Эрозия роговицы мкб: Травматическая эрозия роговицы — МКБ-10

Основные моменты

•

Совершенно новая классификация нейрокристопатий предлагается.

•

Обсуждаются причинные механизмы нейрохристопатий.

•

28 новых нейрокристопатий.

•

Сделана классификация 66 нейрокристопатий.

•

Рассмотрены 24 производных нервного гребня.

Abstract

Нервный гребень (NC) — это временная, мультипотентная и мигрирующая популяция клеток, которая генерирует удивительно разнообразный набор типов клеток во время развития позвоночных.Эти клетки, которые происходят из эктодермы в области латеральнее нервной пластинки в нервной складке, дают начало нейронам, глии, меланоцитам, хондроцитам, гладкомышечным клеткам, одонтобластам и нейроэндокринным клеткам, среди прочего. Нейрокристопатии (НКП) — это класс патологий, встречающихся у позвоночных, особенно у людей, которые возникают в результате аномальной спецификации, миграции, дифференцировки или гибели клеток нервного гребня во время эмбрионального развития. К нейрокристопатиям можно отнести различные пигментные, кожные, щитовидные и слуховые нарушения, черепно-лицевые и сердечные аномалии, сбои в работе пищеварительного тракта и опухоли.В этом обзоре мы пересматриваем текущую классификацию и предлагаем новый способ классификации NCP на основе эмбрионального происхождения пораженных тканей, недавних открытий, касающихся молекулярных механизмов, которые управляют образованием NC, и повышенной сложности современных методов молекулярной эмбриологии.

Сокращения

костный морфогенетический белок

эпителиально-мезенхимальный переход

энтеральная нервная система

Фактор роста фибробластов

Сигнальный путь клеток ежа

02

Эмбриональное развитие

Миграция клеток

Нейрогенез

Периферическая нервная система

Шванновские клетки, нейрокристопатии, заболевания, синдромы

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

© 2018 Elsevier Inc.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Технология контролируемого высвобождения лекарств • iBiology

