Острый тонзиллит по мкб 10: Ошибка 404. Файл не найден

Авторские права © 2021 Wu et al.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы продемонстрировали микробные различия между поверхностной и центральной тканью миндалин и их связь с заболеваниями CT и TH с помощью секвенирования гена 16S рРНК микробиома. Наши данные указывают на сопоставимое бактериальное альфа-разнообразие микробиоты миндалин от пациентов с CT и TH.Однако микробные сообщества, присутствующие в тканях миндалин пациентов с CT, отличаются от таковых у пациентов с TH, особенно на поверхности миндалин. Мы предложили четыре различных типа микробов в миндалинах и определенные роды / виды бактерий, которые могли отличить пациентов с КТ от пациентов с ТГ. Кроме того, были исследованы ключевые участники микробиоты и бактериальных функций.

Выводы.

Подводя итог, мы продемонстрировали, что значительные уровни дифференциальной микробиоты присутствуют в сердцевинных и поверхностных тканях миндалин у пациентов с CT и TH. Кроме того, наши результаты показали, что несколько идентифицированных родов, таких как Haemophilus , Neisseria , Dialister и Parvimonas , могут использоваться в качестве потенциальных биомаркеров и играть роль в патогенезе заболеваний.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Жюстин Дебелиус за отличный совет по биоинформатическому анализу и Нагихана Бостанчи и Пера Хидбринга за критическое прочтение рукописи. Мы особенно благодарим двух анонимных рецензентов за ценные предложения и комментарии по улучшению этого исследования.

Концепция и дизайн: L.H.N., M.J., L.E., J.D., and A.T. Сбор образцов: L.H.N., M.J. и A.T. Разработка методологии: S.W., L.C., S.A.R., P.A., Y.Z.G., M.H. и J.D. Сбор данных: S.W., L.C., S.A.R., P.A., Y.Z.G., M.H., and J.D. Анализ и интерпретация данных: S.W., L.H.N., J.D. и A.T. Написание, рецензирование и / или редактирование рукописи: S.W., L.H.N., J.D. и A.T. вместе со всеми авторами.

J.D. and S.W. были поддержаны Шведским фондом стратегических исследований (SSF) [ICA16-0050], Фондом Оке Вибергса [M18-0112], Фондом Жанссона [JS2018-0034], Миннесфондом Класа Грошинскиса [M18213, M19351] и Каролинским институтом. Ferring Pharmaceuticals профинансировала центр, в котором реализовывался этот проект.

Мы заявляем, что у нас нет никаких конкурирующих или коммерческих интересов.

Молекулярное картирование на видовом уровне микробиоты тонзиллярной крипты, связанной со здоровьем и рецидивирующим тонзиллитом

Abstract

Небные миндалины человека, которые относятся к центральным участкам обработки антигена иммунной системы слизистой оболочки, часто поражаются острыми и рецидивирующими инфекциями. В этом исследовании сравнивали микробиоту крипт миндалин у детей и взрослых, страдающих рецидивирующим тонзиллитом, с микробиотой здоровых взрослых и детей с гиперплазией миндалин.Углубленный подход пиросеквенирования на основе гена 16S рРНК в сочетании с новой стратегией, включающей филогенетический анализ и обнаружение видоспецифичных сигнатур последовательностей, позволил идентифицировать основную часть микробиоты на уровне видов. Сложная микробиота, состоящая от 42 до 110 таксонов, была продемонстрирована как у детей, так и у взрослых. Это включало основной микробиом из 12 многочисленных родов, обнаруженных во всех образцах, независимо от возраста и состояния здоровья. Тем не менее, Haemophilus influenzae , Neisseria видов и Streptococcus pneumoniae были почти исключительно обнаружены у детей.Напротив, Streptococcus pseudopneumoniae присутствовал во всех образцах. Облигатные анаэробы, такие как Porphyromonas , Prevotella и Fusobacterium , широко присутствовали у детей, но видовое разнообразие Porphyromonas и Prevotella было больше у взрослых и включало виды, которые считаются предполагаемыми патогенами пародонта. Porphyromonas gingivalis , Porphyromonas endodontalis и Tannerella forsythia.Анализ Unifrac показал, что рецидивирующий тонзиллит связан со сдвигом микробиоты крипт миндалин. Fusobacterium necrophorum, Streptococcus intermediateus и Prevotella melaninogenica / histicola были связаны с рецидивирующим тонзиллитом у взрослых, тогда как виды, традиционно связанные с острым тонзиллитом, такие как пиогенные стрептококки и Staphylococcus scarureceus, были . Полученные данные свидетельствуют о том, что рецидивирующий тонзиллит является полимикробной инфекцией, этиологическую роль в которой играют взаимодействия внутри консорциума таксонов.Исследование способствует получению данных о микробиоме человека, пониманию этиологии инфекций, поражающих миндалины, и формирует основу для дальнейшего понимания последствий интенсивных взаимодействий микробов и хозяев, происходящих в миндалинах.

Образец цитирования: Jensen A, Fagö-Olsen H, Sørensen CH, Kilian M (2013) Молекулярное картирование на уровне видов микробиоты тонзиллярной крипты, связанной со здоровьем и рецидивирующим тонзиллитом. PLoS ONE 8 (2): e56418.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056418

Редактор: Пин Сюй, Университет Содружества Вирджинии, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 01.10.2012; Принята к печати: 9 января 2013 г .; Опубликован: 21 февраля 2013 г.

Авторские права: © 2013 Jensen et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было поддержано стипендией факультета медицинских наук Орхусского университета AJ и грантом проекта MK от Датского совета медицинских исследований (271-08-0808). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Последние данные подтверждают гипотезу о том, что человеческое тело и комменсальная микробиота кожи и слизистых оболочек составляют единый суперорганизм [1].Взаимные выгоды для хозяина и микробов многочисленны. Хотя микробам предоставляется селективная среда, наполненная питательными веществами, они, в свою очередь, играют роль в обеспечении барьера против потенциальных патогенов, в регуляции эпителиального ангиогенеза и гомеостаза, а также в активации и формировании слизистой оболочки и системной иммунной системы и модели их реакции. Как следствие, состав комменсальной микробиоты, вероятно, играет роль в определении предрасположенности человека к инфекционным, аутоиммунным и аллергическим заболеваниям [2] — [4].

Понимание взаимодействий внутри человеческого суперорганизма и их последствий для здоровья и болезней требует подробной информации о составе микробиоты многих различных экосистем, составляющих человеческое тело. Среди них особый интерес представляют парные небные миндалины кольца Вальдейера. Из-за своего расположения небные миндалины и их лимфоидные фолликулы с М-клетками, подобными клеткам Пейера кишечника, расположенным внутри глубоко разветвленных крипт, являются одними из первых мест обработки микробных антигенов и антигенов окружающей среды в организме человека.Кроме того, они являются очагом и вероятным местом проникновения многочисленных инфекций, особенно в детском и подростковом возрасте [5], [6].

Тонзиллит — очень распространенная инфекция небных миндалин, в основном у детей и молодых людей, и особенно рецидивирующий тонзиллит является клинической проблемой, и многим пациентам в конечном итоге может быть проведена тонзиллэктомия. Streptococcus pyogenes и другие виды Streptococcus , такие как S. dysgalactiae subsp. equisimilis привлекли особое внимание как этиологические агенты [7], [8], но недавно было показано, что анаэробный вид Fusobacterium necrophorum связан с тонзиллитом и особенно рецидивирующим тонзиллитом у молодых людей [9], [10].Хотя один вид микробов может вызывать острый тонзиллит, было высказано предположение, что рецидивирующий тонзиллит является следствием полимикробной инфекции анаэробными бактериями, образующими биопленку в криптах [11], [12]. Хотя во многих исследованиях на основе культур сравнивали бактериальное сообщество в криптах миндалин пациентов с рецидивирующим тонзиллитом и пациентов с гипертрофией [13] — [16], никаких всеобъемлющих исследований с использованием молекулярных методов высокого разрешения не проводилось. За последние несколько лет пиросеквенирование ДНК стало широко доступным и теперь превосходит другие молекулярные стратегии с глубиной отбора проб, которая на несколько порядков выше [17].В настоящее время это метод выбора для анализа бактериального разнообразия 16S рРНК, который с успехом использовался для определения бактериального разнообразия во многих компартментах человека, включая кишечник и ротовую полость, в зависимости от состояния здоровья [18] — [21].

