Сдать анализ на цитологическое исследование по системе Бетесда
ПАП-тест, или цитологическое исследование мазков из экзо- и эндоцервикса методом Папаниколау, является скрининговым методом диагностики патологии шейки матки. Данный вид цитологического исследования рекомендован большинством сообществ и входит в современные клинические рекомендации. В рамках настоящего анализа ПАП-тест проводится классическим методом, а именно материал наносится на стекло. Забор мазков проводит врач, используя специальные эндобраши (цитощеточки) для изолированного получения мазков с поверхности шейки матки (экзоцервикс) и из цервикального канала. Мазки наносятся на стекло, которое в дальнейшем будет направлено врачам-цитологам для оценки полученного материала. Метод Папаниколау является наиболее точным исследованием клеток экзо- и эндоцервикса. В отличие от других методов используется несколько сложных красок для лучшего окрашивание цитоплазмы и ядер. Также мазок фиксирует 96% спиртом. Такая методика позволяет снизить количество ошибок, допущенных из-за недостаточной подготовки материала непосредственно к исследованию, а также дает возможность цитологам оценить максимально окрашенный материал. Описание цитограммы при этом всегда развернутое, а заключение согласно существующей классификации Бетесда.
Классификация Бетесда.
Оценка качества мазка:
Материал полноценный, содержит клетки плоского и цилиндрического эпителия в достаточном количестве.
Неудовлетворительный для оценки (неинформативный) материал, Скудное количество клеток или их отсутствие.
Цитограмма в пределах нормы (NILM):
Содержит клетки поверхностного и промежуточного слоев многослойного плоского эпителия, клетки метаплазированного эпителия, лейкоциты, клетки цилиндрического эпителия, клетки эпителия эндометрия.
Метаплазия (норма), клетки плоского метаплазированного эпителия свидетельствуют о том, что материал забран из зоны трансформации.
Реактивные изменения:
Цитограмма воспаления, дегенеративные и реактивные изменения клеток, воспалительная атипия, плоскоклеточная метаплазия, гиперкератоз, паракератоз, койлоцитоз и другие признаки вирусного поражения.
Атрофия, клетки базального и парабазального типов -мелкие клетки с гиперхромным ядром и скудной цитоплазмой. Часто могут ошибочно трактоваться как клетки с атипией, давая ложноположительный результат цитологии.
Патологические изменения эпителия:
ASCUS (atypical squmous cells of undetermined significance), Изменения, которые трудно дифференцировать между реактивными изменениями эпителия и дисплазией. При ASCUS определяются клетки, трактовка которых затруднена — клетки с дискариозом, укрупненными и гиперхромными ядрами. Рекомендуется динамическое наблюдение и дообследование, а именно повторное цитологическое исследование через 6 месяцев и ВПЧ-тестирование. В случае подтверждении ASCUS и наличии вируса папилломы человека высокого онкогенного риска — проводится кольпоскопия. Исследования показывают, что 20% женщин с ASC имеют дисплазию после более тщательного обследования.
Предопухолевые изменения:
LSIL (CIN I), слабовыраженное интраэпителиальное поражение, включающее папилломавирусную инфекцию. Рекомендуется наблюдение без активной терапии. У большинства женщин LSIL самостоятельно регрессирует в течение нескольких лет. В эту группу объединены все изменения с низким злокачественным потенциалом, поскольку цитолог зачастую не может отличить изменения при ВПЧ инфекции и CIN 1.
HSIL (CIN II-III), умеренно выраженное и тяжелое интраэпителиальное поражение. Рекомендуется удаление всех пораженных тканей методом (конизация) с последующим морфологическим исследованием. В эту группу объединены все изменения с высоким злокачественным потенциалом.
AGC (atypical glandular cells), Атипические клетки цилиндрического эпителия. Рекомендуется выскабливание цервикального канала для гистологического исследования.
Опухолевые изменения:
Плоскоклеточный рак, злокачественная опухоль из плоского эпителия.
Железистый рак, злокачественная опухоль из железистого эпителия эндоцервикального типа.
Эндометриальный рак, злокачественная опухоль, развивающаяся из слизистой оболочки матки и прорастающая в цервикальный канал.
Gravita Family Clinic ► Неопухолевые изменения клеток эпителия
Плоскоклеточная метаплазия
Процесс, который характеризуется нераковыми изменениями в эпителиальных клетках шейки матки. Плоскоклеточная метаплазия возникает в результате совокупности общих и местных факторов, которые негативно влияют на организм, вызывая обратимый процесс, в ходе которого дифференцированные эпителиальные клетки преобразуются в более выносливые клетки многослойного плоского эпителия, с ороговением или без. Плоскоклеточная метаплазия цервикального канала также возникает как результат слияния с находящимся рядом эндоцервиксом. Изменение типа клеток может приводить к снижению функции эпителия. Когда патологические раздражители устраняются, метапластические клетки приобретают свою первоначальную форму и функцию. Сохранение физиологических стрессоров в областях, подверженных метаплазии, может приводить к дисплазии или предраковым клеточным изменениям. Развитие метаплазированных клеток происходит под влиянием герпеса или бактериальных инфекций (хламидиоз, токсоплазмоз, уреаплазмоз), протекающих на фоне ослабленного иммунитета и имеющих хроническую форму.
Кератоз
Представляет собой патологический процесс, который характеризуется пролиферацией и ороговением клеток плоского эпителия, выстилающего влагалищную часть шейки матки. При этом образуются утолщения или бляшки белого цвета с четкими границами, выступающие над поверхностью слизистых оболочек и могут быть видимы невооруженным глазом до любой обработки растворами.
Гиперкератоз
Это усиленное ороговение верхнего слоя многослойного плоского эпителия шейки матки. Считается, что причиной может быть недостаток эстрогена в организме женщины. В процессе ороговения слизистая покрывается плотными белесоватыми структурами, слегка выступающими над поверхностью здоровой ткани.
Паракератоз
Нарушения Ороговения эпителиального слоя эпидермиса (неполное ороговение). Характеризуется ороговением слизистых оболочек, потерей эпидермисом способности синтезировать кератогиалин (предшественник кератина) и нарушением морфологии слизистой оболочки. При данном процессе пораженный участок цервикального канала выглядит сморщенным из-за нарушения эластичности ткани. Такие островки более грубые.
Опасность представляет лейкоплакия, возникшая в результате активизации вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска.
Трубная метаплазия
Характеризуется наличием в строме шейки матки нормальных по строению желез, выстланных клетками, напоминающими эпителий маточной трубы. Данная патология обычно представлена одиночной железой или группой желез и может быть реснитчатая либо секреторная. Трубная метаплазия часто встречается в неупорядоченном пролиферативном эндометрии
Атрофические изменения
Атрофия матки и шейки в большинстве случаев диагностируется у женщин в климактерическом периоде. Результатом данной патологии становится регресс эпителиальной ткани. Однако женщины детородного возраста также не застрахованы от атрофии шейки матки. Заболевание может развиться при дефиците эстрогенов, после оперативных вмешательств на шейке матки, при системных патологиях соединительной ткани. Атрофия шейки матки – один из факторов, вызывающих женское бесплодие.
В основном атрофические изменения происходят в период менопаузы. Снижение выработки гормонов приводит к исчезновению слизистой секреции, изменению бактериальной флоры. В результате происходит поэтапное сокращение толщины эпителия, что приводит ткани к раздражениям, травмам.
Изменения при беременности
В течение беременности устанавливается типичная для данного процесса картина мазка. Эти изменения связаны с продукцией гормонов плацентой и могут быть неверно трактованы как предопухолевые или опухолевые. Реактивные изменения шейки матки связаны с нарушением клеток ее эпителия. Возникают при: воспалениях, гиперкератозе, паракератозе, дискератозе, плоскоклеточной метаплазии, железистой гиперплазии, полипах, лимфоцитарном (фолликулярном) цервиците.
Внутриэпителияальные изменения клеток и рекомендуемые алгоритмы ведения пациенток
ASC-US (ASC of undetermined significance) – клетки плоского эпителия с атипией неясного значения. *ASCCP, 2013(Цитология жидкостная и традиционная при заболеваниях шейки матки. Цитологический атлас / Под ред. И.П.Шабаловой, К.Т.Касоян. 4-е издание, исправленной и ополненное. М. –Тверь: ООО«Издательство «Триада»», 22016. – 320 с.: 1122 ил.)LSIL (Low-grade squamous intraepithelial lesion) внутриэпителиальное поражение клеток плоского эпителия низкой степени ASCCP, 2013ASC-H (ASC, cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion) клетки плоского эпителия с атипией, не позволяющие исключить HSIL(Цитология жидкостная и традиционная при заболеваниях шейки матки. Цитологический атлас / Под ред. И.П.Шабаловой, К.Т.Касоян. 4-е издание, исправленной и ополненное. М. –Тверь: ООО«Издательство «Триада»», 22016. – 320 с.: 1122 ил.)HSIL (High-grade squamous intraepithelial lesion) — внутриэпителиальное поражение клеток плоского эпителия высокой степени, включают CIN II и CIN III, рак in situ(Цитология жидкостная и традиционная при заболеваниях шейки матки. Цитологический атлас / Под ред. И.П.Шабаловой, К.Т.Касоян. 4-е издание, исправленной и ополненное. М. –Тверь: ООО«Издательство «Триада»», 22016. – 320 с.: 1122 ил.)Атипичные железистые клетки (AGC)
Различают:
- эндоцервикальные
- эндометриальные
- неопределенные
%PDF-1.6 % 1 0 obj > endobj 4 0 obj /ModDate (D:20160622160135+03’00’) /Subject >> endobj 2 0 obj > stream application/pdf
Опасная дисплазия железистого эпителия шейки матки лечится только методом ФДТ
Афанасьев Максим Станиславович.
Д.м.н., профессор Сеченовского университета, онколог, хирург, онкогинеколог, гинеколог-иммунолог, эксперт по лечению дисплазии, предраковых и опухолевых заболеваний шейки матки.
Если говорить совсем коротко, то железистая дисплазия – это предраковое заболевание шейки матки. Из-за особенности своего расположения оно практически не поддается лечению классическими хирургическими методами. Фотодинамическая терапия в этом случае – пожалуй, единственный эффективный способ лечения, который защищает от рецидивов и раковой трансформации.
А теперь обо всем по порядку.
Чтобы лучше понять, что такое железистая дисплазия шейки матки, мы немного погрузимся в теорию и изучим строение шейки матки.
Строение шейки матки: эктоцервикс, эндоцервикс. зона трансформации.
Участок шейки матки, который погружен во влагалище (синий прямоугольник) называется эктоцервиксом. Он покрыт многослойным плоским эпителием.
Участок шейки матки от наружного зева по направлению к матке называется цервикальным каналом шейки матки (оранжевый прямоугольник). Он покрыт эндоцервиксом, или железистым (цилиндрическим) эпителием.
Цервикальный канал не ровный, а складчатый. На медицинском языке эти складки называются криптами. Железы цилиндрического эпителия секретирует слизь, которая составляет основной объём нормальных выделений.
Так выглядят крипты шейки матки. Всю поверхность крипты выстилает цилиндрический эпителий.
Зона, в которой многослойный плоский эпителий переходит в железистый эпителий называется переходной зоной, или зоной трансформации. Обычно дисплазия начинает свое развитие в зоне трансформации – в ней идет непрерывное клеточное деление, и вирусу папилломы легче всего проникнуть сквозь слабую защиту незрелых клеток в необходимые для его выживания базальные клетки.
Переходная зона или зона трансформации.
Дисплазия представляет собой скопление измененных вирусом клеток. Такие клетки называются атипическими, а само заболевание чаще всего относится к предраковым.
Что такое «дисплазия метаплазированного эпителия»?Мы уже выяснили: зона, в которой сходится плоский и цилиндрический эпителий, называется зоной трансформации. Втрое ее название – переходная зона.
Но это только на схеме она представляет собой ровную линию. На самом деле, в этой зоне один эпителий заходит на другой, как морские волны на песчаный берег. Молодой плоский эпителий перекрывает молодой цилиндрический. Такой незрелый плоский эпителий и называется метаплазированным.
Незрелый метаплазированный эпителий.
Само словосочетание «метаплазированный эпителий» вызывает много вопросов. Не скрывается ли за этой формулировкой рак? – Нет, не скрывается.
Хуже, если в вашей цитологии ничего про метаплазированный эпителий не написано. Это значит, что он отсутствует в мазке, и анализ взят неправильно (помните, я писал о том, что правильная цитология начинается в кабинете врача, а не в лаборатории?).
А теперь давайте обратим внимание на то, что написано в заключении. Если в заключении написано «на фоне метаплазии очаги дисплазии», перед нами дисплазия переходного эпителия. Так как в зоне трансформации идет непрерывный процесс интенсивного деления клеток, незрелые клетки менее защищены от заражения, и вирусу папилломы (причина дисплазии) как раз в области метаплазированного эпителия легче проникнуть в глубокий базальный слой и встроиться в ДНК клетки.
Именно поэтому шейку матку так тщательно осматривают и берут с нее анализ на цитологию – дисплазия обычно начинается в переходной зоне.
А теперь поговорим о том, что означает диагноз «интраэпителиальная дисплазия железистого эпителия шейки матки».
Что такое дисплазия цервикального канала и чем она опасна«Интраэпителиальная дисплазия железистого эпителия шейки матки» – это так называемый «цитологический» или «гистологический» диагноз. Такое заключение пишет специалист в лаборатории после изучения вашего цитологического мазка или биопсии.
Он видит в микроскоп, что в клетках железистого эпителия происходит предраковая трансформация клеток.
Формулируя таким образом свое заключение, врач-морфолог подчеркивает, что процесс происходит не в зоне трансформации, а В ЦЕРВИКАЛЬНОМ КАНАЛЕ ШЕЙКИ МАТКИ.