00: 00: 07.14 Итак, меня зовут Боб Лангер.
00: 00: 09.07 Я профессор Массачусетского технологического института,
00: 00: 10.27, и я собираюсь обсудить,
00: 00: 13.03 в этой первой лекции,
00: 00: 14.19, чтобы дать вам обзор
00: 00: 16.10 этой области технологии контролируемой доставки лекарств,
00: 00: 20.18 и во второй лекции …
00: 00: 23.05 Я перечислил лекции здесь…
00: 00: 25.01 Я буду говорить о
00: 00: 27.00 некоторых из наших собственных работ
00: 00: 29.27, которые приводят к некоторым из этих систем доставки лекарств
00: 00: 32.07, а также некоторым будущим работа
00: 00: 34.15 в нанотехнологиях и других областях
00: 00: 36.09, которые, я думаю, будут захватывающими для будущего доставки лекарств.
00: 00: 38.23 И в третьей и заключительной лекции
00: 00: 40.08 я буду говорить о биоматериалах и биотехнологиях
00: 00: 43.13 и приведу пример, в частности,
00: 00:46.06 о том, как создавать новые материалы,
00: 00: 48.02, и я также расскажу
00: 00: 49.29, как можно комбинировать материалы с ячейками,
00: 00: 52.07, который помог заложить фундамент
00:00 : 53.28 тканевой инженерии.
00: 00: 56.03 Итак, я начну с того, что перейду к
00: 00: 59.06, как здесь упоминается,
00: 01: 01.04 всей этой области технологии контролируемого выпуска,
00: 01: 03.05 и это поле, которое на самом деле
00: 01: 05.02 теперь затрагивает сотни миллионов пациентов
00:01:08.09 по всему миру
00: 01: 10.01, но это все еще очень новая область.
00: 01: 11.22 Возможно, самый простой способ начать с
00: 01: 13.12 — это просто рассмотреть, как люди обычно принимают наркотики.
00: 01: 15.26 Обычно вы принимаете таблетку
00: 01: 18.05 или можете сделать инъекцию,
00: 01: 21.05, но всякий раз, когда вы принимаете какой-либо из этих препаратов
00: 01: 24.17, происходит следующее: мы можем видеть на слайде …
00: 01: 28.14 есть эти синие линии
00: 01: 30.14, которые дают вам желаемый диапазон…
00: 01: 32.17, если вы находитесь выше этого диапазона, лекарство может быть токсичным,
00: 01: 34.28, если вы ниже, оно неэффективно.
00: 01: 37.13 Я иногда просто использую снотворное.
00: 01: 39.29 Если бы кто-то принял слишком много
00: 01: 43.00, он бы умер — это явно токсично.
00: 01: 44.26 И если вы взяли слишком мало, это не сработает,
00: 01: 46.28 вы не уснете.
00: 01: 49.05 Итак, для любого препарата
00: 01: 51.05 у вас есть желаемый диапазон
00:01:53.06 и то, что происходит во многих случаях
00: 01: 55.21, заключается в том, что вы получаете то, что я называю доставкой в ​​режиме пик-и-впадина
00: 01: 58.24, которую вы видите здесь,
00: 02: 00.14, что означает, что когда сначала вы принимаете препарат
00: 02: 02.10, он начинается с очень низкого уровня,
00: 02: 04.04, затем продолжает расти,
00: 02: 06.05, а затем снижается.
00: 02: 07.26 Итак, вам придется взять его снова,
00: 02: 10.13, и с этим действительно есть две или три проблемы.
00: 02: 12.13 Одна из проблем, о которой я только что упомянул, —
00:02:14.08, что вы можете получить эти токсические эффекты
00: 02: 15.29 или это может не сработать.
00: 02: 17.28 Второй эффект, большой эффект
00: 02: 20.00, заключается в том, что у людей наблюдается то, что называется очень плохой комплаентностью.
00: 02: 23.13 Люди обычно не делают то, что должны делать
00: 02: 25.23 и часто не принимают наркотики
00: 02: 28.09, когда им положено,
00: 02: 30.07, что привело к госпитализации
00: 02: 32.07 и всевозможным другим проблемам.
00:02:34.20 Итак, что кто-то хотел бы сделать, это
00: 02: 37.28, когда вы посмотрите на эти строки,
00: 02: 40.00 — это таблетка или инъекция или что-то еще
00: 02: 43.29, которое начинается с низкого уровня. но потом переходит в желаемый диапазон.
00: 02: 47.19 В некотором смысле люди пытались сделать это более 100 лет.
00: 02: 52.18 Самые ранние примеры этих
00: 02: 54.28 — это то, что мы назвали замедленным высвобождением.
00: 02: 57.08 Системы замедленного высвобождения,
00: 02: 58.23 и люди, вероятно, слышали о них,
00:03:00.14 — это крошечные таблетки времени
00: 03: 02.04 и тому подобное,
00: 03: 04.00, а не то, что вы могли видеть на последнем слайде,
00: 03: 06.11, где вы, скажем, принимали таблетка может быть каждые четыре часа,
00: 03: 08.25 с замедленным высвобождением, вероятно, длится двенадцать часов,
00: 03: 11.26 и это как бы притупляет эти пики.
00: 03: 13.25 Но случается так, что вы все еще …
00: 03: 18.20 вам все равно нужно их принимать,
00: 03: 21.05, и вы действительно находитесь не в желаемом диапазоне.
00: 03: 24.28 Я имею в виду, вы находитесь в желаемом диапазоне
00: 03: 26.16 может быть дольше, но недостаточно долго.
00: 03: 29.02 Итак, способ, которым они были достигнуты,
00: 03: 32.00 эти системы с замедленным высвобождением,
00: 03: 34.01 включают различные типы химии и химической инженерии,
00: 03: 37.20 как вы можете есть то, что называется комплексом.
00: 03: 39.23 Например,
00: 03: 41.20 вы хотите замедлить выпуск,
00: 03: 43.13 и способ замедления выпуска
00:03:45.22 — это добавление соли или даже ее комплексное соединение
00: 03: 48.09 с так называемой ионообменной смолой.
00: 03: 50.20 Другой способ замедлить его
00: 03: 52.26 — нанести так называемое медленно растворяющееся покрытие вокруг него.
00: 03: 55.21 Например, есть что-то, называемое энтеросолюбильным покрытием,
00: 03: 57.22, и если у вас есть таблетка с энтеросолюбильным покрытием,
00: 04: 01.16 желудок, который часто содержит много кислоты,
00: 04: 04.15 не растворяет это покрытие,
00:04:07.04, так что вы не получите освобождения позже …
00: 04: 10.15 подождите, пока вы не пройдете мимо желудка
00: 04: 12.21, и кислотность нейтрализуется.
00: 04: 16.16 Вы также можете делать такие вещи, как суспензии или эмульсии,
00: 04: 19.25, которые уменьшают доступность лекарства
00: 04: 22.22 для организма,
00: 04: 24.22 и даже что-то простое. в виде прессованной таблетки
00: 04: 26.23 замедляет высвобождение, потому что лекарство
00: 04: 28.29 не растворяется так быстро.
00: 04: 30.24 Тем не менее, когда мы смотрим на нижнюю часть этого слайда,
00:04:34.01 какие системы с замедленным высвобождением …
00: 04: 36.07 обычно высвобождают лекарства в течение коротких периодов времени, например, часов,
00: 04: 39.19, и они требуют повторного введения.
00: 04: 41.24 Кроме того,
00: 04: 44.02 на скорость выброса очень сильно влияют условия окружающей среды.
00: 04: 46.15 Например, я упоминал,
00: 04: 48.09, вы знаете, расслабление в желудке.
00: 04: 50.05 Ну, pH вашего желудка
00: 04: 52.03 очень зависит от того, когда вы ели в последний раз,
00:04:53.25, поэтому существует большая изменчивость
00: 04: 55.23, когда вы берете такие системы.
00: 04: 57.17 И, имея это в виду,
00: 04: 59.05 то, что произошло за последние 40 лет
00: 05: 01.04 — это появление того, что мы сейчас называем
00: 05: 03.02 рецептур с контролируемым высвобождением.
00: 05: 04.22 Это часто полимеры или насосы.
00: 05: 08.08 Они могут высвобождать лекарство
00: 05: 09.27 очень долго,
00: 05: 11.23 не только дни, но и в некоторых случаях, как я перейду,
00:05 : 14.От 19 до 5 лет от одной крошечной системы.
00: 05: 17.16 Кроме того, скорость выпуска очень слабо
00: 05: 19.28 или совсем не зависит от условий окружающей среды,