В этом исследовании мы сравнили бактериальное разнообразие в криптах небных миндалин у детей и взрослых с рецидивирующим тонзиллитом и здоровых взрослых и детей с гиперплазией миндалин, используя метод пиросеквенирования мультиплексированного гена 16S рРНК с высокой пропускной способностью.Используя новую стратегию, мы смогли идентифицировать основную часть микробиоты на уровне видов. Помимо описания бактериальных сообществ, связанных с рецидивирующим тонзиллитом, исследование обеспечивает улучшенную основу для понимания значения микробиоты миндалин для здоровья и болезней.

Результаты

Обзор 20 субъектов, их пол, возраст и клинический статус, а также количество и характеристики последовательностей, сгенерированных из каждого образца, показаны в таблице 1.Количество необработанных последовательностей для каждого образца варьировалось от 15 461 для образца 2 до 163955 последовательностей для образца 16 и имело среднюю длину 517 оснований. Качественная фильтрация исключала в среднем 43% последовательностей, а количество последовательностей, используемых для дальнейшего анализа, варьировалось от 4599 последовательностей в образце 20 до 94 893 в образце 16 и составляло в общей сложности 890 708 последовательностей со средней длиной 334 оснований. Однако все образцы были разрежены до 4599 последовательностей до анализа на основе OTU.

Количество OTU при уровне различия 3% варьировалось от 33 в образце 9 до 108 в образце 12 (таблица 1).В общей сложности во всех выборках было обнаружено 236 различных OTU, из которых 14 OTU были обнаружены во всех 20 выборках и составили в среднем 64% (диапазон: от 6% до 95%) от общего числа последовательностей. Это указывает на то, что основной микробиом присутствует в криптах миндалин человека независимо от возраста и состояния здоровья миндалин. Преобладающие представители этой основной микробиоты принадлежали к родам Streptococcus , Prevotella , Fusobacterium, Porphyromonas, Neisseria, Parvimonas, Haemophilus, Actinomyces, Rothia, Granulicatella и Gemella.Когда образцы были объединены в четыре группы на основе возраста и клинических характеристик, 52 ОТЕ, составляющие 89% от общего числа последовательностей, представленных во всех четырех группах, как показано на диаграмме Венна (Рисунок 1). Никаких существенных различий (p> 0,2) в сложности сообщества четырех групп и между детьми и взрослыми не было обнаружено с помощью индексов разнообразия invsimpson и Shannon (таблица 1).

Рис. 1. Диаграмма Венна, показывающая перекрытие наблюдаемых OTU для четырех групп.

Всего 52 OTU, обнаруженных во всех четырех группах, составили более 90% всех последовательностей (A). Данные также выражаются в соответствии с типом, к которому принадлежат общие OTU (B).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056418.g001

Таксономические группы последовательностей показали, что во всех образцах было обнаружено десять типов (таблица S2). Однако только Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Fusobacteria, Actinobacteria, и Spirochaetes были обнаружены в количестве, превышающем 1% (Рисунок 2).Помимо спирохет, обнаружены только в 13 из 20 образцов, и в первую очередь у здоровых взрослых, основные типы были обнаружены во всех образцах (рис. 2). Среди малых типов, которые были обнаружены, Cyanobacteria и Deinococcus-Thermus , вероятно, являются временными контаминантами от вдыхания и приема пищи. Незначительная часть последовательностей не может быть отнесена к известному типу и может быть связана с неадекватным обнаружением химер.

Рис. 2. Относительная численность (процент от общего числа последовательностей) шести бактериальных типов, обнаруженная в значительных количествах (> 1%) в четырех указанных группах взрослых и детей и в отдельных образцах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056418.g002

Несмотря на значительные межиндивидуальные различия (рис. 2), значительные различия в составе филумов между четырьмя группами были обнаружены с помощью метастазов. И Bacteroidetes , и Firmicutes были связаны со здоровыми взрослыми. Напротив, Proteobacteria были тесно связаны с детьми (таблица 2 и таблица S2).

На более детальном таксономическом уровне последовательности были отнесены к 93 названным родам (Таблица S2).Ядро из 12 родов присутствовало во всех образцах: Actinomyces, Rothia, Streptococcus, Gemella, Granulicatella, Johnsonella, Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium Veillonella, Neisseria, и Haemophilus . Наиболее распространенными родами были Prevotella (27 названных и 9 безымянных видов), Streptococcus (17 видов и неразличимые группы видов), Haemophilus (6 видов), Fusobacterium (3 названных и 3 неназванных вида). ), Porphyromonas (4 названных и 2 безымянных вида), Gemella (4 вида и группы видов), Neisseria (7 видов и неразличимые группы видов), Veillonella (3 названных вида или группы) видов и 2 безымянных вида), Capnocytophaga (4 вида и неразличимые группы видов), Parvimonas (1 вид), Rothia (3 вида), Actinomyces (8 видов) и Treponema (7 названных и 3 безымянных вида) (Таблица S2).Из общего числа 3,2% последовательностей, которые не могли быть отнесены к уровню рода с разумной степенью уверенности с использованием автоматической процедуры отнесения последовательностей к уровню рода, 2,4% были успешно отнесены к видам с использованием ручного филогенетического подхода. Последовательности, отнесенные к неклассифицированным Pasteurellaceae, неклассифицированным Neisseriaceae и неклассифицированным Flavobacteriaceae с помощью автоматической процедуры, все с помощью этого анализа были отнесены к видам.Последовательности, идентифицированные как неклассифицированные Bacteroidales с помощью автоматического подхода, не могли быть отнесены к признанным родам или видам с помощью ручного филогенетического анализа, и все они были отнесены к некультивируемым геномогерам или геномовидам на основе уровня, на котором возникла кластеризация (Таблица S2). Отнесение случайных последовательностей к распознаваемым родам с помощью автоматической процедуры не подтверждалось филогенетическим анализом и, соответственно, переназначалось геномогенерам (т.е. Porphyromonadaceae genomosgenus POAJ1 и Flavobacteriaceae genomogenus FLAJ1) (Таблица S2).

В криптах миндалин детей с гиперплазией миндалин преобладали следующие роды: Streptococcus (21,5%), Neisseria (13,5%), Prevotella (12,0%), Haemophilus (10,2%), Porphyromonas (9,0%), Gemella (8,6%) и Fusobacterium видов (6,4%) (Таблица S2). В бактериальных сообществах миндалин взрослых с рецидивирующим тонзиллитом преобладали те же роды, но в значительно измененных пропорциях.Анализ метастатов показал, что Haemophilus и Neisseria были значительно более многочисленными в образцах от детей, чем от взрослых (Таблица 2). Напротив, Prevotella, Actinomyces, Parvimonas Veillonella и Treponema были значительно более многочисленными у взрослых по сравнению с детьми (Таблица 2).

