Противовирусные гранулы: Противовирусные препараты — купить лекарство от простуды в Москве, цены от 0,4 рублей в наличии в аптеке

Множественные маркеры SG частично колокализуются в гранулах, и гранулы содержат поли (A) РНК. (A) Клетки U2OS (i и ii) или HeLa (iii) были инфицированы мутантным вирусом Δ E3L при MOI 5. Клетки фиксировали при 7 hpi и окрашивали антителами к компонентам SG / гранулы TIA-1 ( i, зеленый) и G3BP (i, красный) или eIF3b (ii, зеленый) и G3BP (ii, красный) и с DAPI для окрашивания ДНК. (B) Клетки U2OS были инфицированы мутантом Δ E3L (с i по iv и vi) или WT (vii и viii) VV с MOI 5 или ложно инфицированными (v).При 7 hpi клетки фиксировали и обрабатывали для FISH с использованием меченного флуоресцеином олиго (dT) зонда для локализации мРНК. В качестве контроля образец, инфицированный мутантным вирусом Δ E3L , инкубировали без зонда (vi). Показаны прогнозы максимальной интенсивности. Области в рамке показывают увеличенные области

Поскольку известно, что как G3BP, так и TIA-1 взаимодействуют с мРНК, чтобы управлять образованием SG, мы окрашивали инфицированные клетки U2OS с использованием флуоресцентно меченного олиго (dT) РНК-зонда (рис. 4B), чтобы определить, содержат ли AVG мРНК.Поли (A) -содержащая РНК накапливалась по схеме, напоминающей структуру AVG в клетках, инфицированных мутантным вирусом Δ E3L , проявляя гранулярное распределение по периферии фабрики, а иногда и в ее центре. Зонд олиго (dT) совместно локализован с G3BP-положительными AVG в клетках, инфицированных мутантным вирусом Δ E3L (данные не показаны). В клетках, инфицированных WT VV, окрашивание олиго (dT) было обнаружено в центре VF в распределении, аналогичном показанному ранее (19). Однако зонда вокруг фабрик не обнаружено (рис. 4B, часть ii). Следовательно, инфицирование клеток U2OS и HeLa мутантным VV Δ E3L индуцирует образование цитоплазматических, трансляционно-неактивных AVG. Эти AVG содержат поли (A) РНК, SG-ассоциированные клеточные белки и их известных партнеров по связыванию, и они образуются вокруг (а иногда и внутри) фабрик репликации вирусов.

Δ E3L мутантные VV-индуцированные AVG не являются стрессовыми гранулами, потому что AVG регулярно окрашиваются положительно на несколько SG-ассоциированных белков (TIA-1, G3BP), но, по-видимому, содержат меньше других SG-ассоциированных белков (например.g., eIF3), мы спросили, являются ли гранулы уникально локализованным типом SG или они представляют собой отдельную структуру, однозначно запускаемую во время инфекции Δ E3L мутантной VV. Для этого клетки HeLa или U2OS инфицировали мутантным VV Δ E3L с MOI 1 и обрабатывали в течение 2 часов, начиная с 5 hpi, NA (химическое вещество, которое, как известно, останавливает трансляцию и запускает образование SG посредством окислительного стресса) для определения были ли AVG перераспределены по цитоплазме. В Δ E3L мутантных VV-инфицированных клетках G3BP был обнаружен в AVG, окружающих VF, а не где-либо еще в цитоплазме после обработки NA (рис.5 А). В неинфицированных клетках, обнаруженных в том же поле зрения, SG-подобные структуры (разбросанные по цитоплазме) были очевидны (то есть те, у которых отсутствуют фабрики). Таким образом, AVG отличались от SG по своей локализации, оставаясь тесно связанными с VF даже во время лечения NA.

Образование гранул, по-видимому, ингибирует дальнейшее образование SG, и гранулы стабильны после обработки CHX. Клетки U2OS инфицировали мутантным вирусом Δ E3L при MOI 1 (A, C) или ложно инфицировали (B).Некоторые образцы обрабатывали 0,1 мМ NA при 5 hpi и фиксировали при 7 hpi (A). Дополнительные образцы обрабатывали 0,1 мМ NA при 5 hpi в течение 1 часа, а затем обрабатывали 100 мкг / мл CHX в течение 1 часа и фиксировали при 7 hpi (B, C). После фиксации клетки окрашивали на G3BP (красный) и DAPI (синий) для окрашивания ДНК. Показаны прогнозы максимальной интенсивности.

Этот результат подсказал нам, что AVG могут быть очень стабильными структурами. Известно, что SG разрушаются обработкой CHX (22), который останавливает трансляцию, «замораживая» рибосомы на молекулах мРНК, предотвращая удлинение трансляции и отток рибосом.Это приводит к демонтажу ячеистых SG, поскольку SG являются динамическими структурами; без источника новых комплексов инициации трансляции SGs рассеиваются (3). Мок-инфицированные клетки, обработанные CHX, показали полное растворение индуцированных арсенитом SG (фиг. 5B). В клетках, инфицированных мутантным вирусом Δ E3L и обработанных CHX при 6 hpi в течение 1 ч, частота AVG не уменьшалась и оставалась ассоциированной с вирусными репликационными фабриками в клетках, инфицированных Δ E3L мутантным VV (фиг. 5C).Сохранение AVG после обработки, которая растворяет SG, указывает на то, что AVG составляют отдельную клеточную структуру, которая более стабильна, чем канонический SG.

Репликация мутантных VV WT и Δ E3L в (A) PKR KO и (B) eIF2α ^S51A MEF и согласованных контролях WT (A и B, части i). Клетки инфицировали мутантными вирусами WT или Δ E3L при MOI 0,01 в трех повторностях. Образцы собирали через 2, 24, 48 и 72 hpi, и титры вирусов измеряли с помощью анализа бляшек на клетках BHK (Δ E3L мутантный вирус) или Vero (WR).Планки погрешностей показывают 1 стандартное отклонение. (A и B, части ii) Клетки инфицировали мутантом Δ E3L или вирусом WR при MOI 5 или ложно инфицировали. При 6 hpi клетки собирали для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Блоты зондировали антителами к фосфорилированному eIF2α. Перекрестно-реактивный полипептид связывается антителом в инфицированных образцах, но его легко отличить от eIF2α (*). Значения слева — это размеры молекул в килодальтонах. (A и B, части iii) Клетки инфицировали мутантным вирусом Δ E3L при MOI 5 и фиксировали при 6 hpi для окрашивания антителами к G3BP и DAPI для окрашивания ДНК.(A и B, части iv) Клетки инфицировали и окрашивали, как описано выше. Было подсчитано количество фабрик, содержащих гранулы, и выражено в процентах от общего количества фабрик. Планки погрешностей показывают 1 стандартное отклонение.

Мы окрашивали G3BP в MEF PKR WT и KO и рассчитывали частоту образования AVG. Для сравнения были включены данные параллельных экспериментов с использованием клеток U2OS (фиг. 6A и B, часть iv). В MEF PKR WT инфекция мутантного вируса Δ E3L вызвала устойчивое образование AVG, как было определено с использованием G3BP в качестве маркера, при этом AVG представлены примерно в 97% VF (рис.6A, части iii [внизу] и iv). Однако в PKR KO MEF образование AVG было снижено по частоте на ~ 40% и качественно выглядело меньше и менее отчетливо (рис. 6A, части iii и iv).

Затем мы спросили, требуется ли фосфорилирование eIF2α для образования AVG. MEF WT (SS) и eIF2α ^S51A (AA) инфицировали мутантным вирусом WT или Δ E3L . При 72 hpi продукция мутантных вирионов Δ E3L увеличивалась более чем в 180 раз в клетках AA по сравнению с аналогичными MEF дикого типа (рис.6Б, часть i). Присутствие нефосфорилируемого eIF2α не влияло на репликацию WT VV. Как и ожидалось, вестерн-блоттинг показал, что инфицирование мутантным вирусом Δ E3L стимулировало фосфорилирование eIF2α в MEF дикого типа, но не в клетках с нокаутом AA (фиг. 6B, часть ii). В MEF, содержащих WT eIF2α, образование гранул было нормальным, но в MEF, лишенных фосфорилируемой формы eIF2α, образование AVG было полностью отменено. Таким образом, фосфорилирование eIF2α имеет решающее значение для снижения репликации VV, лишенного гена E3L , и для образования AVG.Интересно, что клетки PKR KO не спасают вирус так же, как клетки AA, что позволяет предположить, что PKR — не единственная киназа eIF2α, активируемая во время инфекции VV.

Репликация мутантного вируса Δ E3L повышена в MEF, в которых отсутствует ген TIA — 1 , несмотря на повышенные уровни фосфорилирования eIF2α и образование AVG. Основываясь на обнаруженной нами корреляции между уровнями фосфорилирования eIF2α и частотой AVG, мы Затем проверили, ингибируют ли AVG активно репликацию вируса после фосфорилирования eIF2α.Поэтому мы спросили, может ли TIA-1 (компонент AVG) быть важным для противовирусной активности AVG во время репликации мутантного вируса Δ E3L . Сначала мы определили, проявляют ли MEF, лишенные TIA-1, измененное фосфорилирование eIF2α после инфицирования мутантным VV Δ E3L (фиг. 7 A). Вестерн-блоттинг показал, что инфекция мутантного вируса Δ E3L вызвала сопоставимое увеличение eIF2αP в обоих TIA-1 — / — и + / + MEF по сравнению с уровнем в вирусе WT (рис. 7A, Δ мутант E3L вирус на дорожках 2 и 4 и WT на дорожках 3 и 5).

Репликация WT и Δ E3L мутантных VV в клетках TIA-1 KO и MEF WT. (A) Клетки инфицировали мутантом Δ E3L или WT VV при MOI 5 и собирали при 6 hpi для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Блоты зондировали антителами к фосфорилированному eIF2α. Перекрестно-реактивный полипептид был связан с антителом в инфицированных образцах (*). Значения слева — это размеры молекул в килодальтонах. (B) Клетки инфицировали мутантным вирусом Δ E3L при MOI 5 и фиксировали при 6 hpi для окрашивания антителами к G3BP и DAPI.Стрелки указывают на фабрики вирусов. (C) Фабрики, содержащие гранулы, были подсчитаны и выражены в процентах от общего количества фабрик. (D) Клетки инфицировали мутантным вирусом Δ E3L , экспрессирующим Венеру под контролем последнего промотора F17R при MOI 5. При 7 hpi образцы собирали для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга и зондировали антителами к GFP (для обнаружения Венеры, верхние панели) и бета-актин в качестве контроля загрузки (нижние панели). (E) Клетки инфицировали мутантным вирусом Δ E3L при MOI 0.01 в трех экземплярах. Образцы собирали через 2, 24, 48 и 72 hpi, и титры вирусов измеряли с помощью анализа бляшек на клетках BHK (Δ E3L мутантный вирус) или Vero (вирус WR). Планки погрешностей показывают 1 стандартное отклонение. (F) Клетки инфицировали мутантным вирусом Δ E3L при MOI 5 в трех повторностях. Образцы собирали через 2 и 24 часа на дюйм, и титры вирусов измеряли с помощью анализа бляшек на клетках BHK. Планки погрешностей показывают 1 стандартное отклонение.

Затем мы количественно оценили образование AVG в TIA-1 ^{— / —} и TIA-1 + / + MEF, инфицированных мутантом Δ E3L или вирусом WT, с использованием G3BP для обнаружения AVG и DAPI для окрашивания вирусных репликационных фабрик.Не было обнаружено качественных или количественных различий в AVG между TIA-1 ^{— / —} и TIA-1 ^{+ / +} MEF (рис. 7B), что согласуется с высокими уровнями фосфорилирования eIF2α, наблюдаемыми в обоих типах клеток, что приводит к AVG. формирование. Однако следует отметить, что морфология мутантного VF Δ E3L в клетках TIA-1 ^{— / —} была более похожа на фабрики, сформированные в инфицированных вирусом WT клетках, что позволяет предположить, что рост вируса восстанавливается.

Мы исследовали возможность того, что MEF TIA-1 KO были более пермиссивными для репликации мутантного вируса Δ E3L .Первоначально мы использовали мутантный вирус Δ E3L , который экспрессировал флуоресцентный белок Венеры поздно во время инфекции VV (с использованием промотора F17R ). В MEF дикого типа Вестерн-блоттинг для выявления экспрессии Венеры показал, что накопилось очень мало белка (фиг. 7D, дорожка 2), но в TIA-1 — / — MEF экспрессия была значительно увеличена (дорожка 4), что соответствует удалению этого белка. приводя к восстановлению репликации ДНК и поздней экспрессии генов. На кривой многоциклового роста (рис.7E), титр мутантного вируса Δ E3L был увеличен в 25 раз в TIA-1 — / — MEF по сравнению с титром в TIA-1 WT MEF при 72 hpi. На 24 и 48 hpi титры мутантного вируса Δ E3L увеличивались в 7 и 4 раза соответственно по сравнению с титрами, наблюдаемыми во время репликации в TIA-1 + / + MEF. Чтобы подтвердить этот фенотип, мы также провели эксперименты с одноцикловой кривой роста с этими клетками, чтобы определить, наблюдалось ли улучшение роста вируса в течение более короткого периода инфицирования (рис.7F). Эти анализы показали аналогичное увеличение репликации Δ E3L мутанта VV. Это подтвердило, что в отсутствие TIA-1 мутантный вирус Δ E3L уклоняется от нормального блока репликации вируса, связанного с фосфорилированием активации PKR и фосфорилирования eIF2α.

