаса, интегрированного с композитными микросферами. Малый 10, 3943–3953. DOI: 10.1002 / smll.201401211

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Pandolfi, L., Minardi, S., Taraballi, F., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E., et al. (2016). Композитный функционализированный микросферами каркас для контролируемого высвобождения малых молекул в тканевой инженерии. J. Tissue Eng. 7: 2041731415624668.

Google Scholar

Quint, P., Althoff, J., Höhling, H.J., Boyde, A., and Laabs, W.A. (1980). Характерные молярные соотношения магния, углекислого газа, кальция и фосфора в минерализующей мозоли трещины и предентине. Calcif. Tissue Int. 32, 257–261. DOI: 10.1007 / bf02408549

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ратнаяке, Дж. Т. Б., Мукало, М., и Диас, Г.J. (2017). Замещенные гидроксиапатиты для регенерации костей: обзор современных тенденций. J. Biomed. Матер. Res. Часть B Прил. Биоматер. 105, 1285–1299. DOI: 10.1002 / jbm.b.33651

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рей, К., Комб, К., Друэ, К., и Глимчер, М. Дж. (2009). Костный минерал: обновленная информация о химическом составе и структуре. Остеопор. Междунар. 20, 1013–1021. DOI: 10.1007 / s00198-009-0860-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сакагучи, Ю., Секия, И., Ягишита, К., Ичиносе, С., Шиномия, К., Мунета, Т. и др. (2004). Взвешенные клетки губчатой кости в результате переваривания коллагеназы становятся практически идентичными мезенхимальным стволовым клеткам, полученным из аспиратов костного мозга. Кровь 104, 2728–2735. DOI: 10.1182 / кровь-2003-12-4452

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sears, C., Mondragon, E., Richards, Z. I., Sears, N., Chimene, D., McNeill, E. P., et al. (2020). Кондиционирование напечатанных на 3D-принтере каркасов с ионно-ковалентной связью с матрицами, полученными из iP-hMSC. Adv. Здоровьеc. Матер. 1

0. DOI: 10.1002 / adhm.201

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Су, Дж. (2018). Повышенная биосовместимость и остеогенный потенциал композитных каркасов мезопористого силиката магния / поликапролактона / белка пшеницы. Внутр. J. Nanomed. 13, 1107–1117. DOI: 10.2147 / ijn.s157921

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тео, Дж. К. М., Си-Хое, К. М., Кех, Дж.Э. Л. и Теох С. Х. (2006). Взаимосвязь между интенсивностью компьютерной томографии, микроархитектурой и механическими свойствами губчатой кости позвоночника свиньи. Clin. Биомех. 21, 235–244. DOI: 10.1016 / j.clinbiomech.2005.11.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Tsao, C.J., Taraballi, F., Pandolfi, L., Velasquez-Mao, A.J., Ruano, R., Tasciotti, E., et al. (2018). Контролируемое высвобождение малых молекул для сердечной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток. Tissue Eng. Часть A 24, 1798–1807. DOI: 10.1089 / ten.tea.2018.0054

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вагнер В., Хорн П., Кастольди М., Дильманн А. и Борк С. (2008). Репликативное старение мезенхимальных стволовых клеток: непрерывный и организованный процесс. PLoS One 3: 2213. DOI: 10.1371 / journal.pone.0002213

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wälchli, C., Koch, M., Chiquet, M., Odermatt, B.F., и Trueb, B. (1994). Тканеспецифическая экспрессия ассоциированных с фибриллами коллагенов XII и XIV. J. Cell Sci. 107, 669–681.

Google Scholar

Ямазаки М., Майеска Р. Дж., Йошиока Т., Мория Х. и Эйнхорн А. (1997). пространственная и временная экспрессия фибриллообразующих минорных генов коллагена (типы V и XI) во время заживления перелома. J. Bone Jt. Surg. 15, 757–764. DOI: 10.1002 / jor.1100150519

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зейтуни, С., Krause, U., Clough, B.H., Halderman, H., Falster, A., Blalock, D.T., et al. (2012). Матрицы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток человека, для усиленной остеорегенерации. Sci. Пер. Med. 4: 132ra55. DOI: 10.1126 / scitranslmed.3003396

