Муковисцидоз мкб: Ошибка 404. Файл не найден

Содержание

Муковисцидоз > Клинические протоколы МЗ РК

Признаки	Муковисцидоз	Астма	Целиакия	Врожденые пороки легких
Начало заболевания	Вскоре после рождения	Позже	Чаще после 6 мес., до 2-3 лет	Чаще в период новорожденности и в первые месяцы жизни
Масса тела при рождении	Часто низкая	Нормальная	Нормальная	Средняя/ Ниже средней
Семейная предрасположенность	Часто подобное заболевание у двоюродных братьев и сестер	Наследственная отягощенность по аллергии, атопии.	Иногда наблюдается у родителей	Нет
Акушерский анамнез	Отягощенный акушерский анамнез: мертворождение, выкидыши, наличие больного с МВ в семье	Без особенностей	Без особенностей	Интеркуррентные заболевания матери в первом триместре беременности
Заболевания органов дыхания	Тяжелые поражения бронхолегочной системы, трудно поддающиеся лечению с момента рождения	Внезапно, связано с экспозицией аллергена. Быстрое облегчение симптомов самостоятельно или под воздействием терапии	Может быть вялотекущая пневмония, поддающаяся комплексному лечению	Характерно, поддается лечению
Аппетит	Хороший, повышен	Не изменен	Снижен	Не изменен
Поражение печени	Часто	Не характерно	Не характерно	Не характерно
Гипотрофия	С первых месяцев жизни, постепенно нарастая до II- III степени	Не характерно	Обычно со второго полугодия, быстро прогрессирует	Редко
Соленый привкус кожи	Характерно	Не характерно	Не характерно	Не характерно
Симптом «барабанных палочек»	Чаще в раннем возрасте	Не характерно	Не характерно	Развивается позже
Неврологический статус	Без отклонений	Без отклонений	Раздражительность, мышечная гипотония, судороги	Без отклонений
Лабораторно-диагностический тест	Повышение уровня хлоридов в поте, стеаторея с преобладанием нейтрального жира	Повышение Ig Е	Нарушение всасывания углеводов, жиров, белков, повышение IgA в крови	Не характерно
Белковый обмен	Гипопротеинемия	В норме	Тяжелая гипопротеинемия	В норме
IgA, Ig G, Ig M	В норме	В норме	Повышение IgA	В норме
Исследование кала	Жидкий, светло-желтый, глинистый, жирный, «зловонный»	Без особенностей	Обильный, разжиженный, светло-желтый, гнилостный	Без особенностей
Нейтральный жир	В большом количестве	Отсутствует	В небольшом количестве	Не характерен
Трипсин	Резко снижен до полного отсутствия	В норме	Умеренно снижен	Нормальный
Мутации гена CFTR	Да	Нет	Нет	Нет
Хлориды в потовой жидкости	Повышены	В норме	В норме	В норме
Рентгенологическое исследование грудной клетки и желудочно-кишечного тракта	Деформация бронхолегочного рисунка, ателектазы, пневмофиброз, бронхоэктазы в ранние сроки болезни	Признаки эмфиземы в поздних стадиях	Без особенностей	Подвижность и пролабирование задней стенки трахеи, признаки гипоплазии
	Дискинезия тонкой кишки, рельеф слизистой оболочки грубый, «спикулы» псевдодивертикул, большое количество слизи в кишечнике	Без особенностей	Расширение петель кишечника, гипотония, дискинезия кишечника, горизонтальные уровни жидкости	Без особенностей
Спирография	Смешанный тип нарушения вентиляции	Обструктивный тип нарушения вентиляции	Без особенностей	При малых пороках без особенностей, при больших — рестриктивный тип нарушения
Бактериологическое исследование мокроты	Стафилококковая, гемофильная, синегнойная инфекции с раннего возраста	Без особенностей	Без особенностей	Чаще пневмококк, м.б. микробные ассоциации, госпитальные штаммы
Прогноз	Тяжелый, часто погибают в детском возрасте от дыхательной недостаточности, поражения печени, инфекционных осложнений.	Благоприятный	Благоприятный	Благоприятный

МУКОВИСЦИДОЗ — это… Что такое МУКОВИСЦИДОЗ?

муковисцидоз — муковисцидоз … Орфографический словарь-справочник

Муковисцидоз — МКБ 10 E84.84. МКБ 9 277.0277.0 OMIM … Википедия

муковисцидоз — сущ., кол во синонимов: 2 • болезнь (995) • панкреофиброз (1) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов

Муковисцидоз — * мукавісцыдоз * cystic fibrosis одно из наиболее распространенных наследственных системных заболеваний человека (у белой расы), характеризующееся выработкой аномальных глипротеинов и поражением слизистых оболочек. М. передается по наследству по… … Генетика. Энциклопедический словарь

Муковисцидоз — I Муковисцидоз (mucoviscidosis; лат. mucus слизь + iscidus липкий + ōsis; синоним: кистофиброз, панкреофиброз) наследственное заболевание, характеризующееся системным поражением экзокринных желез и проявляющееся тяжелыми расстройствами функций… … Медицинская энциклопедия

муковисцидоз — cystic fibrosis муковисцидоз. Oдно из наиболее распространенных НЗЧ (у белой расы), характеризующееся выработкой аномальных гликопротеинов и поражением слизистых оболочек; передается по аутосомно рецессивному типу ген CFTR <cystic fibrosis… … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

МУКОВИСЦИДОЗ — мед. Муковисцидбз наследственная болезнь с распространённым поражением экзокринных желез, характеризующаяся кистозным перерождением поджелудочной железы, желез кишечника и дыхательных путей из за закупорки их выводных протоков вязким секретом,… … Справочник по болезням

муковисцидоз — (mucoviscidosis; мука + лат. viscidus липкий + оз; син.: диспория энтеробронхопанкреатическая, панкреофиброз, стеаторея панкреатическая врожденная) наследственная болезнь, характеризующаяся кистозным перерождением поджелудочной железы, желез… … Большой медицинский словарь

муковисцидоз — наследственная болезнь, характеризующаяся нарушением секреции желез с избыточным выделением натрия и как следствие кистозным перерождением поджелудочной железы, желез кишечника и дыхательных путей из за закупорки их выводных протоков вязким… … Медицинские термины

МУКОВИСЦИДОЗ — (mucoviscidosis) см. Дегенерация фиброзно кистозная … Толковый словарь по медицине

Об утверждении кодов категорий граждан и категорий заболеваний, при амбулаторном лечении которых лекарственные препараты, медицинские изделия отпускаются по рецептам врачей бесплатно или со скидкой / государственное бюджетное учреждение здравоохранения Ямало-Ненецкого автономного округа «Муравленковская городская больница»

ДЕПАРТАМЕНТ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

ЯМАЛО-НЕНЕЦКОГО АВТОНОМНОГО ОКРУГА

ПРИКАЗ

10 января 2020г. № 3-о

г. Салехард

Об утверждении кодов категорий граждан и категорий заболеваний, при амбулаторном лечении которых лекарственные препараты, медицинские изделия отпускаются по рецептам врачей бесплатно или со скидкой

В целях организации обеспечения граждан, имеющих право на получение государственной социальной помощи в виде социальной услуги, лекарственными препаратами, медицинскими изделиями за счет средств окружного и федерального бюджетов, в соответствии с Законом Ямало-Ненецкого автономного округа (далее – автономный округ) от 10.01.2007 № 12-ЗАО «О здравоохранении в Ямало-Ненецком автономном округе», постановлением Правительства автономного округа от 20.03.2014 № 193-П « О порядке и условиях предоставлений гарантий по лекарственному обеспечению отдельных категорий населения при лечении в амбулаторных условиях», постановлением Правительства Российской Федерации от 26.11.2018 № 1416 «О порядке организации обеспечения лекарственными препаратами лиц, больных гемофилией, муковисцидозом, гипофизарным нанизмом, болезнью Гоше, злокачественными новообразованиями лимфоидной, кроветворной и родственных им тканей, рассеянным склерозом, гемолитико-уремическим синдромом, юношеским артритом с системным началом, мукополисахаридозом I, II и VI типов, лиц после трансплантации органов и (или) тканей, а также о признании утратившими силу некоторых актов Правительства Российской Федерации», приложения № 11 к государственной программе Российской Федерации «Развитие здравоохранения», утвержденной постановлением Правительства Российской Федерации от 26.12.2017 № 1640, п р и к а з ы в а ю:

1. Утвердить:

1.1. коды категорий граждан и категорий заболеваний, при амбулаторном лечении, которых лекарственные препараты, медицинские изделия, специализированные продукты лечебного питания отпускаются по рецептам врачей бесплатно или со скидкой, за счет средств окружного бюджета, в случаях предусмотренных приложениями 1, 2 и 3 к Закону Ямало-Ненецкого автономного округа от 10.01.2007 № 12-ЗАО «О здравоохранении в Ямало-Ненецком автономном округе» согласно приложению №1 к настоящему приказу;

1.2. коды категорий граждан, при обеспечении лекарственными препаратами, медицинскими изделиями, специализированными продуктами лечебного питания по рецептам врачей бесплатно, за счет средств окружного бюджета, в случаях предусмотренных пунктом 1.8 Положения о порядке и условиях предоставления гарантий по лекарственному обеспечению отдельных категорий населения при лечении в амбулаторных условиях, утвержденного постановлением Правительства Ямало-Ненецкого автономного округа от 20.03.2014 № 193-П, согласно приложению №2 к настоящему приказу;

1.3. коды категорий заболеваний граждан, включенных в Федеральный регистр лиц, больных гемофилией, муковисцидозом, гипофизарным нанизмом, болезнью Гоше, злокачественными новообразованиями лимфоидной, кроветворной и родственных им тканей, рассеянным склерозом, гемолитико-уремическим синдромом, юношеским артритом с системным началом, мукополисахаридозом I, II и VI типов, лиц после трансплантации органов и (или) тканей (ВЗН), при обеспечении лекарственными препаратами по рецептам врачей бесплатно, в случаях предусмотренных постановлением Правительства Российской Федерации от 26.11.2018 № 1416, согласно приложению № 3 к настоящему приказу;

1.4. коды категорий заболеваний, при амбулаторном лечении которых лекарственные препараты, отпускаются по рецептам врачей бесплатно, за счет средств окружного и федерального бюджетов при реализации федерального проекта «Борьба с сердечно-сосудистыми заболеваниями» национального проекта «Здравоохранения» и пункта 14 раздела III региональной программы «Борьба с сердечно-сосудистыми заболеваниями», утвержденной постановлением Правительства Ямало-Ненецкого автономного округа от 24 июня 2019 года № 657-П, согласно приложению № 4 к настоящему приказу.

2. Признать утратившими силу:

2.1. приказ департамента здравоохранения автономного округа от 18.11.2016 № 1204-о «Об утверждении кодов категорий граждан и категорий заболеваний, при амбулаторном лечении которых лекарственные препараты, медицинские изделия отпускаются по рецептам врачей бесплатно»;

2.2. приказ департамента здравоохранения автономного округа от 30.05.2012 №386 «Об утверждении кодов льготных категорий граждан»;

2.3. приказ департамента здравоохранения автономного округа от 17.04.2019 №357-о «О внесении изменений в приказ департамента здравоохранения Ямало — Ненецкого автономного округа от 30 мая 2012 года №386».

3. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на первого заместителя департамента здравоохранения автономного округа, курирующего деятельность управления организации медицинской помощи.

И.о. директора департамента К.М. Трапезников

Приложение № 1

к приказу департамента здравоохранения

Ямало-Ненецкого автономного округа

от 10 января 2020г. №3-о

Коды категорий граждан и категорий заболеваний,

при амбулаторном лечении, которых лекарственные препараты, медицинские изделия, специализированные продукты лечебного питания отпускаются по рецептам врачей бесплатно или со скидкой, за счет средств окружного бюджета, в случаях предусмотренных приложениями 1,2 и 3 к Закону Ямало-Ненецкого автономного округа от 10.01.2007 № 12-ЗАО «О здравоохранении в Ямало-Ненецком автономном округе»

КОД	Категории граждан
303	Дети из многодетных семей в возрасте до 6 лет
308	Дети до 18 лет, страдающие психическими расстройствами
304	Дети первых трех лет жизни
309	Лица из числа коренных малочисленных народов Севера и иные лица, ведущие кочевой или полукочевой образ жизни, осуществляющие виды традиционной хозяйственной деятельности на территории Ямало-Ненецкого автономного округа
305	Труженики тыла (лица, проработавшие в тылу в период с 22 июня 1941 года по 9 мая 1945 года не менее шести месяцев, исключая период работы на временно оккупированных территориях СССР, а также лица, награжденные орденами и медалями СССР за самоотверженный труд в период Великой Отечественной войны)
306	Реабилитированные лица
307	Граждане, признанные пострадавшими от политических репрессий
310	Пенсионеры, получающие страховую пенсию по старости, инвалидности или по случаю потери кормильца и имеющие среднедушевой доход ниже величины прожиточного минимума на душу населения, установленного в Ямало-Ненецком автономном округе
КОД	Категории заболеваний
319	Злокачественные новообразования
320	Бронхиальная астма
321	Инфаркт миокарда (первые 6 месяцев)
322	Хронические и затяжные психические расстройства с тяжелыми стойкими или часто обостряющимися болезненными проявлениями
323	Туберкулез и диспансерное наблюдение в связи с туберкулезом
324	Диабет
327	Детские церебральные параличи
328	Нарушения обмена ароматических аминокислот (классическая фенилкетонурия, другие виды гиперфенилаланинемии)
329	Муковисцидоз
330	Острая перемежающаяся порфирия
331	Болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)
332	Гемобластозы, цитопения, наследственные гемопатии
333	Системные хронические заболевания кожи (дискоидная красная волчанка, склеродермия, пузырчатка)
334	Ревматизм, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, болезнь Бехтерева
337	Состояние после операции по протезированию клапанов сердца
338	Пересадка органов и тканей
339	Рассеянный склероз
340	Миастения
341	Гипофизарный нанизм
342	Болезнь Паркинсона
343	Шизофрения
345	Глаукома, катаракта
346	Эпилепсия
348	Болезнь Гоше
357	Лучевая болезнь
358	Мозжечковая атаксия Мари
359	Аддисонова болезнь
360	Миопатия
362	Гемолитико-уремический синдром
363	Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (Маркиафавы-Микели)
364	Апластическая анемия неуточненная
365	Наследственный дефицит факторов II (фибриногена), VII (лабильного), X (Стюарта-Прауэра)
366	Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (синдром Эванса)
367	Дефект в системе комплемента
368	Преждевременная половая зрелость центрального происхождения
369	Тирозинемия
370	Болезнь «кленового сиропа»
371	Другие виды нарушений обмена аминокислот с разветвленной цепью (изовалериановаяацидемия, метилмалоноваяацидемия, пропионоваяацидемия)
372	Нарушения обмена жирных кислот
373	Гомоцистинурия
374	Глютарикацидурия
375	Галактоземия
376	Другие сфинголипидозы: болезнь Фабри (Фабри-Андерсона), Нимана-Пика
377	Мукополисахаридоз, тип I
378	Мукополисахаридоз, тип II
379	Мукополисахаридоз, тип VI
380	Острая перемежающая (печеночная) порфирия
381	Нарушения обмена меди (болезнь Вильсона)
382	Незавершенный остеогенез
383	Легочная (артериальная) гипертензия (идиопатическая) (первичная)
384	Юношеский артрит с системным началом
385	Буллезный эпидермолиз
389	Гельминтозы
390	Болезни, характеризующиеся повышенным кровяным давлением
391	Гепатит B и C
392	Инфекции, передающиеся преимущественно половым путем
393	Педикулез, акариаз и другие инфестации

Приложение № 2

к приказу департамента здравоохранения

Ямало-Ненецкого автономного округа

от 10 января 2020г. № 3-о

Коды категорий граждан,

при обеспечении лекарственными препаратами, медицинскими изделиями, специализированными продуктами лечебного питания по рецептам врачей бесплатно, за счет средств окружного бюджета, в случаях предусмотренных пунктом 1.8 Положения о порядке и условиях предоставления гарантий по лекарственному обеспечению отдельных категорий населения при лечении в амбулаторных условиях, утвержденного постановлением Правительства Ямало-Ненецкого автономного округа от 20.03.2014 № 193-П

302	Участники Великой Отечественной Войны
301	Инвалиды войны
349	Военнослужащие, проходившую военную службу в воинских частях, учреждениях, военно-учебных заведениях, не входивших в состав действующей армии, в период с 22.06.1941 по 03.09.1945 года не менее шести месяцев, военнослужащие, награжденные орденами или медалями СССР за службу в указанный период
350	Лица, награжденные знаком «Житель блокадного Ленинграда
351	Лица, работавшие в период ВОВ на объектах противовоздушной обороны, местной противоздушной обороны, на строительстве оборонительных сооружений ,военно-морских баз, аэродромов и других военных объектов в пределах тыловых границ действующих фронтов, операционных зон действующих флотов, на прифронтовых участках железных и автомобильных дорог, а также члены экипажей судов транспортного флота, интернированных в начале ВОВ в портах других государств
352	Члены семей погибших (умерших)инвалидов войны, участников ВОВ и ВБД, члены семей погибших в ВОВ лиц из числа личного состава групп самозащиты объектовых и аварийных команд местной противоздушной обороны, а также члены семей погибших работников госпиталей и больниц города Ленинграда
353	Инвалиды
354	Дети-инвалиды
355	Бывшие несовершеннолетние узники
356	Военнослужащие и лица рядового и нач. состава органов ВД
361	Ветераны боевых действий из числа лиц, указанных в подпунктах 1-4 1 статьи 3 ФЗ « О ветеранах» (в редакции ФЗ от 02.01.2000 № 40 ФЗ)
386	Граждане, подвергшиеся воздействию радиации вследствие катастрофы на Чернобыльской АЭС
387	Граждане, подвергшиеся радиационному воздействию вследствие ядерных испытаний на Семипалатинском полигоне
388	Граждане, подвергшиеся воздействию радиации вследствие аварии в 1957 г. на ПО «Маяк»