Поскольку рецидивирующий тонзиллит предположительно вызван сдвигом в пропорции бактерий на более детальном филогенетическом уровне, чем роды, мы использовали новую стратегию для отнесения преобладающих кластеров последовательностей к видовому уровню с помощью филогенетического анализа с включением последовательностей гена 16S рРНК соответствующие штаммы обозначенного типа.В качестве дополнения к этому анализу и когда кластеризация последовательностей с однотипными штаммами была неубедительной, были использованы видоспецифические нуклеотидные сигнатуры для отнесения этих последовательностей к видам или, в некоторых случаях, кластерам видов. Средняя численность 33 видов превысила среднюю численность более чем на 0,5% (Таблица 3). Однако наблюдались значительные межиндивидуальные различия в численности видов, и ни один вид не составлял более 0,5% во всех 20 выборках. Однако некоторые виды составляли более 0.5% во всех выборках, принадлежащих к одной из четырех групп. К ним относятся Haemophilus influenzae у детей, Fusobacterium nucleatum у здоровых взрослых, Gemella haemolysans / G. morbillorum / Г. sanguinis у детей с гиперплазией и взрослых с рецидивирующим тонзиллитом, еще не культивированные Porphyromonas геномовидов PAJ1 у детей с гиперплазией, P. cataniae у детей, H. haemolyticus у детей с гиперплазией, F.necrophorum у взрослых с рецидивирующим тонзиллитом и Abiotrophia elegans у детей с гиперплазией (таблица 2). Кроме того, некультивируемые геномовиды и геномогеры были обнаружены во многих родах или ассоциированы со многими родами, включая Prevotella (9 геномовидов), Fusobacterium (три геномовида), Porphyromonas (два вида геномов), Gemella806 (один геномовид), Abiotrophia (один геномовид), Capnocytophaga (один геномовид), Selenomonas (один геномовид), Veillonella (два геномовида), 806 вида два геномогена) и Flavobacteriaceae (один геномоген) (Таблица S2).Идентичность последовательностей, обнаруженная с помощью анализа Blast, показала, что некоторые из этих геномовидов и геномогенов были ранее обнаружены в других исследованиях микробиома. Их ближайшие совпадения в базе данных HOMD перечислены в таблице S3. Однако наблюдались некоторые различия в назначении последовательности между автоматическим подходом и ручным филогенетическим подходом (Таблица S2). Распространение вида в основных родах подробно описано ниже.

В роду Haemophilus доминировали H.influenzae и H. haemolyticus во всех образцах, полученных от детей, и никаких существенных различий между детьми с гиперплазией миндалин и детьми с рецидивирующим тонзиллитом не наблюдалось (Таблица S2). Напротив, распределение видов Neisseria отличалось, но не статистически значимо, между детьми с гиперплазией миндалин и детьми с рецидивирующим тонзиллитом. В образцах от детей с рецидивирующим тонзиллитом преобладали N. cineria, N.flavescens и N. elongata / Kingella denitrificans (Таблица S2).

S. pneumoniae (2 образца) и S. pseudopneumoniae доминировали в роду Streptococcus у детей. Интересно, что S. pseudopneumoniae обычно был очень распространен среди детей и был значительно более связан с детьми, чем со взрослыми (q = 0,04) (таблица 2). И наоборот, две группы Anginosus Streptococcus видов S.constellatus и S. intermediateus были обнаружены в основном в образцах взрослых особей. На S. intermediateus, приходилось 2,7–44,1% (среднее значение = 16%) от общего количества последовательностей у взрослых с рецидивирующими тонзиллами, что выше, чем у здоровых взрослых (q <0,04) (Таблица 2). Пиогенные стрептококки ( S. pyogenes , S. agalactiae и S. dysgalactiae subsp. equisimilis ) составляли менее 1% всех последовательностей, отнесенных к роду Streptococcus во всех образцах, кроме одного ( С.dysgalactiae subsp. equisimilis , 1,3% всех последовательностей из образца 15) (Таблица S2).

Филогенетический анализ рода Fusobacterium показал, что во всех образцах, за исключением образцов от взрослых с рецидивирующим тонзиллитом, преобладали F. nucleatum и два некультивируемых геномовида Fusobacterium , обозначенные FAJ1 и FAJ2 (Таблица S2). Напротив, F. necrophorum был обнаружен в значительных количествах во всех пяти образцах от взрослых с рецидивирующим тонзиллитом, но практически отсутствовал во всех других образцах (Таблица 3).В двух образцах от рецидивирующего тонзиллита у взрослых F. necrophorum составлял более 15% всех последовательностей, в то время как на него приходилось 2–5% от общего числа последовательностей в трех других образцах от этих пациентов. Это значительно отличается от здоровых взрослых (таблица 2).

Последовательности Porphyromonas от детей были отнесены исключительно к P. cataniae и некультивируемым геномовидам Porphyromonas PAJ1, оба из которых были в значительной степени связаны с детьми (Таблица 2). Porphyromonas Геномовиды PAJ1 образовали отдельный и когерентный кластер, как было обнаружено, наиболее близкородственный, наиболее тесно связанный с P. catoniae с 95% сходством последовательностей. Подобной последовательности не было обнаружено в HOMD, но «некультивируемые клоны бактерий» в GenBank были на 100% идентичны последовательности, представляющей геномовидов Porphyromonas PAJ1 (таблица S3). У взрослых особей такие виды, как P. asaccharolytica и P. endodontalis и родственный ему Tannerella forsythia , также были обнаружены в значительных количествах в образцах, взятых у взрослых. P. gingivalis присутствовал только в одном образце от здорового взрослого человека (Таблица S2).

В то время как среди других родов преобладало относительно небольшое количество видов, Prevotella продемонстрировала значительное видовое разнообразие, особенно среди взрослых особей. Помимо известных видов, среди которых наиболее многочисленными были P. melaninogenica / P. histicola , было обнаружено несколько геномовидов. P. melaninogenica / P. histicola , которые были обнаружены в значительных количествах (Таблица S2), были в значительной степени связаны с рецидивирующим тонзиллитом у взрослых.Кроме того, несколько видов с низкой численностью различались по встречаемости у детей и взрослых (Таблица 2).

Чтобы проанализировать, различались ли структуры филогенетических сообществ между четырьмя группами, мы использовали расстояния UniFrac филогенетического дерева, созданного с помощью программы Clearcut. Результирующая кластеризация, визуализированная графиком PCoA, показывает, что образцы сгруппированы по возрасту и частично по состоянию здоровья (рисунок 3). Кластеризация, наблюдаемая на графике PCoA, была статистически подтверждена тестом AMOVA, который показал, что микробиота как детей с гиперплазией миндалин, так и детей с рецидивирующим тонзиллитом значительно отличалась от таковой здоровых взрослых (p <0.01) и взрослых с рецидивирующим тонзиллитом (p = 0,04; p <0,01 соответственно). Кроме того, тест AMOVA выявил значительную разницу в структуре сообщества у здоровых взрослых по сравнению со взрослыми с рецидивирующим тонзиллитом (p <0,001), тогда как между детьми с гиперплазией миндалин и детьми с рецидивирующим тонзиллитом не наблюдалось значительной разницы (p = 0,13). Тем не менее, когда одна внешняя выборка из группы детей с рецидивирующим тонзиллитом была исключена из анализа, в этих двух группах также была очевидна существенно различающаяся структура сообщества (p = 0.01).

Рис. 3. График анализа главных координат (PCoA), показывающий отношения сходства между составами микробиоты крипт 20 миндалин.

Графики были созданы с использованием взвешенных расстояний UniFrac с использованием филогенетического дерева, созданного с помощью программы Clearcut. Эти два компонента объясняют 42,8% дисперсии. Образцы, взятые у детей с гиперплазией миндалин, показаны синими кружками; дети с рецидивирующим тонзиллитом в виде красных кружков; здоровые взрослые в виде зеленых кружков; и взрослые с рецидивирующим тонзиллитом в виде фиолетовых кругов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056418.g003

Обсуждение

Насколько нам известно, это первый отчет о сложной микробиоте крипт миндалин у детей и взрослых, оцененной с помощью углубленного секвенирования. Миндалины являются частыми очагами инфекции, а микробиота крипт как при здоровье, так и при болезни находится в тесном контакте с важнейшим антигеном, воздействующим на лимфоидные ткани, с еще неизвестными иммунологическими последствиями. В то время как предыдущие исследования были сосредоточены на поверхности миндалин, мы взяли образцы микробиоты крипт, что стало возможным благодаря общей анестезии 20 пациентов в сочетании с тонзиллэктомией.Одним из ограничений этой процедуры является то, что здоровые миндалины у детей должны были быть заменены гиперпластическими миндалинами без признаков воспаления и без предшествующего острого или рецидивирующего тонзиллита.