00: 05: 23.01, поэтому вы получаете фиксированный заранее заданный шаблон выпуска
00: 05: 28.05 на определенный период времени.
00: 05: 30.23 Это просто график
00: 05: 32.23, который показывает вам идеализированный случай этого.
00: 05: 35.03 Итак, вместо того, чтобы получать такую ​​доставку в режиме пик-и-впадина
00: 05: 38.10, о которой я упоминал ранее,
00:05:40.07 то, что вы можете получить, это то, что лекарство начинается с
00: 05: 42.15 в низком диапазоне, затем он переходит в желаемый диапазон,
00: 05: 45.09, и остается там столько, сколько вы хотите.
00: 05: 47.24 Это своего рода идеальный случай.
00: 05: 50.02 Я хотел бы упомянуть еще одну вещь,
00: 05: 53.08, которая очень интересна в этой области доставки лекарств.
00: 05: 56.08 — это не только идея управления продолжительностью
00:05. : 59.00 препарата и контроль его уровня,
00: 06: 02.10, но на самом деле в некоторых случаях
00:06:04.09, направляя его прямо туда, куда вы хотите,
00: 06: 06.17, и в этой области ведется много исследований.
00: 06: 10.05 Еще очень рано,
00: 06: 11.24, но я упомяну кое-что из этого в своем втором выступлении,
00: 06: 15.06, но то, что люди делают
00: 06: 17.29, это они ‘ Посмотрите на маленькие жировые частицы, называемые липосомами
00: 06: 21.09, которые можно направить на определенные типы клеток.
00: 06: 24.12 Они также изучают микросферы и микроносители
00:06:28.00, которые можно украсить определенным образом
00: 06: 30.12, чтобы нацелить их на определенные места тела.
00: 06: 33.04 И, наконец,
00: 06: 35.03 вы можете прикрепить лекарство к носителю,
00: 06: 36.28, который может быть антителом или полимером,
00: 06: 38.18, надеюсь, снова
00: 06: 40.12 нацельте его туда, куда хотите.
00: 06: 42.12 Итак, все это очень захватывающие области
00: 06: 45.04, как можно принимать наркотики
00: 06: 47.12 и заставлять их делать то, что они никогда не могли делать раньше.
00: 06: 50.13 В этой лекции я подумал
00: 06: 52.13 то, что я хочу сделать, это рассмотреть
00: 06: 56.01 общие механизмы, с помощью которых это происходит,
00: 06: 58.13 и, как правило, есть три механизмы.
00: 07: 00.26 Диффузия — первая,
00: 07: 02.13 и есть две геометрии, которые люди часто используют.
00: 07: 05.02 То, что называется резервуаром,
00: 07: 06.22, и я покажу вам его изображение через минуту,
00: 07: 08.18 и то, что называется матрицей.
00:07:10.05 Второй механизм включает химическую реакцию
00: 07: 14.00, и в случае химической реакции
00: 07: 15.25 это может привести к разрушению полимера, bioerode,
00: 07: 18.22, что позволит лекарству чтобы выйти наружу,
00: 07: 20.20 или у вас может быть то, что мы называем системой подвесных цепочек,
00: 07: 23.22, где лекарство прикреплено к полимеру,
00: 07: 26.05 скажем,
00:07 : 28.08 и что-то приходит и отсекает его.
00: 07: 30.14 Третий механизм — растворитель что-то делает.
00: 07: 33.04 Растворитель может вызвать набухание полимера,
00: 07: 36.04, поэтому лекарство может быть зафиксировано на месте,
00: 07: 37.29 но когда он набухает,
00: 07: 39.19 теперь лекарство выходит.
00: 07: 41.06 Или, как я покажу вам,
00: 07: 42.14 есть несколько очень умных способов использования так называемого осмоса
00: 07: 44.19 для доставки лекарств.
00: 07: 47.04 Наконец,
00: 07: 49.23, в некоторых случаях вы можете даже создать умную систему доставки,
00:07:53.07, где вы можете активировать его извне
00: 07: 55.05 и заставлять больше лекарств выходить в определенные периоды времени,
00: 07: 57.27 и я пройдусь по этому …
00: 08: 02.08 немного примера этого в моей второй лекции.
00: 08: 04.11 Итак, я просто рассмотрю каждый из этих трех основных механизмов.
00: 08: 08.19 Во-первых, диффузия,
00: 08: 11.11 и наиболее распространенный способ, которым люди настраивают доставку лекарств
00: 08: 14.19 путем диффузии, — это то, что показано здесь,
00: 08: 16.16 резервуар.
00: 08: 18.03 Резервуар,
00: 08: 19.18 и люди, вероятно, это видели,
00: 08: 21.06 может быть капсулой, может быть микрокапсулой,
00: 08: 23.23 может быть полым волокном,
00: 08: 25.13 или лекарство можно поместить между двумя мембранами,
00: 08: 27.29, но в основном то, что мы видим,
00: 08: 29.16 и маленькие точки на этом слайде
00: 08: 31.17 иллюстрируют лекарство. ,
00: 08: 33.03 синий цвет показывает мембрану, скажем,
00: 08: 35.26 или капсулу,
00:08:37.15 и это просто поперечное сечение.
00: 08: 39.05 Итак, если вы перейдете
00: 08: 47.00 с левой на правую
00: 08: 49.14, то увидите, что маленькие точки …
00: 08: 52.13 левая — это система в момент времени 0,
00: 08: 57.04, но то, что происходит, происходит со временем,
00: 08: 59.07 точки продолжают выходить за счет диффузии.
00: 09: 01.01 Они диффундируют через полимер,
00: 09: 02.26, и это будет продолжаться в течение очень долгого времени.
00:09:06.27 Существует ряд полимеров, которые очень часто
00: 09: 09.17 используются для изготовления этих систем,
00: 09: 11.07, например, силиконовый каучук, EVA,
00: 09: 12.20, который представляет собой сополимер этилена и винилацетата,
00: 09: 15.09 или разные гидрогели.
00: 09: 17.19 Для химиков-полимеров
00: 09: 19.08 хорошим примером может быть
00: 09: 21.12 поли (2-гидроксиэтилметакрилат),
00: 09: 23.10, но в целом гидрогели являются материалами
00: 09: 25.15, которые используются в мягких контактных линзах
00:09:27.15, и они очень биосовместимы.
00: 09: 29.21 Эти системы имеют ряд преимуществ:
00: 09: 32.08 вы можете заставить их выпускаться с относительно постоянной скоростью,
00: 09: 35.24, но один возможный недостаток
00: 09: 38.02 — если бы у вас были утечка,
00: 09: 39.23 предположим, была дыра в синем,
00: 09: 41.23 лекарство могло выплеснуться.
00: 09: 43.24 Итак, это может означать, что у вас был потенциально токсичный препарат
00: 09: 46.13, например, лекарство от рака или инсулин,
00:09:48.28 вы, вероятно, не использовали бы резервуарную систему,
00: 09: 51.16, но если бы вы доставляли …
00: 09: 53.14 предположим, что вы доставляли гормон роста человека,
00: 09: 55.14 или что-то в этом роде ,
00: 09: 57.13 это, вероятно, было бы хорошо.
00: 09: 59.12 Вторая система
00: 10: 01.11, которая также основана на диффузии
00: 10: 03.25 — это то, что мы называем матричной системой,
00: 10: 05.20, и снова синие точки представляют лекарство,
00: 10: 09.14 и желтый, который вы видите там,
00:10:12.08 желто-зеленый,
00: 10: 14.22, это внешняя часть полимерной матрицы.
00: 10: 17.14 Итак, в случае неразрушающейся матрицы,
00: 10: 20.08, лекарство равномерно распределяется по этой матрице,
00: 10: 23.09, и мы видим, что вверху,
00: 10: 25.01, но затем, когда мы опускаемся на дно
00: 10: 27.01, мы видим, как лекарство распространяется наружу.
00: 10: 29.11 И снова
00: 10: 31.15 он диффундирует через полимер,
00: 10: 33.10 но теперь, из-за другой геометрии,
00:10:35.Происходит еще 11 вещей.
00: 10: 37.04 Например, получить стабильный выпуск не так просто,
00: 10: 39.24, но с положительной стороны,
00: 10: 41.24 скажем, в этой матрице был разрыв …
00: 10: 44.26 Ничего особенного не получится
00: 10: 46.27, потому что он встроен во всю матрицу.
00: 10: 49.27 Итак, это первый механизм — диффузия.
00: 10: 52.04 Второй механизм, как я уже упоминал,
00: 10: 53.25 — это химическая реакция,