Приложение № 3

к приказу департамента здравоохранения

Ямало-Ненецкого автономного округа

от 10 января 2020г.№ 3-о

Коды категорий заболеваний граждан, включенных в Федеральный регистр лиц, больных гемофилией, муковисцидозом, гипофизарным нанизмом, болезнью Гоше, злокачественными новообразованиями лимфоидной, кроветворной и родственных им тканей, рассеянным склерозом, гемолитико-уремическим синдромом, юношеским артритом с системным началом, мукополисахаридозом I, II и VI типов, лиц после трансплантации органов и (или) тканей (ВЗН), при обеспечении лекарственными препаратами по рецептам врачей бесплатно, в случаях предусмотренных постановлением Правительства Российской Федерации от 26.11.2018 № 1416

(централизованные поставки лекарственных препаратов Минздравом России за счет средств федерального бюджета в автономный округ)

КОД	Категории заболеваний
201	Злокачественные новообразования лимфоидной, кроветворной и родственных им тканей: — хронический миелоидный лейкоз (С 92.1) — макроглобулинемия Вальденстрема (С88.0) — множественная миелома (С 90.0) — фолликулярная (нодулярная) неходжкинская лимфома (С 82) — мелкоклеточная (диффузная) неходжкинская лимфома (С 83.0) — мелкоклеточная с расщепленными ядрами (диффузная) неходжкинская лимфома (С 83.1) — крупноклеточная (диффузная) неходжкинская лимфома (С 83.3) — иммунобластная (диффузная) неходжкинская лимфома (С 83.4) — другие типы диффузных неходжкинских лимфом (С83.8) — диффузная неходжкинская лимфома неуточненная (С 83.9) — другие неуточненные типы неходжкинской лимфомы (С 85) — хронический лимфоцитарный лейкоз (С91.1)
202	Муковисцидоз кистозный фиброз (Е 84)
203	Гемофилия наследственный дефицит фактора VIII (D66) наследственный дефицит фактора IX (D67) болезнь Виллебранда (D 68.0)
204	Рассеянный склероз (G35)
205	Гипофизарный нанизм гипопитуитаризм (E 23.0)
206	Болезнь Гоше другие сфинголипидозы (Е 75.2)
207	Состояния после трансплантации органов и/или тканей: — наличие трансплантированной почки (Z94.0) — наличие трансплантированного сердца (Z94.1) — наличие трансплантированной печени (Z94.4) — наличие других трансплантированных органов и тканей (Z94.8)
208	гемолитико-уремический синдром (D59.3)
209	юношеский артрит с системным началом (M08.2)
210	мукополисахаридоз I типа (E76.0)
211	мукополисахаридоз II типа (E76.1)
212	мукополисахаридоз VI типа (E76.2)

Коды категорий заболеваний, при амбулаторном лечении которых лекарственные препараты, отпускаются по рецептам врачей бесплатно, за счет средств окружного и федерального бюджетов при реализации федерального проекта «Борьба с сердечно-сосудистыми заболеваниями» национального проекта «Здравоохранения» и пункта 14 раздела III региональной программы «Борьба с сердечно-сосудистыми заболеваниями», утвержденной постановлением Правительства Ямало-Ненецкого автономного округа

Bolnica

Алгоритм диспансерного наблюдения детей первого года жизни регламентирован федеральным законодательством (Приказ МЗ РФ от 10.08.2017 г. N 514н).

Медицинские осмотры проводятся с целью повышения качества наблюдения за здоровьем детей, раннего выявления отклонений в состоянии здоровья, для наиболее эффективной организации профилактической, лечебно-коррекционной и реабилитационной работы.

Профилактические медицинские осмотры несовершеннолетних (далее — профилактические осмотры) проводятся в установленные возрастные периоды в целях раннего (своевременного) выявления патологических состояний, заболеваний и факторов риска их развития, а также в целях формирования групп состояния здоровья и выработки рекомендаций для несовершеннолетних.

Медицинский осмотр — это комплекс медицинских мероприятий, вмешательств, который включает в себя осмотр врачей-специалистов, а также лабораторные и инструментальные исследования, направленные на выявление патологических состояний, заболеваний, факторов риска у несовершеннолетних, чтобы в дальнейшем проводить более эффективную профилактическую работу или, в случае необходимости, лечение.

Согласно Приказу N 514н, медицинские осмотры и диспансерное наблюдение несовершеннолетних проводятся в рамках Программы государственных гарантий бесплатного оказания гражданам медицинской помощи. Диспансерное наблюдение детей первого года жизни проводится в объеме, предусмотренном перечнем исследований при проведении медицинских осмотров несовершеннолетних согласно приложению № 1 к Порядку, утвержденному Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 10 августа 2018 г № 514н (далее — Перечень исследований).
Данные о прохождении профилактического осмотра вносятся в медицинскую документацию несовершеннолетнего (историю развития ребенка). Медицинская документация несовершеннолетнего (история развития ребенка) должна содержать следующие сведения:

данные анамнеза:

о перенесенных ранее заболеваниях (состояниях), наличии функциональных расстройств;
о результатах проведения диспансерного наблюдения (если установлено) с указанием диагноза заболевания (состояния), включая код по Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (далее — МКБ), медицинской организации и врача-специалиста, осуществляющего диспансерное наблюдение;
о соблюдении рекомендаций врачей-специалистов по диспансерному наблюдению, лечению, медицинской реабилитации.

данные, полученные при проведении профилактического осмотра:

объективные данные и результаты осмотров врачами-специалистами;
результаты лабораторных, инструментальных и иных исследований;
результаты дополнительных консультаций и исследований, не включенных в раздел 1 Перечня исследований и назначенных в ходе проведения профилактического осмотра;
диагноз заболевания (состояния), выявленного (установленного) при профилактическом осмотре, с указанием кода по МКБ, выявлено впервые или нет.

оценка физического развития.
группа состояния здоровья несовершеннолетнего.
рекомендации:

по формированию здорового образа жизни, режиму дня, питанию, физическому развитию, иммунопрофилактике, занятиям физической культурой;
о необходимости установления или продолжения диспансерного наблюдения, включая диагноз заболевания (состояния) и код по МКБ, по лечению, медицинской реабилитации.

В случае подозрения на наличие у несовершеннолетнего заболевания (состояния), диагноз которого не может быть установлен при проведении осмотров врачами-специалистами и исследований, включенных в Перечень исследований, врач, ответственный за проведение профилактического осмотра, врачи-специалисты, участвующие в проведении профилактического осмотра, направляют несовершеннолетнего на дополнительную консультацию и (или) исследование с указанием даты и места их проведения.

Приложение № 1

(С изменениями и дополнениями от 3 июля 2018 г)

Возрастные периоды, в которые проводятся профилактические медицинские осмотры несовершеннолетних	Осмотры врачами-специалистами	Лабораторные, функциональные и иные исследования
Новорожденный	Педиатр	Неонатальный скрининг на врожденный гипотиреоз, фенилкетонурию, адреногенитальный синдром, муковисцидоз и галактоземию* Аудиологический скрининг**
1 месяц	Педиатр Невролог Детский хирург Офтальмолог Детский стоматолог	Ультразвуковое исследование органов брюшной полости (комплексное) Ультразвуковое исследование почек Ультразвуковое исследование тазобедренных суставов Эхокардиография Нейросонография Аудиологический скрининг**
2 месяца	Педиатр	Общий анализ крови Общий анализ мочи
3 месяца	Педиатр Травматолог-ортопед	Аудиологический скрининг**
4 месяца	Педиатр
5 месяцев	Педиатр
6 месяцев	Педиатр
7 месяцев	Педиатр
8 месяцев	Педиатр
9 месяцев	Педиатр
10 месяцев	Педиатр
11 месяцев	Педиатр
12 месяцев	Педиатр Невролог Детский хирург Оториноларинголог Травматолог-ортопед Офтальмолог	Общий анализ крови Общий анализ мочи Электрокардиография

Неонатальный скрининг на врожденный гипотиреоз, фенилкетонурию, адреногенитальный синдром, муковисцидоз и галактоземию проводится детям в возрасте до 1 месяца включительно в случае отсутствия сведений о его прохождении в истории развития ребенка.

Аудиологический скрининг проводится детям в возрасте до 3 месяцев включительно в случае отсутствия сведений о его прохождении в истории развития ребенка.

Муковисцидоз у взрослых и детей: причины, симптомы, лечение

Что такое муковисцидоз
Как наследуется муковисцидоз
Механизм развития основных симптомов
Формы и проявления болезни
Муковисцидоз у детей
Диагностика
Принципы лечения
Микразим при муковисцидозе
Прогноз и профилактика

В настоящее время все большую актуальность приобретают наследственные заболевания, обусловленные различными нарушениями в генетическом материале. Это связано в основном с накоплением в популяции рецессивных мутаций в аутосомных (неполовых) хромосомах. Одним из таких заболеваний является муковисцидоз (mucoviscidosis). Его иногда называют также кистозным фиброзом (кистофиброзом), врожденной энтеробронхопанкреатической диспорией, синдромом соленого ребенка.

Муковисцидоз считается самой частой патологией среди всех наследственных заболеваний моногенной природы. Причем он встречается преимущественно у представителей европеоидной расы. Распространенность этого заболевания колеблется в разных регионах и составляет в среднем 1 случай на 2–4,5 тысячи новорожденных.

Что такое муковисцидоз

Муковисцидозом называют хроническое заболевание наследственной природы, ключевым признаком которого является стойкое повышение вязкости секрета железистых клеток с вторичным кистозным перерождением пораженных структур и органов. Этот момент отражается и в названии: mucos с латыни переводится как «слизь», viscidus – как «клейкий, липкий». А окончание -osis используется для обозначения невоспалительной природы патологического процесса.

Муковисцидоз – заболевание с доказанной наследственной природой. Причиной всех происходящих нарушений является мутация одного гена на середине длинного плеча 7 соматической (аутосомной) хромосомы. Его называют SFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator), что переводится как трансмембранный регулятор проводимости ионов натрия и хлора. Этот ген кодирует структуру особого белка, который является основой хлорного и некоторых других ионных каналов в эпителии. Поэтому ключевой момент заболевания – это нарушение транспортной функции клеточных мембран с преимущественным поражением желез внешней секреции. А вот органы внутренней секреции (эндокринные, гормонально активные) в патологический процесс не вовлекаются.

Работа гена SFTR не имеет ограничений по времени, он функционирует в течение всего жизненного цикла. А вот срок появления симптомов и их выраженность могут быть различными. Это зависит в основном от типа мутации. В настоящее время известно уже более 1600 ее вариантов, причем частота встречаемости каждого из них отличается в разных регионах Земного шара.

Как наследуется муковисцидоз

К особенностям наследования муковисцидоза относят:

Мутация SFTR является рецессивной. Это означает, что у человека с нормальным геном в парной хромосоме не будет никаких симптомов муковисцидоза. Таких людей в популяции достаточно много. Они являются носителями заболевания и могут передавать его патологический ген своим детям.
Передача гена не связана с полом, так что вероятность появления болезни у мальчиков и девочек одинакова.
Ребенок будет болен муковисцидозом только в том случае, если он унаследует сразу 2 дефектных гена. Такое возможно, если у обоих родителей имеется хотя бы одна хромосома с мутацией в соответствующей области. Вероятность рождения больного ребенка при этом может быть различной (см. таблицу).

	Мать здорова (обе хромосомы без мутации)	Мать носитель (один ген мутантный, другой нормальный)	Мать больна муковисцидозом (оба гена мутантные)
Отец здоров (обе хромосомы без мутации)	В 100% случаев дети здоровы	Вероятность рождения ребенка-носителя 50%, вероятность рождения носителя 50%	Вероятность рождения больного ребенка 0%, все дети будут носителями
Отец носитель (один ген мутантный, другой нормальный)	Вероятность рождения ребенка-носителя 50%, вероятность рождения носителя 50%	25% вероятность рождения больного ребенка, 25% вероятность рождения здорового, 50% — носителя	Вероятность рождения больного ребенка 50%, вероятность рождения носителя 50%
Отец болен муковисцидозом (оба гена мутантные)	Вероятность рождения больного ребенка 0%, все дети будут носителями	Вероятность рождения больного ребенка 50%, вероятность рождения носителя 50%	Все дети будут больны муковисцидозом

Следует понимать, что на вероятность рождения ребенка с муковисцидозом влияет только факт наличия у родителей аномального гена SFTR. Характер (тип) мутации при этом не имеет значения.

Механизм развития основных симптомов

При наличии 2 аномальных генов SFTR у человека синтезируется функционально неполноценный белок хлор-ионного трансмембранного канала. Это приводит к каскаду необратимых и склонных к прогрессии нарушений:

Нарушение транспорта ионов хлора с их накоплением в цитоплазме железистых клеток. Это влечет за собой изменение мембранного потенциала и ухудшает работу других ионных каналов, в первую очередь натриевого.
Повышение концентрации ионов натрия в клетки приводит к усиленному «забору» воды из близлежащего околоклеточного пространства. А так как при муковисцидозе поражаются железистые клетки, жидкость начинает всасываться из уже выделенного ими секрета. Этот процесс ничем не компенсируется и становится причиной постепенного развития вторичных необратимых изменений в органах.
Чрезмерно густой и вязкий секрет склонен застаиваться, что приводит к закупорке (обтурации) просвета выводящих канальцев, протоков, бронхов. А сопутствующее этому воспаление усугубляет ситуацию, вплоть до развития слипчивого процесса и грубого рубцевания. Протоки постепенно становятся непроходимыми.
Застой секрета способствует воспалению самого железистого органа и окружающих тканей. Поэтому при муковисцидозе чаще всего выявляются бронхопневмонии (как следствие закупорки бронхов), панкреатит (в результате расплавления поджелудочной железы собственными ферментами), холангогепатит (воспаление желчных протоков и печени).

Вторично в патологический процесс вовлекаются и нежелезистые органы. Например, бронхолегочная патология приводит к нарушению работы сердечно-сосудистой системы. Ферментная недостаточность вследствие панкреатита и воспаления кишечной стенки становится причиной снижения усвоения питательных веществ, железа и витаминов. При выраженных нарушениях страдают все органы и головной мозг, что особенно критично в раннем детском возрасте.

Формы и проявления болезни

При муковисцидозе поражаются все экзокринные железистые образования, независимо от их размера. Но выраженность патологических изменений различных органов обычно отличается. С учетом этого выделяют несколько клинических форм заболевания:

Мекониальная кишечная непроходимость. Развивается у младенцев первых дней жизни и обусловлена выраженным сгущением у них первичного кала (мекония).
Бронхолегочная форма, связанная с нарушением работы желез бронхиального эпителия и обтурацией (закупоркой слизью) конечных отделов дыхательной системы. Проявляется рецидивирующими бронхопневмониями с формированием бронхоэктазов и хронической обструктивной болезни легких. (ХОБЛ).
Кишечная форма, включающая в себя и картину поражения поджелудочной железы (панкреатита) с развитием ферментной недостаточности.
Билиарный цирроз печени, связанный с непроходимостью желчевыводящих путей вследствие выраженного сгущения желчи.

Встречаются также очень «мягкие» формы заболевания, когда имеющиеся нарушения не столь грубо нарушают качество жизни и не относятся к потенциально жизнеугрожающим состояниям. Например, у мужчин муковисцидоз может проявляться изолированной обструктивной азооспермией в виде бесплодия из-за непроходимости семявыносящих путей. Встречаются абортивные формы с поражением потовых желез, синуситами, хроническим панкреатитом без склонности к кистообразованию и пр.

В клинической практике используется терминология международной классификации болезней 10 пересмотра (МКБ-10). Муковисцидоз при этом имеет шифр Е84 и подразделяется на формы с легочными, кишечными и другими проявлениями. Имеется также подрубрика «Неуточненный муковисцидоз». При этом врачу приходится шифровать только наиболее тяжелые нарушения, ведь в 70% случаев отмечается смешанная (легочно-кишечная) форма заболевания.

При постановке диагноза также указывают степень выраженности имеющихся расстройств и описывают уже развившиеся осложнения.

Муковисцидоз у детей

Более чем в 90-94% случаев муковисцидоз дебютирует в первые годы жизни ребенка. А иногда его симптомы обнаруживаются уже у новорожденного и нарастают в течение нескольких дней.

К основным признакам муковисцидоза в детском возрасте относят:

Кишечные расстройства, обусловленные ферментной недостаточностью. Чаще всего они появляются при введении прикорма или докорма. Отмечается обильный неоформленный частый зловонный стул с большим количеством жира (стеаторея), вздутие живота. Вскоре развиваются гипополивитаминоз, железодефицитная анемия. Высока вероятность присоединения сахарного диабета.
Склонность к рецидивирующим затяжным осложненным пневмониям.
Сложности при проглатывании пищи, что объясняется чрезмерной вязкостью слюны и сухостью слизистой глотки и пищевода. Ребенок склонен запивать еду.
Нарушения терморегуляции в жаркое время года и в душных помещениях. Это обусловлено расстройством потоотделения.

Кишечная и бронхолегочная формы заболевания в детском возрасте способствуют задержке физического развития ребенка, формированию у него хронической полиорганной недостаточности. Интеллектуальное снижение не характерно, хотя выраженные нарушения обмена веществ могут приводить к ухудшению работы головного мозга.

Диагностика

Для диагностики муковисцидоза ключевыми являются лабораторные исследования:

Тест на иммунореактивный трипсин (у детей первого месяца жизни).
Потовая проба. Может проводится в классической вариации по Гибсону-Куку или с помощью современных анализаторов.
ДНК-диагностика. Используется в качестве скрининговой методики со взятием крови у ребенка на бумажный фильтр. При необходимости проводят и другие варианты генетического исследования, в том числе с определением генотипа родственников.
Тест Е1 (на панкреатическую эластазу в кале).