Поэтому заболевание еще называют «цервикальная дисплазия», или «дисплазия канала».
Такой диагноз говорит о том, что при лечении его классическими методами вероятность рецидива заболевания приближается к 80%.
Классический метод лечения дисплазии называется конизацией шейки матки. Это операция, в ходе которой хирург удаляет кусочек эктоцервикса и эндоцервикса в форме конуса. Задача хирурга – удалить участок вместе с дисплазией.
Низкая (слева) и высокая (справа) конизация шейки матки.
Но такой способ лечения для диагноза «дисплазии цилиндрического эпителия» изначально порочен.
Дело в том, что при работе с цервикальным каналом хирург действует фактически вслепую. Он не видит зоны поражения, не может оценить ее размера, глубины и по факту удаляет ткани «на ощупь». Практика показывает, что после такого лечения частота рецидива дисплазии приближается к 80%.
Фактически, когда врач-морфолог в заключении описывает наличие проблемы в области железистого эпителия, он таким образом подчеркивает сложный характер расположения дисплазии и бесперспективность хирургической тактики лечения.
Этим недостатки хирургического метода не ограничиваются.
Во-первых, радикальность и как следствие, эффективность конизации – всегда сомнительна. Объясню почему. Крипты эндоцервикса достигают глубины 5 мм. У всех разная физиология, и хирург никак не может проверить, убрал ли он достаточно цилиндрического эпителия.
У нерожавших женщин глубокое удаление тканей чревато развитием осложнений, которые могут препятствовать зачатию, вынашиванию и родам (на эту тему читайте мою статью «Беременность после конизации шейки матки»). Хирурги знают об этом, и стараются проводить операцию максимально щадящим образом.
Определение границ изменённого дисплазией эпителия носит всегда субъективный характер. А при проведении конизации глубина конуса определяется хирургом «на глазок», здесь доказательная медицина не подсказывает хирургу как действовать. Глубина обычно определяется длиной электрода – «паруса», а не тяжестью диспластического процесса.
Недостаточно радикальная конизация, как следствие, вызывает закономерный рецидив.
Во-вторых, любое лечебное воздействие само по себе является для вируса провоцирующим фактором.
После лечения вирус начинает вести себя более агрессивно и приводит к быстрому рецидиву, который развивается по негативному сценарию: дисплазия 2 степени переходит в 3, а дисплазия 3 степени и рака ин ситу могут трансформироваться в инвазивный рак шейки матки.
В-третьих, хирургия делает вирус резистентным (устойчивым) К ЛЮБОМУ лечению, даже к фотодинамической терапии. Увы, и я, и коллеги часто наблюдаем это в своей практике.
При таком развитии событий рано или поздно возникнет необходимость в удалении матки. Именно поэтому при диагнозе «дисплазия эндоцервикса» я настоятельно не рекомендую делать конизацию, так как она не устраняет причину болезни.
Как избежать рецидива?Избежать рецидива можно единственным способом – устранить измененные клетки вместе с причиной заболевания – вирусом папилломы человека.
К сожалению, механическое удаление в процессе конизации атипических клеток не приводит к выздоровлению. ВПЧ остается в цервикальном канале. В теории, вместе с очагами дисплазии удаляются и все зараженные ВПЧ клетки. Но на практике так не происходит.
Единственный метод, который позволяет убрать из цервикального канала ВПЧ и атипичные клетки, – это правильно и в полном объеме выполненная фотодинамическая терапия с соблюдением протокола проведения.
Цервикальная дисплазия шейки матки хорошо лечится методом фотодинамической терапииЯ не буду рассказывать о самой: фотодинамической терапии – об этом очень хорошо рассказывает это видео:
Фундаментальные исследования доказали, что лазерный свет глубоко проникает в ткани и запускает фотохимические реакции на глубине минимум 7 мм. Крипты (складки) цервикального канала имеют максимальную глубину 5 мм, поэтому даже самые глубоко залегающие атипические клетки попадают под лечебное воздействие.
При соблюдении протокола проведения ФДТ в ходе фотохимических реакций образуются активные токсичные формы кислорода, которые увеличивают реальную глубину лечебного воздействия до 1,5 см! Соответственно, фотодинамическое воздействие в полной мере оказывает необходимый лечебный эффект, и даже с запасом.
Положительный терапевтический результат процедуры достигается только при неукоснительном соблюдении протокола ФДТ, который включает в себя обязательное облучение и зоны эктоцервикса, и цервикального канала специальным цилиндрическим диффузором.
Этот диффузор вводится в полость цервикального канала на всю его глубину, и по периметру облучает все поле железистого эпителия.
Только такой подход позволяет полностью уничтожить патологические клетки и содержащийся в них вирус папилломы человека (ВПЧ) на всех участках шейки матки и говорить о качественно выполненном лечении.
При такой адекватно проведённой ФДТ ВПЧ уничтожаются в 93% случаев.Хочу отметить, что до сих пор даже очень уважаемые мои коллеги допускают ошибки в обучении специалистов-гинекологов и не показывают им необходимость облучения цервикального канала при лечении дисплазии шейки матки.
В этом случае ФДТ не оказывает нужного лечебного воздействия. Воздействие осуществляется только в области эктоцервикса, а вся полость цервикального канала шейки матки остается не задействованной в лечении. Такой «урезанный» протокол ФДТ зачастую приводит к тем же печальным последствиям, что и конизация.
Я горжусь, что могу менять медицинскую практику вокруг себя в лучшую сторону. Так, методическое пособие для врачей ГНЦ лазерной медицины МЗ РФ «Фотодинамическая терапия фоновых и предраковых заболеваний шейки матки» от 2004 года не включало в себя важный этап обработки цервикального канала.
После моего выступления на конференции StatusPraesens «Перинатальная медицина: от прегравидарной подготовки к здоровому материнству и детству», 18–20 февраля 2016 года, отель «Санкт-Петербург», методические рекомендации подверглись пересмотру и теперь включают в себя обработку цервикального при лечении дисплазии канала шейки матки как обязательный этап.
Многие теперь стали использовать диффузор для облучения цервикального канала. Однако даже после этой революции многие используют его, не понимая, какая интенсивность света выходит из этого диффузора. А это важный параметр, от которого зависит эффективность проведённой фотодинамической терапии.
Многие также используют диффузоры многократно, хотя уже после одного облучения мощность инструмента падает, и необходимое лечебное воздействие не достигается. Но никто об этом не задумывается!
Чтобы получить консультацию, показана ли вам фотодинамическая терапия, и рассчитать стоимость процедуры, высылайте свою историю болезни и анализы на e-mail [email protected]. Или звоните по бесплатному телефону 8 (800) 555-77-26 .
Прием ведет Афанасьев Максим Станиславович, акушер-гинеколог, онкогинеколог, онколог, иммунолог, доктор медицинских наук, профессор и член ученого совета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ, эксперт по лечению дисплазии шейки матки.
Прием проводится в двух клиниках в Москве, а также в Санкт-Петербурге, Махачкале, Ставрополе, Барнауле, Воронеже, Самаре, Набережных Челнах, Саратове, Челябинске, Майкопе и других регионах России. Уточнить дату, место приема в вашем городе и записаться на консультацию вы можете у администратора по телефону 8 (800) 555-77-26 .
После лечения я поддерживаю обратную связь со всеми пациентками и решаю все возникающие вопросы. Гепатит и положительный ВИЧ статус не является противопоказаниями для лечения методом ФДТ.
Мазок на ЦИТОЛОГИЮ — расшифровка цитограммы (NILM, ASCUS, LSIL, HSIL)?
МАЗОК НА ЦИТОЛОГИЮ — МЕТОД МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕРВИКАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ С ЦЕЛЬЮ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ.
Содержание:
Мазок на цитологию в первую очередь проводится для обнаружения атипичных клеток, что позволяет на ранних этапах диагностировать дисплазию (CIN, LSIL, HSIL) или рак шейки матки. Это недорогой и удобный метод для профилактического охвата большого количества женщин. Конечно, чувствительность однократного исследования невысокая, однако ежегодный массовый скрининг в развитых странах позволил значительно снизить смертность женщин от рака шейки матки.
В связи с тем, что атипичные клетки могут располагаться на относительно небольшом участке слизистой, очень важно, чтобы материал был получен со всей поверхности шейки матки, особенно из цервикального канала! Для этого созданы специальные щеточки, позволяющие получать материал из недоступных для осмотра областей.
Особое внимание придается зоне трансформации, клетки которой чаще всего подвергаются опухолевому перерождению. Именно в зоне трансформации развивается до 80-90% рака шейки матки, остальные 10-20% приходятся на цервикальный канал.
Когда сдавать мазок на цитологию? Взятие мазка на цитологию следует проводить начиная с 5-го дня менструального цикла и за 5 дней до предполагаемого начала менструаций. Нельзя проводить анализ в течение двух суток после полового сношения либо введения во влагалище свечей. Несоблюдение этих правил может привести к ошибочной трактовке результатов. Так же наличие выраженного воспалительного процесса в шейке матки и влагалище серьезно осложняют диагностику.
Следует отметить, что забор материала — это достаточно неприятная процедура. Гинеколог должен соскоблить эпителий с поверхности шейки и зайти в цервикальный канал. Чем больше попадет эпителия из различных зон — тем качественнее диагностика. Иногда после цитологии могут оставаться кровоподтеки, это считается нормальным.
Таким образом, основное значение мазка на цитологию — это определение качественных изменений клеток. Для определения инфекционного агента, вызвавшего воспаление, лучше использовать мазок на флору или бактериологический посев. Однако при цитологическом исследовании врач может отметить присутствие каких либо микроогранизмов. К нормальной микрофлоре относятся палочки (лактобациллы), единичные кокки, в небольшом количестве может быть условно-патогенная флора. Наличие специфических инфекционных агентов (трихомонады, амебы, грибы, гонококки, гарднереллы, лептотрикс, хламидии, обилие кокков) считается патологией, которую необходимо лечить.
Обработка мазков. Сроки выполнения цитологии
После забора материала, образец переносится на предметное стекло, фиксируется и окрашивается. При прямом переносе мазка со щеточки возможна частичная потеря материала и деформация клеток, что ведет к снижению чувствительности метода и большому числу ложных результатов. На смену классическому методу пришла жидкостная цитология, что значительно повысило точность и качество исследования.
Жидкостная цитология — это новая технология обработки мазков, которая заключается в помещении проб в контейнер со специальным стабилизирующим раствором. При этом в раствор попадает весь полученный эпителий, который затем центрифугируется и очищается от нежелательных примесей (слизи и др). На сегодняшний момент жидкостная цитология становится «золотым стандартом» для исследования мазков со слизистой шейки матки. Но и в этом случае чувствительность однократного исследования не превышает 60-70%. В репродуктивном возрасте часты ложноотрицательные результаты, а у женщин в менопаузе — ложноположительные. Только трехкратное цитологическое исследование позволяет приблизиться к 100%.
Существуют различные методы окраски препаратов: по Papanicolau (Пап-тест), по Романовскому, по Wright-Diemsa, по Граму. Все методы направлены на окрашивание определенных клеточных структур, что позволяет дифференцировать различные типы эпителия, отличать клетки с ороговением и опухолевой трансформацией. Тест Папаниколау широко признан и сейчас используется как основной стандартизированный метод.
Сколько времени делается тест? В зависимости от организации процесса результат можно получить в течение 2-3 дней.
Цитограмма без особенностей — что это значит?
Варианты цитологического заключения широко варьируют. Как вариант нормы, могут употребляться следующие заключения: «цитограмма без особенностей«, «цитограмма в пределах нормы«, «цитограмма без интраэпителиальных поражений«, «цитограмма соответствует возрасту — атрофический тип мазка«, «NILM — Negative for intraepithelial lesion or malignancy«, «пролиферативный тип мазка«. Все это — НОРМА!
Слизистая шейки матки в норме гладкая, блестящая, влажная. Плоский эпителий бледно-розовый, железистый эпителий — ярко красный. Клеточный состав, который можно встретить в нормальной цитологии представлен в таблице.
| Цитограмма без особенностей (NILM) у женщин репродуктивного возраста | |
| Экзоцервикс | Хорошо сохранившиеся клетки плоского эпителия, преимущественно поверхностного, промежуточного слоев. |
| Эндоцервикс | Клетки железистого (цилиндрического) эпителия. |
| Зона трансформации | Клетки плоского эпителия, единичные клетки или мелкие скопления метаплазированного плоского эпителия, небольшие скопления железистого эпителия. |
Атрофический тип мазка — что это значит?
У женщин в переменопаузе и менопаузе за счет снижения общего уровня эстрогенов замедляются многие метаболические процессы, что приводит в результате к атрофии плоского эпителия. Эти изменения можно увидеть в цитограмме. Атрофический тип мазка относится к варианту нормальной цитограммы. Часто можно встретить в заключении фразу «цитограмма соответствует возрасту» или «возрастные изменения nilm«. Все это — варианты нормы!
Нужно понимать, что у женщин в менопаузе очень часты ложноположительные результаты цитограммы — тот случай, когда цитологу сложно отличить атрофичный плоский эпителий от дисплазии. Это нужно понимать, поскольку при последующей биопсии шейки матки патологии обычно не находят. Кроме того у пожилых женщин может быть склонность к кератинизации эпителия с формированием гиперкератоза (лейкоплакии).
| Цитограмма без особенностей (NILM) у женщин в пере- и менопаузе (атрофический тип мазка) | |
| Экзоцервикс | Хорошо сохранившиеся клетки плоского эпителия, преимущественно парабазального и базального слоев. Чаще бывают мазки атрофического типа, но могут быть и пролиферативного или смешанного типов. |
| Эндоцервикс | Отсутствие клеток цилиндрического (железистого) эпителия не является показателем плохого качества мазка, поскольку в этот период зона трансформации смещается глубоко в канал и для получения железистого эпителия щеточку нужно вводить на глубину более 2-2,5 см. |
| Зона трансформации | Клетки плоского, метаплазированного эпителия. |
Слизистая шейки матки в менопаузе истончена, легко травмируется и подкравливает, что является следствием снижения эстрогенов.