00:10:56.06, и один из самых распространенных способов сделать это
00: 10: 58.20 — это биоразлагаемая система.
00: 11: 01.15 Итак, в случае биоэродируемой системы
00: 11: 04.15 вначале она будет выглядеть как
00: 11: 06.25, по существу идентично тому, что я показал вам на матрице
00 : 11: 10.25 но теперь желтый цвет не остается прежним,
00: 11: 16.14 другими словами, матрица не остается прежнего размера,
00: 11: 19.26 фактически сжимается и в конечном итоге полностью растворяется,
00 : 11: 23.01 и по мере его растворения
00: 11: 25.00 мы видим, что все эти синие точки выходят и отпускаются.
00: 11: 27.22 Итак, биоэрозия
00: 11: 30.01 обеспечивает целый второй механизм высвобождения,
00: 11: 32.13 и большое преимущество биоэрозии,
00: 11: 34.13, если рассматривать это с точки зрения пациента. ,
00: 11: 36.15, если у вас был имплант, и он не рассосался,
00: 11: 40.04 вам нужно войти и вынуть его.
00: 11: 42.24 В некоторых случаях это будет сделано,
00:11:44.05, как я упомяну позже,
00: 11: 46.19, но это все еще недостаток.
00: 11: 48.18 Конечно, для пациента
00: 11: 50.11 было бы предпочтительнее сделать всего одну инъекцию или один имплант
00: 11: 52.10 и никогда больше не беспокоиться об этом.
00: 11: 54.26 Итак, одним из механизмов химической реакции является эрозия.
00: 12: 00.20 Второй механизм — это идея полимера
00: 12: 03.14, содержащего подвесную цепочку,
00: 12: 05.23, и теперь происходит прикрепление лекарства
00:12:08.03 с основной цепью полимера,
00: 12: 10.03, но вода или фермент, как мы видим внизу,
00: 12: 12.28 приходят и в основном разрывают связь
00: 12: 15.26, а затем высвобождается лекарство.
00: 12: 18.06 Одним из преимуществ этого
00: 12: 19.26 является то, что вы можете добавить к ним много лекарств,
00: 12: 22.29, но возможный недостаток
00: 12: 25.17 заключается в том, что они так называемые новые химические образования.
00: 12: 28.13 Мы химически модифицировали лекарство, прикрепив его,
00:12:30.29, значит, это новое химическое соединение,
00: 12: 32.14, так что вам придется провести гораздо больше токсикологии
00: 12: 34.13, чтобы в конечном итоге получить одобрение,
00: 12: 36.06, тогда как более ранние системы, о которых я говорил ,
00: 12: 38.10 в препарате нет изменений,
00: 12: 39.27 он просто физически встроен.
00: 12: 42.15 Третий механизм
00: 12: 44.26 — это растворитель, который что-то делает,
00: 12: 47.14, и здесь мы смотрим на эффект набухания,
00: 12: 50.08 и идею опухоль это ты,
00:12:53.20 снова, если мы посмотрим на левую панель,
00: 12: 56.18, лекарство растворено в полимере
00: 12: 58.23, и мы увидим, что он просто выглядит синим,
00: 13: 00.27, но теперь, как мы переходим к правой панели,
00: 13: 04.28 что происходит, вода уходит в
00: 13: 08.15, и внешняя часть матрицы действительно набухает.
00: 13: 11.27 Итак, лекарство было зафиксировано на месте,
00: 13: 14.02, но теперь, поскольку оно набухло, оно может выйти,
00: 13: 18.02, и это происходит с течением времени
00:13:20 .15, и это дает вам возможность
00: 13: 25.06 доставлять лекарство просто на основе воды.
00: 13: 27.13 Кроме того,
00: 13: 29.07, что люди иногда делают в случае систем набухания
00: 13: 31.17, заставляют их набухать настолько
00: 13: 33.21, что они может оставаться в желудке немного дольше,
00: 13: 35.21, и это также может дать вам возможность, если вы выберете оральную систему,
00: 13: 38.25, возможно, заставит ее действовать дольше.
00: 13: 42.07 И, последний механизм для растворителей,
00:13:45.07 и из одного, о котором я собираюсь поговорить,
00: 13: 48.08 — это осмотическое давление.
00: 13: 50.09 Идея осмоса заключается в том, что происходит следующее:
00: 13: 53.04, если у вас есть … скажем так, у меня было два сайта,
00: 13: 58.22 У меня есть сайт 1, где я есть вода и много соли,
00: 14: 02.08, как поваренная соль,
00: 14: 04.16 и у меня есть участок 2, в котором только вода,
00: 14: 07.26, а затем они подключены мембраной.
00: 14: 10.04 Есть целая область, называемая термодинамикой
00:14:12.20, где происходит следующее:
00: 14: 14.16, если у вас есть эти два участка
00: 14: 16.10, и они разделены мембраной
00: 14: 18.11 и вода может проникать,
00: 14: 20.03 что они хотят иметь то, что называется
00: 14: 22.03, ту же термодинамическую активность,
00: 14: 23.14, поэтому происходит то, что вода на самом деле
00: 14: 26.24 хлынет от одного к другому, чтобы фактически разбавить его,
00: 14: 29.04, так что, надеюсь, когда-нибудь
00: 14: 31.06 будет иметь одинаковую концентрацию соли с обеих сторон.
00: 14: 34.12 Но когда это происходит,
00: 14: 35.29 это то, что приводит к осмотическому давлению,
00: 14: 39.21, потому что вода на самом деле устремляется в
00: 14: 41.18 и есть определенное количество давление
00: 14: 43.23, вызванное этим.
00: 14: 45.21 То же самое проявляется здесь в этом последнем механизме осмоса
00: 14: 48.12,
00: 14: 50.23 где лекарство растворено в полимере,
00: 14: 53.07, но теперь вода устремляется в
00: 14: 55.08, потому что наркотики не снаружи, а вода хочет…
00: 14: 58.24 вода хочет войти, чтобы разбавить это лекарство,
00: 15: 01.04, и вы видите эти трещины, эти пористые отверстия,
00: 15: 04.00 и те, которые позволяют высвобождаться.
00: 15: 05.26 Одна из проблем этой конкретной системы
00: 15: 08.27 заключается в том, что она не так воспроизводима.
00: 15: 12.07 Появляются трещины …
00: 15: 13.24 Сделать воспроизводимые трещины непросто,
00: 15: 15.28, но я хочу показать вам, что я считаю очень умным подходом
00:15 : 19.06 что сделано
00:15:21.18, где можно сделать осмотический насос,
00: 15: 23.26 и что интересного в этом насосе …
00: 15: 25.21 Я думаю, когда люди обычно думают о насосах
00: 15: 27.28, вы думаете о насосах, которые включают механические части
00: 15: 31.28, электричество и тому подобное.
00: 15: 34.03 В насосе, который я вам здесь покажу,
00: 15: 35.25 ничего этого нет.
00: 15: 37.15 Это полностью приводной насос,
00: 15: 39.24, и он действительно может дать вам очень и очень точную скорость высвобождения.
00: 15: 42.12 Итак, когда мы смотрим на этот слайд,
00: 15: 45.06 давайте сначала посмотрим на верхний левый угол,
00: 15: 47.23, это передний разрез,
00: 15: 50.03
00: 15: 52.19 — это внешняя мембрана
00: 15: 55.02, жесткая, но водопроницаемая,
00: 15: 57.13, поэтому вода может проходить через нее
00:15 : 59.08 и все же система не расширяется.
00: 16: 01.20 Сразу под
00: 16: 04.12 есть еще одна камера, где вы видите соль.
00: 16: 06.17 Эта соль может быть похожа на хлорид натрия или хлорид калия.
00: 16: 10.08 Эта соль, опять же,
00: 16: 12.11, что вызовет осмотическое давление,
00: 16: 14.10, потому что снаружи мало соли,
00: 16: 16.03, поэтому вода захочется броситься к этой соли.
00: 16: 19.17 И на самом деле вы загружаете соль
00: 16: 21.18 на довольно высоком уровне
00: 16: 23.18, так что она всегда будет выше ее уровня растворимости,
00:16:26.17, поэтому вода будет поступать с постоянной скоростью.
00: 16: 29.22 Теперь следующая камера,
00: 16: 31.24, когда мы продолжаем идти внутрь,
00: 16: 33.29 — это сжимаемая мембрана,
00: 16: 35.24, но эта сжимаемая мембрана в точности соответствует напротив
00: 16: 38.06 жесткой мембраны снаружи.