Для диагностики имеющихся нарушений используют копрограмму, рентгенографию органов грудной клетки, бронхоскопию, ФГДС и другие методики. Программа обследования составляется индивидуально, с учетом имеющейся симптоматики.

Принципы лечения

Следует понимать, что назначаемая при муковисцидозе терапия не позволяет вылечить заболевание. Она лишь способствует коррекции имеющихся нарушений с улучшением качества жизни пациента, облегчает симптоматику, помогает справляться с тяжелыми осложнениями и несколько снижает риск их развития. Генная терапия с воздействием на дефектный ген пока находится на стадии разработки и клинической апробации.

Основные группы назначаемых при муковисцидозе препаратов:

Ферментные препараты, особенно актуальные при кишечной форме заболевния.
Поливитаминные комплексы и особенно жирорастворимые витамины для восполнения дефицита всасывания их в кишечнике.

Микразим при муковисцидозе

Применение ферментных препаратов при муковисцизоде позволяет частично скомпенсировать недостаточный уровень собственных пищеварительных ферментов. А такие нарушения отмечаются практически у всех людей с этим заболеванием, ведь поражение поджелудочной железы является его типичным проявлением. Особого внимании при этом требует коррекция уровня липазы – фермента, обеспечивающего адекватного переваривание жиров в тонком кишечнике. С этой целью при муковисцидозе назначается Микразим.

К ожидаемым клиническим эффектам такой терапии относят:

Улучшение усвоения базовых нутриентов, снижение вероятности алиментарной гипотрофии.
Уменьшение риска развития диареи, связанной с недостаточным перевариванием жиров.
Снижение выраженности кишечного дискомфорта, обусловленного повышенным газообразованием и усиленной перистальтикой на фоне ферментной недостаточности.

Микразим при муковисцидозе может быть использован и для лечения детей первых лет жизни, в этом случае препарат назначается в виде капсул. Дозировка подбирается врачом с учетом выраженности стеатореи и возраста ребенка.

Прогноз и профилактика

Ранее с проявлениями муковисцидоза сталкивались в основном педиатры, эта болезнь считалась «детской». В настоящее время эта патология нередко встречается и у взрослых, что объясняется возросшими возможностями современной фармакологии. Используемые препараты позволяют частично скомпенсировать нарушенные секреторные функции слизистой оболочки бронхиального дерева и поджелудочной железы. И при адекватно подобранной терапии ребенок с муковисцидозом имеет шанс на взросление.

Важно: перед применением ознакомьтесь с инструкцией или проконсультируйтесь с лечащим врачом.

что это, симптомы, причины, диагностика, лечение, осложнения

check_circle Статья проверена 25 июн 2020 (обновлена)

0 мин на чтение

Автор статьи Харитонова Маргарита Александровна

Зам. заведующей эмбриологией, к.б.н. Стаж 17 лет.

Лечением данного заболевания занимается генетик.

Важно! Данная статья размещена исключительно в познавательных целях, информацию нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к врачу.

Краткое содержание статьи

МКБ-10: E84 — Кистозный фиброз.

Муковисцидоз — это наследственное заболевание, течение которого характеризуется поражением органов пищеварения и дыхания.

Содержание

Причины муковисцидоза
Признаки и симптомы муковисцидоза
Степени тяжести заболевания
Диагностика муковисцидоза
Лечение муковисцидоза
Профилактика муковисцидоза

Биохимическое исследование (анализ) крови и мочи при мочекаменной болезни

После определения состава конкремента с помощью инфракрасной спектроскопии требуется проведение дифференциальной диагностики причин камнеобразования. Рекомендации Европейского общества урологов 2017 г. указывают на необходимость выявления пациентов с высоким риском камнеобразования и рецидива, что требует прицельного выявления ряда состояний.

Таблица 1. Основные диагностируемые причины МКБ

Общий фактор*	Заболевания с риском МКБ	Генетические причины МКБ
Ранний дебют МКБ (дети и подростки) и частые рецидивы (>3 за 3 года)	Гиперпаратиреоз	Гиперцистинурия (типы А,В,АВ)
Семейный анамнез	Метаболический синдром	Первичная гипероксалатурия
МКБ при солитарной почке	Нефрокальциноз и поликистоз почек	Ренальный тубулярный ацидоз (1 тип)
Конкременты определенного химического состава: брушит, ураты и мочевая кислота, струвиты и другие инфекционные камни	Абсорбционная гиперкальциемия/ гипероксалатурия при заболеваниях ЖКТ	2,8–Дигидроаденинурия и Ксантинурия
Анатомические причины: губчатая и подковообразная почка, обструкция мочеточника и уретры, везико-уретроренальный рефлекс, уретероцеле, киста и дивертикул лоханки	Саркоидоз	Синдром Леш-Нихана и муковисцидоз
	Поражение спинного мозга, нейрогенный мочевой пузырь	Лекарственные конкременты: в том числе аллопуринол, ампициллин, цефтриаксон, хинолоны, индинавир, триамтерен, сульфониламиды

Наряду с данными факторами, у больных МКБ описан ряд характерных измерений метаболизма, которые следует выявлять в целях последующей коррекции. К ним относятся изолированная гиперкальциурия, гипероксалатурия, гиперурикозурия, низкий объем мочи и гипоцитратурия. Для того, чтобы избежать избыточного обследования, выявление причин камнеобразования должно быть основано на клинической картине, данных инструментальной диагностики и визуализации, а также анализа состава мочевого камня. В зависимости от преобладания химических компонентов следует использовать уточняющие лабораторные тесты.

Диагностика причин камнеобразования при конкрементах с преобладанием фосфатных солей кальция (брушит, октакальция фосфат, гидрокси- и карбоксиапатиты)

Хотя частота монокомпонентных конкрементов из фосфата кальция сравнительно мала, однако фосфатные соли кальция лежат в основе образования формирования большинства смешанных конкрементов, прежде всего оксалатов. Поскольку причиной преципитации фосфатных соли кальция часто является системное нарушения обмена кальция, поиск такой причины актуален при большинстве смешанных конкрементов. При постоянно высокой концентрации кальция и фосфата в моче в слабощелочной среде формируется брушит – соль кальция фосфата с максимальным количеством кальция. Другие кальциевые соли (апатиты) образуются в щелочной среде (pH>7) и являются инфекционно-зависимыми.

Гиперпаратиреоз первичный и вторичный

Паратиреоидный гормон или паратгормон (ПГ) поддерживает содержание кальция крови, поэтому первым проявленим гиперпаратиреоза (ГПТ) является повышение концентрации общего кальция и ионизированного кальция в крови. Частота субклинического ГПТ может доходить 0,2% всех лиц старше 60 лет, поэтому рекомендуется скрининг этого состояния путем оценки ионизированного кальция крови и определения концентрации паратгормона. Нормальные значения ионизированного кальция позволяют исключить первичный ГПТ. Первичный ГПТ обычно течет субклинически, и проявляется нефролитиазом и остеопенией, расстройствами со стороны ЖТК. На фоне хронического поражения почек и ряде других причин может развиваться вторичный ГПТ, паратгормон повышен, но концентрация кальция крови нормальная или снижена в связи с гиперкальцурией. Обследование следует дополнять исследованием креатинина с расчетом скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и мочевины крови и другими тестами на функциональное состояние почек. Другими причинами гиперкальциемии является метастазирование солидных опухолей и гематологические раки (миелома), гипертиреоз, прием тиазидных диуретиков, гипервитаминоз А и D, интоксикация алюминием, и передозировка Ca-содержащими препаратами и антацидами (молочно-щелочной синдром).

Исследование причин гиперкальциемии требует выявление характерных изменений метаболизма, включая гиперкальциурию, гипофосфатемию, увеличение сывороточной щелочной фосфатазы, уровень витамина D сыворотки крови.

Абсорбционная гиперкальциурия и гиперчувствительность к витамину D

Хотя гиперкальциурию (ГКУ) не выделяют в отдельное заболевание, однако это состояние, связанное с изолированной мочевой экскрецией кальция, отмечают у 5-10% популяции. Гиперкальцурия без гиперкальцемии является наиболее частой причиной МКБ с солями кальция и может быть выявлена у 25-30% пациентов. Выделяют три основных причины: абсорбционную, ренальную, резорбтивную (гиперпаратиреоз). Из них абсорбционная или пищевая (не более 200 мг/сут при диете в 400 мг кальция), обусловленная повышенным всасыванием кальция, является наиболее частой.

Для скринига изолированной ГКУ используется отношение кальция и креатинина в разовой моче, которое должно быть подтверждено увеличением суточной экскреции кальция. При абсорбционной ГКУ кальций мочи изменяется в зависимости от пищевой концентрации, однако ионизированный кальций, фосфаты сыворотки и паратгормон при абсорбционной ГКУ остаются в пределах нормы. Причиной абсорбтивной ГКУ может быть высокие концентрации витамина Д, а также высокая врожденная чувствительность рецепторов витамина Д, которая обуславливает повышенное всасывание кальция в ЖКТ. Полиморфизм VRD283В обуславливает повышенную экспрессию рецептора и как следствие более высокую чувствительность тканей к витамину Д.

Другие причины гиперкальциурии

Причиной длительной гиперкальциемии являются гранулематозные процессы, в частности саркоидоз. Клетки саркоидных гранулем формируют повышенное количество активного витамина D3, что приводит к увеличению всасывания кальция и фосфатов, повышению их концентраций в крови, и частому развитию нефрокальциноза (см.ниже). Повышение метаболитов витамина D и высокая активность антиотензин-превращающего фермента в крови указывает на саркоидоз. Выделяют также ренальную форму ГКУ на фоне поражения почек, которая не реагирует на изменения кальция в диете, сопровождается выраженной гиперфосфатурией и умеренным вторичным гиперпаратиреозом с увеличением паратгормона, при нормокальциемии и гипофосфатемии.

Резорбтивная гиперкальциурия может возникать при вторичном гиперпаратиреозе, гипертиреозе, длительном приеме стероидных гормонов, иммобилизации и ряде других причин. Щелочная фосфатаза часто повышена при ренальной и резорбтивной формах ГКУ.

Почечный канальцевый ацидоз

Почечный канальциевый ацидоз (ПКА) представляет состояние с нарушением закисления мочи канальцами, с нарушением выделения аммония в мочу и синтеза бикарбоната в кровь. Это состояние сопровождается стабильно высоким рН мочи (не ниже 5,3 при фармакологических пробах с аммония хлоридом или фуросемидом; стабильно более 5,8). Нарушения синтеза бикарбонатов проявляется гиперхлоремией, которая является наиболее ярким проявлением этого заболевания. Также в крови выявляется гипокалиемией, гипокальциемией. Нередко на фоне ПКА в результате гипокальцемии возникает компенсаторный вторичный ГПТ. При врожденном ПКА 1 типа нарушения кислотно-основного баланса часто проявляются нефрокальцинозом. Существует ряд вторичных форм ПКА на фоне медуллярной губчатой почки (см. ниже), системных ревматических процессов (СКВ, с.Шегрена), гматоонкологии и ряда обменных нарушений.

Для диагностики этого стояния следует исследовать электролиты Na, K, Cl сыворотки крови, ионизированный кальций и паратгормон. При повторном определении (не менее 2 дней) рН утренней и разовой мочи рН мочи остается стабильно высоким (>6.5) в отсутствии инфекции мочевыводящих путей. В анализе суточной мочи следует исследовать суточную экскрецию натрия, калия, хлоридов, что позволяет исключить другие причины ацидоза, а также определить суточную экскрецию кальция, которая значительно повышена при этом заболевании. Низкая концентрация цитрата и магния характерна для расстройств функций канальцев и является основой для последующей фармакологической коррекции.

Медуллярная губчатая почка, нефрокальциноз и поликистоз почек

Губчатая почка представляет частый врожденный дефект образования почечной ткани с дефектом функции собирательных трубочек, который проявляется почечным кальцевым ацидозом (см выше) со щелочной мочей, гиперкальциурией и гиперфосфатурией. При губчатой почке отмечаются конкременты с преобладанием фосфата кальция. Другим обычным проявление медуллярной губчатой почки является ренальная гиперкальциурия со вторичным гиперпаратиреозом (см.ниже).

Нефрокальциноз сопровождается кальцификацией паренхимы почек и нарушении концентрационной функции почек. Он выявляется у больных с гиперпаратиреозом, хронической гиперкальциемий, губчатой почкой, и другими грубыми нарушением метаболизма кальция. Его проявлением также является почечный канальцевый ацидоз, гипокалиемия, и нарушение способности концентрировать мочу, гиперфосфатурия и гипернатриурия. Поликистоз почек также представляет собой наследственную патологию канальцев, сопровождающуюся пролиферацией эпителиальных клеток и формированием кист. До 30% пациентов с поликистозом почек имеют кальциевые или уратные конкременты.

При губчатой почке, нефрокальцинозе и поликистозе отмечается выраженное нарушение концентрации мочи с осмолярностью не выше 800 мОсмоль, что требует повторных исследований рН (02-089) и осмолярности утренней и разовой мочи. Обследование утренней мочи рекомендуется проводить на фоне ограничения жидкости на срок 12-24 часа.

Канальциевые нарушения при этих состояниях проявляются гипокальциурией с высоким отношением кальция к креатинину в разовой моче. Часто эти заболевания проявляются микро/макрогематурией и рецидивирующим пиелонефритом и требуют контроля функции почек с помощью исследования креатинина с расчетом СКФ и мочевины, кальция и фосфора крови, суточной экскреции уратов, фосфатов, цитрата и кальция, посева мочи, а также выявления микроальбуминурии.

Причины формирования конкрементов с преобладанием оксалата кальция (моногидрат, дигидрат и тригидрат оксалата кальция)

Идиопатическая гипероксалатурия 40-60 mg/d (>0.5ммоль/сут) является основной причиной нарушения почечной экскреции солей. На фоне поражения ЖКТ отмечается абсорбционная гипероксалатурия. К ней приводит как высокое потреблением оксалата с растительной пищей, так и патологией ЖКТ, проявляющейся хронической диареей. Диарея на фоне воспалительных заболеваний кишечника, поражения тонкого кишечника, нарушения функции печени, бариатрической хирургии снижается количество доступного кальция в кишечнике, что приводит к нарушение формирования нерастворимых оксалатных солей кальция из диетических оксалатов. Это проявляется снижением всасывания жирорастворимых витаминов, в том числе витамина D и витамина А. Таким образом, в кишечнике сохраняется значительное количество свободных оксалатов, что ведет к всасыванию избыточных количеств щавелевой кислоты в кровь и ее последующей экскреции почками с формированием мочевых конкрементов. Выделяют редкую первичную аутосомно-рецессивную гипероксалурию, обусловленную повышенным синтезом оксалата печенью, и сопровождающуюся наибольшими концентрациями оксалатов в моче (>100 мг/сутки >1ммоль/сут). Однако у многих пациентов с МКБ отмечается идиопатическая гипероксалатурия, которая не имеет очевидной причины. Нередким сочетанием при оксалатных конкрементах является сочетание гипероксалатурии и гиперурикозурии (>4 ммоль/сутки). При выраженной гиперурикозурии кальциевые соли, в частности оксалат, может высаливаться из мочи с формированием типичных оксалатов кальция.

Минимальный объем обследования первичных пациентов должен включать анализ крови на ионизированный кальций и креатинин с расчетом СКФ, электролиты плазмы (К, Na, Cl), рН утренней и разовой мочи, общий анализ мочи, отношение кальция и креатинина в разовой моче, а также следует обращать внимание на повышенную суточную экскрецию кальция, уратов, оксалатов при снижении экскреции цитрата и магния.

Причины образования конкрементов с преобладанием мочевой кислоты (ангидрид мочевой кислоты, дигидрат мочевой кислоты, натрий моноурат,)

Конкременты мочевой кислоты являются вторыми после кальций-содержащих мочевых камней, причем их формирование в меньшей степени зависит от концентрации других солей. При рН 5,5 мочевая кислота и ее анионы (ураты) находятся в равновесии, а при более низких значениях рН формируется избыток нерастворимой мочевой кислоты, которая преципитирует в виде уратных конкременты. Стабильно низкий рН мочи (<5.8) являются основным фактором формирования уратных конкрементов, а медикаментозное защелачивание мочи до 7.0-7.2 приводит к химолизу конкрементов. Высокий уровень потребления мочевой кислоты и ее продукция при метаболизме также играют роль развитии гиперурикемии. Гиперурикемия, которая в ряде случаев сопровождается урикозурией, отмечается у лиц с характерными метаболическими изменениями, т.н. «метаболическим синдромом» в виде гипертриглицеридемии, высоким индексом массы тела, сниженной толерантностью глюкозе и сахарном диабете 2 типа. В ряде случаев у таких лиц может развиваться картина подагры, однако урикозурия часто отсутствует. Особенностью «метаболического синдрома» является крайне низкий рН мочи, который лежит в основе нарушения растворимости мочевой кислоты. Причиной нарушения рН мочи является нарушение синтеза аммонийных оснований и синтеза бикарбонатных анионов почками.

Минимальный объем обследования первичных пациентов должен включать анализ крови на концентрацию мочевой кислоты, триглицеридов, холестерин, липидограмму, глюкозу, инсулин, гликированный гемоглобин, креатинин, высокочувствительный С-реактивный белок (СРБ), рН утренней и разовой мочи, общий анализ мочи, а также суточную экскрецию уратов.