Зная о текущем внимании к артефактам, которые могут быть внесены пиросеквенированием [27], [28], [34], мы применили строгий протокол для фильтрации последовательностей. Кроме того, последовательности были подвергнуты филогенетическому анализу в сочетании с обнаружением видоспецифических сигнатур последовательностей, что, помимо создания дополнительного этапа проверки, позволило нам идентифицировать значительную часть микробиоты на уровне видов, даже виды, которые имеют более 97% идентичности последовательности гена 16S рРНК, такой как у нескольких представителей рода Streptococcus с отчетливой клинической значимостью.Отнесение последовательностей 16S рРНК к конкретным таксонам обычно выполняется путем автоматической оценки общей идентичности последовательностей с широким диапазоном эталонных последовательностей в базах данных, некоторые из которых имеют неправильную маркировку [31]. Как показывают наши результаты, при этой процедуре может быть упущено подробное таксономическое сообщение о последовательностях.

Наши результаты показывают, что микробиота крипт миндалин к возрасту 2–4 лет уже достигла той же общей сложности, что и у взрослых, что также подтверждается статистическим сравнением индексов разнообразия invsimpson и Shannon, но при этом сохраняются поразительные различия. ранее было предложено культурологическими исследованиями [35].Бактерии, которые были обнаружены почти исключительно у детей, — это видов H. influenzae , H. haemolyticus , видов Neisseria и S. pneumoniae . Облигатные анаэробы, такие как Porphyromonas , Prevotella и Fusobacterium , в большом количестве присутствовали у детей, но разнообразие видов Porphyromonas было больше у взрослых и включало виды, которые считаются предполагаемыми патогенами заболеваний пародонта [36], i.е. P. gingivalis , P. endodontalis и Tannerella forsythia .

Только шесть типов присутствовали в значительных пропорциях (> 1%), что согласуется с данными из других анатомических участков и подчеркивает избирательность колонизации человеческого тела [19], [21], [37] — [39]. Одна из основных целей Международного проекта по микробиому человека состоит в том, чтобы определить, существует ли идентифицируемый «основной микробиом» общих организмов, генов или функциональных возможностей в данной среде обитания тела всех или подавляющего большинства людей [40].Мы обнаружили, что довольно небольшое количество таксонов, в основном принадлежащих к родам Streptococcus и Prevotella, присутствовало в криптах миндалин всех 20 образцов и составляло значительную часть от общего числа последовательностей. Кроме того, на восемь наиболее распространенных родов приходилось более 70% от общего числа последовательностей во всех выборках. Эти результаты показывают, что сердцевинный микробиом присутствует в криптах миндалин человека независимо от возраста и состояния здоровья, и подтверждают общую идею сердцевинного микробиома человека.Хотя мы включили 20 человек, необходимо проанализировать больше людей, чтобы сделать определенные выводы относительно деталей основного микробиома в криптах миндалин человека. В очень всестороннем исследовании образцов фекалий 154 человек, проведенном Turnbaugh et al. [19], во всех образцах не было обнаружено единого бактериального филотипа. Тем не менее, микробиом ядра кишечника, по-видимому, существует на уровне метаболических функций, что позволяет предположить, что у разных людей сохраняется скорее микробная функция, чем филогения.

Поразительно, что коринебактерии и коагулазонегативные стафилококки, которые являются важными компонентами микробиоты верхних дыхательных путей в целом, были обнаружены лишь в небольших количествах в криптах миндалин, что подтверждает наши ожидания, что крипты представляют собой уникальную среду обитания. больше напоминает микробиоту пародонта [41], чем традиционные поверхности слизистой оболочки. Исследование показало значительные различия между микробиотой крипт миндалин у здоровых взрослых и взрослых с рецидивирующим тонзиллитом, а также несколько разные структуры сообщества у детей с рецидивирующим тонзиллитом и детей с гиперплазией миндалин.Хотя необходимы исследования с участием большего числа субъектов, эти результаты подтверждают гипотезу о том, что рецидивирующий тонзиллит может быть вызван сдвигом микробиоты крипт миндалин, но со значительными индивидуальными различиями.

Как и при других инфекционных заболеваниях, связанных со сложной микробиотой, идентификация конкретного этиологического агента затруднена. Одним из ярких различий между здоровыми взрослыми и взрослыми с рецидивирующим тонзиллитом было присутствие Fusobacterium necrophorum в последнем.В течение последнего десятилетия, F. necrophorum привлек внимание из-за возможной связи с тонзиллитом, особенно рецидивирующим тонзиллитом [9], [10], [42], а также как этиология тяжелого синдрома Лемьера [43]. Синдром начинается с фаринготонзиллита и / или перитонзиллярной инфекции, за которыми следует односторонний отек и болезненность грудинно-ключично-сосцевидной мышцы из-за тромбофлебита внутренней яремной вены. В течение одной недели у пациентов может развиться тяжелый постангинальный синдром F.necrophorum сепсис с ознобом, высокой температурой и метастатическими инфекциями, особенно в легкие и кости [44]. Хотя синдром часто считается редким, за последние два десятилетия число зарегистрированных случаев увеличилось, а ежегодная заболеваемость в Дании оценивается в 3,6 случая на миллион. У молодых людей в возрасте 15–24 лет ежегодная заболеваемость может достигать 14,4 случая на миллион [45], что в пять раз выше, чем заболеваемость острой ревматической лихорадкой, вызываемой S.pyogenes [42]. Синдром обычно требует госпитализации на срок более трех недель, и даже сегодня уровень смертности составляет около 7% [44]. F. necrophorum предполагалось, что не является частью нормальной микробиоты миндалин человека [46], но недавние исследования с использованием культурально-независимых методов (кПЦР) выявили присутствие F. necrophorum в мазках из горла здоровых людей. миндалины [10], [47]. Такие результаты, особенно результаты на основе ПЦР, могут быть смещенными и не раскрывать относительные пропорции целевых видов в сложной микробиоте.Настоящее исследование, в котором применялся наиболее чувствительный и объективный независимый от культуры метод, показало, что F. necrophorum почти полностью отсутствует в криптах миндалин у детей и здоровых взрослых, но присутствует в значительных количествах во всех образцах от взрослых, страдающих от рецидивирующий тонзиллит. Это подтверждает гипотезу о том, что F. necrophorum этиологически вовлечен в рецидивирующий или хронический тонзиллит у молодых людей и что миндалины составляют основной очаг синдрома Лемьера.Однако из-за сложности микробиоты нельзя исключить полимикробную этиологию рецидивирующего тонзиллита у взрослых.

Предыдущие бактериологические исследования рецидивирующего тонзиллита на основе культур были сосредоточены в основном на бактериях, которые признаны этиологическими агентами острого тонзиллита, то есть S. pyogenes , S. aureus, S. pneumoniae, и H. influenzae . В большинстве случаев рецидивирующего тонзиллита эти виды могут быть выделены из ядра миндалин [47] — [49].Мы обнаружили значительные количества S. pneumoniae в двух образцах от детей и H. influenzae в большинстве детей. Однако последовательности, отнесенные к роду Staphylococcus , составляют менее 0,1% от общего числа последовательностей, а S. pyogenes и Streptococcus dysgalactiae subp. equisimilis составляли лишь незначительную долю как у детей, так и у взрослых. Хотя методология, в частности экстракция ДНК, дизайн праймеров, а также различия в амплификации и сродстве к последовательностям между разными бактериями, в некоторой степени влияют на полученные результаты, анализы на основе последовательностей по-прежнему более объективны, чем ранее использовавшиеся методы на основе культивирования.Таким образом, наши результаты предполагают, что исследования на основе культур могут переоценить численность и клиническую значимость S. pyogenes, S. dysgalactiae subp. equisimilis и S. aureus у детей и взрослых с рецидивирующим тонзиллитом.