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хумулин 70/30, Новолин 70/30 (инсулин изофан человеческий / инсулин обычный человеческий) дозировка, показания, взаимодействия, побочные эффекты и многое другое

ИНСУЛИН ЧЕЛОВЕЧЕСКАЯ ПОДВЕСКА ИЗОФАНА 70 / ОБЫЧНЫЙ 30 — ИНЪЕКЦИЯ

(IN-su-lin HUE-man EYE-soe-fane 70 / Regular 30)

ОБЩЕЕ НАИМЕНОВАНИЕ БРЕНДА: Humulin 70-30, Novolin 70-30

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ: Комбинация изофан / обычный инсулин используется с правильной диетой и программой упражнений для контроля высокого уровня сахара в крови у людей с диабетом.Контроль высокого уровня сахара в крови помогает предотвратить повреждение почек, слепоту, нервные расстройства, потерю конечностей и проблемы с сексуальной функцией. Правильный контроль диабета также может снизить риск сердечного приступа или инсульта. Этот искусственный инсулин аналогичен человеческому инсулину. Он заменяет инсулин, который обычно вырабатывает ваше тело. Это смесь 70% инсулина средней продолжительности действия (изофан) и 30% инсулина короткого действия (обычного). Он начинает действовать так же быстро, как и обычный инсулин, но действует дольше. Этот инсулиновый продукт помогает сахару (глюкозе) в крови попасть в клетки, чтобы ваше тело могло использовать его для получения энергии.Этот продукт можно использовать отдельно или с другими пероральными лекарствами от диабета (такими как метформин).

КАК ИСПОЛЬЗОВАТЬ: Прочтите информационный буклет для пациента, предоставленный вашим фармацевтом, прежде чем начинать использовать комбинацию изофан / обычный инсулин, а также каждый раз, когда вы будете получать дополнительную дозу. Если у вас есть какие-либо вопросы, спросите своего врача, диабетолога или фармацевта. Выучите все инструкции по приготовлению и применению у вашего лечащего врача и упаковку продукта. Перед использованием аккуратно скрутите флакон или картридж, перевернув его вверх дном и обратно 10 раз смешать лекарство.Не трясите емкость. Визуально проверьте этот продукт на наличие частиц или обесцвечивания. Если таковой присутствует, не используйте инсулин. Комбинация изофан / обычный инсулин должна выглядеть равномерно мутной / молочной после смешивания. Не используйте, если вы видите комки белого материала, «морозный» вид или частицы, прилипшие к стенкам флакона или картриджа. Перед введением каждой дозы очищайте место инъекции медицинским спиртом. Меняйте место инъекции каждый раз, чтобы уменьшить риск возникновения проблем или повреждений под кожей (например, ямок / комков или утолщения кожи).Введите это лекарство под кожу по указанию врача, обычно один или два раза в день. Этот инсулиновый продукт можно вводить в область живота, бедра, ягодиц или тыльной стороны плеча. Не вводите в вену или мышцу, потому что может возникнуть очень низкий уровень сахара в крови (гипогликемия). Не трите место после укола. Не вводите препарат в красную, опухшую, зудящую или поврежденную кожу. Не вводите холодный инсулин, потому что это может быть болезненно. Контейнер с инсулином, который вы сейчас используете, можно хранить при комнатной температуре.Этот продукт нельзя смешивать с любым другим инсулином. Не меняйте марки или типы инсулина без указаний врача. Не используйте ручку-ручку совместно с другим человеком, даже если меняли иглу. Вы можете заразить других людей серьезной инфекцией или заразиться от них. Узнайте, как безопасно хранить и выбрасывать медицинские принадлежности. Дозировка зависит от вашего состояния здоровья и реакции на лечение. Очень тщательно измеряйте каждую дозу, потому что даже небольшие изменения количества инсулина могут сильно повлиять на уровень сахара в крови.Регулярно проверяйте уровень сахара в крови в соответствии с указаниями врача. Следите за своими результатами и поделитесь ими со своим врачом. Это очень важно для определения правильной дозы инсулина. Используйте это лекарство регулярно, чтобы получить от него максимальную пользу. Чтобы помочь вам запомнить, используйте его в одно и то же время каждый день. Сообщите своему врачу, если ваше состояние не улучшится или ухудшится (уровень сахара в крови слишком высок или слишком низок).