ОБСУЖДЕНИЕ

Здесь мы показываем, что клетки реагируют на непродуктивную инфекцию VV путем сборки цитоплазматических гранул, которые окружают фабрики репликации вируса. Эти гранулы требуют фосфорилирования eIF2α и, по-видимому, важны для подавления репликации вируса.Эти AVG схожи с SG по содержанию белка, но устойчивы к разборке под действием CHX, в отличие от SG (1, 23). Поэтому AVG выглядят более статичными и менее динамичными, чем SG. Это говорит о том, что AVG не несут ответственности за удержание мРНК в «приостановленном» состоянии для последующего высвобождения (как SG), но их функция заключается исключительно в блокировании репликации VV.

AVG, по-видимому, отличаются от других скоплений белков-хозяев, которые образуются на фабриках репликации VV или на них. Было высказано предположение, что локальная трансляция вирусной мРНК происходит внутри VF, что было элегантно продемонстрировано на клетках, инфицированных вирусами, экспрессирующими голубой флуоресцентный белок (CFP) или вирусные белки, меченные YFP ​​(19). Сходные отчеты описывают локализованное рекрутирование аппарата инициации трансляции хозяина (eIF4E, eIF4G, но не PABP) в специфические субрегионы внутри VFs (19, 47). Это рекрутирование факторов трансляции клетки-хозяина в VF было приписано успешному захвату вирусами трансляционного аппарата хозяина. AVG, которые мы определяем в этих исследованиях, демонстрируют явные отличия от внутренних структур VF, описанных ранее. (i) AVG формируются в основном вне VF (хотя были некоторые случаи, когда эти гранулы формировались внутри VF).(ii) AVG содержат TIA-1, который был исключен из внутренних очагов VF (47). (iii) AVG появляются раньше, чем описанные ранее очаги. (iv) Сборка AVG абсолютно требует фосфорилирования eIF2α, которое в значительной степени подавлено в WT VV-инфицированных клетках. (v) Наиболее важно то, что AVG, по-видимому, обладают противовирусной природой, в то время как внутренние гранулы, как предполагается, выполняют провирусную функцию. AVG более многочисленны во время инфицирования мутантным вирусом Δ E3L , чем во время инфицирования WT (AVG окружают фабрики в 73–100% клеток, инфицированных мутантным VV Δ E3L , тогда как только 3–12% инфицированных WT клеток обнаруживают аналогичные конструкции). Если бы активная транскрипция или трансляция были связаны с AVG, мы могли бы ожидать увидеть больше AVG во время успешного инфицирования WT VV, чем во время ограниченного репликацией инфекции мутантного вируса Δ E3L . Более того, потребность в повышенном фосфорилировании eIF2α для образования AVG сильно свидетельствует против того, чтобы они были нормальной частью цикла репликации VV.

Требования к образованию AVG. Требование фосфорилирования eIF2α для запуска образования AVGs предлагает модель для их сборки.Мы предполагаем, что блокада E3L восприятия дцРНК при инфекции WT VV делает возможным образование больших VF, которые не ограничиваются AVG в большинстве клеток (рис. 8, верхняя панель). При инфекциях с VV, лишенным белка E3L (нижняя панель), дцРНК доступна для активации PKR, что увеличивает фосфорилирование eIF2α и приводит к образованию AVG. Предсказание этой модели состоит в том, что другие мутанты VV, которые индуцируют фосфорилирование eIF2α, также должны индуцировать образование AVG (6, 29). Неясно, действительно ли eIF2α является компонентом AVG, поскольку окрашивание IF не показало окончательно накопление этого белка вокруг мутантных VF Δ E3L , возможно, из-за перекрестной реактивности антител с неизвестным вирусным белком.Скорее, мы предполагаем, что фосфорилирование eIF2α может остановить вирусную трансляцию в достаточной степени, чтобы позволить белкам, обнаруживаемым в AVG (РНК-связывающие белки, такие как TIA-1, G3BP, FMRP и FXR1), образовывать зародышевую структуру на вирусной РНК, что приводит к AVG. формирование. Хотя эта гипотеза является спекулятивной, она согласуется с известными свойствами подавления трансляции TIA-1, FXR1 и FMRP, подобных клеткам сборок AVGS, которые формируются вокруг VF, и их корреляции с ингибированием репликации VV.

Модель роли AVG в противовирусном ответе на VV. Инфекция вирусом WT (вверху) продуцирует дцРНК, которая связывается с E3L, предотвращая активацию PKR и приводя к продуктивной инфекции, поскольку фосфорилирование eIF2α и образование AVG подавляются E3L. Заражение мутантным вирусом Δ E3L (внизу) приводит к активации PKR, что приводит к фосфорилированию eIF2α и отсроченной инициации трансляции. Связанные с фабрикой вирусные мРНК связываются трансляционным сайленсером TIA-1, который ограничивает репликацию вируса.Формируются многочисленные AVG, содержащие мРНК, G3BP, TIA-1 и связанные с ними белки.

Есть два возможных механизма работы AVG. Одна из возможностей заключается в том, что AVG секвестрируют факторы хозяина, необходимые для репликации, вдали от центра репликации вируса. Наше открытие, что G3BP и каприн-1 сконцентрированы в AVG, представляет особый интерес в этом контексте, поскольку G3BP и каприн-1 были предложены для облегчения транскрипции промежуточных генов VV и необходимы для промежуточной вирусной транскрипции in vitro (20 ).G3BP и каприн-1 были обнаружены внутри VF WT на промежуточной стадии инфекции VV (19). Этот набор был расценен как часть успешного заражения. Хотя мы практически не наблюдали накопления G3BP или каприна-1 в большинстве VF во время инфицирования вирусом WT, количественное накопление G3BP и каприна-1 в AVG, окружающих фабрики, образованных во время инфицирования мутантным VV Δ E3L , согласуется с интерпретацией что эти белки секвестрируются в AVG во время инфицирования мутантным вирусом Δ E3L , чтобы блокировать развитие репликации вируса на стадии промежуточной транскрипции.

Мы считаем важным, что и каприн-1, и USP10 присутствуют в AVG и являются взаимодействующими партнерами G3BP. Каприн-1, как известно, образует ядра SG при сверхэкспрессии и может регулировать G3BP-опосредованный транспорт РНК, тогда как деубиквитинирующая активность USP10 регулируется ассоциацией с G3BP (43, 44) и регулирует мембранный транспорт между ER и аппаратом Гольджи. Тот факт, что оба эти белка связаны с AVG, предполагает, что одна из функций AVG состоит в том, чтобы служить центром набора для множества различных типов сигналов.Роль сигнального центра согласуется с очевидной стабильностью AVG, что может позволить нескольким различным типам сигналов интегрироваться в окрестности центра репликации VV. Учитывая важность передачи сигналов дцРНК в стимуляции апоптоза при инфекции VV (25), также возможно, что компоненты апоптоза также присутствуют в AVG.

Вторая потенциальная функция AVG — это привлечение белков с прямой противовирусной активностью, таких как TIA-1, в область VF. Предыдущая работа указала на противовирусную роль TIA-1 в репликации вируса HSV-1 и Sindbis (28), предполагая, что противовирусный механизм TIA-1 не ограничивается поксвирусами.Однако TIA-1 также играет провирусную роль в репликации флавивирусов (28), поэтому его противовирусный эффект не универсален для всех вирусов. В нестрессированных клетках TIA-1 является преимущественно ядерным и опосредует альтернативный сплайсинг. Однако при инфицировании мутантным VV Δ E3L TIA-1 накапливается в цитоплазме и концентрируется поблизости от центра репликации. Потеря TIA-1 приводит к усилению репликации мутантного вируса Δ E3L (фиг. 7), демонстрируя его функциональную роль в ограничении инфекции.Это предполагает, что TIA-1 может напрямую ингибировать экспрессию вирусного гена, связывая вирусную мРНК и подавляя ее трансляцию. С другой стороны, рекрутирование TIA-1 в AVG и последующее истощение из ядра может изменить сплайсинг генов-мишеней TIA-1 и тем самым обеспечить более устойчивый противовирусный ответ. Необходима дальнейшая работа, чтобы различать эти возможности. Следует отметить, что MEF, лишенные TIAR, близкого родственника TIA-1, не спасают репликацию мутантного VV Δ E3L (данные не показаны).Поскольку TIA-1 и TIAR имеют разные мишени для мРНК, это может указывать на то, что TIA-1 специфически распознает вирусную мРНК, а TIAR — нет.

Наши данные, представленные на рис. 6, подтверждают предыдущие исследования, показывающие, что dsRNA-активированная киназа PKR важна для ограничения репликации мутантного вируса Δ E3L (8, 11, 12, 50, 51). Наши исследования также предполагают, что множественные киназы eIF2α могут вносить вклад в фосфорилирование eIF2α в клетках, инфицированных мутантным вирусом Δ E3L , который незначительно увеличивает фосфорилирование eIF2α даже при отсутствии PKR.В соответствии с идеей, что фосфорилирование eIF2α является критическим этапом в ограничении репликации мутантного вируса Δ E3L , инфицирование клеток eIF2α S51Α, неспособных фосфорилировать eIF2α (но способных активировать PKR) мутантным вирусом Δ E3L , приводило к большему спасение репликации мутантного вируса Δ E3L и более полный блок образования AVG. Неожиданно наши эксперименты показали, что фосфорилирование eIF2α не единственное событие, необходимое для репликации VV.Клетки TIA-1, инфицированные мутантным вирусом Δ E3L , поддерживали репликацию вируса, несмотря на увеличение фосфорилирования eIF2α. Репликация вирусов, продуцирующих кэпированные и поли (A) мРНК в присутствии фосфорилирования eIF2α, была отмечена ранее (7).

Эта диссоциация фосфорилирования eIF2α от репликации VV убедительно доказывает, что фосфорилирование eIF2α per se не ограничивает репликацию VV, но также необходима индукция AVG посредством этого фосфорилирования.Открытие того, что клетки, лишенные TIA-1, все еще образуют цитоплазматические гранулы, но что гранулы с дефицитом TIA-1 не блокируют репликацию вируса, согласуется с исследованиями вирусного разрушения SG. Например, полиовирус специфически расщепляет G3BP и индуцирует образование TIA-1-содержащих SG, которые не ингибируют репликацию вируса. Это говорит о том, что уклонение вируса от противовирусного действия цитоплазматических гранул может принимать форму блокирования их образования или удаления критических компонентов (9, 28, 32, 35).

Выяснение молекулярного механизма, с помощью которого TIA-1 ингибирует репликацию мутантного вируса Δ E3L , и полное исследование состава и функций этих новых цитоплазматических гранул являются целями будущих исследований. Настоящее исследование показывает, что TIA-1 играет ранее не охарактеризованную роль в ограничении репликации поксвируса. Предыдущая работа описывает роль TIA-1 и родственного белка TIAR в клеточном гомеостазе, росте и метаболизме клеточной РНК, влияя на сплайсинг, трансляцию и распад мРНК (38, 53).Предыдущие результаты предполагают, что TIA-1 подавляет репликацию вирусов HSV-1 и Sindbis, и были продемонстрированы взаимодействия между TIA-1 и вирусными РНК-транскриптами при инфицировании вирусом гепатита B и WNV (14, 45). Остается важный вопрос: ограничивает ли TIA-1 репликацию мутантного вируса Δ E3L посредством его взаимодействия с молекулами вирусной РНК во время инфекции и образуются ли аналогичные гранулы во время заражения этими другими вирусами.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Сару Джонстон (USAMRIID) за помощь в проведении экспериментов, Рэйчел Фирнс и сотрудников лаборатории Коннора за полезную критику рукописи, а также Саманту Стюарт, Сару Тисдейл и Джуди Йен за отличную техническую поддержку.

Работа поддержана грантами NIH R01 (AI 033600) и R01 (AR 051472), присужденными П.А. J.H.C. при частичной поддержке профессора Питера Пола по развитию карьеры.

Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовке рукописи.