00: 16: 40.18 Эта сжимаемая мембрана непроницаема для воды,
00: 16: 42.23 другими словами, вода не может пройти через нее,
00: 16: 44.27, и все же она сжимаема, она не жесткая.
00: 16: 47.17 Вы могли бы сделать это, как воздушный шар.
00: 16: 49.27 И внутри этой камеры,
00: 16: 53.15, у вас растворенное лекарство.
00: 16: 55.23 Итак, единственная другая вещь
00: 16: 57.23, на которую я хотел указать, когда мы смотрим на этот верхний раздел
00: 17: 01.20, теперь, если мы посмотрим на вид сбоку,
00: 17: 03.20 на самом деле есть просверленное лазером отверстие
00: 17: 05.13 в самом передней части этой системы,
00: 17: 07.11, и вот как выйдет лекарство.
00: 17: 09.19 Но позвольте мне сейчас рассказать, как это работает,
00:17:11.14, и на самом деле он будет смотреть на нижнюю часть
00: 17: 14.18 этого слайда, которая показывает, как это происходит.
00: 17: 18.03 Итак, что происходит,
00: 17: 20.12, как я упоминал ранее, вода захочет устремиться в
00: 17: 23.06 с постоянной скоростью через эту жесткую мембрану
00:17: 25.27 и происходит следующее:
00: 17: 27.19, когда вода врывается с постоянной скоростью,
00: 17: 30.25 внешняя мембрана не расширяется,
00: 17: 32.14 вся система не расширяется, но …
00: 17: 35.29, поэтому единственное, что может произойти
00: 17: 38.08, — это камера, в которой находится соль,
00: 17: 40.07, которая расширяется внутрь
00: 17: 42.25, потому что это единственное место, где может идти вода.
00: 17: 45.16 Итак, вода врывается с постоянной скоростью,
00: 17: 48.11 разбавляя соль,
00: 17: 50.13, и сжимает эту сжимаемую мембрану.
00: 17: 52.17 Он не может попасть внутрь этой мембраны, но может сжать ее,
00: 17: 55.07, и она становится все меньше и меньше,
00:17:57.15 и это похоже на сжатие тюбика с зубной пастой,
00: 18: 00.06, и когда вы сжимаете его
00: 18: 02.07, единственное, что может произойти
00: 18: 04.08, — это содержимое в центре, раствор,
00: 18: 06.08 выйдите из просверленного лазером отверстия
00: 18: 08.16, где вы видите, что лекарство выходит из нижней части.
00: 18: 11.02 Итак, вы подавляете это осмотическим давлением
00: 18: 13.03 с точно постоянной скоростью,
00: 18: 14.21 лекарство выходит с точно постоянной скоростью,
00:18:17.25, и пациент получает стабильные роды.
00: 18: 22.19 Итак, что нового в этом, так это
00: 18: 24.25. Я думаю, это очень интересный пример
00: 18: 27.13, где для проектирования используются различные химические и физические принципы
00: 18: 29.24. стабильная система доставки,
00: 18: 34.04, и она действительно широко использовалась.
00: 18: 36.06 Эти виды систем используются для систем доставки
00: 18: 38.25 и изучения различных биологических объектов у животных,
00: 18: 41.26 и фактически его разновидностей
00:18:43.28 — это таблетки, которые, вероятно, принимает большинство людей.
00: 18: 46.09 Они могут этого не осознавать,
00: 18: 47.29, но иногда, если очень внимательно посмотреть вниз
00: 18: 50.06 на таблетку, можно увидеть маленькое просверленное лазером отверстие справа
00:18 : 52.26 где у них есть метка.
00: 18: 55.01 Итак, до сих пор я рассмотрел
00: 18: 57.01 несколько различных механизмов, с помощью которых они работают.
00: 19: 00.08 Теперь я подумал, что перейду и покажу вам, как они на самом деле используются
00: 19: 02.08 в разных приложениях.
00: 19: 04.20 На самом деле глаз был одним из первых мест
00: 19: 07.21, где люди использовали контролируемое высвобождение.
00: 19: 10.02 Они использовали его при глаукоме,
00: 19: 12.19, которая является основной причиной слепоты,
00: 19: 14.11 и при искусственных слезах, что очень неудобно.
00: 19: 17.06 Я рассмотрю каждый из них.
00: 19: 18.25 Это была одна из самых ранних систем
00: 19: 20.25, разработанных с контролируемым выпуском.
00: 19: 22.12 Это было в 70-е годы, и называлось оно Ocusert,
00:19:26.04 и это небольшое устройство, которое вы просто вставляете себе в глаз,
00: 19: 29.24, которое вы видите здесь,
00: 19: 31.22, на самом деле это резервуарная система, которая действует в течение одной недели.
00: 19: 38.04 Обычно, если бы кто-то болел этой болезнью,
00: 19: 40.10 должен был бы принять 28 глазных капель.
00: 19: 44.21 Здесь показано, как это устроено.
00: 19: 47.01 Это резервуарная система,
00: 19: 48.27, точно так же, как и первое, что я рассмотрел
00: 19: 50.28 на этих трех разных типах,
00:19:52.22 Итак, у вас есть пилокарпин, это лекарство.
00: 19: 55.01 Он окружен двумя мембранами
00: 19: 57.00, которые действительно контролируют скорость распространения,
00: 19: 59.21 и то, что они сделали,
00: 20: 01.09, чтобы люди могли это визуализировать. лучше,
00: 20: 03.10, они поставили прямо здесь кольцевое кольцо
00: 20: 06.17, в котором есть диоксид титана,
00: 20: 08.20, и это позволяет пациенту легко видеть.
00: 20: 11.03 Вот почему, когда вы посмотрели на последний слайд
00:20:13.07 у него было это маленькое кольцо внизу.
00: 20: 16.18 Итак, в зависимости от толщины этих двух мембран
00: 20: 20.25, которые фактически контролируют скорость высвобождения,
00: 20: 22.22, так что было сделано
00: 20: 24.24, чтобы сделать одну который выделяется со скоростью 40 мкг / час
00: 20: 27.09 после первоначального всплеска,
00: 20: 29.07 и другой, который выделяется со скоростью 20 мкг / час
00: 20: 31.17 после первоначального всплеска.
00: 20: 33.06 Но на самом деле, опять же, используя инженерные разработки
00: 20: 35.03, вы можете заставить их выпускаться в любом количестве,
00:20:37.00, просто контролируя толщину этих мембран,
00: 20: 39.18, так что это всего лишь две наиболее часто используемые мембраны.
00: 20: 43.17 Следующая система, о которой я хотел бы упомянуть, — это искусственная слеза.
00: 20: 46.09 Если у кого-то был сухой глаз
00: 20: 48.07, это может быть очень болезненно,
00: 20: 50.12 и цель состоит в том, чтобы вставить в глаз что-то
00: 20: 53.16, что могло бы длиться долго долго,
00: 20: 55.12 вместо того, чтобы заставлять кого-нибудь принимать глазные капли, ну знаете,
00: 20: 57.15 на самом деле иногда каждые 20 минут.
00: 20: 59.08 Итак, что было сделано, это создать аппликатор,
00: 21: 01.24, показанный здесь,
00: 21: 03.25, который вы можете использовать для сбора небольшого количества полимера
00: 21: 07.15, а затем бросьте его в глаз
00: 21: 10.11 и в основном, когда вы это сделаете,
00: 21: 13.18 он может длиться до 18 часов
00: 21: 15.23 и удерживать влагу роговицы.
00: 21: 17.29 Это ни в коем случае не идеальная система,
00: 21: 19.28, потому что одна из вещей, которые иногда случаются с некоторыми пациентами
00: 21: 22.02, — это помутнение зрения,
00:21:24 .10, но это иллюстрация того, что вы можете сделать,
00: 21: 26.02 и на самом деле я думаю, что это вызов для будущего
00: 21: 28.21, чтобы иметь возможность создавать такие системы, как эта
00: 21: 32.01, которые не будут есть какие-либо изменения остроты зрения.
00: 21: 36.19 Вероятно, одна из самых больших областей
00: 21: 38.11, где вся эта область контролируемого высвобождения
00: 21: 40.10 использовалась во всем мире
00: 21: 42.12, — это системы контрацепции.
00: 21: 44.06 Есть несколько способов
00:21:46.01, что это сделали люди:
00: 21: 47.23 неэродируемые подкожные имплантаты, разрушаемые имплантаты,