ПОБОЧНЫЕ ДЕЙСТВИЯ: Возможны реакции в месте инъекции (такие как боль, покраснение, раздражение) или увеличение веса.Если какой-либо из этих эффектов сохраняется или ухудшается, немедленно сообщите об этом своему врачу или фармацевту. Помните, что ваш врач прописал это лекарство, потому что он или она посчитали, что польза для вас больше, чем риск побочных эффектов. Многие люди, принимающие это лекарство, не имеют серьезных побочных эффектов. Немедленно сообщите своему врачу, если у вас есть какие-либо серьезные побочные эффекты, в том числе: признаки низкого уровня калия в крови (такие как мышечные спазмы, слабость, нерегулярное сердцебиение). вызывают низкий уровень сахара в крови (гипогликемию).Это может произойти, если вы не потребляете достаточно калорий из пищи или если вы делаете необычно тяжелые упражнения. Симптомы низкого уровня сахара в крови включают внезапное потоотделение, дрожь, учащенное сердцебиение, голод, помутнение зрения, головокружение или покалывание в руках / ногах. Это хорошая привычка носить с собой таблетки или гель глюкозы для лечения низкого уровня сахара в крови. Если у вас нет этих надежных форм глюкозы, быстро поднимите уровень сахара в крови, употребляя быстрый источник сахара, такой как столовый сахар, мед или конфеты, или пейте фруктовый сок или не диетические газированные напитки.Немедленно сообщите врачу о реакции и использовании этого продукта. Чтобы предотвратить низкий уровень сахара в крови, ешьте регулярно и не пропускайте приемы пищи. Посоветуйтесь со своим врачом или фармацевтом, чтобы узнать, что вам делать, если вы пропустите прием пищи. Симптомы высокого уровня сахара в крови (гипергликемия) включают жажду, учащенное мочеиспускание, спутанность сознания, сонливость, приливы, учащенное дыхание и запах фруктового дыхания. Если возникают эти симптомы, немедленно сообщите об этом своему врачу. Возможно, вам потребуется увеличить дозировку. Очень серьезные аллергические реакции на этот препарат возникают редко.Однако немедленно обратитесь за медицинской помощью, если вы заметили какие-либо симптомы серьезной аллергической реакции, в том числе: сыпь, зуд / отек (особенно лица / языка / горла), сильное головокружение, затрудненное дыхание. Это не полный список возможных побочные эффекты. Если вы заметили другие эффекты, не перечисленные выше, обратитесь к врачу или фармацевту. В США — обратитесь к врачу за медицинской консультацией по поводу побочных эффектов. Вы можете сообщить о побочных эффектах в FDA по телефону 1-800-FDA-1088 или на сайте www.fda.gov/medwatch. В Канаде — позвоните своему врачу для получения медицинской консультации о побочных эффектах.Вы можете сообщить о побочных эффектах в Министерство здравоохранения Канады по телефону 1-866-234-2345.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Перед использованием комбинации изофан / обычный инсулин, сообщите своему врачу или фармацевту, если у вас аллергия на него; или к другим типам инсулинов; или если у вас есть другие аллергии. Этот продукт может содержать неактивные ингредиенты, которые могут вызвать аллергические реакции или другие проблемы. Поговорите со своим фармацевтом для получения более подробной информации. Не используйте это лекарство при низком уровне сахара в крови (гипогликемия). Перед использованием этого лекарства сообщите своему врачу или фармацевту о своей истории болезни, особенно о: проблемах надпочечников / гипофиза, заболеваниях почек, печени. болезни, проблемы с щитовидной железой.Вы можете испытывать нечеткость зрения, головокружение или сонливость из-за очень низкого или высокого уровня сахара в крови. Не садитесь за руль, не используйте механизмы и не занимайтесь какой-либо деятельностью, требующей бдительности или ясного зрения, пока вы не будете уверены, что можете выполнять такие действия безопасно. Ограничьте употребление алкоголя при использовании этого лекарства, потому что это может увеличить риск развития низкого уровня сахара в крови. Это может быть труднее чтобы контролировать уровень сахара в крови, когда ваше тело находится в состоянии стресса (например, из-за лихорадки, инфекции, травмы или операции). Проконсультируйтесь с врачом, потому что это может потребовать изменения вашего плана лечения, лекарств или анализа уровня сахара в крови.Перед операцией расскажите своему врачу или стоматологу обо всех продуктах, которые вы используете (включая лекарства, отпускаемые по рецепту, лекарства, отпускаемые без рецепта, и растительные продукты). Проверяйте уровень сахара в крови до и после тренировки. Вам может потребоваться перекус перед тренировкой. Если вы путешествуете по часовым поясам, спросите своего врача, как изменить график приема инсулина. Возьмите с собой дополнительный инсулин и вспомогательные вещества. Пожилые люди могут быть более чувствительны к побочным эффектам этого препарата, особенно к низкому уровню сахара в крови. Дети могут быть более чувствительны к побочным эффектам этого препарата, особенно к низкому уровню сахара в крови.Немедленно сообщите своему врачу, если вы беременны. Беременность может вызвать или усугубить диабет. Обсудите с врачом план регулирования уровня сахара в крови во время беременности. Ваш врач может изменить ваше лечение диабета во время беременности (например, диету и лекарства, включая инсулин). Это лекарство проникает в грудное молоко, но вряд ли нанесет вред грудному ребенку. Перед кормлением грудью проконсультируйтесь с врачом. Ваши потребности в инсулине могут измениться во время кормления грудью.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ: Взаимодействие с лекарствами может изменить то, как действуют ваши лекарства, или повысить риск серьезных побочных эффектов.Этот документ не содержит всех возможных лекарственных взаимодействий. Составьте список всех продуктов, которые вы используете (включая рецептурные / безрецептурные препараты и растительные продукты), и поделитесь им со своим врачом и фармацевтом. Не начинайте, не прекращайте и не изменяйте дозировку каких-либо лекарств без одобрения врача. Некоторые продукты, которые могут взаимодействовать с этим лекарством, включают: репаглинид, розиглитазон. Бета-адреноблокаторы (такие как метопролол, пропранолол, глазные капли от глаукомы, такие как тимолол) может предотвратить учащенное / учащенное сердцебиение, которое вы обычно ощущаете при слишком низком уровне сахара в крови (гипогликемия).Эти препараты не влияют на другие симптомы низкого уровня сахара в крови, такие как головокружение, голод или потоотделение. Многие препараты могут влиять на уровень сахара в крови, что затрудняет контроль уровня сахара в крови. Прежде чем начинать, прекращать или менять какое-либо лекарство, поговорите со своим врачом или фармацевтом о том, как лекарство может повлиять на уровень сахара в крови. Регулярно проверяйте уровень сахара в крови в соответствии с указаниями врача. Расскажите своему врачу о результатах и о любых симптомах высокого или низкого уровня сахара в крови. (См. Также раздел «Побочные эффекты».) Вашему врачу может потребоваться скорректировать прием лекарств от диабета, программу упражнений или диету.