• Авторские права © 2011, Американское общество микробиологии

Гранулы подавления трансляции и стресса в противовирусном иммунном ответе

Критическая роль антивирусной стресс-гранулы, содержащей RIG-I и PKR, в обнаружении вирусов и врожденном иммунитете

Abstract

Ретиновая кислота, индуцируемая геном I (RIG-I) -подобные рецепторы (RLR), действуют как цитоплазматические сенсоры вирусной РНК, чтобы инициировать противовирусные реакции, включая продукцию интерферона I типа (IFN). Было неясно, как RIG-I встречает и воспринимает вирусную РНК. Чтобы решить эту проблему, мы исследовали внутриклеточную локализацию RIG-I в ответ на вирусную инфекцию с использованием недавно созданных антител против RIG-I. Иммуногистохимический анализ показал, что RLR локализованы в вирус-индуцированных гранулах, содержащих маркеры стрессовых гранул (SG) вместе с вирусной РНК и противовирусными белками. Из-за сходства морфологии и компонентов мы назвали эти агрегаты антивирусными стрессовыми гранулами (avSG). Вирус гриппа A (IAV), дефицитный по неструктурному белку 1 (NS1), эффективно генерировал avSG, а также IFN, однако IAV, кодирующий NS1, производил мало.Ингибирование образования avSG путем удаления компонента SG или двухцепочечной РНК (dsRNA) -зависимой протеинкиназы (PKR) приводило к снижению продукции IFN и сопутствующему усилению репликации вируса. Кроме того, мы наблюдали, что трансфекция дцРНК приводит к продукции IFN зависимым от avSGs образом. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что avSG является локусом для восприятия несамостоятельной РНК, и что оркестровка множества белков имеет решающее значение для запуска противовирусных ответов.

Образец цитирования: Ономото К., Джоги М., Ю Дж-С, Нарита Р., Моримото С., Такемура А. и др. (2012) Критическая роль антивирусной стрессовой гранулы, содержащей RIG-I и PKR, в обнаружении вирусов и врожденном иммунитете. PLoS ONE 7 (8): e43031. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031

Редактор: Акио Канаи, Университет Кейо, Япония

Поступила: 11.04.2012; Принята к печати: 16 июля 2012 г .; Опубликовано: 13 августа 2012 г.

Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, надстраивать или иным образом использовать в любых законных целях.Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

Финансирование: Министерство образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии (инновационные области «Регулирование РНК» (№ 20112009), научные исследования «A» и начало исследовательской деятельности) (http: / /www. mext.go.jp/english/), Министерство здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии (http://www.mhlw.go.jp/english/index.html), Японское агентство науки и технологий PRESTO (http://www.jst.go.jp/kisoken/presto/index_e.html), Мемориальный фонд Уэхара (http://www.ueharazaidan.com/), Мемориальный фонд Мочида для медицинских и фармацевтических исследований (http://www.mochida.co.jp/zaidan/), Научный фонд Такаэда (http://www.takeda-sci.or.jp/index.html), Фонд Наито (http://www.naito-f.or.jp/) и Nippon Boehringer Ingelheim (http: // www .boehringer-ingelheim.co.jp / com / Home / index.jsp). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: У авторов есть следующие конкурирующие интересы: Это исследование частично финансировалось Nippon Boehringer Ingelheim. Нет патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые можно декларировать. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLoS ONE в отношении обмена данными и материалами, как подробно описано в руководстве для авторов.

Введение

Интерфероны I и III типов (IFN) — это цитокины с сильной противовирусной активностью [1], [2].При связывании IFN с их родственными рецепторными комплексами активируется внутриклеточный сигнал, что приводит к активации факторов транскрипции, фактора 3 гена, стимулированного IFN, гетеротримерного преобразователя сигнала и активатора транскрипции (STAT) 1, STAT2 и фактора регуляции IFN ( IRF) -9 и гомодимер STAT1. Эти факторы вызывают активацию сотен генов, стимулированных интерфероном (ISG). Некоторые продукты ISG действуют как противовирусные белки и участвуют в блокаде репликации вируса.Уровень двухцепочечной (ds) РНК-зависимой протеинкиназы (PKR) повышается при обработке IFN, однако для каталитической активности PKR требуется dsRNA. Когда IFN-обработанные клетки инфицированы вирусом, дцРНК, продуцируемая как побочный продукт репликации вируса, активирует PKR, а активированная PKR инактивирует фактор инициации трансляции эукариот (eIF) 2а путем фосфорилирования [3]. Другой противовирусный белок 2’– 5 ‘олигоаденилатсинтетаза (OAS) также индуцируется экспрессией IFN. Каталитическая активность OAS требует дцРНК, и вирусная инфекция активирует OAS с образованием 2’– 5 ‘A.Затем 2’– 5 ‘A активирует клеточную РНКазу L, и вирусная РНК разрушается [1]. Хотя модель «dsRNA-активируемого ингибирования» широко принята, обработанные IFN и инфицированные вирусом клетки не обязательно подвергаются самоубийству, поскольку обычные биоанализы IFN продемонстрировали индуцированное IFN выживание инфицированных клеток [4]. Чтобы объяснить эти явления, была выдвинута гипотеза, что вирусная транскрипция / трансляция происходит в определенном субклеточном компартменте, таким образом, блокирование трансляции и деградация РНК этими противовирусными белками мало влияет на метаболизм хозяина.Однако такой купе еще никто не демонстрировал.

IFN обычно не продуцируются в биологически значимых количествах. Большинство типов клеток млекопитающих способны продуцировать IFN при вирусной инфекции. Репликация вируса определяется цитоплазматическими сенсорами не собственной РНК; RIG-I, ген 5, связанный с дифференцировкой меланомы (MDA5), и лаборатория генетики и физиологии 2 (LGP2), которые в совокупности называются RLR, чтобы инициировать каскад событий, ведущих к активации факторов транскрипции, IRF-3 / — 7 и ядерный фактор-êB (NF-êB), затем активация генов IFN [5] — [9].Таким образом, основная функция системы IFN состоит в том, чтобы воспринимать чужеродную РНК и уничтожать вторгающуюся РНК, которая включает РНК, полученную в результате репликации ДНК-вирусов [10], [11]. Хотя генетические данные показывают, что RLR имеет решающее значение для обнаружения вирусной РНК в цитоплазме, его конкретное распределение неизвестно.

В этом отчете мы исследовали клеточную локализацию RIG-I в клетках, инфицированных вирусом гриппа А. Мы обнаружили, что вирусная инфекция или трансфекция вирусной РНК заставляет RIG-I образовывать гранулярные агрегаты, содержащие маркеры стрессовых гранул, которые мы называем антивирусными стрессовыми гранулами (avSG). Наш анализ показал, что avSG имеют решающее значение для передачи сигналов для активации гена IFN, предполагая, что avSG служит платформой для восприятия чужеродной РНК с помощью RLR. Более того, поскольку гранула также рекрутирует PKR, OAS и РНКазу L, настоятельно рекомендуется, чтобы это был компартмент, в котором некоторые противовирусные белки ингибируют репликацию вируса.

Результаты

Инфекция IAV с дефицитом NS1 приводит к образованию гранул, содержащих RIG-I

Мы создали антитело против RIG-I, которое специфически обнаруживает RIG-I с помощью иммуноокрашивания и иммуноблоттинга (Рисунок S1) (Материалы и методы) [12].Для наблюдения за распределением RIG-I в клетках клетки инфицировали двумя типами IAV, диким типом (WT) и ÄNS1, в котором отсутствует ген неструктурного белка 1 (NS1), мощного ингибитора продукции IFN [13]. . Репликация WT IAV была обнаружена через 3 часа после инфицирования как ядерное накопление вирусного нуклеокапсидного белка (NP) (рис. 1A). Позднее при инфицировании (9–12 ч) NP, предположительно в виде комплекса с вирусной геномной РНК [14], перемещается в цитоплазму. RIG-I был диспергирован в неинфицированных клетках, и инфекция WT IAV не вызвала каких-либо изменений в его распределении.С другой стороны, в клетках, инфицированных IAVÄNS1, NP накапливались в ядре через 6 часов после инфицирования, однако только часть NP перемещалась в цитоплазму через 9–12 часов (Рисунок 1B). В отличие от WT IAV, NP IAVÄNS1 обнаруживают спекл-подобное распределение в цитоплазме. Примечательно, что образование этого спекла, содержащего RIG-I, сильно коррелирует с активацией RIG-I-опосредованной активации сигнала, о чем судят по ядерной локализации (рис. 1C) и димеризации IRF-3 и сопутствующему усиленному производству ISG, таких как RLR и STAT1 (Данные не показаны).Действительно, соотношение клеток с IAV- и IAVÄNS1-индуцированным ядерным IRF-3 составляло 2,7% и 33,7% соответственно, а клетки, содержащие спеклы RIG-I вместе с ядерным IRF-3, составляли 0,0% (IAV) и 72,2% (IAVÄNS1). ).

Рис. 1. Инфекция IAV вызывает спекловое распределение маркеров RIG-I и стрессовых гранул.

( A – C ) Клетки HeLa были имитированы или инфицированы IAV ( A ) или IAVÄNS1 ( B ) в течение указанного периода, фиксированы, окрашены и проанализированы с помощью конфокальной микроскопии.Клетки окрашивали антителами против RIG-I (RIG-I), нуклеокапсидного белка против IAV (NP) и антителами против TIAR (TIAR). Ядра окрашивали DAPI. Через 9 и 12 часов после заражения процент спекл-подобного распределения RIG-I составлял 0,5% и 0,0% в клетках, инфицированных IAV, и 62,4% и 83,6% в клетках, инфицированных IAVÄNS1, соответственно. Увеличенные изображения соответствуют области в рамке на каждой панели. Клетки через 9 часов после инфицирования окрашивали антителами против RIG-I и против IRF-3 ( C ).( D и E ) Клетки HeLa инфицировали IAVÄNS1 в течение 9 часов и окрашивали анти-G3BP (G3BP) вместе с анти-RIG-I (RIG-I) ( D ) или анти-eIF3 (eIF3 ) ( E ). Увеличенные изображения соответствуют областям в рамке. ( F ) Клетки HeLa ложно обрабатывали или инфицировали IAV или IAVÄNS1 в течение 12 часов. Готовили клеточные экстракты и иммунопреципитировали антителом против RIG-I. Осадки анализировали иммуноблоттингом (IP: RIG-I) с использованием антител против G3BP, HuR, TIAR и RIG-I.Исходные данные: 1/50 экстрактов, используемых для иммунопреципитации, были проанализированы аналогичным образом с помощью иммуноблоттинга.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.g001

Гранулы, индуцированные IAVÄNS1, содержат как маркер стрессовых гранул, так и антивирусные белки

Мы охарактеризовали природу этих пятен с помощью различных антител и обнаружили, что интересно, что RIG-I демонстрирует совместную локализацию с NP (83,5%) и маркером стрессовых гранул (SG), внутриклеточным антиген-связанным белком, ограниченным Т-клетками (TIAR ) (97.1%) через 9 ч (Рисунок 1B). Другие маркеры SG аналогичным образом рекрутируются в гранулы, продуцируемые IAVÄNS1: белок, связывающий домен Sh4 Ras-GAP (G3BP) (97,6% колокализован с RIG-I), eIF3 (99,8% колокализован с G3BP) (рис. 1D и 1E) человеческий антиген R (HuR) (98,8% колокализован с RIG-I) (данные не показаны). Кроме того, физическое взаимодействие между маркерами RIG-I и SG было продемонстрировано с помощью анализов с понижением (рис. 1F). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что, хотя инфекция IAV потенциально индуцирует передачу сигналов для активации гена IFN и образование гранулярных агрегатов, содержащих маркеры SG, NS1 сильно блокирует и то, и другое.Эктопическая экспрессия полноразмерного NS1 и N-концевого РНК-связывающего домена NS1 резко ингибировала как образование гранул, так и передачу сигналов RIG-I в ответ на инфекцию IAVÄNS1, что указывает на то, что N-концевой домен NS1 отвечает за эти активности ( Рисунок S2A и S2B).

представляют собой внутриклеточный рибонуклеопротеиновый комплекс (РНП), генерируемый клеточным стрессом, включая окислительный, тепловой шок и стресс эндоплазматического ретикулума, и содержат мРНК с остановкой трансляции и различные РНК-связывающие белки [15]. Поскольку многие маркеры SG являются РНК-связывающими белками, мы исследовали локализацию других RLR, MDA5 и LGP2, а также PKR (см. Ниже), РНКазы L и OAS с помощью специфических антител. Интересно, что эти белки также рекрутировались в SG и вирус-индуцированные гранулы в ответ на арсенит и IAVÄNS1, соответственно (рис. 2A, 2B, 2C, 2D).

Рис. 2. Противовирусные белки совместно локализованы с SG.