Причины образования конкрементов инфекционного характера (струвит, урат аммония, гидроксиапатит, карбонапатит, аморфный фосфат, карбонат кальция, витлокит, ньюберит)

Расщепление мочевины под действием фермента уреазы приводит к образованию ионов аммония и солей угольной кислоты. В результате этой реакции моча защелачивается аммонийными основаниями до сверхфизиологического уровня (pH>7), формированию аммонийных солей тривалентных фосфатов (струвита) и уратных солей (урат аммония), а также и образованию конкрементов, содержащих карбонат или гидрокарбонат кальция. Основными уреазо-позитивными микроорганизмами являются Proteus spp. и Klebsiella spp., реже бактерии рода Providencia, Staphylococcus, Serratia, Ureaplasma urealyticum. Менее 5% штаммов кишечной палочки (E.coli) производят уреазу.

Редкие конкремента урата аммония сопровождаются гиперурикозурией при щелочном рН мочи

Для диагностики инфекции мочевыводящих путей следует исследовать общий анализ мочи, рН утренней и разовой мочи, проводить подсчет клеток по Нечипоренко, проводить посев мочи с определением чувствительности к антибиотикам. Клинический анализ крови, и исследование высокочувствительного С-реактивного белка или прокальцитонина позволяет выявить воспаление, характерное для хронического инфекционного процесса.

Конкременты, содержащие цистин и другие редкие компоненты (цистин, дигидроксиаденин, ксантин)

Редкие монокомпонентные конкременты, такие как цистин, обусловлены генетическими нарушения метаболизма. Гиперцистинурия, обсловленная врожденным нарушением реабсорбции аминокислот, приводит к формированию цистиновых конкрементов. Общий анализ мочи и анализ мочи по Нечипоренко позволяет обнаружить характерные гексагональные цистиновые кристаллы, а эффективное лечение приводит к их исчезновению из мочи. При анализе рН утренней и разовой мочи отмечается кислая среда.

Дефицит аденин-фосфорибозилтрансферазы приводит к формированию конкрементов дигидрокисаденина. Как и при цистинемии исследованием мочевого осадка позволяет обнаружить характерные мелкие округлые кристаллы с характерным лучепреломлением, при этом рН мочи является щелочным. При нарушения метаболизма, приводящих к ксантиновым мочевым камням, отмечается снижение синтеза мочевой кислоты, приводящих как к выраженной гипоурикемиии, так снижению ее концентрации в моче.

Для обследования пациентов с цистиновыми камнями и конкрементами с редким химическим составом следует проводить анализ мочевого осадка с помощью поляризационной микроскопии. Такой анализ позволяет выявить редкие формы кристаллов и контролировать эффект проводимой терапии.

Список литературы

Negri AL et oth. Clinical and biochemical profile of patients with «pure» uric acid nephrolithiasis compared with «pure» calcium oxalate stone formers. Urol Res 2007 Oct;35(5):247-51.
Simic-Ogrizovic S. et oth. The most important factor for active urinary stone formation in patients with urolithiasis. Med Pregl 2007;60 Suppl 2:117-202.
Stone Disease ed. Denstedt J. et Khoury S. The 2nd International Consultation on Stone Disease held at the 29th Congress of the Société Internationale d’Urologie Health Publications, 2008, 328 p.
Conort P Tostivint I Urinary stone management at the time of its discovery . Rev Prat 2011;61(3):379-81.
Goodman, H.O., R.P. Holmes, D.G. Assimos Genetic factors in calcium oxalate stone disease. J Urol, 1995. 153(2): p. 301-7.
Pak, C.Y., Southwestern Internal Medicine Conference: medical management of nephrolithiasis—a new, simplified approach for general practice. Am J Med Sci, 1997. 313(4): 215-9.
Pak C.Y., Should patients with single renal stone occurrence undergo diagnostic evaluation? J Urol, 1982. 127(5): 855-8.
Glemain P, Prunet D. Identification of lithogenic risk factors by a simplified first-line laboratory assessment in urinary calculi patients. Prog Urol. 2006 Nov;16(5):542-5.
Lemann, J., Calcium and phosphate metabolsim:an overview in health and in calcium stone formers. Kidney Stones Medical and Surgical Management, ed. and F. Coe, Pak, Parks,Preminger. 1996, Philadelphia, Pennsylvania: Lipincott-Raven. 264 p.
Taguchi Y. Managment of urinary calculi: updated CMA J. 1970 vol. 102 (2),154-156.
Lee YH et oth. Stone recurrence predictive score (SRPS) for patients with calcium oxalate stones. J Urol 2003 170(2 Pt 1): 404-7
Glew RH et oth. Nephropathy in dietary hyperoxaluria: A potentially preventable acute or chronic kidney disease World J Nephrol 2014, 6:122-142 .
Curhan GC, Taylor EN 24-h uric acid excretion and the risk of kidney stones Kidney Intеrn 2008, 73: 489-496.

Документы

Подавление экспрессии гена трансмембранного регулятора проводимости при муковисцидозе агентами, которые модулируют внутриклеточные двухвалентные катионы

При муковисцидозе (CF) эпителиальные клетки неспособны нормально регулировать секрецию Cl- апикальной мембраной в ответ на агенты, которые увеличивают циклический AMP, но они действительно увеличивают секрецию Cl- в ответ на увеличение внутриклеточного Ca2 +. Поскольку внутриклеточные двухвалентные катионы регулируют экспрессию многих генов, мы предположили, что мобилизация внутриклеточного Ca2 + и / или других двухвалентных катионов может модулировать не только Ca (2 +) — зависимые Cl- каналы, но также экспрессию гена регулятора трансмембранной проводимости кистозного фиброза (CFTR). .Чтобы оценить эту концепцию, клетки карциномы толстой кишки человека HT-29 культивировали в различных условиях, разработанных для манипулирования внутриклеточными концентрациями двухвалентных катионов, а экспрессию гена CFTR количественно оценивали на уровнях транскрипции, накопления мРНК, периода полужизни мРНК и белка. Воздействие ионофоров двухвалентных катионов A23187 и иономицина (агентов, повышающих внутриклеточные концентрации двухвалентных катионов) вызывало зависимое от дозы и времени снижение уровней мРНК CFTR, которое можно было заблокировать с помощью Ca (2 +) — и Mg (2+). ) -бесплатные СМИ.Ионофор-индуцированная модуляция гена CFTR наблюдалась также с клетками карциномы толстой кишки человека Т84 и свежевыделенными нормальными эпителиальными клетками бронхов человека. Инкубация клеток HT-29 с тапсигаргином, агентом, высвобождающим Ca2 + из внутриклеточных хранилищ, или в среде, содержащей повышенные внеклеточные концентрации Ca2 + или Mg2 +, также вызвала подавление уровней мРНК CFTR. Продолжительный анализ транскрипции показал, что параллельно со снижением уровней мРНК CFTR, A23187 снижает скорость транскрипции гена CFTR, в то время как период полужизни транскрипта мРНК CFTR не изменяется.В соответствии с подавлением экспрессии гена CFTR уровни белка CFTR также снижались после воздействия A23187. Таким образом, несмотря на независимость Ca (2 +) — зависимых каналов Cl- и циклических AMP-зависимых каналов Cl-, связанных с CFTR, в эпителиальных клетках, увеличение внутриклеточных концентраций двухвалентных катионов подавляет экспрессию гена CFTR на уровне транскрипции. , с последующим уменьшением мРНК и белка CFTR.

Страница исследования факультета | Молекулярная и клеточная биология

Терри Мачен

Профессор отделения клеточной биологии и биологии развития аспирантуры

Домашняя страница лаборатории: http: // mcb.berkeley.edu/labs/machen/

Полная справочная информация

Область научных интересов

Основная цель наших исследований, начиная с 1995 г., состояла в том, чтобы определить, как эпителиальные клетки дыхательных путей легких реагируют на бактериальные инфекции, особенно при генетическом муковисцидозе, и предотвращать их.

Текущие проекты

Регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR) представляет собой анионный канал, расположенный в апикальной мембране трахеи и других секреторных и абсорбирующих эпителиальных клетках.Генетическое заболевание кистозный фиброз (CF) вызывается мутациями в CFTR. В прошлом мы использовали патч-зажим и трансэпителиальную электрофизиологию для характеристики проницаемости канала CFTR для Cl ^–, HCO _{3 ^–} и других анионов. Позже мы объединили электрофизиологию с цифровой микроскопией с визуализацией и генетическим нацеливанием на зеленый флуоресцентный белок (GFP) и органические флуоресцентные красители, чтобы показать, что наиболее важной функцией CFTR является опосредование секреции Cl ^— и HCO ₃ ^— в реакция на присутствие бактерий (наиболее заметно — Pseudomonas aeruginosa ) в просвете дыхательных путей.У людей, страдающих МВ, снижение функции CFTR приводит к изменению ионной среды просвета и накоплению вязкой слизи со сниженной активностью антибактериальных продуктов, а также бактерий (наиболее заметно — Pseudomonas aeruginosa ) и нейтрофилов. Симптомы заболевания возникают в результате повреждающего действия бактерий, нейтрофилов и их секретируемых продуктов.

После выхода на пенсию я сосредоточился на преподавании в Bio1AL (лаборатория Intro Biol) и MCB136 (Advanced Human Physiology), но также продолжал участвовать в исследованиях благодаря сотрудничеству: (i) Chi Li (U.Луисвилл) и его группа определяют, как молекула N- (3-оксоацил) гомосерин-лактон (C12), секретируемая P. aeruginosa , вызывает апоптоз (самоубийство клеток) в эпителиальных клетках дыхательных путей. Параоксоназа 2 (лактоназа в эпителиальных клетках дыхательных путей) расщепляет C12 на более мелкие молекулы, которые активируют новую форму апоптоза, в которой участвуют митохондрии, но не проапоптотические молекулы Bax и Bak. Ли и его группа пытаются идентифицировать другие небольшие, похожие на C12 молекулы, которые можно использовать для лечения рака, резистентного к обычным лекарствам, активирующим Bax и Bak.(ii) С помощью Кристиана Шварцера (UCB) и Хорста Фишера (Исследовательский институт Детской больницы Окленда) мы показали, что аминокислоты, высвобождаемые из раненых или поврежденных эпителиальных клеток дыхательных путей, являются сильными хемоаттрактантами для P. aeruginosa , которые обнаруживают и связываются с клетками. Эти связанные бактерии могут обеспечивать начальные места прикрепления для роста и устойчивости бактерий. (iii) Хуан Яновски и его группа (U. Saskatchewan) показали, что P. aeruginosa запускают секрецию ионов и жидкости из клеток глубоко в железах трахеи у живых свиней.В настоящее время проводятся эксперименты, в ходе которых проверяется, контролируют ли местные нервные сети эту секрецию. Яновски и его группа также проверяют, могут ли при МВ небольшие дыхательные пути легких, помимо снижения Cl ^–, HCO _{3 ^–} и секреции жидкости, также страдать от изменения абсорбции Na ⁺.

Избранные публикации

Pseudomonas aeruginosa вызывает секрецию жидкости с поверхности дыхательных путей, опосредованной CFTR, в трахее свиней.[Луан X, Кампануччи В.А., Наир М., Йилмаз О., Белев Г., Мачен Т.Э., Чапман Л.Д., Яновски Дж. П.. Proc. Nat. Акад. Sci ., 111: 12930-5, 2014] Отмечено в Nature как «Изюминка исследования»: http://www.nature.com/nature/journal/v512/n7515/full/512350d.html

Параоксоназа 2 выполняет проапопотическую функцию в клетках мыши и человека в ответ на N- (3-оксододеканоил) -гомосерин-лактон молекулы Pseudomonas aeruginosa , воспринимающей кворум. [Шварцер С., Фу З., Морита Т., Уитт А.Г., Нили А.М., Ли С., Мачен Т.Э. J Biol Chem. 290 (11): 7247-5, 2015]

Лактон N- (3-оксоацил) гомосерина ингибирует рост опухоли независимо от белков Bcl-2. [Чжао Г., Нили А.М., Шварцер К., Лу Х., Уитт А.Г., Стиверс Н.С., Берлисон Дж. А., Уайт С., Мачен Т.Э., Ли К. Oncotarget . 7 (5): 5924-42, 2016]

Хемотаксис и связывание Pseudomonas aeruginosa с эпителиальными клетками дыхательных путей человека, пораженными царапинами при муковисцидозе. [Шварцер С., Фишер Х., Мачен Т.Э. 2016. PLoS One. 11 (3): e0150109, 2016]

Муковисцидоз свиней неспособен выделять жидкость с поверхности дыхательных путей в ответ на вдыхание патогенов [Луан X, Кампануччи В.А., Наир М., Йилмаз О., Белев Г., Мачен Т.Э., Чепмен Д., Яновски Ю.П. Nat Commun. 8: 786, 2017]

N- (3-оксоацил) -гомосерин-лактон индуцирует апоптоз главным образом через митохондриальный путь в фибробластах [Neely AM, Zhao G, Schwarzer C, Stivers NS, Whitt AG, Meng S, Burlison JA, Machen TE, Li C. Клеточная микробиология, 20.DOI: 10,1111 / cmi, 2018.

Распыленный гипертонический раствор вызывает активную секрецию жидкости, опосредованную нервной системой, при муковисцидозе трахеи свиней. [Луан Х, Там Дж. С., Белев Дж., Джагадишан С., Мюррей Б., Хассан Н., Мачен Т. Э., Чепмен Д. Е., Яновски Дж. П.. Nature Sci. Репутация . в печати, 2019]

Подслизистые железы дыхательных путей свиней с муковисцидозом страдают от аномального переноса ионов через серозные ацинусы, собирательный проток и реснитчатый проток.

[Луан Х, Там Дж. С., Джагадишан С., Грищенко Н., Хассан Н., Джойно П., Шипли А. М., Мачен Т. Э., Яновски Дж. П.. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5): L931-L942, 2019]

Фотография предоставлена: Марк Джозеф Хэнсон из студии Марка Джозефа.

Последнее обновление 07.08.2021

Генетические методы лечения муковисцидоза легких | Молекулярная генетика человека

Аннотация

Целью генной терапии кистозного фиброза (CF) заболевания легких является эффективная и безопасная экспрессия регулятора трансмембранной проводимости CF (CFTR) в соответствующих типах легочных клеток.Хотя пациенты с МВ страдают полиорганными заболеваниями, хронические бактериальные инфекции легких и связанное с ними воспаление являются основной причиной сокращения продолжительности жизни. Терапевтические подходы, основанные на переносе генов, возможны отчасти потому, что эпителий дыхательных путей напрямую доступен для доставки аэрозоля или инстилляции. Улучшение стандартных векторов доставки и разработка новых векторов, а также появляющиеся технологии и новые модели животных продвигают вперед новые захватывающие исследования.Здесь мы рассматриваем последние события, которые продвигают эту область исследований.

ВВЕДЕНИЕ

С момента открытия гена трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) при кистозном фиброзе (CF) в 1989 году, CF был в поле зрения ученых, надеющихся предотвратить или отсрочить начало и прогрессирование заболевания легких с помощью переноса генов. Хотя потеря функции CFTR отрицательно сказывается на множестве клеток и тканей, прогрессирующее заболевание легких составляет большую часть заболеваемости и смертности.По этой причине большинство усилий в этой области было сосредоточено на переносе генов в дыхательные пути. CFTR экспрессируется множеством типов эпителиальных клеток в поверхностных и подслизистых железах проводящих дыхательных путей, где его мРНК экспрессируется в небольшом количестве. Продукт гена представляет собой анионный канал апикальной мембраны, который регулируется нуклеотидами и фосфорилированием (1–3). Утрата функции CFTR, вероятно, изменяет объем и состав секрета дыхательных путей, но ключевые детали молекулярного патогенеза заболевания легких при МВ остаются предметом интенсивных исследований.

Комплементация этого аутосомно-рецессивного заболевания путем доставки кДНК CFTR в эпителий дыхательных путей с помощью вирусного или невирусного вектора является привлекательной, поскольку предполагаемые клетки-мишени доступны посредством прямой инстилляции или доставки аэрозоля. Более того, ранние исследования показали, что комплементация всего лишь 6-10% эпителия CF генерирует уровни транспорта хлоридов in vitro дикого типа (4). Однако после завершения первого испытания генной терапии на людях в 1993 году достижение этой цели оказалось сложной задачей.

Существуют разногласия относительно того, какие клетки нацелены на генную терапию МВ. Можно привести аргументы в пользу коррекции клеток поверхностного эпителия, подслизистых желез или того и другого (5–8). Гетерогенная популяция клеток экспрессирует CFTR в дыхательных путях, включая реснитчатые клетки в поверхностном эпителии и субпопуляцию клеток в протоках подслизистых желез и ацинусах. По-видимому, в легких существует несколько типов эпителиальных клеток, которые обеспечивают функции предшественников, обеспечивая возможность долгосрочной коррекции, если такие клетки могут быть нацелены с помощью интегрирующих векторов (9).Эти клетки могут представлять плюрипотентную популяцию или служить предшественниками для определенного клона. Эксперименты с несколькими видами и модельными системами идентифицируют популяции потенциальных предшественников, в том числе: базальные клетки (10,11) и столбчатые клетки без ресничек дыхательных путей (10,12,13), эпителий подслизистых желез (14–16), клетки Клары ( 17,18) и альвеолярные клетки типа II в дистальном отделе легкого (19,20). Исследования с использованием интегрирующих векторов [на основе вируса мышиного лейкоза Молони (MLV) и лентивируса] предполагают, что если клетки, обладающие способностью к предшественникам, нацелены на in vitro и in vivo на , может быть достигнута долговременная экспрессия (21-25).