H. influenzae был связан с рецидивирующим тонзиллитом [13] и гиперпластическими миндалинами у детей [49]. Мы обнаружили, что H. influenzae присутствовало в основных пропорциях в восьми из 10 образцов, взятых у детей (> 2% от всех последовательностей), без различий в количестве между гиперплазией миндалин и рецидивирующим тонзиллитом.То же самое относится и к H. haemolyticus, , который, в отличие от H. influenzae , считается имеющим низкий патогенный потенциал [50]. Наши результаты показывают, что крипта миндалин является основным местом обитания этого вида. Напротив, видовой состав Neisseria отличался в образцах от детей с гиперплазией миндалин и в образцах от детей с рецидивирующим тонзиллитом. N. lactamica, , обнаруженный исключительно у детей с гиперплазией миндалин и в очень низких пропорциях у взрослых, ранее было показано, что обеспечивает иммунологическую «нечувствительность» у хозяина из-за экспрессии суперантигена В-клеток с высоким сродством к поверхностным IgM и IgD.Это позволяет N. lactamica специфически активировать CD5 ⁺ B1 клетки, которые продуцируют естественные антитела, препятствующие активации адаптивной иммунной системы [51], [52].

спирохет, , особенно Treponema, , были связаны с хроническим тонзиллитом в бельгийском исследовании [53], а T. denticola является членом так называемого «красного комплекса» видов бактерий, которые тесно связаны при пародонтите [36]. Интересно, что Treponema , в основном T.medium и T. denticola были обнаружены почти исключительно у взрослых, особенно у здоровых взрослых. Porphyromonas gingivalis , который также является частью «красного комплекса» поддесневых бактерий, связанных с пародонтозом, присутствовал только у одного здорового взрослого человека. Напротив, P. catoniae был обнаружен во всех образцах вместе с еще некультивируемым геномовидом Porphyromonas PAJ1, который, согласно поиску BLAST, ранее был обнаружен в таких разнообразных средах обитания, как подвздошная кишка, дистальный отдел пищевода и в коже человека, а также в слюне, субгигивальной бляшке и в образцах нижних дыхательных путей от пациентов с муковисцидозом только видов Porphyromonas обнаружены у детей [54] — [56].Интересно, что P. catoniae является одним из первых колонизаторов периодонтальных щелей [57] и был предложен в качестве маркера здоровья полости рта [58], [59], что согласуется с его обычным присутствием в невоспаленных миндалинах.

Prevotella intermedia ранее была связана с рецидивирующим тонзиллитом, что подтверждается демонстрацией сывороточных антител, реактивных с P. intermedia у пациентов с рецидивирующим нестрептококковым тонзиллитом [60]. В нашем исследовании P.intermedia практически отсутствовали, за исключением одной здоровой взрослой особи (образец 13), где этот вид встречался в очень больших количествах (84,6%). Как потенциальный фактор воспаления миндалин, P. melaninogenica / P. histicola (неразличимы при анализе последовательности) были обнаружены в значительно больших количествах в образцах взрослых с рецидивирующим тонзиллитом, чем у здоровых взрослых. Это согласуется с предыдущими данными о более крупных пропорциях P. melaninogenica у детей с рецидивирующими воспалениями миндалин по сравнению с нормальными миндалинами [61]. P. melaninogenica признан одним из продуцентов β-лактамаз [62], которые могут быть обнаружены в больших количествах в миндалинах [63], что объясняет, почему пенициллин может быть неэффективным для лечения рецидивирующего тонзиллита [64] как β-лактамаза. продуцирующие анаэробные бактерии могут защитить другие патогенные бактерии от уничтожения пенициллином.

В заключение, наши результаты продемонстрировали основной микробиом относительно небольшого числа пропорционально значимых родов во всех образцах крипт миндалин независимо от возраста и состояния здоровья, но со значительными различиями в относительных пропорциях у людей как в состоянии здоровья, так и во время болезни.Анализ Unifrac показал, что рецидив тонзиллита связан со сдвигом бактериального состава крипт миндалин. Используя новый подход к присвоению последовательностей на уровне видов, мы смогли продемонстрировать неизвестные до сих пор детали микробиоты, включая значительные различия между детьми и взрослыми. F. necrophorum, S. intermediateus, и P. melaninogenica / P. histicola были в значительной степени связаны с рецидивирующим тонзиллитом у взрослых, в то время как виды, традиционно связанные с острым тонзиллитом, т.е.е. S. pyogenes, S. dysgalactiae subsp. equisimilis, и S. aureus, были обнаружены в очень низких пропорциях. Эти подробные карты микробиоты крипт миндалин в состоянии здоровья и болезней обеспечивают улучшенную основу для понимания сложных взаимоотношений паразит-хозяин в особой и важной среде обитания человеческого тела, имеющей тесные связи с иммунной системой.

Материалы и методы

Субъектов

Всего было исследовано 20 образцов от 20 пациентов, поступивших в отделение «ухо-нос-горло» больницы Гентофте, Дания.Десять образцов были от детей в возрасте от 2 до 4 лет, а 10 образцов — от взрослых в возрасте от 18 до 35 лет. Во время тонзиллэктомии из-за рецидивирующего тонзиллита было взято по пять образцов у детей и взрослых. Остальные пять образцов были взяты у детей во время тонзиллэктомии из-за гиперплазии миндалин, но без текущего или предыдущего острого или рецидивирующего тонзиллита. Пять образцов от здоровых взрослых, у которых в анамнезе не было эпизодов острого или рецидивирующего тонзиллита, служили здоровым контролем и были собраны во время операции, отличной от тонзиллэктомии.Эти пять контрольных пациентов лечились от полипа голосовых связок (два пациента), доброкачественной опухоли горла (один пациент) и пластической хирургии уха (один пациент) и перегородки (один пациент) (см. Таблицу 1). Пациенты были исключены из исследования, если они получали антибиотики за месяц до сбора образцов или проходили лечение иммунодепрессантами. На момент отбора проб ни у одного из включенных пациентов не было острой инфекции горла. Рецидивирующий тонзиллит определяется как три или более случаев острого тонзиллита в год.

Образцы из крипт миндалин были взяты во время анестезии, но перед операцией, с помощью небольшой острой хирургической ложки. Особое внимание уделялось тому, чтобы не прикасаться ложкой к внешней поверхности миндалины. Образцы собирали из двух крипт из одной миндалины и объединяли в криопробирки, содержащие 400 мкл ATL-буфера (Qiagen), немедленно замороженного при -20 ° C. Затем образцы были транспортированы замороженными на сухом льду из больницы Гентофте в Орхусский университет, где были выполнены все анализы.

Заявление об этике

Протокол исследования был одобрен Датским комитетом по научной этике (ссылка 20080224), и письменное информированное согласие было получено от пациентов или родителей детей, включенных в исследование.

Экстракция ДНК

После оттаивания к образцу добавляли 45 мкл раствора протеиназы К (10 мкг / мкл) и инкубировали при 55 ° C в течение двух часов. Затем образцы переносили в пробирку E Lysing Matrix Tube (MP Biomedicals) и добавляли 500 мкл ТЕ-буфера.Экстракцию ДНК из образцов проводили на Fastprep FP120 (Thermo Savant) при 5,5 мс ^-1 в течение 30 секунд. Обработку повторяли три раза, и между обработками образцы охлаждали на льду. Наконец, образцы центрифугировали в течение 5 минут при 3000 × g, а затем супернатант переносили в три пробирки объемом 1,5 мл (Eppendorf) по 200 мкл в каждой. Окончательная экстракция ДНК была произведена с использованием набора Qiagen Blood and Tissue и протокола Animal Tissue из шага 3 в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen).ДНК элюировали в буфере 100 AE.