Расшифровка цитограммы
Терминология
Мазок на цитологию- норма
Дискариоз и дискариоциты — аномальные клетки с гиперхромными (плотными и темными) ядрами и нерегулярным ядерным хроматином. За дискариозом последует развитие злокачественного новообразования. Используется как синоним дисплазии, но как более общий термин.
Атипия — любое отличие структуры клетки от нормы. Смысл зачастую зависит от контекста. Но чаще все же используется для описания предопухолевых и опухолевых изменений.
Воспалительная атипия — сочетание дегенеративных, реактивных, пролиферативных изменений клеток при воспалении. Эти изменения могут стать причиной ложно-положительного диагноза дисплазии или рака.
Дисплазия — процесс нарушения созревания плоского эпителия. Является истинным предопухолевым процессом. Имеет 3 степени. К первой обычно относят вирусное поражение, ко второй и третьей — поражение с опухолевым потенциалом.
Дисплазия эпителия тяжелой степени
ASCUS — атипичные клетки, которые трудно дифференцировать с реактивной атипией и собственно предопухолевым процессом. Атипия неясного значения.
Дискератоз — нарушение кератинизации отдельных клеток плоского эпителия. Является признаком ВПЧ.
Паракератоз — нарушение кератинизации эпителиального пласта. Поверхностные клетки плоского эпителия всегда имеют некоторую степень кератинизации — это защитный механизм. Паракератоз может наблюдаться в норме, при раздражении слизистой любой причины, или при ВПЧ-поражении.
Койлоцитоз (койлоцитарная атипия, койлоцит) — специфические изменения ядер, характерные для вируса папилломы человека.
Койлоциты, многоядерная клетка
Гиперкератоз (лейкоплакия) — выраженная кератинизация эпителиального пласта с появлением защитного бесструктурного слоя из кератогиалина. Это нормальный процесс для кожи, но в слизистых оболочках считается патологией. Наблюдается при ВПЧ-инфекции, а также при раздражении слизистой, особенно при опущении органов малого таза, выпадении матки.
Плоскоклеточная метаплазия — защитный механизм, физиологический процесс замещения нежного железистого эпителия более устойчивым плоским эпителием. Метаплазированный эпителий часто становится источником дисплазии и рака, так как легко поражается вирусом папилломы человека.
Железистая гиперплазия — пролиферация, активный рост железистого эпителия. Является реактивным процессом при воспалении, эрозии шейки матки. Часто встречается при использовании гормональных препаратов.
Классификация Bethesda (США) — расшифровка цитограммы
| Оценка качества мазка | |
| Материал полноценный | Содержит клетки плоского и цилиндрического эпителия в достаточном количестве. |
| Неудовлетворительный для оценки (неинформативный) материал | Скудное количество клеток или их отсутствие. |
| Цитограмма в пределах нормы (NILM) | Содержит клетки поверхностного и промежуточного слоев многослойного плоского эпителия, клетки метаплазированного эпителия, лейкоциты, клетки цилиндрического эпителия, клетки эпителия эндометрия. |
| Метаплазия (норма) | Клетки плоского метаплазированного эпителия свидетельствуют о том, что материал забран из зоны трансформации. |
| Реактивные изменения | |
| Цитограмма воспаления | Дегенеративные и реактивные изменения клеток, воспалительная атипия, плоскоклеточная метаплазия, гиперкератоз, паракератоз, койлоцитоз и другие признаки вирусного поражения. |
| Атрофия | Клетки базального и парабазального типов -мелкие клетки с гиперхромным ядром и скудной цитоплазмой. Часто могут ошибочно трактоваться как клетки с атипией, давая ложноположительный результат цитологии. |
| Патологические изменения эпителия | |
| ASCUS (atypical squmous cells of undetermined significance) | Изменения, которые трудно дифференцировать между реактивными изменениями эпителия и дисплазией. При ASCUS определяются клетки, трактовка которых затруднена — клетки с дискариозом, укрупненными и гиперхромными ядрами. Рекомендуется динамическое наблюдение и дообследование, а именно повторное цитологическое исследование через 6 месяцев и ВПЧ-тестирование. В случае подтверждении ASCUS и наличии вируса папилломы человека высокого онкогенного риска — проводится кольпоскопия. Исследования показывают, что 20% женщин с ASC имеют дисплазию после более тщательного обследования. |
| Предопухолевые изменения | |
| LSIL (CIN I) | Слабовыраженное интраэпителиальное поражение, включающее папилломавирусную инфекцию. Рекомендуется наблюдение без активной терапии. У большинства женщин LSIL самостоятельно регрессирует в течение нескольких лет. В эту группу объеденены все изменения с низким злокачественным потенциалом, поскольку цитолог зачастую не может отличить изменения при ВПЧ инфекции и собственно CIN 1. |
| HSIL (CIN I-II) | Умеренно выраженное и тяжелое интраэпителиальное поражение. Рекомендуется удаление всех пораженных тканей методом (конизация) с последующим морфологическим исследованием. В эту группу объеденены все изменения с высоким злокачественным потенциалом. |
| AGC (atypical glandular cells) | Атипические клетки цилиндрического эпителия. Рекомендуется выскабливание цервикального канала для гистологического исследования. |
| Опухолевые изменения | |
| Плоскоклеточный рак | Злокачественная опухоль из плоского эпителия. |
| Железистый рак | Злокачественная опухоль из железистого эпителия эндоцервикального типа. |
| Эндометриальный рак | Злокачественная опухоль, развивающаяся из слизистой оболочки матки и прорастающая в цервикальный канал. |
Классификация цитологических изменений по Папаниколау несколько проще, чем Bethesda. Однако, посыл остается тем же. Имеется раздел доброкачественных реактивных изменений, которые не угрожают здоровью, класс предопухолевой патологии и собственно рак шейки матки. Каждый класс выделен на основании прогноза, риска злокачественной трансформации и необходимого медицинского вмешательства.
| Классификация цитологических изменений по Папаниколау | |
| I класс | норма |
| II класс | доброкачественная атипия (реактивные изменения) |
| III класс | дисплазия (предопухолевые изменения) |
| IV класс | cancer in situ |
| V класс | инвазивный плоскоклеточный рак |
Читайте также:
- Дисплазия шейки матки — тактика лечения
- Мазок на флору — норма и патология
- Вирус папилломы человека
Помогите расшифровать результат цитологии — Вопрос гинекологу
Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 71 направлению: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.
Мы отвечаем на 97.39% вопросов.
Оставайтесь с нами и будьте здоровы!
диагностика и лечение в СПб, цена
Эрозия шейки матки выявляется у многих женщин, относящихся к различным возрастным группам. Наиболее часто это заболевание шейки матки встречается у женщин репродуктивного возраста, может себя никак не проявлять и обнаруживаться только при плановом гинекологическом осмотре.
В ряде случаев эрозия может проявляться контактными кровянистыми выделениями после полового акта или обильными слизистыми выделениями из половых путей. Под словом «эрозия» скрываются различные страхи: не будет ли рака, как и чем лечить, что делать, если еще предстоят роды; не появится ли эрозия вновь после лечения…? Многие из них вполне обоснованы и требуют устранения вместе с причиной, их вызвавшей. А некоторые – абсолютно напрасны, но тоже должны быть развеяны, так как лишают женщину душевного равновесия.
Что такое эрозия шейки матки?
Под эрозией в среде пациентов подразумевают неопределенное, но опасное для шейки матки состояние. Медицинское название этому явлению –псевдоэрозия (ложная), так как истинная эрозия шейки матки, или какой-либо другой ткани, подразумевает ее дефект (повреждение). Псевдоэрозию называют еще и эктопией цилиндрического эпителия (по латыни: ткань не на своем месте). На шейке матки дефекта ткани нет, хотя внешнее сходство есть. Что же находят врачи? Нетипичный (цилиндрический) эпителий, место которому в цервикальном канале (это канал шейки матки), обнаруживают на влагалищной поверхности шейки матки. Естественно, внешне он отличается от типичного (многослойного) эпителия. Будучи тонким (однослойным), он позволяет сосудам просвечиваться, что и придает так называемой «эрозии» красный цвет на фоне бледно-розового многослойного плоского эпителия.
Причина такого соседства в том, что цилиндрический эпителий своевременно не «сместился» в канал шейки матки, чтобы выполнять там свою функцию, а «задержался» на поверхности шейки. И в таком виде «мешает жить» женщине, усиливая дискомфорт от повышенного количества выделений из влагалища. К слову говоря, в таком состоянии «эрозия шейки матки» мало опасна. Врачи-кольпоскописты даже называют ее нормальной зоной трансформации, описывая стадии превращения.
Нужно ли лечиться?
Многие современные девушки начинают жить половой жизнью достаточно рано, а возраст первых родов отодвигается ближе к 30 годам, вследствие чего данная группа женщин попадает в группу риска по развитию патологии шейки матки. Псевдоэрозия – это клетки, живущие в нетипичном для себя месте. Поэтому они более уязвимы к различным воздействиям. Клетки законного многослойного эпителия могут языками «наползать» с периферии, перекрывая цилиндрический эпителий. Возможно и превращение однослойного цилиндрического эпителия в многослойный плоский. Этот процесс называется метаплазия. Сам по себе он тоже достаточно невинный, но в нем заложен потенциал активного деления клеток. Эктопия шейки матки, особенно в сочетании с вирусом папилломы человека (ВПЧ), имеет высокий риск исхода в рак шейки матки, потому что ВПЧ и его онкобелки подавляют защитные механизмы апоптоза – естественного (запрограммированного) отмирания старых и поврежденных клеток. На сегодняшний день неутешительно растет статистика развития рака шейки матки в молодом возрасте ( у женщин до 25-30 лет). Откладывая на будущее лечение патологии шейки матки, молодая женщина рискует столкнуться с тяжелыми осложнениями. Мы предлагаем самое современное лечение эрозии шейки матки, применение которого не вызывает отрицательных последствий, не препятствует наступлению в дальнейшем беременности и прохождению процесса родов.
При обнаружении эрозии обязательными исследованиями являются:
- исследование на ВПЧ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР),
- кольпоскопия,
- по показаниям — биопсия шейки матки,
- мазок на онкоцитологию*,
*В нашей Клинике появилась услуга по проведению высокоточной жидкостной онкоцитологии. Данная методика является новаторской и позволяет прицельно исследовать материал в жидкостной среде на наличие атипичных клеток.
Но это, к сожалению, не «абсолютный стандарт». Он не отражает всего масштаба поражения, если речь идет о папилломовирусной инфекции. А также не позволяет адекватно прогнозировать дальнейшие события в отношениях между эпителием шейки матки и ВПЧ.
Другие способы диагностики патологии
Специальные методы исследования эктопии шейки матки могут позволить определить вероятную степень интеграции вируса в геном клетки, решить спорные вопросы, когда при ПЦР ВПЧ не определяется, а на шейке матки несомненны грозные проявления предрака. Здесь на помощь могут прийти генетический, иммуногистохимический метод и другие.
Чем более точно проведена диагностика, тем правильнее будет принято решение по тактике лечения данного конкретного пациента.
Лечение эрозии (эктопии) шейки матки
План лечения эктопии шейки матки определяется группой риска, возрастом, планами и возможностями женщины. Выбор должен быть сделан между наблюдательной тактикой и лечением, срочность которого также зависит от конкретной ситуации и в первую очередь от степени инфицирования ВПЧ и риском развития рака шейки матки.
Лечение псевдоэрозии шейки матки с использованием ванночек, тампонов с мазями и маслами является псевдолечением!
Эти методы могут быть использованы как вспомогательные на определенном этапе. То же самое можно сказать и об иммунопрепаратах, например, в пред- и послеоперационном ведении. Это абсолютно необходимо. Кроме ВПЧ на несовершенный (метаплазированный) могут нападать другие инфекции: хламидии, микоплазмы, грибы и другие микроорганизмы. Некоторые из них лечатся быстро и эффективно, некоторые долго и мучительно. Таковы, например, хламидии. Коварство этой инфекции в том, что сам микроорганизм, поглощенный защитной клеткой нашего организма – фагоцитом, способен подавлять переваривания самого себя в фагоците (незавершенный фагоцитоз) и, таким образом, поддерживает свое существование.
Если начать хирургическое лечение эктопии шейки матки без предварительной подготовки, то вновь образованный после деструкции эпителий будет инфицирован и также неполноценен. Подготовка может быть в виде местного, общего лечения или их сочетания. То же можно сказать и о послеоперационном ведении. Оно обычно менее объемно, но достаточно активно, чтобы процесс заживления происходил удовлетворительно.
Единственным методом лечения псевдоэрозии шейки матки и родственных ей заболеваний является деструктивный метод. Суть его в разрушении измененного эпителия, который таит в себе угрозу рака шейки матки. Методы деструкции тканей могут быть разными: электрохирургический, радиоволновой, лазерный, химический (солковагин), с использованием жидкого азота (криодеструкция).
- Электроэксцизия («прижигание») – эффективный метод, однако сама процедура часто болезненна, после нее могут оставаться рубцы на шейке матки, возможно появление спаек в цервикальном канале, что приведет к бесплодию.
- Лазерное лечение – эффективный, щадящий и современный метод, с помощью которого лечатся незначительные эктопии. Данное лечение эрозии шейки матки может быть назначено нерожавшим женщинам.
- Радиоволновой метод – высокоэффективный и наиболее безопасный, а также минимально болезненный метод. С его помощью можно прижечь, а если потребуется — удалить участок шейки матки. После процедуры рубца не остается, можно планировать беременность через 1-2 месяца после операции.
- Химический метод (обработка кислотой) – самое щадящее и безболезненное лечение, которое используется обычно для избавления от незначительной эктопии шейки матки.