ПОСЛЕДНИЕ ВЕКТОРНЫЕ РАЗРАБОТКИ

Оболочечные вирусные векторы

Современная технология лентивирусных векторов достигла значительного прогресса в достижении целей эффективной, безопасной и устойчивой экспрессии CFTR в соответствующих типах легочных клеток. Начинаются исследования последствий повторного введения лентивирусных переносчиков в дыхательные пути. Sinn и др. . (26) многократно вводили (семь доз, одна доза в неделю) лентивирусный вектор на основе вируса иммунодефицита кошек (FIV) на основе бакуловирусной оболочки (GP64) в носовой эпителий мышей и наблюдали дозозависимое увеличение экспрессии репортерного гена, которое сохранялось. за 80 недель эксперимента (рис.1). Наблюдаемые врожденные или адаптивные иммунные ответы на вектор или трансгены, кодируемые вектором, были минимальными и не могли ограничить экспрессию репортерного или терапевтического гена. Напротив, Limberis et al . (27) сообщили, что перенос гена с помощью вектора ВИЧ, псевдотипированного VSV-G, приводил к активации трансген-специфичных Т-клеток у мышей. Трансдукция VSV-G-псевдотипами ВИЧ-векторов может быть дополнительно улучшена с помощью составов, включающих магнитофектины (28), полиэтиленимин (29) или лизофосфатидилхолин (30,31).Такие методы могут оказаться жизненно важными для достижения эффективности трансдукции, достаточной для исправления дефекта транспорта хлорида in vivo . Для дальнейшей оценки безопасности и эффективности различных исследуемых лентивирусных векторных платформ для переноса легочных генов потребуются тщательные доклинические исследования на крупных животных моделях.

Рисунок 1.

Повторное введение лентивирусного вектора приводит к стойкой экспрессии трансгена в носовых дыхательных путях.Семь доз GP64-псевдотипированной FIV-экспрессирующей люциферазы вводили мышам с интервалом в 1 неделю в течение 7 недель подряд через носовые инстилляции (стрелки). В указанные моменты времени световое излучение регистрировалось с помощью биолюминесцентного изображения, а данные количественно оценивались с помощью программного обеспечения Living Image. Стабильная экспрессия люциферазы была зарегистрирована в течение 80 недель. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка. n = 5.

Рисунок 1.

Фетальное и неонатальное повторное введение GP64-псевдотипированного вектора ВИЧ также исследовали в легких мыши (32).Бакли и др. . (32) сравнили однократное внутриматочное введение плода, одно внутриматочное введение, два неонатального введения и два неонатального введения. Уровни макрофагальной трансдукции увеличиваются при повторном введении в неонатальный период. Авторы предположили, что после начальной дозы лентивирусного вектора макрофаги рекрутируются в просвет легких и впоследствии трансдуцируются второй и третьей дозами. Авторы далее пришли к выводу, что внутриамниотическое введение GP64-псевдотипа ВИЧ было наиболее эффективным способом доставки для достижения трансдукции эпителиальных клеток дыхательных путей в модели на мышах.

Mitomo et al . (33) описали лентивирусный вектор на основе вируса иммунодефицита обезьян (SIV), псевдотипированный белками оболочки вируса Сендай, гемаглютинин-нейраминидазой (HN) и гибридным белком (F). F / HN-псевдотипированный вектор SIV трансдуцировал клетки носового эпителия, что приводило к устойчивой экспрессии трансгена в течение всего эксперимента (8–12 месяцев) in vivo . Подобно исследованиям с GP64-псевдотипом FIV (26), повторное введение было возможным с F / HN-псевдотипом SIV, где экспрессия трансгена оставалась стабильной после трех доз вектора.Кроме того, SIV с псевдотипом F / HN обеспечивает функциональную экспрессию CFTR in vitro , как определено анализом оттока йодида.

Члены семейства парамиксовирусов с известным тропизмом дыхательных путей в настоящее время изучаются как потенциальные средства доставки CFTR для лечения заболевания легких с использованием систем обратной генетики. Квилас и др. . (34) недавно продемонстрировали, что вектор на основе респираторно-синцитиального вируса (RSV) может доставлять CFTR и корректировать дефект транспорта хлоридов в первичных культурах эпителия дыхательных путей человека при CF.Кроме того, вектор на основе вируса парагриппа человека (PIV) опосредовал детектируемую, но временную экспрессию GFP и α-фетопротеина у макак-резусов (35). Оба вектора, основанные на RSV и PIV, способны к репликации; однако эти исследования могут привести к векторам с ослабленной репликацией, которые в дальнейшем будут сконструированы для снижения экспрессии цитотоксических и / или иммуногенных белков. Если такая инженерия осуществима, она может улучшить продолжительность экспрессии гена, устранить препятствие ранее существовавшего иммунитета, позволить повторное введение и сделать эти векторы пригодными для клинических исследований.

Инкапсидированные вирусные векторы

Хелпер-зависимые аденовирусные (HD-Ad) векторы не экспрессируют вирусные кодирующие последовательности и не вызывают сниженные клеточно-опосредованные иммунные ответы по сравнению с предыдущими поколениями Ad-векторов. Однако капсидные белки HD-Ad остаются мишенями для нейтрализующих антител и могут запускать цитокиновые ответы эффекторных клеток врожденного иммунитета. Недавно Cao et al . (36) продемонстрировали, что временная иммуносупрессия значительно повышает эффективность экспрессии трансгена и облегчает повторное введение векторов HD-Ad в легкие мыши.В дополнение к иммуносупрессии, переключение серотипа является предложенным методом, позволяющим повторно дозировать CFTR, экспрессирующие векторы HD-Ad in vivo (37). Гранио и др. . (38) доставили вектор Ad, экспрессирующий GFP-меченный CFTR, в первичные культуры эпителия дыхательных путей человека при CF. Они заметили, что замена волокна Ad5 волокном серотипа 35 дает более эффективную апикальную трансдукцию и коррекцию дефекта транспорта Cl ^—. Эти данные предполагают, что векторы Ad, такие как Ad5, которые используют рецептор коксаки и аденовируса (CAR), менее эффективны при трансдукции апикальной поверхности эпителиальных клеток дыхательных путей, чем CAR-независимые серотипы векторов, такие как Ad35.В совокупности эти исследования описывают стратегии использования HD-Ad, иммуносупрессии, переключения серотипов и оптимального отбора волокон для повышения безопасности и долгосрочной эффективности аденовируса для переноса генов в дыхательные пути.

Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (AAV) использовался для переноса легочных генов в нескольких доклинических и клинических испытаниях. Flotte и др. . (39) продемонстрировали, что AAV1 имеет преимущества перед AAV5 в дыхательных путях шимпанзе как с точки зрения эффективности переноса генов, так и с точки зрения снижения иммуногенности.Важно отметить, что это наблюдение было подтверждено исследованиями на хорошо дифференцированном эпителии дыхательных путей человека, предполагая, что подход с коинфекцией двойного репортерного вируса может помочь предсказать эффективность векторов AAV in vivo . Также был достигнут прогресс в разработке кассет с минимальной экспрессией CFTR, которые могут быть размещены вектором AAV (40).

Дополнительные стратегии повышения эффективности трансдукции AAV в эпителий дыхательных путей включают использование различных серотипов капсида или мутантов капсида с большим сродством к эпителиальным клеткам дыхательных путей (41).Как обсуждается ниже, др. Новые варианты капсида AAV возникли в результате направленной эволюции и перетасовки последовательностей (42–44). Хотя стандартная методология тройной трансфекции остается вариантом, новые разработки в методах на основе бакуловирусов лучше подходят для удовлетворения требований к продукции AAV (45–47). В заключение, улучшения в разработке AAV, дизайне серотипов капсида и методах получения сделали AAV привлекательным вектором для доставки CFTR в дыхательные пути. Исследования эффективности и повторного введения переносчиков на крупных моделях животных помогут направить развитие переносчиков.

Невирусные векторы

Значительный прогресс был достигнут в разработке невирусных векторов для переноса генов в легкие. Обычно невирусные векторы делятся на две категории: (i) неинтегрирующиеся, такие как плазмиды (48), наночастицы (49) и мини-круги (50), или (ii) интегрирующие, такие как транспозоны (51) и фаг phiC31 (52,53). Как интегрирующие, так и неинтегрирующие невирусные векторы сталкиваются со многими из одних и тех же препятствий для доставки и трансдукции in vivo .Оптимизация эффективности доставки ДНК-векторов в дыхательные пути in vivo и остается в центре внимания (54,55). Доксорубицин (56), карбоксиметилцеллюлоза (57) и хитозан (58) улучшают перенос и экспрессию плазмидных генов в дыхательных путях. В качестве альтернативы некоторые группы исследуют гибридные векторные системы, сочетающие свойства аденовируса (59) или лентивируса с векторами на основе транспозонов для улучшения доставки (60).

ПОСЛЕДНИЕ РАЗРАБОТКИ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ CF

С 1993 г. было проведено около 25 испытаний фазы I / II с использованием вирусных или невирусных векторов для лечения МВ (61).В настоящее время продолжающееся клиническое исследование в этой области было инициировано Консорциумом генной терапии МВ Великобритании, финансируемым Фондом кистозного фиброза, с использованием невирусного агента переноса генов в аэрозольной форме (62). Пациенты с МВ получают однократную дозу плазмиды, несущей кДНК CFTR, которая входит в комплекс с катионным липидом GL67. Плазмида, названная pGM169, лишена предполагаемых провоспалительных последовательностей (CpG-островков), а экспрессия гена регулируется промотором гибридного фактора элонгации-1a. При образовании комплекса с катионным липидом GL67A pGM169 приводила к экспрессии> 4 недель в моделях мышей при однократном дозировании (48).Первоначальное клиническое испытание однократной дозы позволит оценить безопасность и продолжительность экспрессии у пациентов и послужит руководством для запланированного (примерно 100 пациентов) многодозного плацебо-контролируемого испытания. Запланированное исследование, которое должно начаться осенью 2011 г. (Ута Гризенбах, личное сообщение), определит, улучшит ли повторный невирусный перенос гена CFTR (12 доз в течение 12 месяцев) заболевание легких при МВ (61).

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

Направленная эволюция вирусных векторов

В качестве носителей для применения в генной терапии все вирусные векторы обладают потенциальными недостатками, такими как иммуногенность, тропизм, временная экспрессия трансгена и получение высоких титров.Успех использования вирусных векторов будет зависеть от способности преодолевать эти ограничения. Направленная эволюция вирусов — это метод создания новых или улучшенных свойств вирусных белков с использованием подходов, основанных на отборе. В последнее десятилетие AAV и ретровирусы были предметом комбинаторных инженерных подходов. AAV был привлекательным благодаря своему профилю безопасности, низкой иммуногенности и способности трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Капсид AAV определяет инфекционность и клеточный тропизм (63) и, следовательно, является целью модификации посредством направленной эволюции (42) или пэннинга фага (64).Широкий спектр встречающихся в природе серотипов AAV предполагает, что капсид устойчив к изменениям (65). Направленная эволюция капсида AAV с помощью мутагенеза на основе ПЦР в сочетании с высокопроизводительной рекомбинацией in vitro сгенерировала библиотеку химерных генов cap с компонентами из двух различных серотипов. Эти серотипы, AAV2 и AAV5, используют разные рецепторы, гепарансульфат и сиаловую кислоту соответственно (42). Дальнейший отбор этой библиотеки для улучшенной трансдукции клеток дыхательных путей человека в культуре позволил идентифицировать новый вариант AAV, AAV2.5T, химера между AAV2 (aa1–128) и AAV5 (aa129–725) с одноточечной мутацией (A581T), которая демонстрирует усиленное связывание с апикальной поверхностью эпителия дыхательных путей и улучшенный перенос генов (42). Кроме того, AAV2.5T может эффективно экспрессировать кДНК CFTR в клетках дыхательных путей человека в культуре и корректировать дефект транспорта Cl ^— в эпителии CF человека (42).

Гамма-ретровирусные векторы также являются эффективными инструментами доставки генов, но инсерционный мутагенез и потенциальный онкогенез из-за преимущественной интеграции в сайтах начала транскрипции (TSS) являются ограничениями для их клинического использования (66–69).Лим и др. . (70) недавно показали, что случайная вставка сконструированных доменов с цинковыми пальцами по всему участку MLV Gag-Pol и отбор жизнеспособных вариантов приводят к изменению предпочтений интеграции этих векторов. Кроме того, эти модифицированные шаблоны интеграции не благоприятствовали TSS. Этот подход может быть распространен на лентивирусы и может служить мощным методом улучшения профиля безопасности ретровирусов как векторов переноса генов для клинического использования.

Ремонт и добавление генов

Метод, известный как «редактирование генома», обеспечивает эффективную и точную модификацию целевой последовательности в геноме путем введения двухцепочечного разрыва (DSB) с последующей модификацией локуса во время последующей репарации DSB путем гомологичной рекомбинации.DSB индуцируется нуклеазой цинкового пальца (ZFN) (71–74), специально сконструированной эндонуклеазой, предназначенной для расщепления выбранной мишени в геноме. ZFN состоит из двух компонентов: белка цинкового пальца (ZFP) и неспецифического домена расщепления эндонуклеазы Fok1. ZFP связывается с целевой последовательностью и содержит тандемный массив пальцев Cys2-His2 (75), каждый из которых распознает 3 п.н. ДНК. Массивы обычно содержат три или четыре пальца, которые связывают мишень из 9 или 12 пар оснований соответственно. Домены Fok1 должны димеризоваться для расщепления ДНК (76), следовательно, специфичность сайта узнавания удваивается с 9 до 18 п.н. для трехпалого ZFN.

Редактирование генома на основе гомологии может быть использовано для коррекции мутировавших генов, ответственных за моногенные нарушения (рис. 2). Редактирование генома на основе ZFN требует доставки матрицы репарации донорской ДНК вместе с целевой парой ZFN. Способы создания пар ZFN, нацеленных на специфические геномные локусы, становятся широко доступными и включают подходы модульного дизайна (77–79) и стратегию инженерии олигомеризованного пула на основе отбора (OPEN) (80). ZFN, сконструированные с использованием технологии OPEN, как было показано, связывают геномную ДНК, кодирующую CFTR (78), и создают DSB вблизи мутации ▵F508 в экзоне 10.Обеспечение донорской ДНК-матрицы дикого типа с неинтегрирующим вектором, таким как лентивирусный вектор с дефицитом интегразы (81), может облегчить репарацию этой мутации путем гомологичной рекомбинации.

Рисунок 2.

Схема стратегии целевой коррекции и добавления генов. ( A ) Экспрессированные пары ZFN связываются и расщепляют целевой геномный локус рядом с мутацией, вызывающей заболевание. ZFN состоят из химерных цинковых пальцев (синий) и эндонуклеазных доменов Fok1 (красный).Введение DSB способствует гомологичной рекомбинации с использованием донора репарационной матрицы. ( B ) Для целевого добавления гена пара ZFN расщепляет заранее определенный локус «безопасной гавани». Кассета экспрессии с терапевтическим геном (зеленый) фланкируется плечами гомологии с локусом безопасной гавани.

Рисунок 2.

Схема целевой коррекции генов и стратегий добавления генов. ( A ) Экспрессированные пары ZFN связываются и расщепляют целевой геномный локус рядом с мутацией, вызывающей заболевание.ZFN состоят из химерных цинковых пальцев (синий) и эндонуклеазных доменов Fok1 (красный). Введение DSB способствует гомологичной рекомбинации с использованием донора репарационной матрицы. ( B ) Для целевого добавления гена пара ZFN расщепляет заранее определенный локус «безопасной гавани». Кассета экспрессии с терапевтическим геном (зеленый) фланкируется плечами гомологии с локусом безопасной гавани.

Другие стратегии репарации с использованием самонаводящихся эндонуклеаз (82–84) или эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (85), обеспечивают альтернативные механизмы для создания DSB в геномной ДНК и позволяют репарацию генов путем совместной доставки гомологичной матрицы репарации.Потенциальное преимущество каждого из этих подходов к репарации генов состоит в том, что коррекция CFTR в типах клеток-предшественников может сохранить нативные регуляторные элементы и сделать возможной коррекцию в последующих дочерних клетках. Разработка и доставка реагентов к эпителию дыхательных путей будут важны для развития этой области.

Альтернатива подходу к репарации генов называется «целевым добавлением гена» (рис. 2). Здесь ZFN могут быть использованы для создания DSB в потенциальных локусах «безопасной гавани», таких как AAVS1 (86), CCR5 (87) или локус Rosa26 мыши (88).В этом подходе весь терапевтический трансген с фланкирующими плечами гомологии будет вставлен в локусы безопасной гавани путем гомологичной рекомбинации. Считается, что модификация такого локуса с меньшей вероятностью нарушит экспрессию соседних генов или нарушит функцию других генетических элементов (89).

Применение РНК-интерференции для лечения CF

Недавний взрыв знаний в области малых интерферирующих РНК привел к их приложениям, имеющим непосредственное отношение к МВ.Во-первых, RNAi использовалась как инструмент для идентификации генных продуктов, которые вносят вклад в этапы биогенеза CFTR дикого типа и мутантного CFTR, включая перенос ER и Golgi, время пребывания в клеточной мембране и его удаление с помощью протеосомной деградации (90–92). Это повысило вероятность того, что стратегии на основе РНКи могут быть разработаны для увеличения экспрессии F508 CFTR, для спасения ▵F508 CFTR от протеосомной деградации или увеличения времени его пребывания в клеточной мембране. Любой из этих подходов может обеспечить достаточную остаточную функцию CFTR, чтобы быть терапевтически значимыми.Точно так же нацеливание на другие клеточные пути, такие как те, которые участвуют в воспалении, может предложить средства для облегчения симптомов болезни и ее прогрессирования. Существенным препятствием для трансляционных исследований в этой области является определение методов эффективной доставки РНКи в хорошо дифференцированный эпителий дыхательных путей. Другой областью исследований, имеющей отношение к данной области, является идентификация репертуара микроРНК в эпителии дыхательных путей и других клетках, экспрессирующих CFTR, а также их соответствующих генных продуктов-мишеней.Знания в этой области могут выявить новые цели для терапевтических манипуляций.