ПЕРЕДОЗИРОВКА: Если у кого-то произошла передозировка и наблюдаются серьезные симптомы, такие как обморок или затрудненное дыхание, позвоните в службу 911. В противном случае немедленно позвоните в токсикологический центр. Жители США могут позвонить в местный токсикологический центр по телефону 1-800-222-1222. Жители Канады могут позвонить в провинциальный токсикологический центр. Симптомы передозировки могут включать: признаки низкого уровня сахара в крови, такие как потливость, дрожь, потеря сознания, учащенное сердцебиение.

ПРИМЕЧАНИЯ: Не передавайте это лекарство, иглы или шприцы другим лицам. Примите участие в образовательной программе по диабету, чтобы узнать больше о том, как управлять диабетом с помощью лекарств, диеты, физических упражнений и регулярных медицинских осмотров. уровень сахара в крови и как лечить низкий уровень сахара в крови. Регулярно проверяйте уровень сахара в крови в соответствии с указаниями и сообщайте о результатах своему врачу. Лабораторные и / или медицинские тесты (например, функциональные тесты печени и почек, уровень глюкозы в крови натощак, гемоглобин A1c, общий анализ крови) должны проводиться во время приема этого лекарства. .Соблюдайте все медицинские и лабораторные приемы. Держите под рукой дополнительные запасы инсулина, шприцев и игл.