ПЦР и пиросеквенирование

Неполные последовательности гена 16S рРНК амплифицировали из образцов с использованием подхода со штрих-кодом и праймером для мультиплексного пиросеквенирования. Используя праймер 530F-mod (адаптер 5′-Fusion A-Barcode-GCCAGCMGCNGCGGTA-3) и праймер 1061R (адаптер 5′-Fusion B-CRRCACGAGCTGACGAC-3) фрагмент ДНК длиной 562 п.н., охватывающий область V4 – V6 16S. Ген рРНК амплифицировали с помощью ПЦР [22], что позволяет анализировать последовательность области V4 – V5.Эти праймеры с успехом использовались в других исследованиях микробного разнообразия с использованием подхода пиросеквенирования [22], [23]. Оценки in silico предсказывают, что области V3 – V4 и V4 – V5 обеспечат наивысшую точность классификации для технологии пиросеквенирования [24], а также самую низкую частоту базовой ошибки в 454-пиросеквенировании по сравнению с областью V6 / V9 [25]. . Адаптеры для слияния предназначались для набора GS FLX Titanium emPCR (Lib-L), а штрих-коды длиной 10 пар оснований были мультиплексным идентификатором (MID), от MID1 до MID8, от Roche.Реакционные смеси для ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл и включали 10 мкл разбавленного образца ДНК, 2,5 мкл реакционного буфера 10 × PfuUltra II (Stratagene), 400 нМ (каждый) каждого праймера (IDT), 0,5 мкл PfuUltra. II слитая ДНК-полимераза HS (Stratagene), 1 мкл смеси dNTP (25 мМ каждого dNTP) и 9 мкл воды для молекулярной биологии. ПЦР проводили в следующих условиях цикла: начальная денатурация при 95 ° C в течение 2 минут, затем 30 циклов денатурации при 95 ° C в течение 20 секунд, отжиг при 55 ° C в течение 20 секунд, элонгация при 72 ° C в течение 15 секунд. с, а затем заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 3 мин.Для всех образцов было проведено шесть реакций ПЦР. Продукты ПЦР каждой из шести реакций каждого образца проверяли на агарозном геле. Затем правильную полосу вырезали из геля, объединяли и очищали с использованием набора NucleoSpin® Extract Kit (Macherey-Nagel). Концентрацию очищенного продукта ПЦР измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Ампликоны 16S рРНК секвенировали однонаправленно от переднего конца праймера с использованием химии титана и двух двухзонных титровальных планшетов GS FLX Standard Pico TiterPlates (70X75) на платформе 454 Genome Sequencer FLX в 454 Life Sciences (Бранфорд, Коннектикут, США).Все последовательности были депонированы в архив считывания последовательностей NCBI (SRA) с номером доступа SRA053229.

Обработка последовательностей и статистический анализ

Для обработки и анализа данных пиросеквенирования использовалась программа с открытым исходным кодом, независимая от платформы и поддерживаемая сообществом, mothur v.1.22.2 (http.//www.mothur.org) [26]. Обработку исходных данных пиросеквенирования проводили в соответствии со стандартной рабочей процедурой (СОП) Schloss (http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP) [25].Вкратце, шум секвенирования изначально был уменьшен с помощью команды shhh.flows, которая является реализацией алгоритма AmpliconNoise в программном пакете mothur [27]. Последовательности с более чем двумя несовпадениями с последовательностью праймера, с одним несовпадением с последовательностью штрих-кода, содержащие более восьми гомополимеров или содержащие какие-либо неоднозначные символы, удаляли перед шумоподавлением последовательностей. Максимальное количество потоков было установлено на 720, как рекомендовано Quince et al. [27]. После шумоподавления последовательности были выровнены по эталонному выравниванию Silva, а затем полученное выравнивание было отфильтровано так, чтобы все наши последовательности перекрывались только в одной и той же области.Кроме того, были удалены последовательности короче 350 оснований. Для дальнейшего уменьшения ошибок секвенирования этап предварительной кластеризации, реализующий алгоритм псевдо-одиночного связывания, первоначально разработанный Huse et al. [28]. Химеры были удалены с помощью встроенной версии алгоритма UCHIME в mothur [29]. Наконец, синглтоны и дубликаты удаляли перед анализом, чтобы исключить включение последовательностей из-за потенциального загрязнения или ошибок секвенирования. Все образцы были разрежены до глубины секвенирования 4599 считываний на образец перед последующим анализом с использованием Sub.пример команды в mothur. Однако все последовательности, прошедшие контроль качества в каждом образце, были использованы для филогенетического анализа последовательностей на уровне видов.

Предварительная сортировка последовательностей была выполнена путем кластеризации последовательностей в операционные таксономические единицы (OTU), определяемые уровнем расстояния 3% с использованием алгоритма кластеризации среднего соседа. Индексы разнообразия Invsimpson и Shannon рассчитывались в mothur. Взвешенный анализ UniFrac был выполнен путем создания филогенетического дерева с использованием программы Clearcut (http: // bioinformatics.hungry.com/clearcut/) в программу mothur.

Классификация последовательностей по типам и родам была проведена с использованием байесовского метода и таксономической схемы из RDP. Порог достоверности был установлен на 80%. Чтобы отнести последовательности к видам, мы выполнили филогенетический анализ уникальных последовательностей 16S рРНК с включением последовательностей генов 16S рРНК соответствующих обозначенных типовых штаммов. Построение филогенетического дерева и бутстрап-анализы с использованием 500 повторов были проведены в Mega v.5.05 [30]. Последовательности, которые образовывали когерентные и отчетливые кластеры вместе с штаммом одного типа, были отнесены к соответствующим видам. Если диффузные кластеры включали несколько типовых штаммов, мы относили последовательности к конкретным таксонам или группам таксонов, когда это возможно, путем обнаружения видоспецифичных сигнатур последовательностей, идентифицированных в соответствии с недавно описанными принципами [31]. Сигнатуры первоначально были идентифицированы на основе выравнивания последовательностей 16S рРНК типа и эталонных штаммов и подтверждены анализом BLAST в версии 10 проекта базы данных рибосомных РНК и базе данных нуклеотидных последовательностей NCBI.Сигнатуры последовательностей, используемые для определения последовательностей на уровне видов, показаны в таблице S1. Последовательности для филогенетического анализа были получены из общего количества последовательностей с помощью команды « get.lineage » в mothur, которая позволяет извлекать последовательности, отнесенные к одним и тем же таксонам, например семейство или род с помощью команды « classify.seq s» в mothur. Последовательности, не классифицированные по уровню родов с помощью автоматической классификации, при необходимости включались в филогенетический анализ.На основании численности и важности с помощью этого подхода были идентифицированы последовательности из следующих таксонов до уровня вида: Streptococcaceae, Neisseriaceae, Fusobacterium, Pasteurellaceae, Prevotella, Porphyromonadaceae, Treponema, Flavobacteriaceae, Veillonellaceae, Gemerellaimaonasia, 80 и Actinomyces. Также в филогенетический анализ были включены последовательности, которые не были отнесены к уровню рода с помощью автоматической классификации в Mothur.Сюда входят последовательности, отнесенные к неклассифицированным Neisseriaceae, неклассифицированным Pasteurellaceae, неклассифицированным Flavobacteriaceae, и неклассифицированным Bacteroidales. Последовательности , отнесенные к геномовидам филогенетическим анализом, также были обработаны с использованием базы данных орального микробиома человека (HOMD) (www.HOMD.org) [32]. Номера доступа GenBank для последовательностей геномовидов приведены в таблице S3.

Metastats использовался для выявления различных признаков у детей и взрослых, детей с гиперплазией и детей с рецидивирующим тонзиллитом, а также здоровых взрослых и взрослых с рецидивирующим тонзиллитом [33].Таксоны считались дифференциально многочисленными при p <0,05 и q <0,05. Для выявления различий в индексах разнообразия Инсимпсона и Шеннона между группами использовался t-критерий Стьюдента. Различия считали достоверными при p <0,05. Молекулярная дисперсия (AMOVA) применялась для проверки того, было ли разделение определенных групп, визуализированных графиком главных координат (PCoA), статистически значимым. Различия считали достоверными при p <0,05.

Дополнительная информация

Таблица S1.