00: 21: 52.01 стероид-высвобождающие внутриматочные устройства,
00: 21: 53.22 и вагинальные кольца.
00: 21: 55.28 Я кратко их рассмотрю.
00: 21: 57.27 Вероятно, наиболее широко известной системой
00: 22: 00.18 для контрацепции с контролируемым высвобождением
00: 22: 03.02 является система, называемая Норплант.
00: 22: 05.12 На самом деле это показано здесь.
00: 22: 07.22 Это женский палец
00:22:09.20, и у нее есть эти шесть палочек,
00: 22: 11.17 теперь они их разработали так, что у вас может быть только две из них,
00: 22: 14.28, но они очень маленькие, они размером со спичку .
00: 22: 17.28 Их можно поместить под кожу
00: 22: 20.24 и они будут доставлять лекарство в течение 5 лет.
00: 22: 22.24 Это просто медленная диффузия через полимер,
00: 22: 25.08 через систему резервуаров, как я уже упоминал,
00: 22: 27.15, и этого хватит на 5 лет.
00: 22: 29.05 Вот пример:
00:22:31.00, где мы смотрим на кривые высвобождения для разных пациентов,
00: 22: 33.19, и это длится 2000 дней
00: 22: 35.26, даже несмотря на то, что он такой маленький, как то, что я вам показал.
00: 22: 38.16 Другая система, тоже резервуарная,
00: 22: 41.27 — это то, что называется Progestasert,
00: 22: 45.21 и эта система …
00: 22: 47.22 опять же, очень маленькая, она внутриматочное устройство.
00: 22: 50.10 Это опять женские пальцы
00: 22: 52.16 и опять вы кладете наркотик
00:22:55.22 в центре системы,
00: 22: 57.29, точно так же, как я показал ранее
00: 23: 00.01 с изображением, где лекарство было точками
00: 23: 03.10, а затем оно расплывется,
00: 23: 05.15 и вот пример
00: 23: 07.19, где посмотрите на основную матрицу.
00: 23: 09.17 Здесь точки снова представляют лекарство,
00: 23: 11.19, и лекарство будет распространяться
00: 23: 14.03 в течение 365 дней.
00: 23: 17.01 Это просто кривая, она не совсем постоянная,
00:23:20.00, но в основном это будет варьироваться от
00: 23: 23.05 за период 400 дней,
00: 23: 26.05 это довольно близко к 50 мкг / день за этот период.
00: 23: 30.21 Итак, это второй способ, которым люди это делают,
00: 23: 33.14, а также другие системы с контролируемым высвобождением
00: 23: 36.12, которые были разработаны для контрацепции.
00: 23: 40.25 Третья очень важная область
00: 23: 43.14 — это стоматология, собственно,
00: 23: 45.18, для которой люди используют контролируемое высвобождение.
00:23:47.22 Если посмотреть на процент пациентов
00: 23: 50.02 с заболеваниями пародонта,
00: 23: 52.00 это может быть 25% населения.
00: 23: 55.13 Чтобы узнать, есть ли у вас заболевание пародонта,
00: 23: 57.07 Я всегда знаю, что если я пойду к стоматологу
00: 23: 59.21, и они будут чистить зубы намного сложнее.
00: 24: 01.24, чем у нас, или, по крайней мере, у меня,
00: 24: 03.20, и если у них начнется кровотечение
00: 24: 05.24, значит, у вас, вероятно, какое-то заболевание пародонта.
00:24:07.20 Это неприятно, 2-3% людей
00: 24: 10.02, страдающих пародонтозом, нуждаются в операции.
00: 24: 12.19 Если у вас нет лечения
00: 24: 14.25, в результате не будет зубов.
00: 24: 16.11 Это не очень хороший результат.
00: 24: 18.03 Если вы сделаете операцию — это больно, это дорого.
00: 24: 21.04 Есть наркотики, которые употребляют люди,
00: 24: 22.26, такие как тетрациклин, но от них очень плохо.
00: 24: 24.21 желудок.
00: 24: 26.20 Итак, что сделано
00:24:28.26 состоит в том, чтобы на самом деле производить волокна
00: 24: 32.04 с тетрациклином или другими лекарствами,
00: 24: 34.05 и вот вы доставляете лекарство на месте.
00: 24: 36.27 Итак, поскольку вы доставляете лекарство локально,
00: 24: 38.24, а не по всему телу,
00: 24: 40.16 тело не получает столько
00: 24: 42.24 и поэтому он эффективен,
00: 24: 45.03, но с гораздо более низкой дозировкой,
00: 24: 46.24, как в этом случае, он эффективен с менее чем 1/1000-й дозы,
00:24:49.23, и дантист может применить их очень быстро,
00: 24: 51,22 примерно по 3 минуты на зуб.
00: 24: 53.28 Вы их почти не видите, я покажу вам картинку.
00: 24: 55.26 Они избавляются от проблемы, спирохет,
00: 24: 58.05 и не вызывают раздражения.
00: 24: 59.24 Я просто покажу вам пару картинок.
00: 25: 01.26 Вот изображение общей идеи
00: 25: 05.15 полого волокна внизу,
00: 25: 08.08 просто покрывающего зуб,
00: 25: 10.12 и оно доставит препарат с течением времени.
00: 25: 13.01 И позвольте мне пойти дальше
00: 25: 15.01 и показать вам, что было сделано.
00: 25: 17.06 Первоначально они использовали систему резервуаров,
00: 25: 19.15 это полое волокно,
00: 25: 21.01, где лекарство было помещено в центр,
00: 25: 22.20, но они получили некоторые утечки.
00: 25: 24.13 Итак, затем они перешли к матричной системе
00: 25: 26.02, где они равномерно распределяют его,
00: 25: 27.29 и тетрациклин является своего рода желтоватым лекарством,
00: 25: 30.07 так что сейчас это в этих волокнах
00:25:33.02, но они распределены равномерно,
00: 25: 34.27 и то, что сделал стоматолог,
00: 25: 37.00 и я просто покажу вам несколько фотографий …
00: 25: 39.28 вот пациент с пародонтозом ,
00: 25: 42.01 обратите внимание на красные десны.
00: 25: 44.15 Затем то, что делает стоматолог
00: 25: 47.17, — он помещает … она помещает
00: 25: 50.13 матричные системы, которые находятся на зубах
00: 25: 54.00, как вы их видите здесь
00: 25: 56.21 и поэтому они фактически находятся на нескольких зубах,
00:25:59.12, и это высвободит лекарство,
00: 26: 01.23, скажем, в течение 10 дней,
00: 26: 03.12, и когда вы закончите с этим,
00: 26: 05.18 заметите разницу в деснах.
00: 26: 07.17 Проблема исчезла.
00: 26: 09.15 И было много разных вариантов
00: 26: 11.07, которые люди использовали
00: 26: 13.06, чтобы помочь людям с этой проблемой.
00: 26: 15.08 Еще один действительно эффективный пример локальной доставки
00: 26: 18.10 — стент с лекарственным покрытием.
00: 26: 20.26 Если у кого-то сердечно-сосудистое заболевание,
00: 26: 23.02 один из наиболее распространенных способов лечения сердечно-сосудистых заболеваний на сегодняшний день
00: 26: 25.08
00: 26: 27.19 заключается в том, чтобы в основном поддержать открытый кровеносный сосуд
00: 26: 29.21 с такой системой.
00: 26: 31.17 Это стент,
00: 26: 33.10, и он в основном похож на китайскую головоломку с пальцами.
00: 26: 35.18 Он поддерживает открытый кровеносный сосуд,
00: 26: 37.06, но, к сожалению, примерно в 50% случаев
00: 26: 39.27, когда вы это делаете, вы получаете много клеток,
00:26:42 .17 гладкомышечных клеток пролиферируют,
00: 26: 44.16, и они блокируют сам кровеносный сосуд,
00: 26: 48.02, что нехорошо, и в худшем случае кто-то может умереть,
00: 26: 51.22 но даже если не считать
00: 26: 54.05, вам придется пойти и проделать еще одну операцию.
00: 26: 56.02 Итак, что было сделано, так это принять некоторые довольно токсичные противораковые препараты
00: 26: 59.26, такие как Taxol,
00: 27: 01.27 покрыть их полимером на эти стенты,
00:27: 05.07 и эти противораковые препараты обладают антипролиферативным действием,
00:27:08.15 они предотвращают деление гладкомышечных клеток
00: 27: 10.25 таким же образом,
00: 27: 13.26, и в основном они сохраняют кровеносный сосуд открытым,
00: 27: 16.03 и, вероятно, около миллиона пациентов используют это каждый раз. год.
00: 27: 20.26 Теперь я собираюсь немного переехать