ПРОПУЩЕННАЯ ДОЗА: Очень важно точно соблюдать режим приема инсулина. Заранее спросите своего врача, что вам следует делать, если вы пропустите дозу инсулина.

ХРАНЕНИЕ: У разных марок этого лекарства разные потребности в хранении. Проверьте упаковку продукта, чтобы узнать, как хранить вашу торговую марку, или спросите своего фармацевта. Защищайте инсулин от света и тепла. Не хранить в ванной.Не замораживайте и не используйте замороженный инсулин. Выбросьте все инсулиновые продукты по истечении срока годности, указанного на упаковке, или по истечении указанного количества дней после того, как она была открыта или хранилась при комнатной температуре, в зависимости от того, какая дата наступит раньше. Храните все лекарства в недоступном для детей и домашних животных. Не смывайте лекарства в унитаз и не выливайте их в канализацию, если это не предписано. Правильно утилизируйте этот продукт, когда срок его годности истек или он больше не нужен. Проконсультируйтесь с фармацевтом или в местной компании по утилизации отходов.

МЕДИЦИНСКОЕ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Ваше состояние может вызвать осложнения в случае неотложной медицинской помощи. Для получения информации о регистрации в MedicAlert звоните по телефону 1-888-633-4298 (США) или 1-800-668-1507 (Канада).

ВАЖНАЯ ИНФОРМАЦИЯ: КАК ИСПОЛЬЗОВАТЬ ДАННУЮ ИНФОРМАЦИЮ: Это сводка, в которой НЕ содержится всей возможной информации об этом продукте. Эта информация не гарантирует, что этот продукт безопасен, эффективен или подходит для вас.Эта информация не является индивидуальным медицинским советом и не заменяет совет вашего лечащего врача. Всегда спрашивайте у своего лечащего врача полную информацию об этом продукте и ваших конкретных медицинских потребностях.

Воздействие вулканического пепла на человека и окружающую среду

Крупные частицы вулканического пепла выглядят и ощущаются как песчинки, а очень мелкие частицы — это порошок. Частицы иногда называют тефрой, что на самом деле относится ко всему твердому материалу, извергаемому вулканами.Пепел — продукт взрывных извержений вулканов. Когда газы внутри магматической камеры вулкана расширяются, они резко выталкивают расплавленную породу (магму) вверх и из вулкана.

Сила этих взрывов разрушает и подбрасывает жидкую породу в воздух. В воздухе магма охлаждается и превращается в осколки вулканической породы и стекла. Извержения также могут разрушить твердую породу магматического очага и саму вулканическую гору. Эти фрагменты горных пород могут смешиваться с застывшими фрагментами лавы в воздухе и образовывать облако пепла.

Ветер может переносить мелкие частицы вулканического пепла на большие расстояния. Пепел был обнаружен за тысячи километров от места извержения. Чем меньше размер частицы, тем дальше ее унесет ветер. В результате извержения вулкана Чайтен в Чили в 2008 году образовалось облако пепла, которое пролетело 1000 километров (620 миль) через Патагонию до Аргентины, достигнув как Атлантического, так и Тихоокеанского побережья.

Отложения вулканического пепла, как правило, толще и имеют более крупные частицы ближе к месту извержения.По мере удаления от вулкана отложения имеют тенденцию истончаться. Двойное извержение вулкана Вулкан и Тавурвур в Папуа-Новой Гвинее в 1994 году покрыло близлежащий город Рабаул слоем пепла глубиной 75 сантиметров (около 2 футов), в то время как области, расположенные ближе к вулканам, были погребены на глубине 150-213 сантиметров (5-7 футов). ) ясеня.

Помимо выброса вулканического пепла в атмосферу, взрывное извержение может вызвать лавину пепла, вулканических газов и горных пород, называемую пирокластическим потоком.От этих невероятно быстрых лавин вулканического мусора невозможно убежать от людей. Пирокластические потоки способны разрушать здания и выкорчевывать деревья.

Воздействие вулканического пепла

Шлейфы вулканического пепла могут распространяться по большим участкам неба, превращая дневной свет в полную темноту и резко снижая видимость.