Сигнатуры последовательностей в генах 16S рРНК, используемые для идентификации видов и групп видов Стрептококк , Prevotella , Haemophilus , Aggregatibacter, Actinomyces, и Veillonellaceae в сочетании с филогенетическими анализами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056418.s001

(DOCX)

Таблица S2.

Процентное соотношение типов, родов и видов в каждой выборке. Идентифицированные виды составляли от 70% до 99% (среднее значение: 90%) от общего числа последовательностей в каждом образце. Значимые различия, рассчитанные с использованием метастатических данных между группами, выделены жирным шрифтом. См. «Материал и метод» для описания методов, используемых для видовой идентификации последовательностей.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056418.s002

(XLSX)

Благодарности

Каспер Уруп Кьельдсен любезно помог с экстракцией ДНК FastPrep.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: MK AJ CHS. Проведены эксперименты: AJ MK HF-O CHS. Проанализированы данные: А.Ю. МК. Написал статью: AJ MK CHS HF-O.

Список литературы

1. 1. Gill SR, Pop M, Deboy RT, Eckburg PB, Turnbaugh PJ и др.(2006) Метагеномный анализ микробиома дистального отдела кишечника человека. Наука 312: 1355–1359.
2. 2. Mazmanian SK, Liu CH, Tzianabos AO, Kasper DL (2005) Иммуномодулирующая молекула симбиотических бактерий направляет созревание иммунной системы хозяина. Cell 122: 107–118.
3. 3. Pamer EG (2007) Иммунные реакции на комменсальные и экологические микробы. Nat Immunol 8: 1173–1178.
4. 4. Xu J, Mahowald MA, Ley RE, Lozupone CA, Hamady M и др.(2007) Эволюция симбиотических бактерий в дистальном отделе кишечника человека. PLoS Biol 5: e156.
5. 5. Геберт А., Пабст Р. (1999) М-клетки вне кишечника. Семин Иммунол 11: 165–170.
6. 6. Перри М., Уайт А. (1998) Иммунология миндалин. Immunol Today 19: 414–421.
7. 7. Карапетис Дж. Р., Стир А. К., Малхолланд Е. К., Вебер М. (2005) Глобальное бремя стрептококковых заболеваний группы А. Lancet Infect Dis 5: 685–694.
8. 8. Turner JC, Hayden FG, Lobo MC, Ramirez CE, Murren D (1997) Эпидемиологические доказательства бета-гемолитических стрептококков группы C Lancefield как причины экссудативного фарингита у студентов колледжа.J Clin Microbiol 35: 1–4.
9. 9. Batty A, Wren MW (2005) Распространенность Fusobacterium necrophorum и других патогенов верхних дыхательных путей, выделенных из мазков из зева. Br J Biomed Sci 62: 66–70.
10. 10. Jensen A, Hagelskjaer Kristensen L, Prag J (2007) Обнаружение Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme при тонзиллите у молодых людей с помощью ПЦР в реальном времени. Clin Microbiol Infect 13: 695–701.
11. 11.Brook I (2002) Анаэробные бактерии в верхних дыхательных путях и другие инфекции головы и шеи. Анн Ото Ринол Ларин 111: 430–440.
12. 12. Chole RA, Faddis BT (2003) Анатомические доказательства микробных биопленок в тканях миндалин: возможный механизм для объяснения хронического заболевания. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 129: 634–636.
13. 13. Gaffney RJ, Cafferkey MT (1998) Бактериология нормальных и больных миндалин, оцененная с помощью тонкоигольной аспирации: Haemophilus influenzae и патогенез рецидивирующего острого тонзиллита.Clin Otolaryngol Allied Sci 23: 181–185.
14. 14. Jeong JH, Lee DW, Ryu RA, Lee YS, Lee SH и др. (2007) Бактериологическое сравнение сердцевины миндалин при рецидивирующем тонзиллите и гипертрофии миндалин. Ларингоскоп 117: 2146–2151.
15. 15. Kuhn JJ, Brook I, Waters CL, Church LW, Bianchi DA и др. (1995) Количественная бактериология миндалин, удаленных у детей с гипертрофией тонзиллита и рецидивирующим тонзиллитом с гипертрофией и без нее. Анн Отол Ринол Ларингол 104: 646–652.
16. 16. Stjernquist-Desatnik A, Holst E (1999) Микробная флора миндалин: сравнение рецидивирующего тонзиллита и нормальных миндалин. Acta Otolaryngol 119: 102–106.
17. 17. Согин М.Л., Моррисон Х.Г., Хубер Дж. А., Марк Велч Д., Хьюз С. М. и др. (2006) Микробное разнообразие морских глубин и малоизученной «редкой биосферы». Proc Natl Acad Sci U S A 103: 12115–12120.
18. 18. Keijser BJ, Zaura E, Huse SM, van der Vossen JM, Schuren FH, et al. (2008) Пиросеквенирующий анализ микрофлоры полости рта здоровых взрослых.J Dent Res 87: 1016–1020.
19. 19. Тернбо П.Дж., Хамади М., Яцуненко Т., Кантарел Б.Л., Дункан А. и др. (2009) Основной микробиом кишечника у тучных и худых близнецов. Природа 457: 480–484.
20. 20. Ву Г.Д., Льюис Д.Д., Хоффманн С., Чен Ю.Й., Найт Р. и др. (2010) Методы отбора проб и пиросеквенирования для характеристики бактериальных сообществ в кишечнике человека с использованием тегов последовательности 16S. BMC Microbiology 10: 206.
21. 21. Заура Э., Кейсер БДЖФ, Хьюз С.М., Крилаард В. (2009) Определение здорового «основного микробиома» микробных сообществ полости рта.BMC Microbiology 9.
22. 22. Ларсен Н., Фогенсен Ф.К., ван ден Берг Ф.В., Нильсен Д.С., Андреасен А.С. и др. (2010) Микробиота кишечника взрослых людей с диабетом 2 типа отличается от взрослых людей, не страдающих диабетом. Plos One 5: e9085.
23. 23. Ларсен Н., Фогенсен Ф.К., Гобель Р., Михаэльсен К.Ф., Абу Аль-Суд В. и др. (2011) Преобладающие роды фекальной микробиоты у детей с атопическим дерматитом не изменяются при приеме пробиотических бактерий Lactobacillus acidophilus NCFM и Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bi-07. FEMS Microbiol Ecol 75: 482–496.
24. 24. Клаэссон М.Дж., Ван К., О’Салливан О., Грин-Диниз Р., Коул Дж. Р. и др. (2010) Сравнение двух технологий секвенирования следующего поколения для определения очень сложного состава микробиоты с использованием тандемных вариабельных участков гена 16S рРНК. Nucleic Acids Res 38: e200.
25. 25. Schloss P, Gevers D, Westcott S (2011) Снижение влияния артефактов амплификации и секвенирования ПЦР на исследования на основе 16S рРНК.PloS One 6 (12): e27310.
26. 26. Schloss PD, Westcott SL, Ryabin T, Hall JR, Hartmann M, et al. (2009) Представляем mothur: программное обеспечение с открытым исходным кодом, независимое от платформы, поддерживаемое сообществом для описания и сравнения микробных сообществ. Appl Environ Microbiol 75: 7537–7541.
27. 27. Quince C, Lanzen A, Davenport RJ, Turnbaugh PJ (2011) Удаление шума из пиросеквенированных ампликонов. BMC Bioinformatics 12: 38.
28. 28. Хьюз С.М., Велч Д.М., Моррисон Х.Г., Согин М.Л. (2010) Разглаживание морщин в редкой биосфере с помощью улучшенной кластеризации OTU.Environ Microbiol 12: 1889–1898.
29. 29. Edgar RC, Haas BJ, Clemente JC, Quince C, Knight R (2011) UCHIME улучшает чувствительность и скорость обнаружения химер. Биоинформатика 27: 2194–2200.