Инженерия ткани легкого

Трансплантация легких в настоящее время является единственным окончательным методом лечения терминальной стадии заболевания легких при МВ. Количество донорских легких ограничено, и трансплантация обеспечивает выживаемость только 10–20% через 10 лет (93). Недавно две группы независимо друг от друга использовали аналогичные стратегии тканевой инженерии для разработки аутологичного биоискусственного легкого, которое может помочь преодолеть ограниченную доступность донорских тканей (94,95).Биоискусственные легкие были созданы путем создания цельнолегочного каркаса путем перфузии и децеллюляризации легкого взрослой крысы с последующим пересевом эндотелиальных и эпителиальных поверхностей каркаса новыми клетками. Доказательства газообмена в полученных трансплантатах были продемонстрированы. При дальнейшем развитии этой технологии можно было бы предусмотреть коррекцию ex vivo клеток, полученных от пациентов, с последующей инженерией легочной ткани и трансплантацией. Несмотря на то, что эти первоначальные результаты очень впечатляющие, необходимо дополнительно оптимизировать несколько этапов, прежде чем долгосрочная тканевая функция легких может быть реализована в клинике (96).

НОВЫЕ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ CF НА ЖИВОТНЫХ

Существенным узким местом в разработке новых терапевтических средств от CF было отсутствие животных моделей, которые воспроизводили бы ключевые особенности патогенеза заболеваний легких и других органов. Модели мышей с нулевыми аллелями CFTR и специфическими мутациями заболевания, доступными с начала 1990-х годов, внесли большой вклад в понимание болезни, но не смогли развить спонтанное заболевание легких, как у людей с CF. Недавно две группы использовали нацеливание на соматические клетки гена CFTR с помощью векторов AAV с последующим переносом ядра и клонированием для разработки новых моделей на свиньях (97,98) и хорьках (99,100).Эти новые модели на животных воспроизводят ключевые особенности заболевания CF (98 100). При рождении легкие свиней, нулевых по CFTR, не имеют воспаления, но проявляют дефект бактериальной защиты хозяина без вторичных последствий инфекции (98,101). У свиней с МВ спонтанно развивается фенотип заболевания легких, отражающий ключевые особенности заболевания легких человека при МВ в первые месяцы жизни, включая бактериальную инфекцию, ремоделирование дыхательных путей и гиперсекрецию слизи (рис. 3). У хорьков с нулевым CFTR также развивается заболевание полиорганной системы, а у новорожденных животных обнаруживается дефект легочной защиты хозяина в дыхательных путях, связанный с колонизацией бактериями (100).Также имеются ранние доказательства того, что у взрослых хорьков с МВ развивается фенотип заболевания легких, сходный с человеческим МВ, включая бактериальную колонизацию (Джон Энгельхардт, личное сообщение). Эти фенотипические особенности делают эти новые модели очень привлекательными для исследований генной терапии. Они предлагают уникальную возможность протестировать меры генной терапии до начала заболевания легких и отслеживать результаты для стратегий лечения, основанных на профилактике.

Рисунок 3.

Свиньи с мутациями CFTR заболевают легочными заболеваниями, сходными с таковыми у людей с CF. В этом примере у свиньи в возрасте 5,5 месяцев основные наблюдаемые патогенные признаки включают накопление слизи в дыхательных путях, обструкцию дыхательных путей гнойным материалом, содержащим нейтрофилы и бактерии (правая панель, черные стрелки) и ремоделирование дыхательных путей. Бактериальные культуры этого животного оказались положительными на Bordetella bronchiseptica . Свинья дикого типа является контрольной группой соответствующего возраста. В качестве красителя использовали гематоксилин и эозин.Оба изображения имеют 100-кратное увеличение.

Рисунок 3.

Свиньи с мутациями CFTR заболевают легочными заболеваниями, сходными с таковыми у людей с CF. В этом примере у свиньи в возрасте 5,5 месяцев основные наблюдаемые патогенные признаки включают накопление слизи в дыхательных путях, обструкцию дыхательных путей гнойным материалом, содержащим нейтрофилы и бактерии (правая панель, черные стрелки) и ремоделирование дыхательных путей. Бактериальные культуры этого животного оказались положительными на Bordetella bronchiseptica .Свинья дикого типа является контрольной группой соответствующего возраста. В качестве красителя использовали гематоксилин и эозин. Оба изображения имеют 100-кратное увеличение.

ВЫВОДЫ

Это беспрецедентный период в разработке новых методов лечения CF. Практически повсеместная доступность скрининга новорожденных на МВ в развитых странах сделала раннюю диагностику обычным делом, что дает возможность лечить здоровые легкие до начала хронического заболевания легких. Однако эта возможность появляется в то время, когда не хватает чувствительных и специфических маркеров раннего заболевания, которые можно использовать для оценки начала заболевания легких и отслеживания реакции на терапию.Необходима дополнительная работа для разработки новых специфических и чувствительных показателей ранних стадий заболевания легких, подходящих для мониторинга реакции на терапию для применения у младенцев и детей младшего возраста. Параллельные разработки улучшенных инструментов переноса генов должны еще больше помочь в этой области и привести к новым клиническим испытаниям.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа была поддержана грантами NIH: R01 HL-075363 (P.B.M.), PO1 HL-51670 (P.B.M.), R21 HL- (P.B.M.), Фонд кистозного фиброза (P.L.S.) и Благотворительный фонд Роя Дж. Карвера (P.B.M.). Мы также признательны за поддержку In vitro Models и Cell Culture Core и Cell Morphology Cores, частично поддерживаемых Центром генной терапии муковисцидоза (NIH P30 DK-54759) и Фондом кистозного фиброза.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Джона Энгельхардта и Уту Гризенбах за полезные обсуждения, а также Дэвида Мейерхольца за предоставленные изображения, представленные на рис. 3.