( A – D ) Клетки HeLa подвергали ложной обработке (ложной), инфицировали IAVÄNS1 в течение 9 часов или обрабатывали NaAsO ₂ в течение 1 часа.Клетки фиксировали и окрашивали на G3BP и MDA5 (94,2% колокализация) ( A ), G3BP и LGP2 (97,6% колокализация) ( B ), RIG-I и РНКазу L (84,5% колокализация) ( C ). , RIG-I и OAS (87,4% колокализация) ( D ) в клетках, инфицированных IAVÄNS1. Увеличенные изображения соответствуют областям в рамке.

https://doi.org/10.1371/journal. pone.0043031.g002

Инфекция IAVÄNS1 индуцирует противовирусные SG, содержащие вирусную РНК

Эти результаты побудили нас изучить корреляцию между образованием SG и активацией гена IFN.Обработка клеток арсенитом (NaAsO ₂ ), которая вызвала окислительный стресс, приводила к образованию гранул, аналогичных тем, которые генерируются IAVÄNS1 (рис. 3A). Точно так же искусственная сверхэкспрессия PKR привела к образованию SG (58,9%) (рис. 3A). Хотя инфекция IAVÄNS1 активировала ген IFN-â, ни арсенит, ни PKR не активировали ген (рис. 3B). Эти результаты предполагают, что SG и вирус-индуцированные гранулы функционально различны, возможно, из-за присутствия вирусной РНК в вирус-индуцированных гранулах.Действительно, флуоресценция in situ гибридизации (FISH) ясно продемонстрировала, что вирусная РНК совместно локализовалась с гранулами NP (рис. 3C) и RIG-I (рис. 3D) в клетках, инфицированных IAVÄNS1, тогда как инфицированные IAV клетки показали совместную локализацию вирусной РНК с NP (Рисунок S3A), но не с RIG-I (Рисунок S3B). Как только вирусная РНК задействована RIG-I-содержащим комплексом, промотор-стимулятор-1 IFN-α (IPS-1, также известный как MAVS, VISA или Cardif), экспрессируемый на внешней мембране митохондрий, задействуется для облегчения RIG-I-IPS1. передача сигналов Mitofusin 1-зависимым образом [12], [16].Хотя большая часть IPS-1 локализуется в митохондриальной сети неинфицированных и инфицированных IAV клеток, инфекция IAVÄNS1 вызывает спекл-подобное распределение. Перелокализованный IPS-1 демонстрирует очевидные контакты с TIAR- (Рисунок 3E, нижняя правая панель) и RIG-I- (Рисунок S4), содержащим SG. Это согласуется с моделью, согласно которой SG физически контактирует с митохондриями посредством взаимодействия между RIG-I и IPS-1 посредством гомотипического взаимодействия домена рекрутирования каспаз (CARD) -CARD [17] — [20]. Хотя сообщалось об ассоциации IPS-1 с меткой FLAG с пероксисомами, положительными по отношению к белку пероксисомной мембраны (PMP70) после вирусной инфекции [21], мы не наблюдали их очевидной ассоциации (рис. 3E).

Рисунок 3. Вирусная РНК необходима для образования функциональной SG для активации сигнального пути RIG-I / IPS-1.

( A ) Клетки 293T трансфицировали пустым вектором (пустым) или вектором экспрессии HA-PKR (HA-PKR) в течение 24 часов или обрабатывали NaAsO ₂ в течение 1 часа и окрашивали анти-RIG- I, антитела против HA (PKR) и против TIAR и DAPI. Увеличенные изображения соответствуют областям в рамке. ( B ) Клетки 293T трансфицировали пустым вектором (пустым) или вектором экспрессии HA-PKR в течение 48 часов, или обрабатывали NaAsO ₂ в течение 1 часа, или инфицировали IAVÄNS1 в течение 12 часов.Относительные уровни мРНК эндогенного гена IFN-â определяли с помощью количественной ПЦР (qPCR). Данные представлены в виде среднего стандартного значения ± ошибка среднего (SEM). ( C и D ) Клетки HeLa ложно обрабатывали или инфицировали IAVÄNS1 в течение 12 часов. Вирусная РНК (вРНК) была обнаружена методом FISH с использованием РНК-зонда, комплементарного сегменту 1 IAV, а NP ( C ) и RIG-I ( D ) были обнаружены с использованием анти-NP и анти-RIG. -I антитела (97,1% и 98,2% совместная локализация вРНК с NP и RIG-I, соответственно).TO-PRO-3 использовали для окрашивания ядерной ДНК (ДНК). ( E ) Клеточные линии HeLa, стабильно экспрессирующие IPS-1 с тегом FLAG, подвергали ложной обработке или инфицировали IAV или IAVÄNS1 в течение 10 часов. Клетки окрашивали антителами против PMP70, против FLAG и против TIAR. Белыми стрелками обозначены контакты между FLAG-IPS-1 и TIAR. 67,8% инфицированных IAVÄNS1 клеток имели контакты, тогда как инфицированные IAV клетки практически не имели контакта (2,7%). На нижней панели показаны увеличенные изображения PMP70 (зеленый) и FLAG (красный), PMP70 (зеленый) и TIAR (красный), а также FLAG (зеленый) и TIAR (красный) в клетках, инфицированных IAVÄNS1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.g003

Производство SG не является результатом передачи сигналов RIG-I или IFN, поскольку избыточная экспрессия IPS-1 активировала ядерную транслокацию IRF-3 без образования SG (Рисунок S5A), и SG, сформированные в клетках HEC-1B с дефицитом IFN-рецептора (Рисунок S5B). Кроме того, другие вирусы, включая вирусы Sindbis (SINV), энцефаломиокардита (EMCV) и Adeno (Ad) dl203, также генерировали гранулы, содержащие RIG-I и G3BP (рисунок S5C), что позволяет предположить, что эта SG-подобная гранула является общей реакцией на вирусные инфекции .Чтобы отличить индуцированные вирусом гранулы от обычных SG, мы назвали индуцированные вирусом спеклы антивирусными SG (avSG).

Нарушение образования avSG ингибирует IAVÄNS1-индуцированную активацию IFN

Чтобы выяснить, требуется ли образование avSG для экспрессии IFN, мы отключили G3BP, критический компонент для образования канонических SG. G3BP siRNA явно подавляла экспрессию G3BP (рис. 4A). В соответствии с предыдущим исследованием [22], нокдаун G3BP сильно ингибировал образование avSG в клетках, инфицированных IAVÄNS1 (рис. 4B), а количество клеток, которые демонстрировали спекловое распределение RIG-I и TIAR, было уменьшено (рис. 4C). и 4D).Более того, экспрессия гена IFN-â сильно ингибировалась в клетках с нокдауном G3BP по сравнению с контрольными клетками, обработанными siRNA (фиг. 4E). Эти результаты предполагают, что образование avSG необходимо для эффективной активации IFN типа I. Кроме того, нокдаун eIF3 или RHAU, оба из которых являются компонентами SG, также блокировал как образование avSG, так и активацию гена IFN (данные не показаны).

Рисунок 4. Нокдаун G3BP нарушает образование avSG и активацию гена IFN-â.

( A – E ) Клетки HeLa трансфицировали контрольной миРНК (N.C) или siRNA, нацеленная на G3BP человека (G3BPi). Через 48 ч после трансфекции клетки собирали и G3BP и актин детектировали иммуноблоттингом ( A ). Клетки имитировали (имитировали) или инфицировали IAVÄNS1 в течение 12 часов, фиксировали и окрашивали антителами против RIG-I, против NP и против TIAR и DAPI ( B ). Определяли процент клеток, содержащих фокусы RIG-I ( C ) или TIAR ( D ). Относительный уровень мРНК IFN-â определяли методом кПЦР ( E ).Данные представлены в виде среднего стандартного значения ± ошибка среднего (SEM).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.g004

Инфекция IAVÄNS1 вызывает активацию и накопление PKR в avSG

Было высказано предположение, что семейство протеинкиназ, включая PKR, общий контроль недерепрессируемого 2 (GCN2), PKR-подобную киназу эндоплазматического ретикулума (PERK) и регулируемую гемом киназу eIF2α (HRI), фосфорилирует eIF2á, что приводит к образованию SGs. Обработка арсенитом вызывает окислительный стресс, приводящий к активации HRI, и образуются SG.PKR активируется дцРНК или 5 ¢ ppp-содержащей РНК [23], поэтому мы предполагаем, что РНК IAV активирует PKR, что приводит к образованию avSG через фосфорилирование eIF2á. Чтобы решить вопрос о вовлечении PKR, мы исследовали локализацию PKR в обработанных арсенитом и инфицированных IAVÄNS1 клетках и обнаружили, что PKR накапливается в SG и avSG (рис. 5A). Интересно, что фосфорилированный eIF2a также был обнаружен в avSG, специфически генерируемых IAVÄNS1, но не в IAV-инфицированных клетках (фиг. 5B). Иммуноблоттинг подтвердил, что IAVÄNS1 специфически индуцирует фосфорилирование PKR и eIF2á, тогда как обработка арсенитом индуцирует фосфорилирование eIF2á без активации PKR, что указывает на то, что IAVÄNS1 и арсенит индуцируют SG через различные пути (рис. 5C).

Рисунок 5. Локализация и активация PKR в индуцированных IAVÄNS1 avSG.

( A ) Клетки HeLa ложно обрабатывали или инфицировали IAVÄNS1 в течение 9 часов или обрабатывали NaAsO ₂ в течение 1 часа. Клетки фиксировали и окрашивали антителами против RIG-I и против PKR (% совместной локализации: 95,1% и 97,0% в клетках, инфицированных IAVÄNS1, и обработанных NaAsO ₂ соответственно). Увеличенные изображения соответствуют областям в рамке. ( B ) Клетки HeLa были имитированы или инфицированы IAV или IAVÄNS1 в течение 9 часов и окрашены антифосфо-eIF2a (Ser 51) (p-eIF2á) и G3BP (% совместной локализации: 0.0% и 46,5% в клетках, инфицированных IAV и IAVÄNS1, соответственно). Увеличенные изображения соответствуют областям в рамке. ( C ) Клетки HeLa инфицировали IAV или IAVÄNS1 в течение 12 часов или обрабатывали NaAsO ₂ в течение 1 часа. Клеточные экстракты были подготовлены и подвергнуты SDS-PAGE и иммуноблоттингу с использованием антител против RIG-I, PKR, фосфорилированной PKR (Thr 446) (p-PKR), фосфорилированного eIF2á (Ser 51) (p-eIF2á), IAV NP и â-актин.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.g005

Критическая роль PKR в образовании avSG и продукции IFN в клетках, инфицированных IAV

Описанные выше результаты указывают на образование вирусных РНК-содержащих avSG, которые необходимы для RLR-опосредованной передачи противовирусного сигнала. Чтобы оценить потребность в PKR во время инфекции IAVÄNS1, мы проанализировали образование avSG в эмбриональных фибробластах мыши (MEF), полученных от мышей WT и с нокаутом PKR (KO) (фиг. 6). MEF PKR WT и KO инфицировали либо IAV, либо IAVÄNS1, окрашивали антителами против RIG-I, против NP и против TIAR и рассчитывали частоту avSG. В случае WT IAV, avSG не образовывались в WT и KO MEF, как определено на рисунке 1. IAVÄNS1 производил avSG в WT, но не в PKR KO MEF (рисунок 6A, 6B, 6C). Более того, делеция PKR привела к блокаде экспрессии гена IFN-â (фиг. 6D), продукции белка IFN-â (фиг. 6E) и димеризации IRF-3 (фиг. 6F). Кроме того, мы подтвердили эти результаты, используя siRNA, направленную на экспрессию PKR в клетках HeLa. SiRNA эффективно подавляла экспрессию эндогенной PKR, что приводило к сильному ингибированию индуцированной IAVÄNS1 экспрессии гена IFN-â, сопутствующему снижению количества avSG (фиг. S6).Взятые вместе, результаты показывают, что PKR важна для активации генов avSG и IFN в клетках, инфицированных IAVÄNS1. Важно отметить, что блокирование образования avSG путем нокдауна PKR или G3BP усиливает репликацию IAVÄNS1 (рис. 7). Эти результаты убедительно указывают на новую роль avSG в противовирусных реакциях врожденного иммунитета.

Рисунок 6. Критическая роль PKR в формировании активации гена avSG и IFN-â.

( A – C ) MEF, полученные от мышей WT и PKR KO, имитировали лечение или инфицирование IAVÄNS1 в течение 12 часов.Клетки окрашивали анти-RIG-I, анти-IAV NP и анти-TIAR антителами и DAPI ( A ). Определяли процент клеток, содержащих фокусы RIG-I ( B ) или TIAR ( C ). ( D – F ) MEF PKR WT и PKR KO подвергали ложной обработке или инфицировали IAVÄNS1. Уровень мРНК IFN-α через 9 ч после инфицирования определяли с помощью кПЦР ( D ). Уровни белка IFN-α в культуральной среде через 15 ч после инфицирования количественно определяли с помощью ELISA ( E ) .Экстракты клеток подвергали Native-PAGE, и димер IRF-3 детектировали иммуноблоттингом с использованием антитела против IRF-3. NP и актин IAV определяли с помощью SDS-PAGE с последующим блоттингом с использованием антител против NP и актина ( F ). Данные, показанные в B-E, представлены в виде среднего стандартного значения ± ошибка среднего (SEM).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.g006

Рисунок 7. Ингибирование образования avSG усиливает репликацию вируса IAV.

HeLa трансфицировали контрольной миРНК (N.C) или siRNA, нацеленная на мРНК PKR человека или G3BP. Через 48 часов после трансфекции клетки обрабатывали имитатором или инфицировали IAVÄNS1 в течение 24 часов. Уровни экспрессии сегмента 3 РНК IAV и мРНК GAPDH определяли с помощью ОТ-ПЦР ( верхний ). Паттерны экспрессии РНК IAV были количественно определены с помощью LAS-1000 UV mini (Fujifilm, Япония) и нормализованы с помощью GAPDH ( нижний ). Данные представлены в виде среднего стандартного значения ± ошибка среднего (SEM).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.g007

Следует отметить, что в отсутствие PKR цитоплазматический транспорт NP ускоряется (Рисунок 6A). Этот эффект также наблюдается в клетках HeLa, в которых PKR подавлена ​​(рисунок S6C). Хотя механизм неизвестен, эти результаты предполагают, что PKR негативно регулируют цитоплазматический транспорт нуклеокапсида IAV.