30. 30. Тамура К., Петерсон Д., Петерсон Н., Стечер Г., Ней М. и др. (2011) MEGA5: анализ молекулярной эволюционной генетики с использованием методов максимального правдоподобия, эволюционного расстояния и максимальной экономии. Mol Biol Evol 28: 2731–2739.
31. 31. Scholz CF, Poulsen K, Kilian M (2012) Новый молекулярный метод идентификации Streptococcus pneumoniae, применимый к клинической микробиологии и исследованиям микробиома на основе последовательности 16S рРНК.J Clin Microbiol 50: 1968–1973.
32. 32. Дьюхерст Ф.Е., Чен Т., Изард Дж., Пастер Б.Дж., Таннер А.С. и др. (2010) Микробиом полости рта человека. J. Bacteriol. 192: 5002–5017.
33. 33. White JR, Nagarajan N, Pop M (2009) Статистические методы обнаружения дифференциально распространенных особенностей в клинических метагеномных образцах. Вычислительная биология PLoS 5: e1000352.
34. 34. Айва С., Ланзен А., Кертис Т.П., Давенпорт Р.Дж., Холл Н. и др. (2009) Точное определение микробного разнообразия по 454 данным пиросеквенирования.Нат методы 6: 639–641.
35. 35. Brook I, Foote PA Jr (1986) Сравнение микробиологии рецидивирующего тонзиллита у детей и взрослых. Ларингоскоп 96: 1385–1388.
36. 36. Holt SC, Ebersole JL (2005) Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola и Tannerella forsythia : «красный комплекс». прототип полибактериального патогенного консорциума при пародонтите. Периодонтол 2000 38: 72–122.
37. 37. Костелло Е.К., Лаубер К.Л., Хамади М., Фирер Н., Гордон Дж. И. и др.(2009) Изменчивость бактериального сообщества в среде обитания человеческого тела в пространстве и времени. Science 326: 1694–1697.
38. 38. Грайс Э.А., Сегре Я.А. (2011) Микробиом кожи. Nat Rev Microbiol 9: 244–253.
39. 39. Лю С.М., Козетти М.К., Азиз М., Буххаген Дж.Л., Контент-Куомо Т.Л. и др. (2011) Отологический микробиом: исследование бактериальной микробиоты у педиатрического пациента с хроническим серозным средним отитом с использованием пиросеквенирования на основе гена 16SrRNA. Хирургия головы и шеи Arch Otolaryngol 137: 664–668.
40. 40. Тернбо П.Дж., Лей Р.Э., Хамади М., Фрейзер-Лиггетт С.М., Найт Р. и др. (2007) Проект микробиома человека. Природа 449: 804–810.
41. 41. Дьюхерст Ф.Е., Чен Т., Изард Дж., Пастер Б.Дж., Таннер А.С. и др. (2010) Микробиом полости рта человека. J Bacteriol 192: 5002–5017.
42. 42. Centor RM (2009) Расширить парадигму фарингита среди подростков и молодых людей. Ann Intern Med 151: 812–815.
43. 43. Sinave CP, Hardy GJ, Fardy PW (1989) Синдром Лемьера: гнойный тромбофлебит внутренней яремной вены, вторичный по отношению к ротоглоточной инфекции.Медицина 68: 85–94.
44. 44. Hagelskjaer LH, Prag J, Malczynski J, Kristensen JH (1998) Заболеваемость и клиническая эпидемиология некробациллеза, включая синдром Лемьера, в Дании, 1990–1995. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 17: 561–565.
45. 45. Hagelskjaer Kristensen L, Prag J (2008) Синдром Лемьера и другие диссеминированные инфекции Fusobacterium necrophorum в Дании: проспективное эпидемиологическое и клиническое исследование. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 27: 779–789.
46. 46. Риордан Т. (2007) Инфицирование человека Fusobacterium necrophorum (некробациллез) с акцентом на синдром Лемьера. Clin Microbiol Rev 20: 622–659.
47. 47. Klug TE, Henriksen JJ, Fuursted K, Ovesen T (2011) Аналогичные показатели восстановления Fusobacterium necrophorum из повторно инфицированных и неинфицированных миндалин. Дэн Мед Булл 58: A4295.
48. 48. Гул М., Окур Э., Чирагил П., Йылдырым И., Арал М. и др.(2007) Сравнение поверхностных и основных культур миндалин при рецидивирующем тонзиллите. Am J Otolaryngol 28: 173–176.
49. 49. Stjernquist-Desatnik A, Prellner K, Schalen C (1990) Колонизация Haemophilus influenzae и стрептококками группы A при рецидивирующем остром тонзиллите и при гипертрофии миндалин. Acta Otolaryngol 109: 314–319.
50. 50. Мерфи Т.Ф., Брауэр А.Л., Сетхи С., Килиан М., Цай Х и др. (2007) Haemophilus haemolyticus : комменсал дыхательных путей человека, который следует отличать от Haemophilus influenzae .J Infect Dis 195: 81–89.
51. 51. Воган А.Т., Бракенбери Л.С., Массари П., Давенпорт В., Горриндж А. и др. (2010) Neisseria lactamica избирательно индуцирует митогенную пролиферацию пула наивных В-клеток через Ig на поверхности клетки. J Immunol 185: 3652–3660.
52. 52. Vaughan AT, Gorringe A, Davenport V, Williams NA, Heyderman RS (2009) Отсутствие иммунитета слизистой оболочки в верхних дыхательных путях человека к комменсальным бактериям Neisseria lactamica , но не патогенным Neisseria meningitidis в период пика носоглоточного носительства.J Immunol 182: 2231–2240.
53. 53. Van Cauwenberge P (1976) De betekenis van de «fusospirillaire associatie» (Плаут-Винсент). Acta Otorhinolaryngol Belg 30: 334–345.
54. 54. Bik EM, Long CD, Armitage GC, Loomer P, Emerson J, et al. (2010) Бактериальное разнообразие в полости рта 10 здоровых людей. ISME J 4: 962–974.
55. 55. Харрис Дж. К., Де Гроот М. А., Сагель С. Д., Земаник Е. Т., Капснер Р. и др. (2007) Молекулярная идентификация бактерий в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у детей с муковисцидозом.Proc Natl Acad Sci U S A 104: 20529–20533.
56. 56. Насидзе И., Ли Дж., Квинк Д., Тан К., Стоункинг М. (2009) Глобальное разнообразие микробиома слюны человека. Genome Res 19: 636–643.
57. 57. Кононен Э. (2000) Развитие бактериальной флоры полости рта у детей раннего возраста. Энн Мед 32: 107–112.
58. 58. Crielaard W, Zaura E, Schuller AA, Huse SM, Montijn RC, et al .. (2011) Изучение микробиоты полости рта детей на различных этапах развития их зубных рядов в связи с их здоровьем полости рта.BMC Med Genomics 4.
59. 59. de Lillo A, Booth V, Kyriacou L, Weightman AJ, Wade WG (2004) Культурально-независимая идентификация ассоциированных с пародонтитом популяций Porphyromonas и Tannerella с помощью целевого молекулярного анализа. J Clin Microbiol 42: 5523–5527.
60. 60. Brook I, Foote PA Jr, Slots J, Jackson W (1993) Иммунный ответ на Prevotella intermedia у пациентов с рецидивирующим нестрептококковым тонзиллитом. Анн Отол Ринол Ларингол 102: 113–116.
61. 61. Брук I (2005) Роль анаэробных бактерий при тонзиллите. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 69: 9–19.
62. 62. Nord CE (1986) Механизмы устойчивости к бета-лактамам у анаэробных бактерий. Rev Infect Dis 8 Suppl 5S543–548.
63. 63. Tuner K, Nord CE (1983) Микроорганизмы, продуцирующие беталактамазу, при рецидивирующем тонзиллите. Scand J Infect Dis Suppl 39: 83–85.
64. 64. Brook I (1984) Роль бактерий, продуцирующих бета-лактамазы, в сохранении стрептококковой инфекции миндалин.Rev Infect Dis 6: 601–607.

Руководство по лечению острой ангины: Группа рекомендаций ESCMID