- Криодеструкция (замораживание азотом тканей) используется редко в связи с невозможностью контролировать участок заморозки эрозии, невысокой эффективностью и длительностью периода восстановления.
Каждый метод имеет свои показания и противопоказания, что определяется врачом. Врачом определяется также тип оперативного вмешательства, характер подготовки к нему и вид послеоперационного ведения для улучшения заживления раны и результатов операции.
Единственным противопоказанием к традиционному лечению шейки матки является диагностированный рак, а также состояния шейки матки, очень подозрительные на злокачественную опухоль. Опытный специалист всегда отличит такие процессы от доброкачественных и своевременно отправит женщину к онкологу. Рак шейки матки не является приговором, если диагностирован своевременно. В нашей Клинике имеются все условия для полного клинического обследования женщины. На консультации врач-гинеколог после осмотра и диагностических исследований индивидуально подберет подходящее лечение эктопии шейки матки.
Метапластический столбчатый эпителий пищевода без бокаловидных клеток демонстрирует аномалии содержания ДНК, аналогичные бокаловидным клеткам — содержащим эпителий
ВВЕДЕНИЕ
Столбчатая метаплазия пищевода является осложнением гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ацидоза пищевода) и представляет собой основную преждевременную болезнь пищевода. Заболеваемость аденокарциномой пищевода в последние несколько десятилетий растет тревожными темпами (2). Первоначальный диагноз пищевода с столбчатой оболочкой обычно устанавливается при эндоскопии, но окончательный «окончательный» диагноз подтверждается гистологическим исследованием биопсийной ткани.В настоящее время Американский колледж гастроэнтерологии (ACG) определяет пищевод Барретта (BE) как состояние, которое демонстрирует эндоскопические доказательства столбчатой метаплазии пищевода и при котором бокаловидные клетки идентифицируются в биопсийной ткани (3,4). Однако включение бокаловидных клеток в качестве необходимого критерия БЭ является спорным (5).
Слизистая оболочка пищевода, выстланного столбчатыми стенками, состоит из нескольких типов метапластического эпителия (6). Железистый компартмент состоит из слизистых желез или кислородных желез, или их комбинации.Поверхностный и ямочный эпителий обычно состоит из муцинозных столбчатых клеток с бокаловидными клетками или без них. Обычно предполагается, что только цилиндрический эпителий с бокаловидными клетками подвержен риску злокачественного новообразования, и, как следствие, бокаловидные клетки необходимы для определения БЭ и являются показанием для эндоскопического наблюдения за пораженными пациентами (3). Однако мало что известно о биологических свойствах и неопластическом потенциале не бокаловидного столбчатого эпителия у пациентов с столбчатой метаплазией пищевода (3).Клинические и эпидемиологические исследования часто используются для подтверждения того факта, что столбчатая слизистая оболочка с бокаловидными клетками является основным предшественником аденокарциномы (3). Например, обнаружение столбчатой слизистой оболочки с бокаловидными клетками у пациентов, прогрессирующих до аденокарциномы, и обнаружение столбчатой слизистой оболочки с бокаловидными клетками в ассоциации с аденокарциномой в образцах после резекции — это признаки, которые подтверждают мнение о том, что бокаловидные клетки являются предраковым поражением (3). , 7). Тем не менее, недавние исследования показывают, что столбчатая слизистая оболочка без бокаловидных клеток фенотипически интестинализирована и демонстрирует хромосомные аномалии (8,9).Фактически, два недавних исследования показывают, что пациенты с цилиндрической слизистой оболочкой пищевода без бокаловидных клеток имеют такой же риск неопластического прогрессирования, что и пациенты со столбчатой слизистой оболочкой с бокаловидными клетками (10,11).
Хорошо известно, что хромосомная и генетическая нестабильность является основным фактором патогенеза аденокарциномы пищевода (12-15). Хромосомные аномалии включают в себя как прирост, так и потерю либо частей, либо целых хромосом, оба из которых приводят к изменению нормального диплоидного числа хромосом в каждой пораженной клетке.Хромосомные аномалии могут возникать на ранней стадии прогрессирования неоплазии и, как было показано, увеличиваются с прогрессированием заболевания (16). Кроме того, было показано, что хромосомные аномалии и анеуплоидия являются важными маркерами неопластического прогрессирования аденокарциномы, ассоциированной с БЭ (12,15).
Нарушения содержания хромосомной ДНК в клетках могут быть измерены с помощью гистограмм ДНК, которые отображают содержание ДНК в клетках на различных фазах клеточного цикла. Нормальная гистограмма ДНК клеток в интерфазе показывает, что большинство клеток находятся в фазе G0 / G1.Содержание ДНК в этих клетках образует диплоидный пик, и клетки содержат ДНК, равную двум копиям хромосом (2 N ), и демонстрируют небольшую вариабельность в содержании ДНК. В нормальных условиях очень мало клеток идентифицируется в фазах S и G2 клеточного цикла. Клетки в фазе G2 содержат ДНК, равную четырем копиям нормальных хромосом. Хромосомные изменения при неоплазии включают пики G0 / G1, которые отклоняются от нормального диплоидного положения и, как таковые, определяются как анеуплоид (17).Поскольку большие потери хромосом часто приводят к летальному исходу для клеток, жизнеспособные клетки обычно демонстрируют анеуплоидию с приростом ДНК (14). Неопластические клетки также демонстрируют повышенную гетерогенность клеточной ДНК в дополнение к анеуплоидии (16,18).
Предыдущие исследования показали, что столбчатая слизистая оболочка с бокаловидными клетками выявляет анеуплоидные пики G0 / G1 и / или повышенное содержание клеток G2 (4 N ) примерно в 10% случаев на основе стандартной проточной цитометрии (12). Однако исследования с использованием более чувствительной техники анализа содержания ДНК, такой как высокоточный анализ гистограмм ДНК с помощью цитометрии изображений на срезах ткани, выявили умеренные пики анеуплоидов G0 / G1 более чем в 50% случаев (16).Гистограммы ДНК с высокой точностью отслеживают содержание ДНК каждой клетки в гистограмме и, таким образом, предоставляют более чувствительную информацию о состоянии клеток на всех фазах клеточного цикла по сравнению с проточной цитометрией (18).
Информация о нарушениях содержания ДНК может также предоставить информацию о неопластическом потенциале эпителия (12,15). К сожалению, статус содержания ДНК в метапластическом цилиндрическом эпителии пищевода без бокаловидных клеток в настоящее время неизвестен. Таким образом, цель этого исследования состояла в том, чтобы определить, имеет ли столбчатая слизистая оболочка без бокаловидных клеток в метапластическом столбчатом эпителии пищевода, как определено с помощью эндоскопии, аномалии содержания ДНК, указывающие на хромосомную нестабильность.
МЕТОДЫ
Исследовательские группы
Все пациенты, включенные в это исследование, представляют собой избранные случаи столбчатого пищевода с бокаловидными клетками или без них, обнаруженные ретроспективным поиском файлов патологии Бригама и женской больницы в период с 1995 по 2005 год. У всех пациентов была эндоскопически подтвержденная столбчатая метаплазия дистального отдела пищевода и была проведена четырехквадрантная биопсия этой патологической слизистой оболочки. Всего обследовано 68 пациентов с столбчатой метаплазией пищевода.Из этих 68 пациентов у 22 выявлена столбчатая метаплазия дистального отдела пищевода без бокаловидных клеток. У этих пациентов были короткие сегменты столбчатой метаплазии пищевода (<3 см). Из 46 оставшихся пациентов с бокаловидными клетками, идентифицированными в одной или нескольких их биопсиях, у 17 были признаны бокаловидные клетки низкой плотности на основании того факта, что у них бокаловидные клетки присутствовали менее чем в 50% крипт, у 15 - высокий - бокаловидные клетки плотности из-за того, что бокаловидные клетки были идентифицированы более чем в 50%, но менее чем в 100% крипт, а 14 были определены как содержащие бокаловидные клетки очень высокой плотности на основании того факта, что бокаловидные клетки были идентифицированы в каждом крипта из всех биоптатов.
Все пациенты с бокаловидными клетками имели длинные сегменты столбчатой метаплазии (> 3 см). В качестве контроля использовали 19 биоптатов нормальной слизистой оболочки желудка (19 пациентов). В целом, в этом исследовании были проанализированы 119 биопсий слизистой оболочки 68 исследуемых пациентов и 19 биопсий слизистой оболочки 19 контрольных пациентов. Кроме того, для 32 пациентов с столбчатой метаплазией бокаловидных клеток были выполнены два отдельных анализа. Один был проведен на участках столбчатой слизистой оболочки без бокаловидных клеток, а другой — на участках столбчатой слизистой оболочки с бокаловидными клетками у тех же пациентов.Было проведено сравнение аномалий содержания ДНК между различными исследуемыми группами и контрольной группой, а также между эпителием, содержащим не бокаловидные и бокаловидные клетки, у пациентов с столбчатой метаплазией бокаловидных клеток. Протокол для высокоточных гистограмм ДНК с помощью цитометрии изображений и срезов тканей был одобрен экспертными советами VA Boston Healthcare System и Brigham and Women’s Hospital, Бостон, Массачусетс.
Гистологические методы
Для всех биопсий из фиксированных формалином блоков ткани были вырезаны два смежных тканевых среза, один толщиной 5 мкм и другой 7 мкм.Срезы ткани толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического анализа. Срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивали под микроскопом на наличие или отсутствие и степень бокаловидных клеток. Ни у одного из пациентов не было дисплазии, острого воспаления или изъязвления. После гистологической оценки части биоптатов, которые должны быть оценены с помощью цитометрии изображений ДНК, были обведены кружком на слайде и отправлены другому участнику исследования для анализа изображений.
Цитометрия изображений и получение гистограмм ДНК с высокой точностью
Срезы тканей толщиной 7 мкм были окрашены красителем Фельгена для цитометрии изображений ДНК.Гистограммы ДНК с высокой точностью были созданы с помощью автоматизированной системы визуализации клеток (ACIS; Clarient, Сан-Хуан-Капистрано, Калифорния). Техника цитометрии изображений, используемая для получения гистограмм ДНК с высокой точностью, была подробно описана в другом месте (16,18,19). Вкратце, слайды, окрашенные по Фельгену, сканировали автоматически. Включены только однородно окрашенные слайды. Ежедневный контроль качества проводился с использованием стандартного калибровочного набора от производителя. Гистологическая область интереса была идентифицирована микроскопически и выбрана для исследования.Срезы были исследованы слепым способом без ведома исследовательской группы, из которой был взят образец биопсии. Для каждой биопсии для анализа отбирали не менее 50 контрольных стромальных клеток и 200 целевых эпителиальных клеток. Все изображения клеток были оцифрованы и сохранены в системе ACIS. Цифровые изображения всех ядер затем преобразуются в серию пикселей, которые количественно оцениваются для получения значения интегрированной оптической плотности (IOD). IOD представляет содержание ДНК клетки.Коэффициент вариации ИОД контрольных стромальных клеток был менее 6%. Затем средней IOD контрольных стромальных клеток присваивается значение индекса ДНК (DI), равное 1, которое служит внутренним диплоидным стандартом для расчетов DI эпителиальных клеток-мишеней. Значение DI, равное 1, соответствует 2 N ( N представляет количество копий хромосом). Затем гистограммы ДНК генерируются системой ACIS, которая показывает графики различных значений DI в зависимости от количества клеток с этим конкретным значением DI.Гистограмма представляет клетки в разных фазах клеточного цикла. В нормальной ткани подавляющее большинство клеток находится в фазе G0 / G1. Лишь несколько клеток присутствуют в фазах S и G2 клеточного цикла.
На основании значений DI пики G0 / G1 считались либо диплоидными (DI = 0,9–1,1), либо анеуплоидными (DI> 1,1), как описано ранее. Далее анеуплоидия была разделена на легкую (DI = 1,1–1,3), среднюю (DI = 1,3–1,8) и тяжелую (DI = 1,8). Индекс гетерогенности (HI) определяли как количество кластеров клеток с IOD равным 0.3 интервала на гистограммах, и они отображались в виде разных столбцов или полос на гистограммах. Значения HI менее 13 считались нормальными, 14–20 — умеренно повышенными, а> 20 — сильно повышенными (16,19,20). Также были отмечены гистограммы, которые выявили клетки с содержанием DI более 5 N (5 N превышающих клетки (5 N -EC)). 5 N -EC представляет клетки с содержанием ДНК> G2.
Статистический анализ
Все значения представлены как среднее ± s.d. Статистическое сравнение результатов содержания ДНК проводили с использованием парного или непарного t -теста. Значение P <0,05 считалось статистически значимым.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Содержание ДНК в нормальной слизистой оболочке желудка
Среднее значение DI, процент случаев анеуплоидии, средний HI, процент случаев с повышенным HI и процент случаев с 5 N -EC из 19 контрольных образцов резюмируются в. Средний DI составил 1,02, а средний HI — 11.6. Ни один из контролей не показал анеуплоидии, повышенного HI или клеток с 5 N -EC. Верхние пороговые значения для DI (пик G0 / G1), равного 1,1, и HI, равного 13, находятся в пределах нормального диапазона, о котором ранее сообщалось для нормального желудочно-кишечного эпителия.