Вирусная РНК генерирует avSG зависимым от PKR способом

Предыдущие сообщения показали, что геномная РНК IAV ответственна за запуск противовирусной передачи сигналов через RIG-I [6], [9], [24], [25].Поскольку геном IAV не является инфекционным, мы извлекли его из инфицированных IAV клеток и трансфицировали в MEF WT или PKR KO и исследовали, индуцирует ли геномная РНК IAV исключительно образование avSG и последующую активацию гена IFN. Как показано на фиг. 8A, геномной РНК IAV достаточно для продуцирования avSG, что указывает на то, что ни вирусный белок, ни репликация вирусной РНК не требуются. Кроме того, PKR требуется для образования вирусных РНК-индуцированных avSG (фиг. 8A и 8B).Поскольку PKR также необходима для индуцированной поли I: C активации гена IFN [26], мы протестировали короткий и длинный поли I: C, которые избирательно активируют RIG-I и MDA5 соответственно [27]. Короткий и длинный поли I: C индуцировали образование avSG зависимым от PKR образом (фиг. 8A и 8B). Мы подтвердили, что продукция IFN-α этими РНК зависит от PKR (рис. 8C). Вирусная, но не хозяйская РНК способна запускать ответ, что продемонстрировано обнаружением того факта, что общая РНК, выделенная из инфицированных клеток, но не из неинфицированных клеток, индуцирует образование avSG и активацию гена IFN-â (рис. S7A и S7B).Эти данные демонстрируют, что PKR необходима для образования avSG, которые рекрутируют вирусную РНК и RLR для запуска активации гена IFN во время IAV-инфекции. Следует отметить, что, как показано на фиг. 3B, сверхэкспрессия PKR может активировать образование SG, но не экспрессию IFN в отсутствие вирусной РНК, предполагая, что функция PKR является предварительным условием, но недостаточна для эффективной индукции RLR-опосредованной передачи противовирусных сигналов.

Рисунок 8. Вирусная РНК и polyI: C индуцируют образование avSG и экспрессию гена IFN-â PKR-зависимым образом.

( A – C ) MEF, полученные от мышей WT и PKR KO, были ложно обработаны или трансфицированы геномной РНК IAV, коротким поли I: C или длинным поли I: C в течение 9 часов и окрашены анти-RIG-I , антитела против G3BP и DAPI ( A ). Процент клеток, содержащих очаги G3BP, показан в ( B ). Относительные уровни мРНК IFN-α определяли с помощью кПЦР ( C ). Данные, показанные в B и C, представлены в виде среднего стандартного ± ошибка среднего (SEM).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0043031.g008

Discussion

Недавние исследования идентифицировали доменную структуру RLRs и различных адаптерных белков, регулирующих RLR-опосредованные антивирусные сигнальные каскады [28], но как RLRs встречаются с вирусной РНК в инфицированных клетках, остается неясным. В этом исследовании мы обнаружили, что все RLR рекрутируются в цитоплазматические гранулы, называемые avSG, при вирусных инфекциях. avSG содержат множество маркеров SG, G3BP, TIAR и eIF3, но в отличие от канонических SG также содержат вирусную РНК и вирусные NP.Мы продемонстрировали, что avSG имеют решающее значение для индуцированной вирусом активации гена IFN. Поскольку RLR должны эффективно находить свои лиганды, чтобы действовать как важные сенсоры для вирусной РНК, avSG могут способствовать правильному взаимодействию между вирусной РНК и RLR. Кроме того, OAS и RNase L рекрутируются в avSG, подтверждая модель, согласно которой RNase L усиливает передачу сигналов, индуцирующих IFN, путем обнаружения криптических лигандов для RIG-I и MDA5 [29]. Более того, специфическое привлечение противовирусных белков в avSG предполагает критическую роль в блокировании вирусной репликации без влияния на нормальную трансляцию хозяина.Мы также наблюдали, что другие вирусы, включая SINV, аденовирус EMCV, вирус гепатита C и вирус болезни Ньюкасла, индуцировали avSG (рисунок S5C и данные не показаны), что позволяет предположить, что avSG могут функционировать как общая платформа для обнаружения многих вирусов, чтобы инициировать передачу антивирусных сигналов. Поскольку PKR сама по себе не может запускать активацию гена IFN (фиг. 3B), PKR вносит вклад в вышеупомянутую IAV-индуцированную активацию RIG-I. Сообщалось, что SINV активирует GCN2 для фосфорилирования eIF2á [30], предполагая, что несколько вирусов могут активировать разные киназы eIF2á с образованием avSG.

Наша модель функции avSG представлена ​​на рисунке 9. Мы строго не исключаем возможность того, что PKR может напрямую фосфорилировать молекулы-мишени для участия в активации гена IFN, однако, поскольку активации PKR одной не достаточно для запуска продукции IFN, это эффект может быть постепенным.

Рисунок 9. avSG и врожденные противовирусные реакции.

Вирусные инфекции генерируют РНК с несамоподписанными, такими как 5′-трифосфат или двухцепочечная структура ( a ).В случае IAVÄNS1 PKR имеет решающее значение для образования avSG ( b ). IAV дикого типа ингибирует образование avSG под действием белка NS1 (c ). Некоторые другие вирусы могут активировать различные киназы eIF2a, такие как GCN2, PERK и HRI, для производства функциональных avSG ( d ). avSG состоят из маркеров SG и других РНК-связывающих белков, включая RLR, противовирусные белки (PKR, OAS и РНКаза L) и вирусную РНК. Внутри avSG вирусная РНК может восприниматься RLR для запуска передачи противовирусных сигналов ( e ).Активированные RLR рекрутируют митохондриальный IPS-1 посредством взаимодействий CARD-CARD ( f ). IPS-1 служит еще одной платформой для TRAF и протеинкиназ, TBK-1, IKKi и комплекса IKK, для активации генов-мишеней ( g ). Антивирусные белки активируются вирусной РНК, чтобы блокировать синтез и трансляцию вирусной РНК ( h ). Более того, система OAS-РНКаза L может продуцировать дцРНК для усиления передачи сигналов RLR ( i ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.g009

Распознавание вирусной РНК с помощью RIG-I и MDA5 вызывает АТФ-зависимые конформационные изменения молекул и позволяет им взаимодействовать с митохондриальным IPS-1 посредством взаимодействия CARD-CARD. Несколько отчетов показали, что активированный RIG-I образует димер или олигомер, который необходим для эффективной активации сигнала [31], [32]. Кроме того, было продемонстрировано, что IPS-1 перераспределяется по митохондриям в ответ на вирусную инфекцию, а IPS-1 образует прионоподобные агрегаты [12], [16].Эти наблюдения указывают на возможность того, что для передачи сигналов необходимо локальное обогащение как RLRs, так и IPS-1. Хотя наша попытка обнаружить биохимическое взаимодействие между RLR-содержащим avSG и агрегатами IPS-1 in vitro до сих пор не увенчалась успехом из-за их нерастворимости, наш иммуногистохимический анализ убедительно показывает, что митохондрии, обогащенные IPS-1, физически связаны с avSG. в ответ на инфекцию IAVÄNS1 (рис. 3E и S4), что предполагает критическую роль avSG как платформы для взаимодействия RLR-IPS-1.

Фосфорилирование eIF2á по Ser51, как известно, запускает образование канонических SGs, однако точный механизм, с помощью которого фосфорилированный eIF2á рекрутирует др. Компоненты SG, не совсем понятен из-за сложности биохимического анализа [33]. Мы продемонстрировали, что PKR активируется, рекрутируется в avSG и необходима для образования avSG после заражения IAVÄNS1. Вирусная РНК в первую очередь ответственна за запуск активации PKR, поскольку трансфекция геномной РНК IAV или поли I: C индуцировала образование avSG и активацию гена IFN зависимым от PKR образом.В соответствии с нашими данными, некоторые исследования показали, что дефицит PKR снижает выработку IFN в ответ на polyI: C и вирусные инфекции [34] — [38]. Schulz et al. сообщили, что PKR не требуется для продукции белков IFN-á / â в ответ на IAV в дендритных клетках костного мозга (BM-DC) [39]. Очевидно, это не согласуется с нашими данными, полученными с помощью MEF. Хотя мы не смогли напрямую сравнить MEF и BM-DC, наше объяснение этого несоответствия заключается в различии типов клеток, поскольку экспрессия белка IFN, определенная с помощью ELISA (рисунок 6E), соответствует уровню мРНК (рисунок 6D) и нокдаун PKR с помощью HeLa. клетки резко уменьшили продукцию IFN (Рисунок S6B).BM-DC может использовать киназу eIF2α, отличную от PKR, для образования avSG.

NS1 IAV представляет собой многофункциональный белок, который ингибирует различные факторы хозяина, включая PKR [40], [41], RIG-I [42], [43], и белок 25, содержащий трехчастный мотив (TRIM25), который, как известно, регулирует Активация RIG-I [44], и потенциально секвестрирует вирусную дцРНК через свой дцРНК-связывающий домен. Здесь мы продемонстрировали, что NS1 IAV заметно ингибирует avSG и активацию гена IFN. В соответствии с этим недавнее сообщение продемонстрировало, что образование IAV-индуцированного SG ингибируется NS1 дикого типа, но не мутантным NS1, в котором Arg38 и Arg41 заменены на Ala [41].Известно, что несколько классов вирусов ингибируют образование SG во время инфекции. Вирусы Западного Нила и Сендай кодируют РНК, которая взаимодействует с TIAR и ингибирует сборку SG [45], [46]. Протеаза полиовируса 3C расщепляет G3BP по Gln 326 в процессе инфицирования [22]. Более того, Simpon-Holley et al. недавно продемонстрировали, что белок E3L вируса осповакцины, предотвращающий активацию и фосфорилирование PKR eIF2á, и вирус осповакцины ÄE3L, лишенный генов E3L, создают гранулированную структуру, отличную от гранулы, называемой противовирусной гранулой (AVG) [47].Они также сообщили, что MEF, лишенные компонента AVG TIA-1, демонстрируют повышенную репликацию вируса осповакцины, что позволяет предположить, что AVG имеет решающее значение для противовирусных ответов хозяина. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что вирусы приобретают средства для ингибирования образования avSG и последующей активации гена IFN.

Канонический SG был предложен в качестве хранилища для остановленной трансляции мРНК хозяина в ответ на различные стрессы и возможного партнера с другим комплексом РНП, процессинговым телом, которое отвечает за деградацию мРНК [33].Следовательно, SG рассматривается как компартмент для динамической регуляции трансляции при стрессе окружающей среды. Наши результаты открывают новую роль недавно идентифицированного avSG как платформы для взаимодействия между вирусной РНК и противовирусными молекулами хозяина, чтобы запустить каскад событий, ведущих к уничтожению вируса. Хотя разница между SG и avSG до конца не изучена, будущие исследования позволят выявить механизм их сборки и биологические функции при стрессах и иммунных ответах.

Материалы и методы

Культура клеток, трансфекция и вирусы

MEF от pkr + / + и — / — мышей были получены от доктора И-Ли Янга [26]. Клетки HeLa, 293T и HEC-1B [48], [49] поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с FBS и пенициллин-стрептомицином (100 Ед / мл и 100 мкг / мл соответственно). Клеточная линия HeLa, стабильно экспрессирующая IPS-1 с тегом FLAG, была описана ранее [12]. Клетки 293T трансфицировали FuGENE6 (Roche) или Lipofectamine 2000 (Invitrogen).Аденовирус типа 12 (Ad12) dl203, предоставленный доктором К. Широки, и SINV размножались в клетках 293T и Vero соответственно. IAV (A / PR / 8/34 и ÄNS1), первоначально произведенные доктором А. Гарсия-Састре (Медицинская школа Маунт-Синай, США) и предоставленные доктором С. Акирой (Университет Осаки, Япония), были выращены в аллантоисные полости 9-дневных яиц с эмбрионами. Клетки обрабатывали культуральной средой («ложно обработанной») или инфицировали IAV, IAVÄNS1, SINV, EMCV или Ad12 dl203 в среде, не содержащей сыворотки и антибиотиков.После адсорбции в течение 1 ч при 37 ° C среду меняли и заражение продолжали в течение различных периодов в присутствии DMEM, содержащей сыворотку. Геномную РНК IAV экстрагировали из частично очищенного вирусного исходного материала с помощью TRIzol (Invitrogen) и 1,0 мкг вирусной РНК трансфицировали Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen) в чашке диаметром 35 мм. PolyI: C был приобретен в Amersham. Короткий полиI: C получали, как описано ранее [27].