Эти огромные и грозные облака часто сопровождаются громом и молнией.Вулканические молнии — уникальное явление, и ученые продолжают спорить о том, как они работают. Многие ученые думают, что чистая энергия вулканического взрыва заряжает частицы пепла электричеством. Положительно заряженные частицы встречаются с отрицательно заряженными частицами либо в более прохладной атмосфере, либо в самом вулканическом мусоре. Затем молнии возникают как средство уравновешивания этого распределения заряда.

В крайних случаях эти «вулканические зимы» могут повлиять на погодные условия по всему миру.Извержение горы Тамбора в Индонезии в 1815 году, крупнейшее извержение в истории человечества, выбросило в воздух около 150 кубических километров (36 кубических миль) обломков. Средняя глобальная температура снизилась на целых 3 ° по Цельсию (5,4 ° по Фаренгейту), что привело к экстремальным погодным условиям во всем мире на три года. В результате вулканического пепла на горе Тамбора в Северной Америке и Европе в 1816 году был отмечен «Год без лета». Этот год характеризовался повсеместным неурожаем, смертельным голодом и болезнями.

Вулканический пепел, переносимый по воздуху, особенно опасен для движущихся самолетов. Мелкие абразивные частицы камня и стекла могут плавиться внутри двигателя самолета и затвердевать на лопастях турбины, вызывая остановку двигателя. При наличии вулканического пепла авиадиспетчеры принимают особые меры предосторожности. В результате извержения вулкана Эйяфьятлайокудль в Исландии в 2010 году образовалось облако пепла, которое вызвало отмену примерно 100 000 рейсов и затронуло 7 миллионов пассажиров, что обошлось авиационной отрасли примерно в 2 доллара.6 миллиардов.

При смешивании с осадками вулканический пепел превращается в тяжелый цементоподобный осадок, способный обрушить крыши. В 1991 году на Филиппинах произошло извержение горы Пинатубо, в то же время, когда сильный тропический шторм нанес ущерб в этом районе. Сильные дожди смешались с пеплопадом, обрушив крыши домов, школ, предприятий и больниц в трех разных провинциях.

Ясень также представляет угрозу для экосистем, включая людей и животных.Углекислый газ и фтор, газы, которые могут быть токсичными для человека, могут накапливаться в вулканическом пепле. В результате выпадение пепла может привести к неурожаю, гибели и уродству животных, а также к болезням человека. Абразивные частицы золы могут царапать поверхность кожи и глаз, вызывая дискомфорт и воспаление.

При вдыхании вулканический пепел может вызвать проблемы с дыханием и повредить легкие. Вдыхание большого количества пепла и вулканических газов может вызвать удушье. Удушье — самая частая причина смерти от вулкана.

Очистка от вулканического пепла

Вулканический пепел очень трудно очистить. Его крошечные частицы размером с пыль могут проникать практически во все — от автомобильных двигателей до вентиляционных отверстий офисных зданий и персональных компьютеров. Он может серьезно разрушить все, с чем соприкасается, часто вызывая отказ оборудования.

После высыхания пепел может быть унесен ветром, распространяясь и загрязняя ранее незатронутые участки. Между тем влажный пепел связывается с поверхностями, как цемент, и его удаление часто означает удаление того, что находится под ним.

Очистка от вулканического пепла — дорогостоящая и трудоемкая процедура. Сообщества должны прилагать скоординированные усилия по утилизации золы, обеспечивая при этом безопасность своих жителей. Извержение вулкана Сент-Хеленс в 1980 году покрыло город Якима, штат Вашингтон, тоннами вулканического пепла. Объявив чрезвычайное положение, Якима получила в дар оборудование для обслуживания и рабочих, которые затем были отправлены по всему городу по сетке. Граждане также помогли очистить квартал за кварталом.Компания Yakima удалила 544 000 метрических тонн золы и выбросила ее на свалки и местные ярмарки. Город даже засыпал пустырь, чтобы создать новый городской парк. Процесс занял семь круглосуточных дней и обошелся городу в 5,4 миллиона долларов, что часто называют эффективным и рентабельным примером очистки от золы.

Такие организации, как Международная сеть опасностей для здоровья, связанная с вулканизмом, Программа по опасностям вулканов Геологической службы США и Комиссия по городам и вулканам, создают и распространяют среди населения информацию о подготовке и ликвидации последствий падения вулканического пепла.