Заявление о конфликте интересов .Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1,.
Строение и функция хлоридного канала CFTR
,
Physiol. Ред.
,
1999
, т.
79
(стр.
S23
—
S45
) 2,.
CFTR: домены, структура и функции
,
J. Bioenerg. Биомембр.
,
1997
, т.
29
(стр.
443
—
451
) 3.
Функция CFTR и перспективы терапии
,
Annu.Rev. Biochem.
,
2008
, т.
77
(стр.
701
—
726
) 4,,,,,.
Эффективность переноса генов для восстановления нормальной эпителиальной функции дыхательных путей при муковисцидозе
,
Нат. Genet.
,
1992
, т.
2
(стр.
21
—
25
) 5,,,,,,,.
Подслизистые железы являются преобладающим местом экспрессии CFTR в бронхах человека
,
Nat. Genet.
,
1992
, т.
2
(стр.
240
—
248
) 6,,,,,.
Коррекция летального кишечного дефекта на мышиной модели муковисцидоза с помощью человеческого CFTR
,
Science
,
1994
, vol.
266
(стр.
1705
—
1708
) 7,,,.
Гипосекреция жидкости из подслизистых желез трахеи свиней с дефицитом CFTR
,
J. Clin. Вкладывать деньги.
,
2010
, т.
120
(стр.
3161
—
3166
) 8,.
Механизмы стимулируемой Са2 + секреции жидкости серозными ацинарными клетками подслизистой железы свиней
,
Am. J. Physiol. Легкое. Cell Mol. Physiol.
,
2010
, т.
298
(стр.
L210
—
L231
) 9,,,,,,.
Анализ трансдукции клеток-предшественников аденоассоциированного вируса в легких мыши
,
Мол. Ther.
,
2009
, т.
17
(стр.
285
—
293
) 10,,,,.
Базальные клетки — мультипотентные предшественники, способные обновлять бронхиальный эпителий
,
Am.J. Pathol.
,
2004
, т.
164
(стр.
577
—
588
) 11,,,,,,,.
Базальные клетки как стволовые клетки трахеи мыши и эпителия дыхательных путей человека
,
Proc. Natl Acad. Sci. США
,
2009
, т.
106
(стр.
12771
—
12775
) 12.
Отношения между предками и потомками в эпителии дыхательных путей
,
Chest
,
1992
, vol.
101
(стр.
11S
—
16S
) 13,.
Базальные клетки являются предшественниками первичных культур эпителиальных клеток трахеи
,
Exp. Cell Res.
,
1992
, т.
198
(стр.
69
—
77
) 14,,,.
Клетки-предшественники дыхательных путей взрослого человека, участвующие в развитии подслизистых желез
,
Development
,
1995
, vol.
121
(стр.
2031
—
2046
) 15,,,,.
Доказательства ниш стволовых клеток в эпителии трахеи
,
Am.J. Respir. Cell Mol. Биол.
,
2001
, т.
24
(стр.
662
—
670
) 16,.
Ниша железистых стволовых клеток / клеток-предшественников в развитии и восстановлении дыхательных путей
,
Proc. Являюсь. Грудной. Soc.
,
2008
, т.
5
(стр.
682
—
688
) 17,,,.
Обновление терминального бронхиолярного эпителия у крыс после воздействия NO ₂ или O ₃
,
Lab. Вкладывать деньги.
,
1976
, т.
35
(стр.
246
—
257
) 18,,,,.
Клетки Клары, экспрессирующие секреторный белок, клетки микроокружения нейроэпителиального тела дыхательных путей включают субпопуляцию, сохраняющую метку, и имеют решающее значение для обновления эпителия после истощения клеток-предшественников
,
Am. J. Respir. Cell Mol. Биол.
,
2001
, т.
24
(стр.
671
—
681
) 19,,,.
Трансформация альвеолярных клеток типа 2 в клетки типа 1 после воздействия NO ₂
,
Exp.Мол. Патол.
,
1975
, т.
22
(стр.
142
—
150
) 20,.
Клетка 2 типа как предшественник регенерации альвеолярного эпителия. Цитодинамическое исследование на мышах после воздействия кислорода
,
Lab. Вкладывать деньги.
,
1974
, т.
30
(стр.
35
—
42
) 21,,,,,,,,,.
Переносчики вируса иммунодефицита кошек постоянно трансдуцируют неделящийся эпителий дыхательных путей и корректируют дефект муковисцидоза
,
J.Clin. Вкладывать деньги.
,
1999
, т.
104
(стр.
R55
—
R62
) 22,,.
Разработка ретровирусных векторов для переноса генов в эпителий дыхательных путей
,
Curr. Opin. Мол. Ther.
,
2000
, т.
2
(стр.
497
—
506
) 23,,,,,,,,.
Фактор роста кератиноцитов индуцирует пролиферацию эпителия, облегчает опосредованный ретровирусами перенос генов в дистальный эпителий легких in vivo
,
J.Gene Med.
,
1999
, т.
1
(стр.
22
—
30
) 24,,,.
Перенос гена на эпителий дыхательных путей с использованием лентивирусных векторов на основе вируса иммунодефицита кошек
,
Meth. Энзимол.
,
2002
, т.
346
(стр.
500
—
514
) 25,,,,.
Постоянная экспрессия гена в назальном эпителии мышей после переноса векторного гена на основе вируса иммунодефицита кошек
,
J. Virol.
,
2005
, т.
79
(стр.
12818
—
12827
) 26,,,.
Лентивирусный вектор может быть повторно введен в назальный эпителий без блокирования иммунных ответов
,
J. Virol.
,
2008
, т.
82
(стр.
10684
—
10692
) 27,,,.
Активация трансген-специфичных Т-клеток после опосредованной лентивирусом доставки гена в легкие мыши
,
Мол. Ther.
,
2010
, т.
18
(стр.
143
—
150
) 28,,,,,,.
Магнитно-управляемая лентивирусная трансдукция эпителиальных клеток дыхательных путей
,
J. Gene Med.
,
2010
, т.
12
(стр.
747
—
754
) 29,,,,.
Влияние опосредованной лентивирусным вектором трансдукции на плотность поляризованной модели эпителия дыхательных путей и эффект катионного полимера полиэтиленимина
,
J. Biomed. Biotechnol.
,
2010
, т.
2010
стр.
103976
30,,.
Лизофосфатидилхолин в качестве адъюванта для опосредованного лентивирусным вектором переноса гена на эпителий дыхательных путей: влияние длины ацильной цепи
,
Респир. Res.
,
2010
, т.
11
стр.
84
31,,,,,.
Однодозовый перенос лентивирусного гена для пожизненной экспрессии гена дыхательных путей
,
J. Gene Med.
,
2009
, т.
11
(стр.
861
—
867
) 32,,,,,,,.
Лентивирусная трансдукция легкого мыши обеспечивает эффективную псевдотип и стадию развития клеточно-специфичную экспрессию трансгена
,
Gene Ther.
,
2008
, т.
15
(стр.
1167
—
1175
) 33,,,,,,,, и др.
На пути к генной терапии муковисцидоза с использованием лентивируса, псевдотипированного оболочкой вируса Сендай
,
Мол. Ther.
,
2010
, т.
18
(стр.
1173
—
1182
) 34,,,,,,.
Респираторно-синцитиальный вирус, сконструированный для экспрессии регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза, корректирует биоэлектрический фенотип эпителия дыхательных путей человека при муковисцидозе in vitro
,
J. Virol.
,
2010
, т.
84
(стр.
7770
—
7781
) 35,,,,,,,.
Доставка гена альфа-фетопротеина в носовой эпителий нечеловеческих приматов вирусными векторами парагриппа человека
,
Hum.Gene Ther.
,
2010
, т.
21
(стр.
1657
—
1664
) 36,,,,,,.
Повторное введение хелпер-зависимых аденовирусных векторов в дыхательные пути мыши посредством временной иммуносупрессии
,
Gene Ther.
,
2010
, т.
18
(стр.
173
—
181
) 37,.
Текущие стратегии и будущие направления для предотвращения иммунитета к аденовирусным векторам
,
Curr. Gene Ther.
,
2006
, т.
6
(стр.
215
—
226
) 38,,,,,,,, и др.
Химерный вектор аденовируса 5-волокна 35 обеспечивает эффективную апикальную коррекцию дефекта регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза в первичном эпителии дыхательных путей при муковисцидозе
,
Hum. Gene Ther.
,
2010
, т.
21
(стр.
251
—
269
) 39,,,,,,,,,.
Двойное репортерное сравнительное индексирование псевдотипных векторов rAAV в дыхательных путях шимпанзе
,
Mol.Ther.
,
2010
, т.
18
(стр.
594
—
600
) 40,,,,,,,,,.
Укороченная кассета экспрессии аденоассоциированного вируса для переноса гена CFTR на эпителий дыхательных путей при муковисцидозе
,
Proc. Natl Acad. Sci. США
,
2005
, т.
102
(стр.
2952
—
2957
) 41,,,,.
Генетическая модификация капсида аденоассоциированного вирусного вектора типа 2 увеличивает эффективность переноса генов в поляризованных эпителиальных клетках дыхательных путей человека
,
Hum.Gene Ther.
,
2008
, т.
19
(стр.
1407
—
1414
) 42,,,,,,,.
Направленная эволюция аденоассоциированного вируса в инфекционный респираторный вирус
,
Proc. Natl Acad. Sci. США
,
2009
, т.
106
(стр.
3865
—
3870
) 43,,,,,,,,,.
Создание новых вариантов AAV путем направленной эволюции для улучшенной доставки CFTR в мерцательный эпителий дыхательных путей человека
,
Mol.Ther.
,
2009
, т.
17
(стр.
2067
—
2077
) 44,,,,,,,, и др.
Эффективный перенос гена в легкие мыши путем внутритрахеальной инъекции плода rAAV2 / 6,2
,
Мол. Ther.
,
2010
, т.
18
(стр.
2130
—
2138
) 45,,,,,,.
Быстрое, простое и универсальное производство рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов в масштабе
,
Hum. Gene Ther.
,
2010
, т.
21
(стр.
1259
—
1271
) 46,,.
Производство рекомбинантного аденоассоциированного вируса в приемных клетках: преодоление производственных ограничений с использованием стратегии экспрессии бакуловирусных клеток и клеток насекомых
,
Hum. Gene Ther.
,
2009
, т.
20
(стр.
807
—
817
) 47,,.
Упрощенная система векторов экспрессии бакуловирус-AAV в сочетании с одностадийной аффинной очисткой дает запасы rAAV с высоким титром из клеток насекомых
,
Мол.Ther.
,
2009
, т.
17
(стр.
1888
—
1896
) 48,,,,,,,, и др.
Плазмиды, не содержащие CpG, снижают воспаление и поддерживают экспрессию легочных генов.
,
Nat. Biotechnol.
,
2008
, т.
26
(стр.
549
—
551
) 49,.
Получение и анализ наночастиц ДНК ПЭГилированного поли-L-лизина для доставки генов
,
Колд-Спринг-Харб. Protoc.
,
2010
, т.
2010
50,,,.
Повышенное поддержание и устойчивость трансгенов за счет удаления кассет экспрессии из плазмидных последовательностей in vivo
,
Hum. Gene Ther.
,
2005
, т.
16
(стр.
558
—
570
) 51,,,,,.
Хелпер-независимые транспозон-транспозазные векторы спящей красавицы для эффективной доставки невирусных генов и постоянной экспрессии генов in vivo
,
Mol. Ther.
,
2003
, т.
8
(стр.
654
—
665
) 52,,,,,,,.
Различия между типами клеток в активности интегразы бактериофага стрептомицетов phiC31
,
Nucleic Acids Res.
,
2008
, т.
36
(стр.
5462
—
5471
) 53,,.
Интеграза фага R4 опосредует сайт-специфическую интеграцию в человеческих клетках
,
Gene
,
2001
, vol.
278
(стр.
167
—
176
) 54,,,,,,,,, и др.
Оптимизация доставки и экспрессии аэрозольных генов в легких овцы
,
Мол. Ther.
,
2007
, т.
15
(стр.
348
—
354
) 55.
Использование невирусных векторов для генной терапии муковисцидоза
,
Proc. Являюсь. Грудной. Soc.
,
2004
, т.
1
(стр.
296
—
301
) 56,,,,,,,,,.
Роль доксорубицина в переносе невирусных генов в легких
,
Биоматериалы
,
2009
, vol.
30
(стр.
1971
—
1977
) 57,,,,,,,, и др.
Использование геля карбоксиметилцеллюлозы для увеличения переноса невирусных генов в дыхательных путях мышей
,
Биоматериалы
,
2010
, vol.
31
(стр.
2665
—
2672
) 58,,.
Хитозан как носитель невирусного переноса генов в линии клеток муковисцидоза
,
Biotechnol. Прил. Biochem.
,
2008
, т.
51
(стр.
153
—
157
) 59,,,,,,,,.
Гиперактивная транспозаза спящей красавицы обеспечивает стойкую фенотипическую коррекцию у мышей и собачьей модели гемофилии B
,
Mol. Ther.
,
2010
, т.
18
(стр.
1896
—
1906
) 60,,,,,,.
Транспозиция «Спящей красавицы» с неинтегрирующегося лентивируса
,
Мол. Ther.
,
2009
, т.
17
(стр.
1197
—
1204
) 61,.
Генная терапия муковисцидоза: успехи, неудачи и надежды на будущее
,
Expert Rev. Respir. Med.
,
2009
, т.
3
(стр.
363
—
371
) 62,,.
Невирусные векторы в генной терапии муковисцидоза: последние разработки и перспективы на будущее
,
Мнение эксперта. Биол. Ther.
,
2009
, т.
9
(стр.
991
—
1003
) 63,,,,.
Аденоассоциированный вирус типа 2 содержит связывающий домен интегрина альфа5бета1, необходимый для проникновения в вирусную клетку
,
J.Virol.
,
2006
, т.
80
(стр.
8961
—
8969
) 64,,.
Молекулярные сигнатуры эндотелия головного мозга при заболеваниях обеспечивают новые участки для ЦНС-направленной ферментной терапии
,
Nat. Med.
,
2009
, т.
15
(стр.
1215
—
1218
) 65,,,,,,.
Клады аденоассоциированных вирусов широко распространены в тканях человека
,
J. Virol.
,
2004
, т.
78
(стр.
6381
—
6388
) 66,,,,,,,,, и др.
LMO2-ассоциированная пролиферация клональных Т-клеток у двух пациентов после генной терапии SCID-X1
,
Science
,
2003
, vol.
302
(стр.
415
—
419
) 67,,,,,,,,, и др.
Генная терапия тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID) -X1 человека
,
Science
,
2000
, vol.
288
(стр.
669
—
672
) 68,,,,,,,,,.
Анализ клональности после опосредованного ретровирусом переноса гена на клетки CD34 + из пуповинной крови ADA-дефицитных новорожденных с SCID
,
Nat. Med.
,
2003
, т.
9
(стр.
463
—
468
) 69,,,.
Стартовые области транскрипции в геноме человека являются предпочтительными мишенями для интеграции MLV
,
Science
,
2003
, vol.
300
(стр.
1749
—
1751
) 70,,,.
Специфические вставки доменов цинковых пальцев в Gag-Pol дают сконструированные ретровирусные векторы со свойствами селективной интеграции
,
Proc.Natl Acad. Sci. США
,
2010
, т.
107
(стр.
12475
—
12480
) 71,,.
Гибридные рестрикционные ферменты: слияния цинковых пальцев с доменом расщепления Fok I.
,
Proc. Natl Acad. Sci. США
,
1996
, т.
93
(стр.
1156
—
1160
) 72,,,,,,.
Стимуляция гомологичной рекомбинации путем направленного расщепления химерными нуклеазами
,
Мол. Cell Biol.
,
2001
, т.
21
(стр.
289
—
297
) 73,,,,,,,.
Целевое добавление гена в указанное место в геноме человека с использованием разработанных нуклеаз цинковых пальцев
,
Proc. Natl Acad. Sci. США
,
2007
, т.
104
(стр.
3055
—
3060
) 74,,,,,,,,,.
Повышение активности нуклеазы цинкового пальца за счет улучшенной облигатной гетеродимерной архитектуры
,
Nat. Методы
,
2011
, т.
8
(стр.
74
—
79
) 75,,.
Распознавание ДНК белками цинковых пальцев Cys2His2
,
Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.
,
2000
, т.
29
(стр.
183
—
212
) 76,,.
FokI требует двух специфических сайтов ДНК для расщепления
,
J. Mol. Биол.
,
2001
, т.
309
(стр.
69
—
78
) 77,,,,,,,, и др.
Стандартизированные реагенты и протоколы для конструирования нуклеаз цинковых пальцев посредством модульной сборки
,
Nat.Protoc.
,
2006
, т.
1
(стр.
1637
—
1652
) 78,,,,,,,,, и др.
Быстрая разработка индивидуальных нуклеаз типа «цинковые пальцы» с открытым исходным кодом для высокоэффективной модификации гена
,
Mol. Ячейка
,
2008
, т.
31
(стр.
294
—
301
) 79,,,.
Получение и функциональный анализ нуклеаз цинковых пальцев
,
Methods Mol. Биол.
,
2008
, т.
434
(стр.
277
—
290
) 80,,,,.
Разработка олигомеризованных бассейнов (OPEN): протокол с «открытым исходным кодом» для создания индивидуальных массивов с цинковыми пальцами
,
Nat. Protoc.
,
2009
, т.
4
(стр.
1471
—
1501
) 81,,,,,,,,, и др.
Редактирование генов в стволовых клетках человека с использованием нуклеаз цинковых пальцев и доставки лентивирусных векторов, дефектных по интегразе
,
Nat. Biotechnol.
,
2007
, т.
25
(стр.
1298
—
1306
) 82,,,,,,.
Создание модифицированных самонаводящихся эндонуклеаз, содержащих ДНК-связывающие домены, полученные из двух различных каркасов
,
Nucleic Acids Res.
,
2010
, т.
38
(стр.
2006
—
2018
) 83,,,,,,,,, et al.
Эффективное нацеливание гена SCID с помощью сконструированной одноцепочечной самонаводящейся эндонуклеазы
,
Nucleic Acids Res.
,
2009
, т.
37
(стр.
5405
—
5419
) 84,,,,.
Самонаводящиеся эндонуклеазы: от основ до терапевтического применения
,
Cell Mol. Life Sci.
,
2010
, т.
67
(стр.
727
—
748
) 85,,,,,,,, и др.
Архитектура нуклеазы A TALE для эффективного редактирования генома
,
Nat. Biotechnol.
,
2010
, т.
29
(стр.
143
—
148
) 86,,,,,,,, и др.
Эффективное нацеливание экспрессируемых и молчащих генов в ЭСК и ИПСК человека с использованием нуклеаз типа «цинковые пальцы»
,
Nat. Biotechnol.
,
2009
, т.
27
(стр.
851
—
857
) 87,,,,,,,, и др.
Установление устойчивости к ВИЧ-1 в CD4 + Т-клетках путем редактирования генома с использованием нуклеаз «цинковые пальцы»
,
Nat. Biotechnol.
,
2008
, т.
26
(стр.
808
—
816
) 88,,,.
Нацеливание на гены путем гомологичной рекомбинации в зиготах мышей, опосредованной нуклеазами «цинковые пальцы»
,
Proc. Natl Acad. Sci. США
,
2010
, т.
107
(стр.
15022
—
15026
) 89,,,,,,,, и др.
Геномные безопасные гавани обеспечивают высокую экспрессию трансгена бета-глобина в плюрипотентных стволовых клетках, индуцированных талассемией.
,
Nat. Biotechnol.
,
2011
, т.
29
(стр.
73
—
78
) 90,,,,,,,,, и др.
Подавление коаперона Hsp90 Aha1 устраняет неправильную укладку CFTR при муковисцидозе
,
Cell
,
2006
, vol.
127
(стр.
803
—
815
) 91,,,,,,,, и др.
Пониженная активность гистондеацетилазы 7 восстанавливает функцию неправильно свернутого CFTR при муковисцидозе
,
Nat. Chem. Биол.
,
2010
, т.
6
(стр.
25
—
33
) 92,,,,,,,.
Контроль качества периферических белков удаляет развернутый CFTR из плазматической мембраны
,
Science
,
2010
, vol.
329
(стр.
805
—
810
) 93,.
Общий обзор трансплантации легких и анализ распределения органов
,
Proc. Являюсь. Грудной. Soc.
,
2009
, т.
6
(стр.
13
—
19
) 94,,,,,,,,, и др.
Тканевые легкие для имплантации in vivo
,
Science
,
2010
, vol.
329
(стр.
538
—
541
) 95,,,,,,,.
Регенерация и ортотопическая трансплантация биоискусственного легкого
,
Нат. Med.
,
2010
, т.
16
(стр.
927
—
933
) 96,,,,,,,, и др.
Влияние человеческого интерлейкина-10 на вызванное вектором воспаление и раннюю функцию трансплантата при трансплантации легкого крысы
,
Am. J. Respir. Cell Mol. Биол.
,
2003
, т.
28
(стр.
616
—
625
) 97,,,,,,,, и др.
Продукция CFTR-нулевых и CFTR-DeltaF508 гетерозиготных свиней посредством аденоассоциированного вируса нацеливания на гены и переноса ядра соматических клеток
,
J. Clin. Вкладывать деньги.
,
2008
, т.
118
(стр.
1571
—
1577
) 98,,,,,,,, и др.
Нарушение гена CFTR дает модель муковисцидоза у новорожденных свиней
,
Science
,
2008
, vol.
321
(стр.
1837
—
1841
) 99,,,,,,,,, и др.
Аденоассоциированное вирусное разрушение гена CFTR у клонированных хорьков
,
J. Clin. Вкладывать деньги.
,
2008
, т.
118
(стр.
1578
—
1583
) 100,,,,,,,,, и др.
Болезненный фенотип хорька с нокаутом CFTR-модели муковисцидоза
,
J. Clin. Вкладывать деньги.
,
2010
, т.
120
(стр.
3149
—
3160
) 101,,,,,,,,, и др.
У свиней с муковисцидозом развивается заболевание легких, и при рождении у них обнаруживается недостаточная бактериальная эрадикация
,
Sci.Пер. Med.
,
2010
, т.
2
стр.
29ra31
© Автор 2011. Опубликовано Oxford University Press. Все права защищены. Для получения разрешений обращайтесь по электронной почте: [email protected]
Новости и объявления | Аспирантура по молекулярной и клеточной биологии в UMass Amherst
Исследователи из Массачусетского университета в Амхерсте недавно обнародовали свое открытие нового процесса создания РНК.Полученная РНК более чистая, более обильная и, вероятно, будет более рентабельной, чем мог бы обеспечить любой предыдущий процесс. Этот новый метод устраняет самый большой камень преткновения на пути к созданию терапевтических препаратов с РНК нового поколения.
Если ДНК — это план, который сообщает клеткам нашего тела, какие белки производить и для каких целей, то РНК — это посланник, несущий инструкции ДНК к фактическому механизму производства белков в каждой клетке. В большинстве случаев этот процесс работает безупречно, но когда это не так, когда организм не может вырабатывать белок, в котором он нуждается, как в случае такого заболевания, как кистозный фиброз, это может привести к серьезному заболеванию.
Один из методов лечения такой белковой недостаточности заключается в применении терапевтических средств, которые заменяют недостающие белки. Но исследователи давно знают, что это более эффективно, когда организм может сам производить необходимый ему белок. Это цель развивающейся области медицины — терапии РНК. Проблема в том, что современные методы производства лабораторной РНК не могут доставить РНК, которая является достаточно чистой, в достаточных количествах и экономически эффективным способом. «Нам нужно много РНК», — говорит Элван Кавач, ведущий автор статьи, недавно опубликованной в Journal of Biological Chemistry, студент MBA Университета Массачусетса в Амхерсте и недавний доктор философии.Д. закончила химический факультет, также УМас. «Мы разработали новый процесс производства чистой РНК, и, поскольку в этом процессе можно повторно использовать ингредиенты, получая от трех до десяти раз больше РНК, чем при использовании традиционных методов, это также экономит время и деньги».
Проблема с нечистой РНК заключается в том, что она может вызывать реакции, такие как отек, которые могут быть вредными и даже опасными для жизни. Например, нечистая РНК может вызвать воспаление в легких пациента с муковисцидозом. Традиционно производимая РНК должна пройти длительный и дорогостоящий процесс очистки.«Вместо того, чтобы очищать РНК, — говорит Крейг Мартин, старший автор статьи и профессор химии в Университете Массачусетса, — мы с самого начала придумали, как сделать чистую РНК». Узнать больше
Журнал муковисцидоза
Если вы не помните свой пароль, вы можете сбросить его, введя свой адрес электронной почты и нажав кнопку «Сбросить пароль».Затем вы получите электронное письмо, содержащее безопасную ссылку для сброса пароля
. Если адрес совпадает с действующей учетной записью, на адрес __email__ будет отправлено электронное письмо с инструкциями по сбросу пароля
.
Муковисцидоз: новые взгляды на терапевтические подходы
Название: Муковисцидоз: новый взгляд на терапевтические подходы
ОБЪЕМ: 15 ВЫДАЧА: 3
Автор (ы): Антонелла Тоско, Валерия Р.Виллелла, Валерия Райя, Гвидо Кремер и Луиджи Майури *
Принадлежность: Отделение трансляционных медицинских наук, педиатрическое отделение, Региональный центр кистозного фиброза, Университет Федерико II, Неаполь, 80131, Отдел генетики и клеточной биологии, Европейский институт исследований кистозного фиброза, Научный институт Сан-Рафаэле, Милан, 20132, отдел кафедры трансляционных медицинских наук, педиатрическое отделение, Региональный центр кистозного фиброза, Университет Федерико II, Неаполь 80131, Equipe11 labellisee Ligue Nationale Contrele Cancer, Центр исследований Корделье, Париж, Отдел генетики и клеточной биологии, Европейский институт исследований кистозного фиброза, Научный институт Сан-Раффаэле, Милан, 20132
Ключевые слова: CFTR, муковисцидоз, редактирование генов, модуляторы, точная медицина, репозиционная терапия.
Резюме: С момента выявления муковисцидоза (МВ) как заболевания в 1938 г. до 2012 г. только Для лечения болезни использовались методы лечения симптомов, а не этиологические методы лечения. Над за последние несколько лет были разработаны новые технологии, и в настоящее время используются стратегии редактирования генов. переход к одноразовому лечению. В этом обзоре будут обобщены последние достижения в области этиологической терапии. которые нацелены на основной дефект трансмембранного рецептора CF (CFTR), белка, мутировавшего в CF.Мы обсудим, как недавно идентифицированные соединения могут напрямую воздействовать на мутировавший CFTR для улучшения его функция. Кроме того, мы обсудим, как регуляторы протеостаза могут изменять среду в мутантный белок CFTR синтезируется и распадается, таким образом восстанавливая функцию CFTR. В будущее терапии МВ заключается в комбинированной терапии, которая может быть индивидуализирована для каждого пациента с МВ.
SFPQ восстанавливает экспрессию и функцию F508del-CFTR в эпителиальных клетках бронхов при муковисцидозе
Экспрессия SFPQ снижена в клетках F508del-CFTR CF по сравнению с контрольными клетками
Мы проанализировали экспрессию SFPQ в эпителиальных клетках бронхов человека CFF508del-CFTR линии (CFBE41o ^—, CF) по сравнению с соответствующей контрольной линией клеток (16HBE14o ^—, контроль), а также с РНК, выделенной из тканей паренхимы легких пациентов с МВ, перенесших трансплантацию легких (CFP), по сравнению с соответствующей контрольной тканью (HBEP ).Интересно, что мы обнаружили значительно сниженные уровни экспрессии мРНК SFPQ в клеточных линиях CF (~ 1,6 раза), а также в тканях паренхимы легких CF (~ 2 раза) по сравнению с соответствующими контролями (Рисунок 1A). Соответственно, белок SFPQ также был снижен (~ 5 раз) в клетках CFBE41o ^— (CFBE) по сравнению с контрольными клетками 16HBE14o ^— (HBE) (Рисунок 1B). Это первое наблюдение относительного снижения экспрессии SFPQ в эпителиальных клетках легких F508del-CFTR CF по сравнению с клетками WT-CFTR.Пониженные уровни экспрессии SFPQ предполагают, что он может играть роль в заболевании легких F508del-CFTR CF .
Рисунок 1
Экспрессия SFPQ в клетках легких при МВ. ( A ) Экспрессия SFPQ была проанализирована в РНК, выделенной из линии эпителиальных клеток легкого F508del-CFTR CF (CFBE41o ^—), по сравнению с соответствующей контрольной линией клеток (16HBE14o ^—) и из тканей паренхимы легких CF и соответствующего контроля. ткани (n = 3, каждая группа). GAPDH использовали в качестве эндогенного контроля.( B ) Белок SFPQ анализировали с помощью иммуноблоттинга в CF и контрольных клетках и нормализовали до уровней белка GAPDH. ( C ) Локализацию белка SFPQ анализировали с помощью иммуноблоттинга в клетках CFBE, содержащих мутацию F508del-CFTR для локализации белка SFPQ. Полноразмерные блоты представлены в дополнительных материалах (Рисунок S1). Данные представляют два или более независимых экспериментов.
Затем мы проанализировали субклеточную локализацию SFPQ в эпителиальных клетках легких CFBE41o ^— с помощью иммуноблоттинга.Мы обнаружили, что белок SFPQ локализован исключительно в ядре (рис. 1С). Полные блоты включены в качестве дополнительных материалов (Рисунок S1).
Сверхэкспрессия SFPQ увеличивает экспрессию F508del-CFTR в клетках CF
Чтобы исследовать роль SFPQ в экспрессии F508del-CFTR, мы сверхэкспрессировали SFPQ в эпителиальных клетках легких при CF. Клетки CFBE41o ^— трансфицировали плазмидным вектором, кодирующим SFPQ, или ложно трансфицировали. Мы проанализировали экспрессию F508del-CFTR в эпителиальных клетках легких при МВ с помощью иммуноцитохимии, а также анализа на основе флюорогена.Было обнаружено, что клетки CFBE41o ^— имеют низкие уровни белка F508del-CFTR (зеленый), распределенного в цитоплазме и плазматической мембране (красный) (рис. 2A: верхняя панель). Однако, когда SFPQ экспрессировался экзогенно, было обнаружено существенное повышение CFTR-специфической метки (зеленый), распределенное в виде точечных гранул в цитозоле и в областях, близких к плазматической мембране (красный), что указывает на повышенную экспрессию и перемещение F508del. -CFTR к апикальной стороне эпителия. (Рисунок 2A: нижняя панель).Желтая флуоресценция вблизи плазматической мембраны указывает на совпадение зеленого (CFTR) и красного (фаллоидин). Соответственно, иммуноблот-анализ белка CFTR также показывает повышенную экспрессию, индуцированную сверхэкспрессией SFPQ в клетках CFBE (рис. 2B: верхняя панель). Также наблюдается соответствующее увеличение мРНК CFTR (рис. 2В: нижняя панель). Полные блоты включены в качестве дополнительных материалов (Рисунок S2).
Рисунок 2
Влияние сверхэкспрессии SFPQ на экспрессию CFTR.Сверхэкспрессию SFPQ в линии эпителиальных клеток легких F508del-CFTR CF (CFBE41o ^—) проводили с использованием вектора, кодирующего SFPQ. ( A ) Клетки CFBE41o ^–, содержащие мутацию F508del, демонстрируют низкие уровни метки CFTR (зеленый), которая является слабо околоядерной и пунктированной. Сверхэкспрессия SFPQ в CFBE41o ^— вызывает большое увеличение количества меток CFTR (зеленый). Зеленый = CFTR, красный = фаллоидин, синий = DAPI. ( B ) Уровни экспрессии белка CFTR анализировали с помощью иммуноблоттинга, и мРНК CFTR измеряли с помощью анализа RT-qPCR с использованием мРНК GAPDH в качестве эндогенного контроля.( C ) Общую и поверхностную экспрессию CFTR анализировали с использованием анализа FAP в клетках F508del-CFTR CFBE410-, трансфицированных аденовирусным вектором, кодирующим SFPQ, с GFP-меткой или контрольным вектором, кодирующим только GFP. На графике показаны данные, нормализованные из 4 независимых экспериментов. ( D ) Функцию F508del-CFTR анализировали в клетках CFBE с помощью анализов камеры Уссинга. Клетки CFBE культивировали на границе раздела воздух-жидкость (ALI), и после дифференцировки их трансфицировали в течение 48 часов аденовирусным вектором, кодирующим SFPQ с GFP-меткой, или контрольным вектором, кодирующим только GFP.Через 48 часов после заражения клетки анализировали на ток короткого замыкания. Данные представляют два или более независимых экспериментов.
Одновременно мы также выполнили анализ на основе флуорогена для анализа общей, а также экспрессии на клеточной поверхности активированного флуорогеном пептида (FAP), меченного F508del-CFTR (FAP-F508del-CFTR). Клетки FAP-F508del-CFBE41o ^— трансдуцировали только SFPQ, кодирующим аденовирусный вектор, меченным GFP, или контрольным вектором, кодирующим GFP. Через 24 часа после трансфекции среду заменяли средой, содержащей 5 мкМ VX-809, для усиления поверхностной экспрессии CFTR.Клетки вернулись в инкубатор еще на 24 часа перед началом анализа FAP. Как показано на рисунке 2C, SFPQ индуцирует повышенные уровни общего белка F508del-CFTR с соответствующим увеличением поверхностной экспрессии, что дополнительно указывает на усиление экспрессии и перемещение F508del-CFTR на апикальную сторону эпителия. В совокупности эти данные предполагают, что SFPQ способствует повышенной экспрессии и перемещению мутантного белка F508del-CFTR на апикальную поверхность эпителия в клетках CFBE.
Для дальнейшего тестирования функциональной эффективности SFPQ клетки CFBE41o ^— культивировали на границе раздела воздух-жидкость (ALI), и после дифференцировки их трансдуцировали в течение 48 часов аденовирусным вектором, кодирующим SFPQ с GFP-тегом или управляющий вектор, кодирующий только GFP. На рисунке 2D показан эксперимент в камере Уссинга, в котором сверхэкспрессия SFPQ вызывает повышенный транспорт хлоридов, когда клетки подвергаются воздействию форсколина для повышения клеточного цАМФ. Увеличение тока было уменьшено добавлением ингибитора CFTR, Inh-172 (рис. 2D).Показанный эксперимент представляет четыре независимых эксперимента. Эти данные указывают на повышенную активность клеток F508del-CFTR CF, индуцированную SFPQ, по сравнению с контрольными клетками.
SFPQ изменяет транскриптом в клетках CFBE
Для изучения клеточного транскриптома, связанного со сверхэкспрессией SFPQ, мы выполнили анализ профиля транскриптома по всему геному (RNA-seq) в клетках CFBE41o ^—, сверхэкспрессирующих SFPQ (n = 3 для каждого группа). График вулкана показывает log2 (изменения содержания РНК в клетках, сверхэкспрессирующих SFPQ, по сравнению с контрольными клетками CFBE41o ^–) и — log10 (скорректированные значения P) всех РНК, обнаруженных с помощью анализа RNA-seq.Статистически дифференциально экспрессируемые гены (DEG) изображены в красных и синих кругах, представляющих значимые гены с повышенной и пониженной регуляцией, соответственно, а остальные не-DEG показаны серыми кружками (рис. 3A). Мы идентифицировали в общей сложности 332 статистически значимых DEG (> 1,5-кратное изменение) в сверхэкспрессированных SFPQ по сравнению с контрольными клетками CFBE41o ^—. Среди них 179 (~ 54%) РНК были активированы, а 153 (~ 46%) РНК подавлены в ответ на сверхэкспрессию SFPQ.Лучшие дифференциально экспрессируемые РНК (изменение> 2,5 раза) в клетках, сверхэкспрессирующих SFPQ, включают Gh2 , NPC1L1 , HSPA6 , AOC3 , CTB-119C2.1 , BHLHA107 IL CMYA5 , BCYRN1 , GDF15 , CHAC1 , ELFN1 , ABCA 1, PPP1R32 и TNF мРНК, в то время как те гены, которые подавляют экспрессию UFP с помощью U , LGR5 , PIK3IP1 , GBP2 , ST8SIA2 и NKAIN4 мРНК .
Рисунок 3
Влияние SFPQ на профили экспрессии генов и пути передачи сигналов в клетках CFBE. ( A ) График вулкана показывает изменение в 2 раза больше (ось x), чем — log10 (скорректированное значение P [Padj]) (ось y) данных общего секвенирования РНК (RNA-seq) по сравнению между сверхэкспрессированным SFPQ и контролем. CFBE41o ^— клеток (n = 3 в каждой группе). Красные кружки представляют гены с высокой активностью, синие кружки — гены с подавленной регуляцией, а серые кружки — гены, не отвечающие пороговому значению.Статистическим критерием того, чтобы ген считался дифференциально экспрессируемым, было скорректированное значение P <0,05, FDR <0,1,> ± 2 FC. ( B ) Гистограмма показывает дифференциальную регуляцию канонических путей передачи сигнала, проанализированную с помощью анализа пути изобретательности (IPA) в сверхэкспрессированных SFPQ по сравнению с контрольными клетками CFBE41o ^—. Полоски указывают — log (значение P) избыточного представления, а оранжевая линия указывает порог, 2,0. Цвет полосок указывает значение z-показателя, как указано в условных обозначениях.( C ) Высшие молекулярные и клеточные функции проанализированы в сверхэкспрессированных SFPQ по сравнению с контрольными клетками CFBE41o ^—.
SFPQ модулирует молекулярные и клеточные пути в клетках CFBE
Мы использовали программное обеспечение Ingenuity Pathway Analysis (IPA) для анализа in silico ДЭГ в клетках CFBE41o ^–, которые экспрессируют повышенные уровни SFPQ по сравнению с контролем CFBE41o ^– клетки. Мы идентифицировали различные дифференциально регулируемые канонические сигнальные пути, которые модулируются SFPQ.К основным каноническим путям относятся сигнальный путь сиртуина (p-значение = 8,7E-15, z-оценка = -2,744), ремоделирование эпителиальных спаек (p-значение = 5,31E-14, z-оценка = -2,668), передача сигналов PTEN. (p-значение = 1,08E-09, z-оценка = 0,7), передача сигналов mTOR (p-значение = 1,32E-08, z-оценка = — 1,043), клеточный цикл: регулирование контрольной точки G1 / S (p-значение = 2E- 08, z-оценка = — 1,569), передача сигналов PI3K / AKT (p-значение = 3,78E-08, z-оценка = -0,849), передача сигналов ERK / MAPK (p-значение = 5,92E-07, z-оценка = -2,582) , клеточный цикл: регуляция контрольной точки повреждения ДНК G2 / M (p-значение = 6.48E-07, z-оценка = 1,789), передача сигналов Wnt / β-катенина (p-значение = 6.55E-07, z-оценка = -0,729) и передача сигналов NF-κB (p-значение = 4.83E-05, z-оценка = — 1,511) (рисунок 3B).
Следовательно, самые важные молекулярные и клеточные функции, на которые существенно влияет SFPQ, включают гибель и выживание клеток (диапазон значений p = от 3,78E-18 до 1,45E-80), развитие клеток (диапазон значений p = от 4,06E-19 до 2.11E-76), клеточный рост и пролиферация (диапазон значений p = от 4,23E-19 до 2,11E-76), экспрессия генов (диапазон значений p = 2.От 01E-21 до 8.14E-72) и клеточного цикла (диапазон значений p = от 3,21E-18 до 6.06E-67) (рис. 3C).
Кроме того, анализ вышестоящих регуляторов предполагает ассоциацию нескольких регуляторов транскрипции с SFPQ. Среди них самые верхние регуляторные молекулы, TP53, 8-бром-цАМФ и SIRT1, которые изменяются повышенными уровнями SFPQ в клетках CFBE41o ^—, показаны на рисунке 4. Соответствующие гены перечислены в дополнительной таблице 1. Они связанные молекулярные и клеточные функции, вероятно, способствовали увеличению экспрессии и перемещению F508del-CFTR в клетках CFBE после сверхэкспрессии SFPQ.Эти результаты показывают, что несколько молекулярных и клеточных механизмов и канонических сигнальных путей связаны с SFPQ-опосредованным спасением F508del-CFTR в клетках CFBE.
Рисунок 4
Влияние SFPQ на вышестоящие регуляторы транскрипции. На диаграммах показаны наиболее обогащенные регуляторные молекулы, ( A ) TP53, ( B ) 8-бром-цАМФ и ( C ) SIRT1, которые, как предполагается, объясняют различия в экспрессии генов между сверхэкспрессированными SFPQ и контроль CFBE41o ^— ячеек.Цвет полосок указывает значение дифференциальных выражений, как указано в условных обозначениях. Сплошные стрелки обозначают гены, которые взаимодействуют напрямую, пунктирные стрелки обозначают косвенные взаимодействия между генами.
Далее мы проанализировали DEGs для определения регуляторных биологических отношений, опосредованных сверхэкспрессией SFPQ. Две основные сети с наивысшим баллом (31) и фокусными молекулами (35), связанными со сверхэкспрессией SFPQ, — это посттрансляционная модификация, деградация белка, синтез белка (Сеть 1), а также сборка и организация клеток, клеточная функция и поддержание. сотовое движение (Сеть 2) (Рисунок 5A, B).В сети 1 гены, которые активируются, включают AIDA , DAZAP1 , DDX19B , FAM118A , GOLGA8K (включает другие), HEBP1 , MINDY2 RNF185 и SMURF2 . Гены с пониженной регуляцией включают ANXA8 / ANXA8L1 , APOBEC3A , DAZAP2 , DHX32 , KCTD10 , KLHDC2 , LHDC2 , KLHDC2 , KLHDC2 , KLHDC2 NEDD8 , PLSCR4 , PRRG1 , RBM12 , RNF145 , SHKBP1 , SMIM14 , TENT5A , TEMM14 , TENT5A , ТМЭМ ТМЭМ и UBE4B .В сети 2 гены с активацией включают ATP5F1B , C1orf35 , DLG1 , EAF1 , EIF5A2 , FRZB , IER5 , MCNJ , KCNJ SEC63 , SLC25A22 , SLC39A8 , TMEM126B и ZC3H8 , в то время как гены с пониженной регуляцией включают C6orf47 , CACFD1
16 CACFD1 , DERE , FZD7 , GPRC5B , HMGB3 , MRFAP1L1 , NDRG4 , PLD3 , RAB30 , RABAC1 , RETREG RABAC1 , RETREG ZC3h23 и ZMYM3 .
Рис. 5
Влияние SFPQ на генные сети. Радиальные представления указывают на наиболее обогащенные сети, которые, как предполагается, объясняют различия в экспрессии генов между сверхэкспрессируемыми SFPQ и контрольными клетками CFBE41o ^—. ( A ) Сеть 1: посттрансляционная модификация, деградация белка, синтез белка; ( B ) Сеть 2: клеточный цикл, морфология клеток, сборка и организация клеток; ( C ) Сеть 3: клеточная сборка и организация, репликация ДНК, рекомбинация и репарация, синтез белка; ( D ) Сеть 4: клеточная функция и поддержание, молекулярный транспорт, трафик РНК.Зеленый цвет обозначает низкую экспрессию или понижающую регуляцию, красный цвет обозначает повышенную регуляцию, тогда как серый цвет обозначает те, которые присутствуют в нашем наборе данных, но существенно не изменились. Сплошные стрелки обозначают гены, которые взаимодействуют напрямую, пунктирные стрелки обозначают косвенные взаимодействия между генами.
Другие сети, связанные со сверхэкспрессией SFPQ с оценкой (29) и фокусными молекулами (34), также участвуют в сборке и организации клеток, репликации, рекомбинации и репарации ДНК, синтезе белка (Сеть 3), клеточной функции и поддержании. , молекулярный транспорт, трафик РНК (Сеть 4), сборка и организация клеток, нарушение развития, репликация ДНК, рекомбинация и репарация (Сеть 5), передача сигналов клеток, посттрансляционная модификация, синтез белка (Сеть 6), синтез белка, РНК повреждение и восстановление, посттранскрипционная модификация РНК (Сеть 7), клеточный цикл, повреждение и аномалии организма, посттранскрипционная модификация РНК (Сеть 8), метаболизм лекарств, посттрансляционная модификация, сворачивание белка (Сеть 9) и клеточный цикл , посттрансляционная модификация, посттранскрипционная модификация РНК (Сеть 10) (Рисунок 5C, D; дополнительный рисунок S3).Соответствующие гены перечислены в дополнительной таблице 2.
Сверхэкспрессия SFPQ восстанавливает функцию F508del-CFTR в клетках CF
Недавний скрининг shРНК на культивируемых эпителиальных клетках CF выявил несколько генов, нокдаун которых способствовал функциональному восстановлению мутанта F508del-CFTR ³¹.