Иммуноблоттинг, антитела и реагенты

Приготовление клеточных экстрактов и иммуноблоттинг уже были описаны ранее [5], [50]. Поликлональные антитела, используемые для обнаружения IRF-3 человека в нативном PAGE, и поликлональные антитела против IRF-3 человека и мыши для иммуноокрашивания были описаны ранее [50]. Моноклональные антитела против NP гриппа (mAb61A5), которые были созданы доктором Y. Kikuchi (Университет Иваки Мейсей, Япония), были предоставлены доктором F. Momose (Университет Китасато, Япония) [51]. Моноклональные антитела против человеческого OAS (6-1) были предоставлены доктором Ю. Сокава (Киотский технологический институт, Япония). Антитела против человеческого RIG-I, против человеческого MDA5 и против человеческого LGP2 первоначально были получены путем иммунизации кроликов синтетическим пептидом, соответствующим аминокислотам 793–807 человеческого RIG-I, 145–160 человеческого MDA5 и 535–553 LGP2 человека соответственно.Как показано на рисунке S1, нокдаун эндогенного RIG-I с помощью shРНК специфически ингибирует гранулистое накопление RIG-I при иммуноокрашивании (рисунок S1A) и появление полосы, соответствующей эндогенному RIG-I при вестерн-блоттинге (рисунок S1B), что указывает на высокую специфичность антитела против RIG-I. Кроме того, аналогичная картина окрашивания была получена с моноклональным антителом к ​​RIG-I человека, производимым Perseus Proteomics Inc, Япония. Другие антитела были получены из следующих источников: анти-G3BP (611126) от Transduction Laboratories ™, анти-IRF-3 (CBX00167) от COSMO BIO, анти-PKR (sc-6282), анти-РНКаза L (sc-22870) , анти-G3BP (sc-70283), анти-eIF3 (sc-16377), анти-c-myc (sc-40) и анти-TIAR (sc-1749) от Santa Cruz Biotechnology, anti-FLAG (M2) от Sigma, анти-фосфо-PKR (pT446) (1120-1) от Epitomics, анти-актин (MAB1501R) от CHEMICON International, анти-PMP70 (ab3421) от Abcam, анти-HA-Tag (6E2) и анти-фосфо- eIF2á (Ser51) (119A11) от Cell Signaling, и анти-HuR (RN004P, RIP-Certified Antibody) и анти-α-актин (PM053) от MBL.В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с Alexa 488, 594 и 633 антитела против IgG мыши, кролика или козы, приобретенные у Invitrogen. К культуре клеток добавляли 0,5 мМ арсенита натрия (Sigma) на 1 час.

Конструкций плазмид

p-125 Luc, pEF-BOS-FLAG-IPS-1, pCAGGS-myc, pCAGGS-myc-NS1, pCAGGS-myc-NS1 (аминокислоты 1–80), pCAGGS-myc-NS1 (аминокислоты 81– 230) плазмиды были описаны ранее [42], [48], [52]. кДНК для PKR человека была получена от Dr.A. Hovanessian (Парижский университет, Франция) и pEF-BOS-HA-PKR и pEF-BOS-HA-IPS1 были получены субклонированием кДНК в вектор pEF-BOS соответственно. pSUPER, pCMVÄR8.91, pMDG и pRDI292 были предоставлены доктором Д. Троно (Федеративная политехническая школа Лозанны, Швейцария) [53] — [56].

Анализ репортера люциферазы

Систему анализа репортерной двойной люциферазы (Promega) использовали в соответствии с инструкциями производителя для анализов люциферазы. В качестве внутреннего контроля использовали люциферазную конструкцию Renilla pRL-TK (Promega).

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Клетки фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в течение 20 мин при 4 ° C, проницаемость 0,05% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре (RT), блокировали 5 мг / мл BSA в PBST (0,04 % Tween20 в PBS) в течение 30 мин и инкубировали с соответствующими первичными антителами, разведенными в блокирующем буфере, в течение ночи при 4 ° C. Затем клетки инкубировали со вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Ядра окрашивали 4,6-димайдино-2-фенилинодолом (DAPI) и анализировали с помощью конфокального лазерного микроскопа LSM 510-V4.2 (Carl Zeiss) или TCS-SP (Leica). Процент клеток, содержащих avSG, был рассчитан более чем в 5 случайно выбранных полях для каждого слайда.

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией

Тотальную РНК получали с помощью реагента TRIzol (Invitrogen), обрабатывали ДНКазой I (Roche Applied Science) и амплифицировали с помощью ПЦР с обратной транскрипцией с системой определения последовательности ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems). Для синтеза кДНК использовали реагенты обратной транскрипции TaqMan (Applied Biosystems).Мы использовали коммерческие наборы TaqMan Universal PCR Master Mix и TaqMan праймер-зонды (Applied Biosystems) для человеческого и мышиного IFN-α. В качестве внутреннего контроля для методов сравнительного порогового цикла использовали набор праймер-зонд для 18 s рРНК эукариот (Applied Biosystems). Результаты были нормированы на обилие внутреннего контроля. Для обнаружения РНК IAV и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) мы использовали специальные наборы праймеров и амплифицировали с Ex Taq HS (Takara). РНК IAV: 5 ¢ — ATTTGCAACACTACAGGGGC-3 ¢ (прямая) и 5 ​​¢ -GACTGACGAAAGGAATCCCA-3 (обратная).МРНК GAPDH:

5 ¢ — GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ¢ (вперед) и

5 ¢ — TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ¢ (реверс).

Коиммунопреципитация

Антитело RIG-I было перекрестно сшито с белком G Dynabeads (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Лизат клеток инкубировали с антителом против RIG-I -Dynabeads в течение 120 мин при комнатной температуре. Иммунопреципитированные комплексы RIG-I элюировали кипячением в загрузочном буфере и затем обрабатывали для вестерн-блоттинга.

РНК-интерференция

Использовали систему экспрессии лентивирусной shRNA.Первоначально были сконструированы RIG-I shRNA № 1 и RIG-I shRNA № 2. Олигонуклеотиды со следующими смысловыми и антисмысловыми последовательностями использовали для конструирования лентивирусного вектора, кодирующего малую шпилечную РНК (кшРНК). РИГ-И шРНК №1; 5 ¢ -GATCCCCGAGGTGCAGTATATTCAGGTT CAAGAGACCTGAATATACTGCACCTCTTTTTGGAAA-3 ¢ (смысл) и 5 ​​¢ -AGCTT T TCCAAAAAGAGGTGCAGTATATTCAGGTCTCTTGAACCTGAATATGACTG CACC РИГ-И шРНК №2; 5 ¢ -GATCCCCGAATTTAAAACCA GAATTATCTTCAAGAGAGATAATTCTGGTTTTAAATTCTTTTTTGGAAA-3 ¢ (смысл) и 5 ​​¢ -AGCTTTTCCAAAAAGAATTTAAAACCAGTAATTATCTCTC TTGAAGATAGATTCTG ¢GAGATAGATTCTG.Описанные выше олигонуклеотиды были отожжены и субклонированы в сайт Bgl II-Hind III pSUPER. Для конструирования pLV-shRNA против RIG-I фрагменты BamHI-SalI, вырезанные из pSUPER-RIG-I # 1 и pSUPER-RIG-I # 2, субклонировали в сайт BamHI-SalI pRDI292. Рекомбинантные лентивирусы получали трансфекцией пустого лентивирусного вектора или соответствующей конструкции shRNA вместе с упаковывающей конструкцией pCMVÄR8.91 и обволакивающей плазмидой pMDG. Через 48 часов супернатант культуры собирали и среду фильтровали с 0.45 мкм фильтр переносили на клетки HeLa. Через 72 часа клетки отбирали средой, содержащей 2 мкг / мл пуромицина (Sigma). Отрицательный контроль миРНК и миРНК, нацеленные на PKR и G3BP, были приобретены у Invitrogen. Каждую siRNA трансфицировали Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Через 48 часов после трансфекции клетки собирали, инфицировали IAVÄNS1 и затем подвергали ПЦР в реальном времени, иммунофлуоресцентным анализам или SDS-PAGE с последующим иммуноблоттингом.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH

FISH был описан ранее [57]. Вкратце, после иммунофлуоресцентных анализов клетки фиксировали в 4% PFA в течение 10 минут и пермеаблизировали на льду с 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут. После депротеинизации протеиназой К клетки повторно фиксировали в 4% PFA в течение 10 мин, а затем подвергали ступенчатой ​​дегидратации в этаноле. Высушенные покровные стекла инкубировали с меченной биотином РНК-зондом в течение 12 ч при 37 ° C.После гибридизации клетки промывали и инкубировали с авидин-FITC в течение 30 мин при 37 ° C. Ядра окрашивали ТО-ПРО-3 и исследовали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

Иммуноферментный анализ (ELISA

Супернатанты культур собирали и подвергали ELISA с использованием набора мышиного IFN-α (источник интерферона PBL) в соответствии с инструкциями производителей.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Антитело против RIG-I специфически распознает эндогенный человеческий RIG-I. Клетки HeLa инфицировали контрольным лентивирусом или двумя лентивирусами, кодирующими различные кшРНК, специфичные для RIG-I (№1 и №2), в течение 72 часов. (A) Клетки обрабатывали NaAsO ₂ в течение 1 часа и окрашивали на RIG-I и G3BP. NaAsO ₂ вызывает спекл-подобную локализацию RIG-I и G3BP. (B) Клетки обрабатывали IFN-α человека в течение 12 часов. Клеточные экстракты получали и подвергали SDS-PAGE и иммуноблоттингу с использованием антител против RIG-I, MDA5 и α-актина.Сигналы RIG-I были ослаблены нокдауном RIG-I.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.s001

(TIF)

Рисунок S2.

N-концевой области NS1 достаточно, чтобы блокировать агрегацию RIG-I и противовирусные сигналы. (A) Клетки 293T трансфицировали пустым вектором (пустым), меченным myc NS1 (myc-NS1 (Full)), N-концевым NS1 (1–80) или C-концевым NS1 (81–230) на 48 ч. Клетки обрабатывали имитатором (имитатором) или инфицировали IAVÄNS1 в течение 9 ч и окрашивали на RIG-I и NS1 (myc).Процент клеток с индуцированным IAVÄNS1 спеклом RIG-I составлял 0,0%, 2,3%, 43,1% для клеток, экспрессирующих NS1, NS1 (1–80) и NS1 (81–230), соответственно. (B) Клетки 293T временно трансфицировали репортерными плазмидами, содержащими природный промотор IFN-α вместе с указанными векторами, экспрессирующими NS1. Трансфицированные клетки обрабатывали имитатором или инфицировали IAVÄNS1 в течение 12 ч и подвергали двойному люциферазному анализу. Данные представлены в виде среднего стандартного значения ± ошибка среднего (SEM).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0043031.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Локализация вирусной РНК в IAV-инфицированных клетках. (A и B) клеток HeLa ложно обрабатывали или инфицировали IAV в течение 12 часов. Вирусная РНК (вРНК) была обнаружена методом FISH с использованием РНК-зонда, комплементарного сегменту 1 IAV, и NP (A) и RIG-I (B) были обнаружены с использованием анти-NP и анти-RIG-I. антитела. TO-PRO-3 использовали для окрашивания ядерной ДНК (ДНК). Вирусные РНК и НЧ не образовывали очагов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.s003

(TIF)

Рисунок S4.

IPS-1 скопился в непосредственной близости от очагов RIG-I. клеток HeLa, стабильно экспрессирующих IPS-1 с тегом FLAG, подвергали ложной обработке или инфицировали IAV или IAVÄNS1 в течение 10 часов. Клетки окрашивали антителами против FLAG и RIG-I и DAPI. Объединенные изображения FLAG и RIG-I увеличены на нижней панели. Белыми стрелками обозначены контакты RIG-I / IPS-1. Эти контакты наблюдались у 74 человек.2% и 1,8% клеток, инфицированных IAVÄNS1 и IAV, соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.s004

(TIF)

Рисунок S5.

Образование avSG не является следствием активации гена IFN. (A) Клетки 293T трансфицировали пустым вектором или вектором экспрессии для IPS-1 (HA-IPS-1) в течение 24 часов. Клетки окрашивали на IRF-3, HA-tag и TIAR. Ядерный IRF-3 наблюдался почти во всех экспрессирующих IPS-1 клетках (95,5%), однако эти клетки демонстрировали небольшие очаги TIAR (3.0%). (B) Клетки HEC-1B, дефицитные по рецептору IFN типа I, подвергали ложной обработке, инфицировали IAVÄNS1 в течение 9 часов или обрабатывали NaAsO ₂ в течение 1 часа, как указано. Клетки окрашивали на RIG-I и G3BP. SG и avSG наблюдались в клетках HEC-1B (% колокализации 98,4% и 92,9% для IAVÄNS1 и NaAsO ₂ соответственно). Увеличенные изображения соответствуют областям в рамке. (C) Клетки HeLa были ложно обработаны или инфицированы SINV, EMCV или Ad12 dl203 в течение 9 часов, зафиксированы и окрашены на RIG-I и G3BP, как указано (% совместной локализации: 99.2%, 98,4% и 98,2% соответственно). Увеличенные изображения соответствуют областям в рамке.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.s005

(TIF)

Рисунок S6.