Таблица 1
Содержание клеточной ДНК у пациентов с столбчатой метаплазией с бокаловидными клетками
| Группы пациентов | Число образцов | Среднее значение DI (среднее ± стандартное отклонение) | Анеуплоидия a (%) | Среднее значение HI (среднее ± с.г.) | Повышенный HI b (%) | 5 N -EC (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| NGM | 19 | 1,02 ± 0,03 | 0 | 11,6 ± 0,7 | 0 | 0 |
| CM-WVHDG | 14 | 1,14 ± 0,15 | 50 | 17,6 ± 1,7 | 14 (100) | 1/14 (7) |
| CM-WHDG | 15 | 1,18 ± 0,12 | 60 | 18,9 ± 2.0 | 15 (100) | 3/15 (20) |
| CM-WLDG | 17 | 1,12 ± 0,10 | 53 | 18,1 ± 2,4 | 17 (100) | 3/17 ( 17) |
| Все CM-WG | 46 | 1,15 ± 0,12 | 54 | 18,2 ± 2,1 | 46 (100) | 7/46 (15) |
Содержание ДНК всех пациентов с метапластическим столбчатым эпителием
суммирует значения содержания ДНК в контроле, пациентах с столбчатой слизистой оболочкой без бокаловидных клеток и пациентами со столбчатой слизистой оболочкой с бокаловидными клетками (последняя включает все три подгруппы плотности бокаловидных клеток).В целом, во всех случаях столбчатой слизистой оболочки, как с бокаловидными клетками, так и без них (100 образцов), среднее значение ± стандартное отклонение. величина пиков G0 / G1 составила 1,12 ± 0,13. Средний HI составил 18 ± 2,56. Оба эти значения были значительно выше, чем в контроле ( P = 0,0053 и 0,001, соответственно). Кроме того, у 52% всех пациентов с столбчатой метаплазией был анеуплоидный пик. Из пациентов с анеуплоидными пиками у большинства (94%) наблюдалась легкая анеуплоидия, а у 6% — умеренная анеуплоидия. Ни в одной группе пациентов не было выявлено тяжелой анеуплоидии.HI был повышен у 98% пациентов с столбчатой метаплазией. В целом, 13% пациентов показали значения HI больше 20. Кроме того, 14% пациентов с столбчатой метаплазией показали клетки с 5 N -EC. В целом, 3% гистограмм показали более одной ячейки с 5 N -EC на гистограмме.
Содержание клеточной ДНК в нормальной слизистой оболочке желудка (NGM), все случаи столбчатой метаплазии (все CM), случаи с бокаловидными клетками (CM-WG) и случаи столбчатой метаплазии без бокаловидных клеток (CM-WOG).Столбики представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. ( a — d ) Значения индекса ДНК (DI) пиков фазы G0 / G1, индекса гетерогенности (HI), уровня анеуплоидии и процента клеток с DI> 5 N соответственно ( a, b ). Пиковые значения DI и HI были значительно повышены во всех группах столбчатой метаплазии по сравнению с нормальной слизистой оболочкой желудка ( P <0,05), но эти значения не различались между группами столбчатой метаплазии ( † P > 0.05). ( c ) Уровень анеуплоидии равен 0 при NGM и приблизительно 50% в случаях столбчатой метаплазии. ( d ) Нормальная слизистая оболочка желудка не содержала клеток с DI> 5 N . Однако почти 15% гистограмм в группах столбчатой метаплазии имели хотя бы одну ячейку с DI> 5 N .
Не было значительных различий ни в одном из параметров содержания ДНК между всеми пациентами с метапластическим столбчатым эпителием с бокаловидными клетками и пациентами без бокаловидных клеток ().Однако обе эти группы показали значительно более высокие параметры содержания ДНК по сравнению с контролем. В целом, 50% случаев бокаловидных клеток были анеуплоидными и 15% содержали клетки с 5 N -EC. Пациенты с бокаловидными клетками показали средний DI 1,15 ± 0,12 и средний HI 18,2 ± 2,1. Средний DI и средний HI пациентов с метапластическим столбчатым эпителием без бокаловидных клеток составляли 1,1 ± 0,13 и 17,8 ± 2,9 соответственно. Из пациентов без бокаловидных клеток у 50% наблюдалась анеуплоидия, а у 9% были клетки с 5 N -EC, которые, как упоминалось выше, были аналогичны пациентам с бокаловидными клетками.
показывает репрезентативные гистограммы ДНК трех пациентов: у одного столбчатая слизистая оболочка с бокаловидными клетками, у одного столбчатая слизистая оболочка без бокаловидных клеток и у одного нормальная слизистая оболочка желудка. Обратите внимание, что нормальная слизистая оболочка желудка показывает диплоидный (DI <1,1) пик G0 / G1, HI, равный 13, и отсутствие клеток с DI> 5 N . Гистограмма пациента со столбчатой слизистой оболочкой с бокаловидными клетками показывает пик анеуплоида G0 / G1 (DI = 1,24), повышенный HI, равный 20, увеличение клеток в S-фазе и одну клетку с DI> 5 N .Гистограмма ДНК пациента со столбчатой слизистой оболочкой без бокаловидных клеток также показывает аналогичные отклонения, в том числе пик анеуплоида G0 / G1 (DI = 1,20), HI 23, увеличение клеток S-фазы и одну клетку с DI> 5 N .
Репрезентативные гистограммы ДНК трех отдельных пациентов. ( a ) нормальная слизистая оболочка желудка, ( b ) столбчатая метаплазия без бокаловидных клеток и ( c ) столбчатая метаплазия с бокаловидными клетками. Обратите внимание, что гистограммы ДНК столбчатой слизистой оболочки с бокаловидными клетками или без них показали аналогичные аномалии, включая пики анеуплоидных G0 / G1, повышенный индекс гетерогенности (HI), увеличение клеток в S-фазе и случайные клетки с индексом ДНК (DI)> 5 N .
Содержание ДНК пациентов с столбчатой метаплазией с бокаловидными клетками
Значения содержания ДНК у пациентов с столбчатой метаплазией с бокаловидными клетками суммированы в. Кроме того, для сравнения включены значения нормального желудочного контроля. В целом, средний DI составил 1,15 ± 0,12, а средний HI — 18,2 ± 2,1. Всего у 54% пациентов была обнаружена анеуплоидия, у 100% — повышенный HI, а у 15% — клетки с 5 N -EC. Все эти значения были значительно выше, чем в контроле.также выявляет параметры содержания ДНК пациентов с метапластическим столбчатым эпителием с бокаловидными клетками, оцененными по плотности бокаловидных клеток (т.е. очень высокая плотность, высокая плотность и низкая плотность). В целом, не было значительных различий в среднем DI, среднем HI, частоте анеуплоидии, частоте повышенного HI или фракции 5 N -EC между пациентами с бокаловидными клетками очень высокой плотности и пациентами с бокаловидными клетками высокой плотности. по сравнению с бокаловидными клетками низкой плотности.Однако каждая из этих групп независимо показала значительно более высокие значения по сравнению с контролем.
Содержание ДНК в метапластическом столбчатом эпителии без бокаловидных клеток, от пациентов с бокаловидными клетками или без них
суммирует значения содержания ДНК в столбчатом эпителии без бокаловидных клеток у пациентов без бокаловидных клеток в другом месте пищевода, а также показывает содержание ДНК значения для не бокаловидных частей столбчатого эпителия у пациентов с бокаловидными клетками низкой или высокой плотности в другом месте пищевода.Некубаковидный столбчатый эпителий пациентов с бокаловидными клетками очень высокой плотности не мог быть оценен, поскольку все крипты в этих случаях содержали бокаловидные клетки. Средний DI и средний HI внекубочного эпителия пациентов с столбчатой метаплазией, но без бокаловидных клеток, составили 1,13 ± 0,16 и 18,4 ± 3,3 соответственно. В целом, 64 и 100% этих случаев показали анеуплоидию и повышенный HI соответственно. Только 18% показали повышенную фракцию 5 N -EC. Все эти значения были значительно выше, чем у контрольных животных.В целом, параметры содержания ДНК были статистически схожими в не бокаловидном эпителии пациентов с бокаловидными клетками низкой плотности по сравнению с пациентами с бокаловидными клетками высокой плотности. Кроме того, внекубочный эпителий пациентов с бокаловидными клетками низкой или высокой плотности был статистически подобен внекубковому эпителию пациентов с столбчатой метаплазией, но без бокаловидных клеток.
Таблица 2
Содержание клеточной ДНК в метапластическом столбчатом эпителии без бокаловидных клеток
| Группы пациентов | No.образцов | Среднее значение DI (среднее ± стандартное отклонение) | Анеуплоидия a (%) | Среднее значение HI (среднее ± стандартное отклонение) | Повышенное значение HI b (%) | 5 N -EC (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| NGM | 19 | 1,02 ± 0,03 | 0 | 11,6 ± 0,7 | 0 | 0 |
| CM-WOG | 22 | 1,13 ± 0,16 | 64 | ± 3,322 (100) | 4/22 (18) | |
| CM-WOG у пациентов с CM-WLDG | 17 | 1.09 ± 0,10 | 41 | 17,3 ± 1,8 | 17 (100) | 1/17 (6) |
| CM-WOG у пациентов с CM-WHDG | 15 | 1,09 ± 0,12 | 40 | 17,5 ± 3,2 | 14 (93) | 2/15 (13) |
| Все CM-WOG | 54 | 1,10 ± 0,13 | 50 | 17,8 ± 2,9 | 53 (98) | 7/54 (13) |
Содержание ДНК в не бокаловидном и бокаловидном эпителии пациентов с столбчатой метаплазией бокаловидными клетками
суммирует значения содержания ДНК в негубковом и бокаловидном эпителии.эпителий, содержащий бокаловидные клетки, только у пациентов с метапластическим цилиндрическим эпителием с бокаловидными клетками в другом месте пищевода. Среди пациентов с метапластическим столбчатым эпителием с бокаловидными клетками были проведены отдельные сравнения для групп с бокаловидными клетками низкой и высокой плотности. В целом, средний DI и средний HI участков эпителия, содержащих бокаловидные клетки, составили 1,15 ± 0,12 и 18,2 ± 2,1 соответственно. В целом, 54 и 100% случаев показали анеуплоидию и повышенный HI, соответственно, и 15% показали 5 популяций клеток N -EC.Эти значения были статистически подобны среднему DI, среднему HI, проценту анеуплоидии, проценту HI и фракциям 5 N -EC в не содержащих кубок участках эпителия тех же пациентов.
Таблица 3
Небокальный эпителий по сравнению с бокаловидным эпителием у пациентов с столбчатой метаплазией с бокаловидными клетками
| Группы пациентов | Число образцов | Среднее значение DI (среднее ± стандартное отклонение) | Анеуплоидия a ( %) | Среднее значение HI (среднее ± с.d.) | Повышенный HI b (%) | 5 N -EC (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| NGM | 19 | 1,02 ± 0,03 | 0 | 11,6 ± 0,7 | ||
| CM-WLDG в пищеводе | ||||||
| Небокальный эпителий | 17 | 1,09 ± 0,12 | 41 | 9001 ± 1,83100 | 1/17 (6) | |
| Боковой клеточный эпителий | 17 | 1,12 ± 0,10 | 53 | 18,1 ± 2,44 | 100 | 3/17 (18) |
| CM-WHDG в пищеводе | ||||||
| Небокальный эпителий | 15 | 1,09 ± 0,12 | 40 | 2/15 (13) | ||
| Эпителий бокаловидных клеток | 15 | 1.18 ± 0,12 | 60 | 18,9 ± 2,05 | 100 | 3/15 (20) |
| Полностью столбчатая метаплазия | ||||||
| Без бокала эпителий | 54 | 1,10 ± 0,13 | 50 | 17,8 ± 2,9 | 98 | 7/54 (13) |
| Эпителий бокаловидных клеток | 46 | 1,15 ± 0,12 | 54 | 18.2 ± 2,1 | 100 | 7/46 (15) |
Аналогичным образом, значения содержания ДНК в не бокаловидном эпителии по сравнению с эпителием, содержащим бокаловидные клетки, у пациентов с бокаловидными клетками низкой плотности были статистически похожи. Однако при сравнении участков эпителия, не содержащих бокаловидные клетки, по сравнению с участками эпителия, содержащими бокаловидные клетки, у пациентов с высокой плотностью бокаловидных клеток было отмечено существенное различие в среднем значении DI.Области эпителия с высокой плотностью бокаловидных клеток показали средний DI 1,18 ± 0,12 по сравнению с 1,09 ± 0,12 в частях эпителия, не содержащих бокалов, от тех же пациентов ( P = 0,035). Тем не менее, все остальные параметры содержания ДНК были статистически схожими между этими двумя типами эпителия у одних и тех же пациентов.
ОБСУЖДЕНИЕ
Мало что известно о биологических свойствах фонового не бокаловидного столбчатого эпителия у пациентов с БЭ, несмотря на то, что этот эпителий составляет большую часть популяции клеток у пациентов с этим заболеванием.Учитывая, что несколько недавних исследований предполагают, что риск неопластического прогрессирования у пациентов с столбчатой метаплазией пищевода аналогичен у пациентов с бокаловидными клетками или без них, мы провели это исследование для оценки содержания ДНК в негубковом эпителии (10,11, 21). Наши результаты показали, что метапластический столбчатый эпителий пищевода с бокаловидными клетками показывает частые, хотя и ранние, аномалии содержания ДНК, включая присутствие пиков анеуплоидных G0 / G1, повышенную гетерогенность содержания клеточной ДНК и появление клеток с повышенным содержанием 5 N -EC.Мы не обнаружили различий в наличии или степени нарушений содержания ДНК у пациентов с метапластическим столбчатым эпителием с бокаловидными клетками, стратифицированными в соответствии с плотностью бокаловидных клеток. Наконец, что наиболее важно, мы отметили, что пациенты с метапластическим столбчатым эпителием без бокаловидных клеток (часто называемых слизистой оболочкой кардиевого типа) (6,22) также часто демонстрируют аномалии содержания ДНК, аналогичные по типу и степени у пациентов с бокаловидными клетками. (часто называемая специализированной кишечной метаплазией, характерной для БЭ) (6,23).