00: 27: 23.20 из местной доставки, такой как зубы и стент
00: 27: 26.15, на системную доставку,
00: 27: 28.20 и снова перейти пара примеров.
00: 27: 31.04 Я думаю, что это очень важные области
00:27:33.28 для контролируемого высвобождения
00: 27: 36.06 — это много раз, когда люди придумывали новые лекарства
00: 27: 38.01, такие как пептиды и белки
00: 27: 40.01 за последние 20 или 30 лет.
00: 27: 41.26 Одним из них был так называемый
00: 27: 43.15 аналог лютеинизирующего гормона, высвобождающий гормон,
00: 27: 45.22, и было показано, что
00: 27: 48.08 очень эффективен при лечении некоторых болезни
00: 27: 50.05, такие как рак простаты, эндометриоз,
00: 27: 52.10 и другие болезни.
00: 27: 53.24 Проблема заключалась в том, что
00: 27: 55.17, поскольку это пептид с молекулярной массой 1200,
00: 27: 57.22 не было подходящего способа дать его пациенту.
00: 28: 00.02 Если пациент пытался его проглотить,
00: 28: 02.02 он разрушается в желудке и желудочно-кишечном тракте
00: 28: 05.14 ферментами.
00: 28: 06.23 Кроме того, он слишком велик, чтобы его можно было усвоить.
00: 28: 08.25 Они также пытались ввести его через носовые проходы
00: 28: 10.24 и другие вещи, но, опять же,
00:28:12.06 в кузов никто не попал.
00: 28: 14.08 Итак, они ввели его,
00: 28: 16.04 но проблема, когда вы вводите его, заключается в том, что ферменты
00: 28: 18.08 уничтожили его сразу,
00: 28: 19.27 так что теперь сделано
00: 28: 21.20 — это поместить его в маленькие микросферы
00: 28: 23.10, как в одной из тех матричных систем,
00: 28: 24.27, на самом деле биоэродируемая матричная система,
00: 28: 26.24, и вы действительно можете отпустите его на много дней.
00: 28: 29.25 Это график
00:28:31.23, но теперь Lupron Depot,
00: 28: 33.08, которым пользовались многие, многие миллионы пациентов …
00: 28: 36.15 большинство из них длятся около четырех месяцев.
00: 28: 39.02 Итак, вы делаете одну инъекцию каждые четыре месяца
00: 28: 41.20 пациенту, и он доставит лекарство.
00: 28: 44.23 Другой широко используемый пример
00: 28: 48.09 — для пациентов, страдающих шизофренией.
00: 28: 50.19 Если кто-то болен шизофренией
00: 28: 52.07, есть еще такие наркотики, как Риспердал
00:28:54.23, которые вполне подходят для пациента,
00: 28: 56.29, но часто люди забывают их принять,
00: 29: 00.26, и поэтому
00: 29: 03.02 было сделано, чтобы поместить их в другой тип. микросферы,
00: 29: 06.23 биоразлагаемая система, о которой я говорил,
00: 29: 09.20, и они вводятся каждые две недели.
00: 29: 11.28 На самом деле, они придумали один
00: 29: 14.01, который будет вводиться каждые четыре недели,
00: 29: 15.24, снова используя такие принципы
00:29:17.12, о котором я упоминал ранее.
00: 29: 19.01 И
00: 29: 22.01 это оказало огромное влияние на помощь пациентам, страдающим шизофренией.
00: 29: 25.23 Это уменьшило количество госпитализаций,
00: 29: 29.21 уменьшилось количество самоубийств,
00: 29: 32.08 и, вероятно, около пяти миллионов пациентов приняли их.
00: 29: 37.00 Другой пример, недавно одобренный,
00: 29: 39.02, представляет собой другую молекулу
00: 29: 41.08, которая может быть полезна в этом случае для лечения диабета 2 типа.
00:29:43.10 Это глюкагоноподобный пептид,
00: 29: 45.20, и что произошло, когда он вышел
00: 29: 48.27, он оказался эффективным с точки зрения повышения уровня сахара в крови
00: 29: 51.16 после приема пищи,
00 : 29: 53.24 но вам приходилось делать уколы два раза в день.
00: 29: 56.05 Теперь он помещен в одну из этих микросфер,
00: 29: 58.03 снова, одна из этих биоразлагаемых систем
00: 29: 59.27, о которых я упоминал,
00: 30: 01.23, и вводится один раз в неделю.
00: 30: 03.20 из разлагаемой системы под названием PLGA,
00:30:05.19, который представляет собой поли (молочно-гликолевую кислоту).
00: 30: 10.02 Последняя область, о которой я хотел поговорить
00: 30: 13.02, чтобы проиллюстрировать некоторые из этих моментов,
00: 30: 14.17 — это то, что называется трансдермальными системами.
00: 30: 16.10 В течение многих лет люди никогда бы не подумали
00: 30: 18.17, что можно доставлять наркотики через кожу
00: 30: 20.22, потому что вы могли подумать, что это может быть …
00: 30: 23.00 знаете, если бы вещи могли легко проникнуть сквозь кожу
00: 30: 25.09, это могло бы быть очень плохо,
00:30:26.25, как будто кто-то может заразиться.
00: 30: 28.15 Но что было обнаружено
00: 30: 30.28, так это то, что некоторые молекулы действительно могут проходить через кожу,
00: 30: 32.22, и что было сделано, так это снова создать
00: 30: 35.29 другая резервуарная система,
00: 30: 37.15, система на основе диффузии, показанная здесь,
00: 30: 39.22, и то, как она устроена
00: 30: 41.18, у вас есть поддерживающая мембрана,
00:30: 43.13 резервуар для лекарственного средства, который показан посередине,
00: 30: 45.27, мембрана, регулирующая скорость,
00:30:47.27 и, наконец, клей.
00: 30: 49.16 И вы просто поместите эту систему резервуаров,
00: 30: 51.19 резервуар с контролируемой диффузией,
00: 30: 53.22 на кожу, и она высвободит лекарство,
00: 30: 56.00, и это может длиться долго. в любом месте
00: 30: 58.11 от дня до недели.
00: 31: 00.20 Ключевой проблемой с точки зрения попадания лекарств
00: 31: 03.13 через кожу
00: 31: 05.09 является практически вся сопротивляемость
00: 31: 07.05 с точки зрения попадания лекарств через кожу.
00:31:08.25 — самый внешний скин-слой.
00: 31: 10.09 Это называется роговым слоем,
00: 31: 12.10, и на самом деле, если вы посмотрите на него под микроскопом
00: 31: 14.07, он выглядит как кирпичная стена.
00: 31: 16.09 Есть мертвые клетки, называемые кератиноцитами
00: 31: 18.05, а между ними есть липидные бислои,
00: 31: 20.28, и это обеспечивает очень плотный барьер
00: 31: 23.10, который делает его очень сложно пройти,
00: 31: 26.04, но если какая-то молекула имеет правильные характеристики,
00:31:29.10 как правильный размер молекулы
00: 31: 31.06 и правильная, скажем так, липофильность,
00: 31: 33.10, означающая, насколько он растворим в жирах,
00: 31: 35.05 на самом деле он может пройти.
00: 31: 37.10 Итак, я хотел бы сделать несколько общих замечаний
00: 31: 39.12 о трансдермальных системах.
00: 31: 41.11 Кожа, как я уже упоминал,
00: 31: 42.26 обычно непроницаема
00: 31: 44.20, а основное сопротивление
00: 31: 46.27 — это роговой слой
00: 31: 49.03, который на самом деле мертвая кожа,
00:31:51.03, но он имеет плотную оболочку, как я уже упоминал,
00: 31: 53.19 из кератиноцитов и липидных бислоев.
00: 31: 57.22 Проницаемость лекарственного средства
00: 32: 01.16 коррелирует с его растворимостью в воде,
00: 32: 03.09 — его молекулярной массой,
00: 32: 05.01 вы бы хотели, чтобы он был довольно маленьким,
00: 32: 06.24 и его коэффициент разделения масло / вода,
00: 32: 09.07, потому что, если лекарство больше того, что называется липидоподобным
00: 32: 11.09, то, знаете ли,
00: 32: 13.16. если взять принцип «подобное-растворяется-подобное»,
00:32:15.19 более вероятно, что она сможет проникнуть через липидные бислои
00: 32: 17.25, которые я показал вам на последнем слайде.
00: 32: 20.08 И, наконец, это полезно …
00: 32: 22.05 трансдермальные системы полезны для лекарств
00: 32: 24.01, требующих низких доз,