IAV-индуцированное образование avSG ингибировалось в клетках с нокдауном PKR. (A – E) Клетки HeLa трансфицировали контрольной миРНК (N.C) или миРНК, нацеленной на три независимые части мРНК PKR человека (№13). (A) Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и определяли PKR и актин с помощью вестерн-блоттинга. (B – E) Через 48 часов после трансфекции клетки обрабатывали имитатором (пустая полоса) или инфицировали IAVÄNS1 (закрашенная полоса) в течение 9 часов. Уровень мРНК IFN-α определяли с помощью qPCR (B) . Иммуноокрашивание клеток HeLa, трансфицированных контрольной (N.C) или PKR-целевой (PKR) siRNA, после имитационной обработки или заражения IAVÄNS1 (C) . Клетки также исследовали путем окрашивания на очаги RIG-I (D) , TIAR (E) после 12 часов инфицирования. Указано процентное содержание клеток, содержащих соответствующие очаги.Данные представлены в виде среднего стандартного значения ± ошибка среднего (SEM).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.s006

(TIF)

Рисунок S7.

Общая РНК из IAV-инфицированных клеток, но не из неинфицированных клеток, индуцирует образование avSG и активацию гена IFN-â. (A и B) MEF дикого типа подвергали ложной обработке (без РНК) или трансфицировали тотальной РНК, экстрагированной из неинфицированных MEF (MEF RNA) или из инфицированных IAV клеток в течение 12 часов (РНК MEF, инфицированная IAV). Клетки окрашивали на RIG-I и G3BP (% образования avSG 0.0%, 4,0% и 21,4% для отсутствия РНК, РНК MEF и РНК MEF, инфицированной IAV, соответственно) (A) . Увеличенные изображения соответствуют областям в рамке. Уровни эндогенного IFN-α мРНК определяли с помощью qPCR (B) . Данные представлены в виде среднего стандартного значения ± ошибка среднего (SEM).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043031.s007

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Р. Кагеяму за предоставление конфокального микроскопа для этого исследования, Ф.Momose и Y. Kikuchi для антитела против IAV NP и Y. Sokawa для антитела против OAS.

Вклад авторов

Задумал и разработал эксперименты: KO MY TF. Проведены эксперименты: KO MJ JY RN SM AT AK SO TM. Проанализированы данные: KO KN HN MY TF. Внесенные реагенты / материалы / инструменты анализа: SS. Написал бумагу: KO MY TF.

Ссылки

1. 1. Samuel CE (2001) Противовирусное действие интерферонов. Clin Microbiol Rev 14: 778–809, содержание.
2. 2. Witte K, Witte E, Sabat R, Wolk K (2010) IL-28A, IL-28B и IL-29: многообещающие цитокины с интерфероноподобными свойствами типа I. Фактор роста цитокинов Rev 21: 237–251.
3. 3. Gale M Jr, Katze MG (1998) Молекулярные механизмы устойчивости к интерферону, опосредованные вирусным ингибированием PKR, индуцированной интерфероном протеинкиназы. Pharmacol Ther 78: 29–46.
4. 4. Rubinstein S, Familletti PC, Pestka S (1981) Удобный анализ интерферонов.J Virol 37: 755–758.
5. 5. Ёнеяма М., Кикучи М., Нацукава Т., Синобу Н., Имаидзуми Т. и др. (2004) РНК-геликаза RIG-I выполняет важную функцию в индуцированных двухцепочечной РНК врожденных противовирусных реакциях. Nat Immunol 5: 730–737.
6. 6. Като Х., Такеучи О, Сато С., Йонеяма М., Ямамото М. и др. (2006) Различная роль геликаз MDA5 и RIG-I в распознавании РНК-вирусов. Природа 441: 101–105.
7. 7. Йонеяма М., Кикучи М., Мацумото К., Имаидзуми Т., Миягиши М. и др.(2005) Общие и уникальные функции DExD / H-box геликаз RIG-I, MDA5 и LGP2 в противовирусном врожденном иммунитете. J Immunol 175: 2851–2858.
8. 8. Хорнунг В., Эллегаст Дж, Ким С., Брзозка К., Юнг А. и др. (2006) 5′-Трифосфатная РНК является лигандом для RIG-I. Наука 314: 994–997.
9. 9. Пихлмайр А., Шульц О., Тан С. П., Наслунд Т. И., Лильестром П. и др. (2006) RIG-I-опосредованные противовирусные ответы на одноцепочечную РНК, несущую 5′-фосфаты. Наука 314: 997–1001.
10. 10. Расмуссен С.Б., Йенсен С.Б., Нильсен С., Куартин Э., Като Н. и др. (2009) Инфекция, вызванная вирусом простого герпеса, определяется как Toll-подобными рецепторами, так и геноподобными рецепторами, индуцируемыми ретиноевой кислотой, которые синергически индуцируют продукцию интерферона I типа. J Gen Virol 90: 74–78.
11. 11. Samanta M, Iwakiri D, Kanda T., Imaizumi T, Takada K (2006) РНК, кодируемые вирусом EB, распознаются RIG-I и активируют передачу сигналов, чтобы индуцировать IFN типа I. EMBO J 25: 4207–4214.
12. 12.Оногути К., Ономото К., Такамацу С., Джоги М., Такемура А. и др. (2010) Вирусная инфекция или 5’ppp-РНК активирует противовирусный сигнал за счет перераспределения IPS-1, опосредованного MFN1. PLoS Pathog 6: e1001012.
13. 13. Hale BG, Randall RE, Ortin J, Jackson D (2008) Многофункциональный белок NS1 вирусов гриппа А. J Gen Virol 89: 2359–2376.
14. 14. Портела А., Дигард П. (2002) Нуклеопротеин вируса гриппа: многофункциональный РНК-связывающий белок, имеющий ключевое значение для репликации вируса.J Gen Virol 83: 723–734.
15. 15. Бучан Дж. Р., Паркер Р. (2009) Гранулы эукариотического стресса: тонкости перевода. Mol Cell 36: 932–941.
16. 16. Хоу Ф, Сун Л., Чжэн Х, Скауг Б., Цзян QX и др. (2011) MAVS формирует функциональные прионоподобные агрегаты для активации и распространения противовирусного врожденного иммунного ответа. Ячейка 146: 448–461.
17. 17. Xu LG, Wang YY, Han KJ, Li LY, Zhai Z и др. (2005) VISA представляет собой адаптерный белок, необходимый для инициируемой вирусом передачи сигналов IFN-бета.Mol Cell 19: 727–740.
18. 18. Сет RB, Sun L, Ea CK, Chen ZJ (2005) Идентификация и характеристика MAVS, митохондриального антивирусного сигнального белка, который активирует NF-kappaB и IRF 3. Cell 122: 669–682.
19. 19. Каваи Т., Такахаши К., Сато С., Кобан С., Кумар Х. и др. (2005) IPS-1, адаптер, запускающий индукцию интерферона I типа, опосредованную RIG-I и Mda5. Nat Immunol 6: 981–988.
20. 20. Мейлан Э., Курран Дж., Хофманн К., Морадпур Д., Биндер М. и др.(2005) Cardif — это адаптерный белок в антивирусном пути RIG-I, на который нацелен вирус гепатита С. Природа 437: 1167–1172.
21. 21. Dixit E, Boulant S, Zhang Y, Lee AS, Odendall C и др. (2010) Пероксисомы являются сигнальными платформами для противовирусного врожденного иммунитета. Ячейка 141: 668–681.
22. 22. White JP, Cardenas AM, Marissen WE, Lloyd RE (2007) Ингибирование образования цитоплазматических стрессовых гранул мРНК вирусной протеиназой. Клеточный микроб-хозяин 2: 295–305.
23. 23.Nallagatla SR, Hwang J, Toroney R, Zheng X, Cameron CE и др. (2007) 5′-трифосфат-зависимая активация PKR РНК с короткими стержневыми петлями. Наука 318: 1455–1458.
24. 24. Баум А., Сачиданандам Р., Гарсия-Састре А. (2010). Предпочтение RIG-I коротким вирусным молекулам РНК в инфицированных клетках выявлено с помощью секвенирования следующего поколения. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 16303–16308.
25. 25. Rehwinkel J, Tan CP, Goubau D, Schulz O, Pichlmair A, et al.(2010) RIG-I обнаруживает вирусную геномную РНК во время инфицирования вирусом РНК с отрицательной цепью. Cell 140: 397–408.
26. 26. Ян Ю.Л., Рейс Л.Ф., Павлович Дж., Агуцци А., Шафер Р. и др. (1995) Недостаточная передача сигналов у мышей, лишенных двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы. EMBO J 14: 6095–6106.
27. 27. Като Х, Такеучи О, Микамо-Сато Э, Хираи Р., Каваи Т. и др. (2008) Зависимое от длины распознавание двухцепочечных рибонуклеиновых кислот индуцируемым ретиноевой кислотой геном-I и геном 5, связанным с дифференцировкой меланомы.J Exp Med 205: 1601–1610.
28. 28. Йонеяма М., Фудзита Т. (2010) Распознавание вирусных нуклеиновых кислот при врожденном иммунитете. Rev Med Virol 20: 4–22.
29. 29. Malathi K, Dong B, Gale M Jr, Silverman RH (2007) Малая собственная РНК, генерируемая РНКазой L, усиливает противовирусный врожденный иммунитет. Природа 448: 816–819.
30. 30. Берланга Дж. Дж., Вентосо И., Хардинг Х. П., Дэн Дж., Рон Д. и др. (2006) Противовирусный эффект фактора инициации трансляции 2-альфа-киназы млекопитающих GCN2 против РНК-вирусов.EMBO J 25: 1730–1740.
31. 31. Оуда Р., Ономото К., Такахаси К., Эдвардс М.Р., Като Х. и др. (2011) Ген I-индуцируемый ретиноевой кислотой miR-23b подавляет инфекции, вызываемые риновирусами минорной группы, посредством подавления рецептора липопротеинов очень низкой плотности. J Biol Chem 286: 26210–26219.
32. 32. Сайто Т., Хираи Р., Лоо Ю.М., Оуэн Д., Джонсон С.Л. и др. (2007) Регулирование врожденной противовирусной защиты через общий репрессорный домен в RIG-I и LGP2. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 582–587.
33. 33. Кедерша Н., Андерсон П. (2007) Гранулы стресса млекопитающих и обрабатывающие тела. Методы Enzymol 431: 61–81.
34. 34. Дибольд СС, Монтойя М., Унгер Х., Алексопулу Л., Рой П. и др. (2003) Вирусная инфекция превращает дендритные клетки, не являющиеся плазмацитоидными, на продуценты интерферона с высоким содержанием. Природа 424: 324–328.
35. 35. Gilfoy FD, Mason PW (2007) Продукция интерферона, индуцированная вирусом Западного Нила, опосредуется двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназой PKR.J Virol 81: 11148–11158.
36. 36. McAllister CS, Samuel CE (2009) РНК-активированная протеинкиназа усиливает индукцию бета-интерферона и апоптоз, опосредованный цитоплазматическими РНК-сенсорами. J Biol Chem 284: 1644–1651.
37. 37. Carpentier PA, Williams BR, Miller SD (2007) Различная роль протеинкиназы R и toll-подобного рецептора 3 в активации астроцитов вирусными стимулами. Glia 55: 239–252.
38. 38. Барри Дж., Брейквелл Л., Фрагкудис Р., Аттарзаде-Язди Дж., Родригес-Андрес Дж. И др.(2009) PKR действует на ранней стадии заражения, подавляя продукцию вируса леса Семлики и сильно усиливая реакцию интерферона типа I. J Gen Virol 90: 1382–1391.
39. 39. Schulz O, Pichlmair A, Rehwinkel J, Rogers NC, Scheuner D, et al. (2010) Протеинкиназа R способствует иммунитету против определенных вирусов, регулируя целостность мРНК интерферона. Клеточный микроб-хозяин 7: 354–361.
40. 40. Min JY, Li S, Sen GC, Krug RM (2007) Сайт на белке NS1 вируса гриппа A опосредует как ингибирование активации PKR, так и временную регуляцию синтеза вирусной РНК.Вирусология 363: 236–243.
41. 41. Хаперский Д.А., Хэтчетт Т.Ф., Маккормик С. (2011) Вирус гриппа А ингибирует образование гранул цитоплазматического стресса. FASEB J.
42. 42. Guo Z, Chen LM, Zeng H, Gomez JA, Plowden J, et al. (2007) Белок NS1 вируса гриппа А подавляет функцию внутрицитоплазматического сенсора патогена, RIG-I. Am J Respir Cell Mol Biol 36: 263–269.
43. 43. Mibayashi M, Martinez-Sobrido L, Loo YM, Cardenas WB, Gale M Jr и др.(2007) Ингибирование индуцируемой ретиноевой кислотой гена I-опосредованной индукции бета-интерферона белком NS1 вируса гриппа А. Дж. Вирол 81: 514–524.
44. 44. Гак М.Ю., Альбрехт Р.А., Урано Т., Инн К.С., Хуанг И.С. и др. (2009) Вирус гриппа А NS1 нацелен на убиквитинлигазу TRIM25, чтобы избежать распознавания вирусным РНК-сенсором хозяина RIG-I. Клеточный микроб-хозяин 5: 439–449.
45. 45. Ли В., Ли Й, Кедерша Н., Андерсон П., Эмара М. и др. (2002) Клеточные белки TIA-1 и TIAR взаимодействуют с 3′-стволовой петлей комплементарной минус-цепи РНК вируса Западного Нила и способствуют репликации вируса.J Virol 76: 11989–12000.
46. 46. Исени Ф., Гарсин Д., Нишио М., Кедерша Н., Андерсон П. и др. (2002) Конечная РНК вируса Сендай связывает TIAR, клеточный белок, участвующий в индуцированном вирусом апоптозе. EMBO J 21: 5141–5150.
47. 47. Симпсон-Холли М., Кедерша Н., Дауэр К., Рубинс К. Х., Андерсон П. и др. (2010) Образование противовирусных цитоплазматических гранул при ортопоксвирусной инфекции. J Virol 85: 1581–1593.
48. 48. Йонеяма М., Сухара В., Фукухара Ю., Фукуда М., Нишида Е. и др.(1998) Прямой запуск системы интерферона типа I вирусной инфекцией: активация комплекса факторов транскрипции, содержащего IRF-3 и CBP / p300. EMBO J 17: 1087–1095.
49. 49. Daly C, Reich NC (1993) Двухцепочечная РНК активирует новые факторы, которые связываются с элементом ответа, стимулированным интерфероном. Mol Cell Biol 13: 3756–3764.
50. 50. Ивамура Т., Йонеяма М., Ямагути К., Сухара В., Мори В. и др. (2001) Индукция киназы IRF-3 / -7 и NF-kappaB в ответ на двухцепочечную РНК и вирусную инфекцию: общие и уникальные пути.Гены клеток 6: 375–388.
51. 51. Momose F, Kikuchi Y, Komase K, Morikawa Y (2007) Визуализация опосредованного микротрубочками транспорта рибонуклеопротеина потомства вируса гриппа. Микробы заражают 9: 1422–1433.
52. 52. Оногучи К., Йонеяма М., Такемура А., Акира С., Танигучи Т. и др. (2007) Вирусные инфекции активируют гены интерферона I и III типов посредством общего механизма. J Biol Chem 282: 7576–7581.
53. 53. Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R (2002) Система для стабильной экспрессии коротких интерферирующих РНК в клетках млекопитающих.Наука 296: 550–553.
54. 54. Налдини Л., Бломер Ю., Галлай П., Ори Д., Маллиган Р. и др. (1996) Доставка гена in vivo и стабильная трансдукция неделящихся клеток лентивирусным вектором. Наука 272: 263–267.
55. 55. Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, Naldini L, Trono D (1997) Множественно аттенуированный лентивирусный вектор обеспечивает эффективную доставку гена in vivo. Nat Biotechnol 15: 871–875.
56. 56. Bridge AJ, Pebernard S, Ducraux A, Nicoulaz AL, Iggo R (2003) Индукция интерферонового ответа векторами РНКи в клетках млекопитающих.Нат Генет 34: 263–264.
57. 57. Джо С., Кавагути А., Такидзава Н., Морикава Ю., Момосе Ф. и др. (2010) Участие системы везикулярного транспорта в мембранном нацеливании на геном потомства вируса гриппа. Микробы заражают 12: 1079–1084.