Метапластический столбчатый эпителий с бокаловидными клетками показал значительно повышенный средний DI, и почти в 50% случаев наблюдалась легкая анеуплоидия. Частота анеуплоидных пиков в случаях в нашем исследовании выше, чем ранее сообщалось в исследованиях, которые оценивали содержание ДНК с помощью проточной цитометрии (12). Это также выше, чем в предыдущих исследованиях, в которых оценивалось содержание ДНК с помощью систем ранней производственной цитометрии изображений (15,24). Различия в результатах, вероятно, связаны с высокой степенью чувствительности цитометрии изображений при обнаружении анеуплоидии с помощью высокоточных гистограмм ДНК, а также с усовершенствованиями аппаратного и программного обеспечения в недавно улучшенных системах цитометрии изображений.Тем не менее, высокая частота анеуплоидии ДНК, обнаруженная в метапластическом столбчатом эпителии бокаловидными клетками в нашем исследовании, сопоставима с результатами, полученными при сравнительной геномной гибридизации, которая ранее показывала высокую скорость прироста хромосомных фрагментов и числа копий у пациентов с БЭ. (25). Например, Чавес и др. . (9) обнаружили хромосомные аномалии у двух третей пациентов с БЭ, последнее определялось наличием бокаловидных клеток в биоптатах слизистой оболочки пищевода.Кроме того, трисомия 7 и 18 и потеря Y были обнаружены в 40% случаев. Структурные изменения были обнаружены в одной трети случаев с повторяющимися точками разрыва в 1Q21, 15Q15 и 15Q22.
В дополнение к высокому уровню распространенности пиков анеуплоидных G0 / G1, мы также продемонстрировали, что почти все случаи метапластического столбчатого эпителия бокаловидными клетками демонстрируют повышенную гетерогенность клеточной ДНК с помощью анализа гистограмм ДНК с высокой точностью. Этот вывод аналогичен предыдущим отчетам (16,19).Фактически, повышенная гетерогенность клеточной ДНК может быть результатом увеличения количества клеток в фазах S / G2 клеточного цикла из-за повышенной клеточной пролиферации, или это может быть связано с появлением вновь образованных неопластических клонов (17). Кроме того, наличие клеток с 5 N -EC нельзя объяснить увеличением пролиферации клеток (26).
Мы показали, что 15% случаев метапластического столбчатого эпителия с бокаловидными клетками содержали DI> 5 N (5 N -EC).Присутствие клеток с DI> 5 N в интерфазных ядрах всегда считается ненормальным. Эти клетки могут представлять собой анеуплоидные клетки в фазах S или G2 клеточного цикла, сильно анеуплоидные клетки в фазе G0 / G1, диплоидные клетки во второй фазе S, присоединяющиеся к эндорепликации, или продукт диплоидных клеток с несбалансированной анафазой, включая G2 фаза большего сегмента и вторая фаза S меньшего сегмента. Таким образом, клетки с DI> 5 N , скорее всего, представляют собой аномальные клетки с неопластическим потенциалом (17).Предыдущие исследования рака груди показали, что клетки с содержанием ДНК за пределами пика G0 / G1, также известного как индекс рассеяния, могут быть маркером повышенной хромосомной нестабильности и плохого клинического исхода (27). Фактически, предыдущие молекулярные исследования БЭ показали анеуплоидию и хромосомную нестабильность, характеризующуюся аномалиями в генах и белках клеточного цикла P53, P16 и P21 (28-30).
Наше исследование впервые продемонстрировало, что метапластический столбчатый эпителий без бокаловидных клеток связан с частыми нарушениями содержания ДНК.Например, почти в 50% случаев метапластического столбчатого эпителия без бокаловидных клеток наблюдается умеренный пик анеуплоида G0 / G1, и в большинстве этих случаев также наблюдается повышенная гетерогенность содержания клеточной ДНК. Кроме того, 13% показали клетки с DI> 5 N (5 N -EC). Эти аномалии присутствовали у пациентов с метапластическим цилиндрическим эпителием без бокаловидных клеток, а также присутствовали в не бокаловидном эпителии пациентов с метапластическим цилиндрическим эпителием с бокаловидными клетками.Фактически, аномалии содержания ДНК в не бокаловидном эпителии были аналогичны наблюдаемым в бокаловидном эпителии у пациентов с метапластическим цилиндрическим эпителием с бокаловидными клетками. Romagnoli и др. . (31) также показали молекулярные изменения, такие как потеря гетерозиготности и аллельный дисбаланс, у пациентов с метапластическим столбчатым эпителием без бокаловидных клеток. Кроме того, Chaves et al . (9) сообщили о сходной степени хромосомной нестабильности в метапластическом столбчатом эпителии без бокаловидных клеток по сравнению с метапластическим столбчатым эпителием с бокаловидными клетками.
Еще одним интересным открытием нашего исследования является то, что анеуплоидия является ранним событием столбчатой метаплазии пищевода, поскольку она присутствует как в бокаловидном, так и в бокаловидном эпителии с одинаковой частотой. Сообщалось о прогрессирующей скорости ухудшения анеуплоидии с прогрессированием дисплазии и аденокарциномы при БЭ (12,16). Таким образом, высокая распространенность ранней анеуплоидии при столбчатой метаплазии пищевода может служить моделью для дальнейшего исследования генеза анеуплоидии в этом состоянии.
Взаимосвязь между эпителием, содержащим не бокаловидные и бокаловидные клетки, у пациентов с цилиндрической метаплазией пищевода изучена недостаточно. Было высказано предположение, что некубково-столбчатая метаплазия может быть начальной реакцией на гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь (21,32). Кроме того, исследования показали, что не бокаловидный столбчатый эпителий у пациентов с БЭ демонстрирует фенотипические особенности кишечной дифференцировки, такие как экспрессия CDX-2, виллина, MUC-2 и DAS-1, которые представляют собой либо белок, либо факторы транскрипции, специфичные для кишечного эпителия (8,33).Эти данные предполагают, что не бокаловидный и бокаловидный клеточный эпителий могут иметь общий клеточный клон, и что метапластический эпителий без бокаловидных клеток и с бокаловидными клетками может просто представлять разные концы спектра кишечной дифференцировки.
Наши результаты, в том числе и другие, показывают, что метапластический столбчатый эпителий без бокаловидных клеток демонстрирует дифференцировку кишечника, содержание ДНК и молекулярные аномалии, которые повышают вероятность того, что этот негубковый эпителий имеет неопластический потенциал, аналогичный кубковидному метапластическому столбчатому эпителию.Таким образом, эти данные имеют важное клиническое значение. Один касается текущих разногласий относительно определения БЭ (34). Например, группа экспертов ACG указала на необходимость гистологической демонстрации бокаловидных клеток в пищеводе («специализированная кишечная метаплазия») для установления диагноза БЭ и ограничила эндоскопическое наблюдение пациентами только с последним обнаружением (3 ). Напротив, Британское общество гастроэнтерологов распространяет диагноз БЭ на всех пациентов с столбчатой метаплазией пищевода, в том числе без бокаловидных клеток (5).Наши исследования, а также некоторые другие, подтверждают мнение о том, что цилиндрическая слизистая оболочка без бокаловидных клеток или слизистой оболочки «кардиевого типа» является метапластической и может иметь неопластический потенциал и, таким образом, должна быть включена в определение БЭ. Определение БЭ имеет не только академический / семантический интерес, так как оно имеет важные последствия в отношении экономических последствий эндоскопического наблюдения, медицинского страхования и затрат, а также медицинских судебных разбирательств (35). Интересно, что неофициальная информация предполагает, что бокаловидные клетки уменьшаются или полностью отсутствуют при неопластической прогрессии при БЭ.Более того, в редких случаях аденокарциномы, особенно в области пищеводно-пищеводного перехода, могут развиваться на слизистой оболочке без каких-либо признаков метаплазии бокаловидных клеток. Эти выводы дополнительно подтверждаются сообщениями о развитии дисплазии или аденокарциномы у пациентов с метапластическим цилиндрическим эпителием пищевода независимо от наличия или отсутствия бокаловидных клеток (10,11,21). Возможно, что неопластические поражения, которые развиваются в метапластическом столбчатом эпителии без бокаловидных клеток, могут прогрессировать по другому биологическому или молекулярному пути, чем рак, развивающийся в метапластическом эпителии с бокаловидными клетками (31).Необходимы дальнейшие исследования для проверки этой гипотезы и определения риска неоплазии у пациентов с бокаловидно-клеточной метаплазией и без нее.
Еще одно важное клиническое значение наших результатов связано с тем фактом, что мы обнаружили аномалии содержания ДНК в не бокаловидном эпителии даже у пациентов с очень короткими сегментами столбчатой метаплазии пищевода, у некоторых из которых была незначительно смещенная (нерегулярная) линия «Z». . Это относительно частая находка у пациентов с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью и, таким образом, предполагает, что аномалии ДНК возникают довольно рано в патогенезе цилиндрической метаплазии пищевода.Ясно, что важность этого открытия и риск неопластического прогрессирования в этой подгруппе пациентов должны быть оценены в дальнейших, желательно проспективных исследованиях.
Таким образом, мы показали, что аномалии содержания ДНК встречаются с одинаковой частотой и степенью в метапластическом столбчатом эпителии без бокаловидных клеток по сравнению с метапластическим цилиндрическим эпителием с бокаловидными клетками. Кроме того, изменения ДНК не изменяются в зависимости от плотности бокаловидных клеток у пациентов с бокаловидными клетками.Эти данные позволяют предположить, что цилиндрический эпителий без бокала пищевода может иметь неопластический потенциал. Необходимо провести дальнейшие исследования для определения естественного течения болезни и риска злокачественных новообразований у пациентов с столбчатой метаплазией пищевода с бокаловидными клетками или без них.
Основные моменты исследования
ЧТО ТАКОЕ НАСТОЯЩИЕ ЗНАНИЯ
Пищевод Барретта определяется наличием метапластического столбчатого эпителия с бокаловидными клетками в дистальном отделе пищевода.
Обычно предполагается, что только столбчатый эпителий с бокаловидными клетками подвержен риску злокачественного новообразования.
Хромосомная и генетическая нестабильность является основным фактором патогенеза аденокарциномы Барретта.
Мало что известно о биологических свойствах не бокаловидного столбчатого эпителия у пациентов с пищеводом Барретта.
ЧТО ЗДЕСЬ НОВОГО
Используя анализ изображений и гистограммы высокой точности, мы показали, что аномалии содержания ДНК возникают с одинаковой частотой и степенью в метапластическом столбчатом эпителии без бокаловидных клеток, по сравнению с столбчатым эпителием с бокаловидные клетки.
Изменения ДНК не меняются в зависимости от плотности бокаловидных клеток у пациентов с пищеводом Барретта.
На основании этих выводов, не бокаловидный столбчатый эпителий пищевода может иметь неопластический потенциал и требует дальнейшего изучения.
Специализированный метапластический столбчатый эпителий пищевода Барретта. Сравнительное просвечивающее электронно-микроскопическое исследование
Пищевод Барретта развивается как осложнение регургитирующего эзофагита и предрасполагает пациентов к развитию дисплазии и аденокарциномы пищевода.Предыдущие ультраструктурные исследования показали, что эпителий Барретта представляет собой секреторный эпителий слизистой, который имеет некоторые морфологические особенности кишечника. Происхождение и развитие эпителия Барретта, а также клеточные аномалии, сопровождающие его неопластическое прогрессирование, плохо изучены. В попытке лучше понять гистогенез клеток, продуцирующих слизь, которые преобладают в эпителии Барретта, эти клетки были изучены с помощью просвечивающей электронной микроскопии и сравнены с другими эпителиями верхних отделов желудочно-кишечного тракта: пищеводными железами, нормальной поверхностью желудка, ямками и областями сердечных желез, желудочно-кишечная метаплазия и нормальные области кончика ворсинок и крипт тощей кишки.Было изучено 134 биопсии слизистой оболочки желудка и пищевода 28 пациентов с пищеводом Барретта и 37 биопсий 14 других контрольных пациентов. Специализированные метапластические поверхностные клетки Барретта демонстрируют спектр ультраструктурных особенностей среди трех основных типов поверхностных столбчатых эпителиальных клеток: слизистые клетки, напоминающие те, которые наблюдаются в нормальном поверхностном эпителии желудка, или клетки слизистой шеи, обычно наблюдаемые в ямках желудка; бокаловидные клетки, подобные тем, что наблюдаются в тощей кишке; и «псевдоабсорбирующие» клетки с характеристиками как секреторных клеток слизистой желудка, так и адсорбирующих клеток тощей кишки.Цитоплазматические органеллы специализированных метапластов Барретта, нормальной слизистой шейки желудка и нормальных эпителиальных клеток слизистой поверхности желудка, включая шероховатый эндоплазматический ретикулум, агрегаты гликогена, аппарат Гольджи и слизистые секреторные гранулы, имеют общие ультраструктурные особенности, связанные с синтезом слизи. Морфологическая гетерогенность специализированных метапластических клеток Барретта и общие ультраструктурные особенности, связанные с нормальным биосинтезом слизи, предполагают, что они развиваются из желудочно-кишечных стволовых клеток, которые сохраняют способность к широкому диапазону нормальной и аномальной дифференцировки в пищеводе.Идентичность этой недифференцированной клетки, которая может находиться в нормальной проксимальной слизистой оболочке желудка или пищевода, остается неизвестной. Однако клетка слизистой шейки желудка обладает свойствами, которые позволяют предположить, что она может быть клеткой-предшественником пищевода Барретта, потому что это стволовая клетка, которая имеет ультраструктурное сходство со специализированными метапластическими эпителиальными клетками Барретта и расположена в интактной слизистой оболочке желудка, рядом с местом образования пищевода Барретта. .