Муковисцидоз > Клинические протоколы МЗ РК

МУКОВИСЦИДОЗ — это… Что такое МУКОВИСЦИДОЗ?

Bolnica

Муковисцидоз у взрослых и детей: причины, симптомы, лечение

Что такое муковисцидоз

Как наследуется муковисцидоз

Механизм развития основных симптомов

Формы и проявления болезни

Муковисцидоз у детей

Диагностика

Принципы лечения

Микразим при муковисцидозе

Прогноз и профилактика

что это, симптомы, причины, диагностика, лечение, осложнения

Содержание

Биохимическое исследование (анализ) крови и мочи при мочекаменной болезни

Список литературы

Документы

Подавление экспрессии гена трансмембранного регулятора проводимости при муковисцидозе агентами, которые модулируют внутриклеточные двухвалентные катионы

Страница исследования факультета | Молекулярная и клеточная биология

Терри Мачен

Область научных интересов

Текущие проекты

Избранные публикации

Генетические методы лечения муковисцидоза легких | Молекулярная генетика человека

Аннотация

ВВЕДЕНИЕ

ПОСЛЕДНИЕ ВЕКТОРНЫЕ РАЗРАБОТКИ

Оболочечные вирусные векторы

Инкапсидированные вирусные векторы

Невирусные векторы

ПОСЛЕДНИЕ РАЗРАБОТКИ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ CF

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

Направленная эволюция вирусных векторов

Ремонт и добавление генов

Применение РНК-интерференции для лечения CF

Инженерия ткани легкого

НОВЫЕ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ CF НА ЖИВОТНЫХ

ВЫВОДЫ

ФИНАНСИРОВАНИЕ

БЛАГОДАРНОСТИ

ССЫЛКИ

Новости и объявления | Аспирантура по молекулярной и клеточной биологии в UMass Amherst

Журнал муковисцидоза

Муковисцидоз: новые взгляды на терапевтические подходы

SFPQ восстанавливает экспрессию и функцию F508del-CFTR в эпителиальных клетках бронхов при муковисцидозе

Экспрессия SFPQ снижена в клетках F508del-CFTR CF по сравнению с контрольными клетками

Сверхэкспрессия SFPQ увеличивает экспрессию F508del-CFTR в клетках CF

SFPQ изменяет транскриптом в клетках CFBE

SFPQ модулирует молекулярные и клеточные пути в клетках CFBE

Сверхэкспрессия SFPQ восстанавливает функцию F508del-CFTR в клетках CF

Related Post

Добавить комментарий Отменить ответ