РНКаза L усиливает передачу сигналов интерферона, индуцируя PKR-опосредованные антивирусные стрессовые гранулы

РЕЗЮМЕ

Вирусная инфекция приводит к активации индуцированной интерфероном эндорибонуклеазы, РНКазы L, что приводит к деградации вирусных и клеточных РНК.Как клеточные, так и вирусные продукты расщепления РНК РНКазой L связывают рецепторы распознавания паттернов (PRR), такие как индуцируемый ретиноевой кислотой I (Rig-I) и / или белок 5, связанный с дифференцировкой меланомы (MDA5), для дальнейшего усиления продукции интерферона (IFN) и противовирусного ответа . Хотя многое известно о механике связывания лиганда и активации PRR, остается неясным, как клетки координируют восприятие РНК с сигнальным ответом и продукцией интерферона. Мы показываем, что продукты расщепления РНК активности РНКазы L вызывают образование антивирусных стрессовых гранул (avSG), регулируя активацию двухцепочечной РНК (dsRNA) -зависимой протеинкиназы R (PKR), и привлекают противовирусные белки Rig-I, PKR, OAS. и РНКаза L в avSG.Биохимический анализ очищенного avSG показал взаимодействие ключевого белка стрессовых гранул, G3BP1, только с PKR и Rig-I, но не с OAS или РНКазой L. Сборка AvSG во время активации РНКазы L необходима для IRF3-опосредованной продукции IFN, а не для передачи сигналов IFN или провоспалительных процессов. индукция цитокинов. Следовательно, клетки, лишенные образования avSG или передачи сигналов РНКазы L, продуцируют меньше IFN и проявляют более высокую чувствительность во время заражения вирусом Сендай, демонстрируя важность avSG в опосредованной РНКазой L защите хозяина.Во время вирусной инфекции мы предлагаем роль РНК, расщепленных РНКазой L, в индукции avSG, содержащих противовирусные белки, чтобы обеспечить платформу для эффективного взаимодействия лигандов РНК с рецепторами распознавания образов для усиления продукции IFN для эффективного усиления противовирусного ответа.

ВАЖНОСТЬ Двухцепочечные РНК, образующиеся во время вирусных инфекций, служат в качестве патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) и связывают рецепторы распознавания паттернов, чтобы стимулировать выработку IFN. РНКаза L представляет собой IFN-регулируемую эндорибонуклеазу, которая активируется в инфицированных вирусом клетках и расщепляет одноцепочечные вирусные и клеточные РНК.Расщепленные РНКазой L дцРНК передают сигнал Rig-подобным геликазам для усиления продукции IFN. Это исследование определяет новую роль антивирусных стрессовых гранул, индуцированных РНКазой L, в качестве антивирусного сигнального хаба для координации лигандов РНК с родственными рецепторами для создания эффективного ответа хозяина во время вирусных инфекций.

Вирусная регуляция гранул РНК в инфицированных клетках

«Консервированная противовирусная роль для индуцированной вирусом цитоплазматической экзосомной композиции» Джером Майкл Моллестон

Название степени

доктор философских наук

Аннотация

— это строго регулируемый и высококонсервативный процесс, который избирательно воздействует на аберрантные РНК с использованием как 5 ’, так и 3’ экзонуклеаз.РНК, деградирующие в этом процессе, включают вирусную РНК, но механизмы, с помощью которых вирусная РНК идентифицируется и задействуется в механизме деградации, не совсем понятны. Чтобы идентифицировать новые противовирусные гены, мы провели скрининг РНКи генов с известной ролью в метаболизме РНК в клетках дрозофилы. Мы идентифицировали экзосому РНК, которая нацелена на распад 3’-конца РНК, и два компонента комплекса TRAMP с кофактором экзосомы, dMtr4 и dZcchc7, в качестве противовирусного средства против группы РНК-вирусов. Поскольку эти гены являются высококонсервативными, я распространил эти исследования на клетки человека и обнаружил, что экзосома, а также компоненты TRAMP hMTR4 и hZCCHC7 являются противовирусными.Хотя hMTR4 и hZCCHC7 обычно являются ядерными, я обнаружил, что инфицирование вирусами цитоплазматической РНК вызывает их экспорт в цитоплазматические гранулы, где они образуют комплекс, который специфически распознает и индуцирует деградацию вирусных мРНК. Более того, я обнаружил, что 3’-UTR мРНК буниавируса достаточно, чтобы вызвать индуцированную вирусом экзосомную деградацию, демонстрируя цис-регуляцию.

Несколько типов гранул рибонуклеопротеина (РНП) взаимодействуют как с 5 ’, так и с 3’ механизмами распада для облегчения деградации секвестрированных РНК.Чтобы определить, содержат ли гранулы, содержащие компонент TRAMP, компоненты других определенных гранул РНП, я провел иммунофлуоресценцию для hZCCHC7, а также компонентов Р-телец, стрессовых гранул и гранул экзосом, и обнаружил, что hZCCHC7 может колокализоваться с белками, находящимися в гранулах экзосом. и стрессовые гранулы во время вирусной инфекции, предполагая, что hZCCHC7 может связывать трансляционно остановленные вирусные РНК и доставлять их к гранулам экзосом для деградации.

Чтобы дополнительно охарактеризовать регуляцию ядерного экспорта компонента TRAMP во время инфекции, я исследовал вирусные сигналы, необходимые для этого транспорта.Я обнаружил, что трансфекции дцРНК достаточно, чтобы вызвать релокализацию, в то время как инфицирование вирусами, инактивированными УФ-излучением, — нет. Более того, я проверил роль канонических адаптеров врожденного иммунитета в этом процессе и обнаружил, что PKR сенсора дцРНК способствует перемещению во время инфицирования вирусом Синдбис. В целом, мои результаты показывают, что присутствие реплицирующейся вирусной РНК заставляет компоненты TRAMP быть перепрофилированы на роль цитоплазматического надзора в нескольких классах гранул РНП, включая стрессовые гранулы и гранулы экзосом.Там они избирательно задействуют вирусные РНК для деградации, чтобы ограничить распространение широкого спектра вирусов.

Рекомендуемое цитирование

Моллестон, Джером Майкл, «Консервативная противовирусная роль для индуцированного вирусом цитоплазматического экзосомного комплекса» (2016). Общедоступные диссертации Пенсильвании . 2480.
https://repository.upenn.edu/edissertations/2480

«ГТФаза-активирующий белок-связывающий белок 1 играет противовирусную роль», автор: Кабита Пандей

Тип документа

Диссертация — Открытый доступ

Название степени

Магистр наук (MS)

Отдел

Биология и микробиология

Первый советник

Xiuqing Wang

Ключевые слова

Противовирусный, G3BP1, PEDV, Стресс гранулы

Аннотация

Вирус эпидемической диареи свиней (PEDV) — это несегментированный вирус, который использует одноцепочечную РНК с положительным смыслом в качестве генетического материала.PEDV относится к семейству Coronaviridae, и основными клиническими признаками являются обширная диарея и обезвоживание кормящих поросят. Это возникающее заболевание приводит к огромным экономическим потерям в свиноводстве. Очень мало исследований проводится в отношении роли врожденного иммунитета в инфекции PEDV. Формирование стрессовых гранул (SG) наблюдается, когда клетки попадают в различные стрессовые условия, включая вирусные инфекции. SG образуются, когда одна из четырех киназ: двухцепочечная РНК (dsRNA) -зависимая протеинкиназа (PKR), PKR-подобная киназа эндоплазматического ретикулума (PERK), недерепрессируемая киназа 2 (GCN2) общего контроля и геморегулируемая ингибиторная киназа (HRI) вызывают фосфорилирование фактора инициации трансляции эукариот (eIF2α).Альтернативный путь образования SG — ингибирование геликазы РНК eIF4A. Фосфорилирование eIF2α путем активации PKR является наиболее распространенным путем образования SG. SG считаются показателем врожденного противовирусного ответа хозяина, который ограничивает трансляцию вирусных генов. Белок, активирующий Ras-GTPase (домен Sh4), связывающий белок 1 (G3BP1), является одним из важных белков, резидентов стрессовых гранул, который зарождается в сборке стрессовых гранул. Целью исследования было изучить роль G3BP1 в репликации PEDV.Мы обнаружили, что истощение G3BP1 ингибирует образование SG, а избыточная экспрессия G3BP1 вызывает сборку SG. Мы наблюдали, что нокдаун G3BP1 путем подавления РНК значительно увеличивал репликацию PEDV. Точно так же сверхэкспрессия экзогенного G3BP1 снижала репликацию вируса примерно в 100 раз по сравнению с векторным контролем. Мы также наблюдали, что клетки, инфицированные PEDV, устойчивы к образованию SG при обработке арсенитом натрия. Повышение уровней мРНК провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1β (IL-1β) и фактор некроза опухоли — α (TNF-α), также наблюдалось в инфицированных PEDV клетках с нокдауном G3BP1 по сравнению с инфицированными PEDV контрольными клетками. .Взятые вместе, наши результаты показывают, что PEDV индуцирует временное образование SG, а G3BP1 играет противовирусную роль в репликации вируса.

Предметные рубрики Библиотеки Конгресса

Диарея свиней.
Свиньи — Вирусные болезни.
Противовирусные средства.
Белок, активирующий ГТФазу.

Описание

Включая библиографические ссылки

Издатель

Государственный университет Южной Дакоты

Рекомендуемое цитирование

Панди, Кабита, «ГТФаза-активирующий белок-связывающий белок 1 играет противовирусную роль в репликации вируса эпидемической диареи свиней (PEDV)» (2018). Электронные диссертации и диссертации . 2973.
https://openprairie.sdstate.edu/etd/2973