Плоскоклеточная метаплазия — обзор
Плоскоклеточная метаплазия
Плоскоклеточная метаплазия проявляется как ряд изменений от доброкачественных реактивных процессов до плоскоклеточной дифференцировки при карциномах.Доброкачественные изменения включают изменения, связанные с хроническим эндометритом, внутриматочными спиралями и травмами (рис. 18.6A и B). 14,15 Обычно этот тип реактивной метаплазии проявляется в виде рассеянных поверхностных очагов. Трудно изученным вариантом плоскоклеточной метаплазии является ихтиоз матки (см. Рис. 18.6C). 16 Хотя такие поражения классифицируются как преувеличенные метаплазии эндометрия, они могут быть обширными, образуя кистоподобные пространства в миометрии, а иногда они могут быть связаны с плоскоклеточной неоплазией. 17 Обширные плоские разрастания, даже если морфологически доброкачественные, заслуживают тщательного изучения, особенно у пациентов в постменопаузе.
Второй и более частый образец плоской дифференцировки — моррулярная метаплазия, которая обычно принимает форму небольших, круглых, сплоченных и правильных гранулемоподобных агрегатов незрелых плоских клеток; они обычно располагаются внутри тракта железы (просвета), между железами или как отдельная находка, отделенная от железистого эпителия (рис.18.7). Центральное расположение морулы предполагает замену тракта железы плоскоклеточной метаплазией с вторичной пролиферацией столбчатого эпителия, похожей на шейную микрогландулярную метаплазию (см. Рис. 18.7B). Иногда морулы могут показывать центральный некроз (см. Рис. 18.7D). Изолированная морулярная метаплазия — с минимальной пролиферацией желез или без нее — не редкость у женщин репродуктивного возраста (см. Рис. 18.7A и E), и ее не следует путать с гистиоцитарными агрегатами. Однако морулярная метаплазия часто связана с некоторой степенью скученности желез, что затрудняет ее интерпретацию (см.рис.18.7B). 9,10
Классификация этих мелких пролифераций желез, связанных с морулярной метаплазией, проблематична, поскольку может отсутствовать степень скученности желез или измененного внешнего вида эпителия, необходимая для обоснования диагноза EIN. Когда эти железистые изменения более обширны, они могут вызывать беспокойство по поводу EIN или рака (рис. 18.8 и 18.9). Диагностический переход от плоских морул (или морулярной метаплазии) к EIN с плоскоклеточной дифференцировкой требует наличия скученности желез и измененных цитологических характеристик внутри железистого эпителия по сравнению с окружающими нормальными железами эндометрия (см.рис.18,8). Тем не менее, как обсуждается ниже, скученность желез без цитологических изменений может быть фактором риска для последующей карциномы эндометрия, независимо от степени ее расслоения и атипии.
Плоские морулы цитологически и архитектурно однородны в EIN, а также в поражениях, которые не могут быть классифицированы как EIN. Напротив, плоскоклеточная дифференцировка, связанная с аденокарциномой эндометрия, более вариабельна. В некоторых поражениях присутствуют дискретные морулы, и диагноз рака основывается строго на архитектуре железы (см.рис.18.9). В других случаях наблюдается аберрантная дифференцировка или ороговение (рис. 18.10). Как обсуждалось в главе 19, термины аденоакантома и аденосквамозная карцинома были отменены вместо термина аденокарцинома с плоскоклеточной дифференцировкой. 18 В некоторых случаях карциноматозный железистый компонент может быть очень тонким. Более плохо дифференцированные новообразования включают плоскоклеточный рак (обсуждается в главе 19), а также редкие, хорошо дифференцированные плоскоклеточные новообразования, включая кондиломы полости эндометрия и атипичные полиповидные аденомиомы. 19-22
Большинство морулярных метаплазий имеют доброкачественный исход. 9,10,23,24 В последующем исследовании морулярной метаплазии в Бригаме и женской больнице мы обнаружили, что биопсия эндометрия или выскабливание классифицируются как неосложненные (класс A или B, т. Е. Без ассоциированного EIN) морулярная метаплазия обычно регрессировали и сопровождались гистологически подтвержденной аденокарциномой эндометрия только в 5% случаев (таблица 18.2). 24 Напротив, морулярные метаплазии, описанные в связи с EIN (класс C), часто сохранялись и сопровождались аденокарциномой в 19% случаев. 23,24 По этой причине регулярное наблюдение с повторным забором образцов является разумным подходом к моррулярным метаплазиям с меньшими изменениями желез, хотя в некоторых случаях морулы могут появляться повторно после интервала между нормальными биопсиями. Случаи с EIN должны обрабатываться так же, как и с любыми EIN. К сожалению, морулярная метаплазия часто встречается у женщин репродуктивного возраста, и шансы на успешную беременность после лечения считаются низкими, что может быть отражением измененного гормонального состояния или биологии эндометрия, которые, как предполагается, также связаны с образованием морул. как возможно причина бесплодия.В редких случаях новообразования яичников развиваются одновременно или после диагноза морулярной метаплазии эндометрия. 25
Ловушки при диагностике плоскоклеточной метаплазии эндометрия включают как гипердиагностику, так и недостаточную диагностику рака эндометрия. Листы плоской метаплазии эндометрия бывает трудно отличить от злокачественного новообразования (рис. 18.11). С другой стороны, очаги явно доброкачественного плоского эпителия в эндометрии могут быть безвредными или связаны с более запущенным заболеванием, включая плоскоклеточный рак (рис.18.12). 26
Аналогичная ошибка — неправильная интерпретация метастатической карциномы в шейку матки как нативную плоскоклеточную метаплазию. Наконец, атипичные полиповидные аденомиомы, сочетающие моррулярную метаплазию с атипичными железами в миоматозной строме, можно спутать с обычной моррулярной метаплазией при полипах или аденокарциноме. Обе они обсуждаются более подробно в главе 19.
Американский журнал хирургической патологии
Пищевод Барретта (ПБ) определяется наличием метапластического цилиндрического эпителия пищевода с бокаловидными клетками в пределах эндоскопически распознаваемых областей пищевода.Однако некоторые карциномы при БЭ или в области пищеводно-пищеводного перехода развиваются внутри слизистой оболочки, лишенной бокаловидных клеток. Однако биологические свойства, патогенез и риск злокачественного новообразования метапластического цилиндрического эпителия пищевода, не являющегося глотком, по существу, неизвестны. В этом исследовании 89 пациентов с метапластическим цилиндрическим эпителием пищевода были оценены иммуногистохимически на маркеры дифференцировки кишечника, такие как MUC2, DAS-1, Villin и CDX2, маркер дифференцировки желудка (MUC5AC), и Ki67, маркер пролиферации клеток. .Из 89 пациентов у 59 была столбчатая метаплазия бокаловидными клетками (BE), которые были дополнительно разделены на группы бокаловидных клеток низкой плотности и бокаловидные клетки высокой плотности на основе процентного содержания крипт с бокаловидными клетками, а у 30 пациентов была столбчатая метаплазия бокаловидных клеток. пищевод без бокаловидных клеток. В качестве контроля использовались биопсии желудка от 19 пациентов, соответствующих возрасту и полу, без патологии пищевода или желудка. Степень положительности маркеров и локализация окрашивания Ki67 оценивалась только в не бокаловидном столбчатом эпителии всех групп пациентов.Пациенты с метапластическим цилиндрическим эпителием пищевода без бокаловидных клеток показали положительную реакцию на MUC5AC, MUC2, DAS-1, Villin и CDX2 в 100%, 0%, 30%, 17% и 43% случаев соответственно. В 17% случаев была выявлена аберрантная положительность Ki67 на поверхности. Эти значения были значительно выше, чем в желудочном контроле, который показал отсутствие окрашивания для всех маркеров, кроме MUC5AC (100%). У пациентов с метапластическим цилиндрическим эпителием пищевода с бокаловидными клетками (БЭ) наблюдалась значительная повышенная скорость окрашивания для всех маркеров, кроме MUC5AC.Кроме того, окрашивание как MUC2, так и поверхностного Ki67 было значительно увеличено у пациентов с БЭ с бокаловидными клетками высокой плотности по сравнению с пациентами с бокаловидными клетками низкой плотности. В отдельном анализе, в котором метапластический негоблеточный эпителий пищевода оценивался на участках слизистой оболочки, лишенных бокаловидных клеток, по сравнению с участками слизистой оболочки с бокаловидными клетками у пациентов, у которых были бокаловидные клетки в другом месте слизистой оболочки (N = 59), не наблюдалось никаких существенных различий. Что касается процента случаев, которые окрашивались любым из маркеров в негоблеточном эпителии в областях, лишенных бокаловидных клеток, аналогично группе пациентов с метапластическим эпителием пищевода без бокаловидных клеток (N = 30).Как и выше, во всех случаях экспрессия кишечных маркеров увеличивалась в областях слизистой оболочки, прилегающих к бокаловидным клеткам. Это исследование предоставляет доказательства того, что метапластический цилиндрический эпителий пищевода без бокаловидных клеток демонстрирует фенотипические доказательства дифференцировки кишечника и поддерживает теорию о том, что плоский эпителий сначала преобразуется в негоблеточный цилиндрический эпителий до метаплазии бокаловидных клеток. Необходимы дальнейшие проспективные исследования для оценки патогенетической последовательности, естественного течения и риска злокачественного новообразования метапластического эпителия пищевода.
% PDF-1.5 % 1 0 объект > / OCGs [7 0 R] >> / Страницы 2 0 R / Тип / Каталог >> эндобдж 85 0 объект > поток 2021-09-15T20: 54: 59-07: 002006-09-16T13: 56: 50 + 08: 002021-09-15T20: 54: 59-07: 00uuid: 95d36b95-76b4-4cd4-b3de-424b4ea1f5d0uuid: 8dd6970e- 1dd2-11b2-0a00-b800786aa4ffapplication / pdf конечный поток эндобдж 2 0 obj > эндобдж 86 0 объект > эндобдж 87 0 объект > эндобдж 51 0 объект > / Font> / T1_1> / T1_2 91 0 R >> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 40 0 объект > / Font> / T1_1> / T1_2> / T1_3 91 0 R >> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 29 0 объект > / Font> / T1_1> / T1_2 91 0 R >> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 18 0 объект > / Font> / T1_1> / T1_2 91 0 R >> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 5 0 obj > / Font> / T1_1> / T1_2 91 0 R >> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 88 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 100 0 объект [107 0 R 108 0 R 109 0 R 110 0 R 111 0 R] эндобдж 101 0 объект > поток q 540.0594177 0 0 68.6011963 35.9702911 675.3988037 см / Im0 Do Q BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 85,56995 576,99985 тм (1973; 33: 504-513.) Tj / T1_1 1 Тс -5.55699 0 Тд (Рак Res \ 240) Tj / T1_0 1 Тс 0 1 ТД (\ 240) Tj 0 1.00001 TD (Энтони Э. Уильямс, Джозеф А. Джордан, Джозефин М. Аллен и др.) Tj / T1_2 1 Тс 0 1 ТД (\ 240) Tj / T1_3 1 Тс 18 0 0 18 272,06305 616,99997 тм (на месте) Tj / T1_4 1 Тс -13,44795 0 Тд (Эпителия и карцинома) Tj Т * (Поверхностная ультраструктура нормальной и метапластической шейки матки) Tj ET 30 522 552 35 рэ 0 0 мес. S BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120.94202 529,99997 тм (\ 240) Tj / T1_4 1 Тс -7,55696 1 тд (Обновленная версия) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 141 521,99994 тм (\ 240) Tj / T1_0 1 Тс 22.06695 1 тд () Tj 0 0 1 рг -22.06695 0 Тд (http://cancerres.aacrjournals.org/content/33/3/504)Tj 0 г 0 1.00001 TD (Последнюю версию этой статьи можно найти по адресу:) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 30 501,99997 тм (\ 240) Tj 0 1 ТД (\ 240) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 30 481,99997 тм (\ 240) Tj Т * (\ 240) Tj ET BT / T1_2 1 Тс 10 0 0 10 30 461,99997 тм (\ 240) Tj Т * (\ 240) Tj ET 30 347 552 115 рэ 0 0 мес. S BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120.94202 429,99997 тм (\ 240) Tj / T1_4 1 Тс -5.66901 1 тд (Оповещения по электронной почте) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 295,4996 442 тм (относится к этой статье или журналу.) Tj 0 0 1 рг -15.44996 0 Тд (Зарегистрируйтесь, чтобы получать бесплатные уведомления по электронной почте) Tj ET BT 0 г / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120.94202 396.99994 тм (\ 240) Tj / T1_4 1 Тс -6.38997 1 тд (Подписки) Tj 0,556 1,00001 тд (Отпечатки и) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 141 399,99994 тм (\ 240) Tj 13.46496 1 тд (.) Tj 0 0 1 рг -6.85098 0 Тд ([email protected]) Tj 0 г -6.61398 0 Тд (Отделение) Tj 0 1.00001 TD (Чтобы заказать перепечатку статьи или подписаться на журнал, свяжитесь с нами \ t Публикации AACR) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 11 0 0 11 120,94 202 374,99997 тм (\ 240) Tj / T1_4 1 Тс -5.66901 1 тд (Разрешения) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 141 346,99988 тм (\ 240) Tj 0 1 ТД (Сайт с правами.) Tj 0 1.00001 TD (Нажмите «Запросить разрешения», чтобы перейти на страницу защиты авторских прав \ Центр Рэнсиса \ (CCC \)) Tj 22.06695 1 тд (.) Tj 0 0 1 рг -22.06695 0 Тд (http://cancerres.aacrjournals.org/content/33/3/504)Tj 0 г 0 1 ТД (Чтобы запросить разрешение на повторное использование всей или части этой статьи, используйте это li \ nk) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 9 0 0 9 283.\ q
Пищевод Барретта и клетки-предшественники на плоско-столбчатом соединении
Столбчатая метаплазия, включая пищевод Барретта (BE), считается предшественником аденокарциномы пищевода, частота которой за последние три десятилетия увеличилась в 600%. . БЭ возникает исключительно на стыке пищевода и желудка, где многослойный плоский эпителий переходит в простые столбчатые клетки.
У пациентов с БЭ соединение смещается кпереди и столбчатый эпителий расширяется, в то же время приобретая характеристики дифференцировки кишечника.Примечательно, что происхождение клеток метапластического цилиндрического эпителия остается спорным. Здесь исследователи идентифицируют новый псевдостратифицированный эпителий, поддерживаемый базальными клетками-предшественниками p63 + ve на стыке.
Их предварительные данные предполагают, что уникальный эпителий служит источником метапластического эпителия во многих моделях мышей. Данные также указывают на то, что передача сигналов Wnt способствует метапластическим изменениям в плоскоклеточном столбчатом соединении. Таким образом, исследователи предполагают, что новый псевдостратифицированный столбчатый эпителий является клеткой происхождения метаплазии Барретта и что передача сигналов Wnt способствует метапластическому патогенезу.
Исследователи проверит гипотезу с тремя конкретными целями: (1) дальнейшая проверка того, что уникальная псевдостратифицированная столбчатая популяция является клеткой происхождения для BE, (2) проверка гипотезы о том, что ингибирование передачи сигналов Wnt блокирует развитие BE из псевдостратифицированных столбчатый эпителий и (3) моделируют патогенный процесс человеческого БЭ с помощью базальных клеток-предшественников столбчатого эпителия, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток.
Исследователи создали надежную систему in vitro для индукции дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в направлении судьбы базальных клеток.С этой целью они будут использовать эту систему, чтобы понять механизм, управляющий аномальной дифференцировкой базальных клеток во время развития БЭ. Результаты этого проекта дадут важную информацию о раннем патогенезе БЭ и обеспечат потенциальные терапевтические цели для лечения БЭ.
GATA4 блокирует экспрессию гена плоских эпителиальных клеток в плоскоклеточных клетках пищевода человека
Иммуногистохимия ткани
Срезы (5 мкм) фиксированных формалином, залитых парафином деидентифицированных биопсийных образцов ткани человека были получены через Банк тканей MCW и Департамент Патология и окрашивание гематоксилином и эозином.Сертифицированный GI патолог подтвердил наличие пищевода Барретта или аденокарциномы пищевода в тканях. Были выполнены стандартные иммуногистохимические процедуры 41,48,49 . Вкратце, извлечение антигена лимонной кислоты выполняли до иммуногистохимии для GATA4 (R&D Systems, AF2606). Окрашивание визуализировали с использованием реагента RTU Vectastain Elite ABC и набора субстратов Metal Enhanced DAB. Микрофотографии получали с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse TE300 и камеры SPOT RT3.Изображения были собраны в фигуры с помощью Adobe Photoshop и Illustrator. Изображения контрольных и экспериментальных образцов обрабатывались идентично.
Культура клеток
Иммортализованные теломеразой NES-B3T и NES-B10T линии клеток плоскоклеточного пищевода человека были получены из образцов биопсии отдельных пациентов с пищеводом Барретта, но не из пораженной области 35,36 . Для размножения и поддержания клетки совместно культивировали с инактивированными митомицином-C питающими клетками эмбриональных фибробластов мыши в среде DMEM / F12 (3: 1), содержащей гидрокортизон (0.4 мг / мл), EGF (20 нг / мл), трансферрин (5 мг / мл), инсулин (5 мг / мл), холерный токсин (10 нг / мл), трийодтиронин (20 пМ), аденин (31 мг / мл). мл), космическая телячья сыворотка (1%), пенициллин / стрептомицин (по 100 Ед / мл). Клетки культивировали при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 . Для экспериментов клетки культивировали на планшетах, покрытых коллагеном IV, в той же среде.
Обработка клеток кислотой и желчью
Клетки (70% слияния) обрабатывали подкисленной средой (pH 5,5), содержащей соли желчных кислот (20: 3: 15: 3: 6: 1, конечная концентрация 400 мМ: гликохолевая, таурохолическая , гликохенодезоксихолевую, таурохенодезоксихолевую, гликодезоксихолевую и тауродезоксихолевую кислоты) в течение 48 часов, как описано ранее 43 .Непосредственно перед обработкой pH среды доводили до 5,5 с использованием 1 М соляной кислоты. Через 48 ч клетки мгновенно замораживали в буфере RLT, содержащем β-меркаптоэтанол, для экстракции РНК.
Трансдукция и клонирование лентивирусного вектора GATA4
Клетки NES-B3T и NES-B10T были инфицированы лентивирусом pInducer20 или pInducer20-GATA4 (MOI 3), подготовленным вирусным ядром Медицинского колледжа Висконсина. Плазмиды были щедро предоставлены доктором Стивеном Элледжем (Гарвардская медицинская школа) 44 .Инфицированные клетки поддерживали в культуральной среде с добавлением FBS, одобренного системой Tet (5%). Клетки отбирали с помощью G418 (350 мг / мл, B3T; 500 мг / мл, B10T) через 24 часа после заражения. Доза G418 была установлена как удвоенная концентрация, необходимая для эффективного уничтожения неинфицированных клеток. Для получения индивидуальных клонов применяли метод клонирования с ограничивающим разведением, и клетки высевали на 96-луночные планшеты, покрытые коллагеном IV. Для экспериментов доксициклин (1 мкг / мл) применяли ко всем культурам клеток (контрольным и трансдуцированным GATA4) в течение 72 часов.Среду заменяли через 48 ч для пополнения доксициклина. Клетки обрабатывали трипсином для сбора РНК и экстракции белка или фиксировали 4% PFA для экспериментов по иммунофлуоресценции.
ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR)
Полную РНК выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit. Для удаления геномной ДНК полную РНК обрабатывали ezDNase. Для количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR) кДНК, синтезированную с использованием MMLV и случайных гексамерных праймеров, амплифицировали с использованием тестов экспрессии генов TaqMan Gene Expression Mastermix и TaqMan ( GATA4 , HS00171403_m1; KRT5 762, Hs001; , Hs01595539_m1; KRT13 , Hs00357961_g1; KRT15 , Hs00951967_m1; KRT20 , Hs00300643_m1; р63 , Hs00978340_m1; CDX2 , Hs01078080_m1; виллин , Hs01031724_m1; Gata4 , Mm00484689_m1; р63 , Mm00495793_m1 ; Krt5 , Mm01305291_g1; Krt15 , Mm00492972_m1).Данные были нормализованы по экспрессии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ( GAPDH , 4352665; Gapdh , 4351309). Для каждой мишени единицы экспрессии рассчитывали по формуле [2 (-dCq) ] × 1000 50 . Для радиоактивной полуколичественной RT-PCR с [α- 32 P] дезоксиаденозинтрифосфатом кДНК получали из РНК, обработанной ezDNase, с использованием набора для синтеза кДНК Superscript VILO. Используемые праймеры: GATA4 (5′-ttctggggagagtgtaagtggacag-3 ‘, 5′-ctttttgcctcctggacaaaagact-3’) и GAPDH (5′-gacagtcagccgcatcttct-3 ‘, 5’-ttaacttct-3’gg.Радиоактивные ампликоны разделяли с помощью 4% PAGE и гели сушили. Экспрессию детектировали и количественно оценивали с помощью Storm80 Phosphor Imager (Amersham Biosciences).
Иммуноцитохимия
Использовались стандартные методы иммуноцитохимии 49 . Вкратце, клетки фиксировали 4% PFA / 1X PBS, пермеабилизировали 0,5% Triton X-100 / 1X PBS, блокировали 3% BSA / 1X PBS и инкубировали с антителами (GATA4, R&D Systems, AF2606; Alexa-Fluor 594 Donkey anti-goat, Thermo Fisher) в 1% BSA / 1X PBS.DAPI использовался для визуализации ядер. Изображения были получены с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse TE300, оснащенного камерой SPOT RT3 с объективом 20X. Изображения были собраны в фигуры с помощью Adobe Photoshop и Illustrator. Изображения контрольных и экспериментальных образцов обрабатывались идентично.
Иммуноблот-анализ
Следование стандартной методике иммуноблоттинга 41,49 . Ядерные экстракты получали с использованием реагентов для ядерной и цитоплазматической экстракции NE-PER и коктейля ингибиторов протеазы HALT.Бензоназу (0,5 Ед / мкл) использовали для увеличения выхода белка факторов транскрипции и качества ядерных экстрактов. Ядерные экстракты (5 мкг) или цитоплазматические экстракты (20 мкг) разделяли с использованием градиентных гелей Nu-PAGE Bis – Tris 4–12% и переносили на поливинилидендифторидную мембрану Immobilon-FL. Revert Total Protein Stain использовали для определения общего белка. Блоты блокировали блокирующим буфером Odyssey в течение 1 ч при комнатной температуре. В блокирующий буфер, содержащий 0.1% Tween и инкубировали при встряхивании при 4 ° C в течение ночи. Мембраны промывали и подвергали воздействию вторичного антитела (IRDye 800CW, ослиное антикроличье, LICOR) в течение 1 ч при комнатной температуре. Кляксы визуализировали с использованием системы инфракрасной визуализации Odyssey (LI-COR) с программным обеспечением для сбора и анализа Image Studio 5.2 (https://www.licor.com/bio/image-studio). Для нормализации использовали краситель общего белка REVERT. При необходимости мембраны очищали 2% SDS, 62,5 мМ Трис-буфером, pH 6,8, содержащим 0.8% β-меркаптоэтанол при 50 ° C в течение 45 мин. Снятые мембраны тщательно промывали проточной водопроводной водой в течение 2 часов. Общий белок был повторно определен количественно с использованием окрашивания общего белка REVERT, и представляющие интерес белки были обнаружены, как описано выше.
Животные
Gata4 flbio / flbio ( Gata4 tm3.1Wtp ) и ROSA26 BirA (ROSA ) (GtOS ) (GtOS ) birA] Mejr ) линий мышей использовали для создания Gata4 flbio / flbio :: ROSA26 BirA / BirA (GATA4-BIO, биотинилированный GATA4) и BirA / BirA (GATA4-WT, небиотинилированный GATA4) мышей для биотин-опосредованной ПЦР иммунопреципитации хроматина (bio-ChIP-PCR) 37,38,39,41 .Праймерами для ПЦР-генотипирования ДНК ушной раковины были Gata4, Exon 7F / R, 5′-cagtgctgtctgctctgaagctgt-3 ‘, 5′-ccaaggtgggcttctctgtaagaac-3′; BirAJax 14/15 5’-ttcagacactgcgtgact-3 ‘, 5′-ggctccaatgactatttgc-3′; и BirAJax 16/17 5’-gtgtaactgtggacagaggag-3 ‘, 5′-gaacttgatgtgtagaccagg-3’ 41 . Институциональный комитет по уходу и использованию животных Медицинского колледжа Висконсина одобрил все процедуры с животными. Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими инструкциями и правилами.
Bio-ChIP-PCR
Эпителиальные клетки заднего живота от 2-4-месячных мышей GATA4-BIO или GATA4-WT (n = 4 животных на генотип) получали, как описано ранее, с небольшими изменениями 41 . Вкратце, эпителий заднего живота мыши разделяли на отдельные клетки путем встряхивания рассеченных, промытых тканей заднего желудка в течение 30 мин при 4 ° C в буфере сбалансированного раствора натриевой соли (BSS), содержащем ЭДТА (1,5 ммоль / л KCl, 96 ммоль / л NaCl, 27 ммоль / л Na 3 C 6 H 5 O 7 , 8 ммоль / л KH 2 PO 4 , 5.6 ммоль / л Na 2 HPO 4 и 15 ммоль / л ЭДТА, 200 мкмоль / л фенилметилсульфонилфторид). После удаления мезенхимальных и мышечных тканей изоляты эпителиальных клеток осаждали центрифугированием при 2000 об / мин в течение 8 минут при 4 ° C. Клетки дважды промывали 1X PBS, содержащим 200 мкмоль / л фенилметилсульфонилфторида. Bio-ChIP выполняли согласно ранее опубликованным протоколам 38,39,41 . Вкратце, клетки фиксировали 1% формальдегидом в течение 10 минут, гасили глицином (конечная концентрация 125 мМ) и мгновенно замораживали.Клетки лизировали и обрабатывали ультразвуком в 2% буфере SDS с использованием Bioruptor Pico в течение 6 полных циклов, обработка ультразвуком 30 секунд / отдых 30 секунд для каждого цикла. Связанный с GATA4 хроматин выделяли с использованием магнитных шариков стрептавидина. После промывок и обработки протеиназой К / рибонуклеазой А хроматин очищали экстракцией фенолом / хлороформом и осаждением этанолом. Размер сдвига хроматина определяли с помощью Agilent 2200 TapeStation с помощью высокочувствительной экранной ленты. Концентрацию измеряли с помощью набора Qubit dsDNA HS Assay Kit. Используя инструмент браузера генома UCSC с геномом мыши (NCBI37 / mm9 build), мы визуализировали промоторы гена (определяемые как 1 КБ выше TSS гена) и идентифицировали эволюционно консервативные сайты связывания GATA в этой области с помощью инструмента Multiz Alignment браузера генома.Зависимость GATA4 эволюционно консервативных сайтов связывания GATA в вышестоящих регуляторных областях генов p63 , Krt5 и Krt15 была подтверждена радиоактивной ПЦР с [α- 32 P] дезоксиаденозинтрифосфатом и ген-специфическими праймерами ( p63 , 5′-gcctacattcagaaaggaaacaaattc-3 ‘, 5′-gcctgtcaatggggaaaaataaagt-3’; Krt5 , 5′-tattccaccagggaagacgtgagt-3 ‘, 5′-tttgggccaactagatag-3′, 5’-tttgggccaactagatag-3 ‘; 5’-tttctggaacttgcccgagtcttat-3 ‘).В качестве отрицательного контроля, обогащение GATA4 оценивали с использованием праймеров для экзона в гене Hprt (5′-agcgcaagttgaatgtgc-3 ‘, 5′-agcgacaatgtaccagag-3’), которые мы ранее подтвердили как охватывающие область без связывания GATA4 40,41,42 .