00: 32: 26.04 чем ниже, тем лучше, потому что по этому вопросу проницаемости,
00: 32: 28.06, а также для лекарств с высокой проницаемостью кожи.
00: 32: 32.09 Одно из важнейших направлений трансдермальных исследований
00:32:35.10 заключается в том, что
00: 32: 37.27 вы можете повысить проницаемость, используя определенные соединения,
00: 32: 41.07 химические соединения,
00: 32: 42.28 и просто в качестве примера,
00: 32: 44.28, когда люди поместили эстрадиол в пластырь,
00: 32: 47.23 для женщин в постменопаузе,
00: 32: 50.20 поток не очень высокий,
00: 32: 52.11 но они обнаружили, что вы можете принимать этанол
00:32 : 55.10 и вы можете поместить его в него,
00: 32: 57.05, и это увеличит поток в 20 раз,
00:32:59.13 и что это означает для пациента
00: 33: 01.14, это то, что они могут перейти от этого гигантского участка
00: 33: 03.14 к гораздо меньшему участку,
00: 33: 05.06, в 20 раз меньше,
00 : 33: 07.00 и это делает его практичным.
00: 33: 08.16 Кроме того, эти трансдермальные системы
00: 33: 11.06 легко наносятся и легко снимаются.
00: 33: 15.12 Одним из самых больших преимуществ
00: 33: 17.05 является тот факт, что когда вы делаете что-то трансдермально,
00: 33: 20.10, а не орально,
00:33:22.09 вы действительно значительно уменьшите эффект первого прохода.
00: 33: 25.01 Например, есть много лекарств, которые,
00: 33: 26.15, когда вы принимаете их перорально,
00: 33: 28.11 они разрушаются печенью,
00: 33: 30.17 и это приводит к к низкому количеству в крови
00: 33: 32.14, а также к изменчивости
00: 33: 34.19, но трансдермальные системы могут значительно уменьшить это количество.
00: 33: 38.20 Однако одним из возможных недостатков трансдермальной системы
00: 33: 41.26 является то, что для достижения устойчивого состояния требуется время,
00:33:44.09, может быть, 2-6 часов в некоторых случаях,
00: 33: 47.17 и это означает, что
00: 33: 49.14 возможно, если у вас была острая проблема,
00: 33: 51.04 например, внезапная боль,
00: 33: 52.27 оральная система была бы лучше, чем трансдермальная система,
00: 33: 55.15, но если у вас хроническая ситуация,
00: 33: 58.03 трансдермальный прием на самом деле неплох.
00: 34: 01.04 На этом слайде
00: 34: 04.13 просто показаны поток различных лекарств
00: 34: 07.05 и точки плавления
00:34:08.28 но, в частности, я хотел отметить
00: 34: 10.29, если вы посмотрите на лекарство сверху,
00: 34: 12.19, например, нитроглицерин, скополамин, фентанил …
00: 34: 14.16 все которые клинически используются
00: 34: 17.21 в трансдермальных системах,
00: 34: 19.07, их потоки довольно высоки,
00: 34: 21.06, но если вы спуститесь ближе к дну
00: 34: 23.14 и посмотрите при эстрадиоле,
00: 34: 25.15 эстрадиол имеет более низкий поток,
00: 34: 27.11, так что единственный способ действительно получить это до
00:34:29.24 может стать полезной трансдермальной системой
00: 34: 31.18, если у вас должен быть усилитель проницаемости,
00: 34: 34.21, который поднимет эстрадиол выше
00: 34: 38.25, так что он будет больше похож на скополамин,
00: 34: 40.15 Фентанил и нитроглицерин.
00: 34: 44.14 На последнем слайде,
00: 34: 46.04 Я просто хотел немного расширить эту точку
00: 34: 48.18 и рассмотреть методы улучшения.
00: 34: 51.03 Это большая область, вероятно, на будущее,
00:34:54.16, потому что большинство лекарств …
00: 34: 55.28 прямо сейчас существует только около 20-25 лекарств
00: 34: 57.21 или комбинаций лекарств
00: 34: 59.19, которые вводятся трансдермально,
00: 35: 01.17, хотя их используют миллионы пациентов.
00: 35: 04.09 Мы хотели бы увеличить количество лекарств
00: 35: 07.16, которые можно было бы давать таким образом,
00: 35: 09.26 так что один из способов сделать это
00: 35: 12.05, что люди глядя на электрические поля
00: 35: 14.05, как при ионофорезе.
00:35:15.29 Можете ли вы взять электрическое поле
00: 35: 18.21 и приложить его к лекарству
00: 35: 21.18, чтобы лекарство могло пройти через волосяные фолликулы или потовые протоки?
00: 35: 24.29 И это экспериментально,
00: 35: 26.28, но может когда-нибудь быть полезным для доставки пептидов,
00: 35: 30.01, например, в пластырях.
00: 35: 31.25 Электропорация, это второй метод,
00: 35: 34.11, и он также включает электричество,
00: 35: 36.06, но включает создание новых путей,
00:35:37.4 увеличивает проницаемость
00: 35: 48.08 и в некоторых случаях проходит клинические испытания.
00: 35: 51.06 Третье — УЗИ.
00: 35: 52.25 Ультразвук … на самом деле
00: 35: 54.13 уже была ультразвуковая система, одобренная FDA
00: 35: 57.07 для доставки обезболивающих,
00: 35: 59.08 и одна из вещей,
00: 36: 01.21 ультразвук помогает избавиться от любого типа задержки,
00: 36: 04.03, но также значительно увеличивает проникновение лекарств,
00:36:07.24, и люди изучают
00: 36: 10.19 различных типов больших молекул.
00: 36: 13.02 Для всех трех:
00: 36: 14.24 ионтофорез, электропорация,
00: 36: 16.05 и ультразвук,
00: 36: 18.08, одна из больших проблем — разработка
00: 36: 20.08 и миниатюризируя
00: 36: 22.14 и удешевляя устройства,
00: 36: 24.09, чтобы вы могли сделать небольшую заплату
00: 36: 26.09, которую пациент мог бы удобно носить.
00: 36: 28.17 В дополнение к этим методам,
00:36:30.08 существуют химические методы, такие как сделать лекарство более липофильным
00: 36: 33.27 путем создания так называемого пролекарства
00: 36: 35.23, что означает присоединение к лекарству чего-то липофильного
00: 36: 38.18 и, как я уже упоминал, усилители проникновения.
00: 36: 41.00 Итак, доставка лекарств, в общем,
00: 36: 43.26 — это на самом деле очень, очень обширная область.
00: 36: 45.13 Он включает в себя множество химических
00: 36: 47.22, а также физических и биологических принципов.
00: 36: 49.15 Это было очень, очень важно
00:36:51.01 для доставки всех видов наркотиков до сих пор,
00: 36: 54.09, и я думаю, что в будущем это будет еще более важно
00: 36: 56.15, когда мы придумаем …
00: 36: 58.13 и мир придумывает новые лекарства
00: 36: 59.29, такие как миРНК, мРНК, ДНК, редактирование генов,
00: 37: 05.21 всевозможные подходы
00: 37: 08.01 где действительно, я думаю, доставка
00:37 : 10.03 будет иметь решающее значение
00: 37: 12.15 для доставки этих важных молекул
00: 37: 14.10 в те клетки, где они вам нужны.
00: 37: 16.10 Большое спасибо.

РЕЗЮМЕ

Иммунная система кишечника постоянно взаимодействует с непатогенными комменсальными организмами и безвредными пищевыми антигенами, которые должны переноситься иммунологически, сохраняя при этом способность быстро реагировать на инфекционные организмы и токсины. Для поддержания этого баланса в кишечном микроокружении находятся уникальные популяции иммунных клеток. Например, было показано, что резидентные в кишечнике дендритные клетки (DC), которые экспрессируют поверхностный маркер CD103, влияют на гомеостаз кишечника, продуцируя метаболит витамина А ретиноевую кислоту (RA) (Scott, et al.2011). Также было показано, что кишечные макрофаги играют центральную роль в толерантности кишечника (Smith, et al. 2010; Bain and Mowat, 2014). Специфические подмножества CD4 ⁺ Т-хелперных клеток (T _H ), в первую очередь FOXP3-экспрессирующие регуляторные Т-клетки (T _reg клетки) и продуцирующие IL-17A T _H клетки (T _H 17 клеток) обогащены собственной пластинкой кишечника (LP) (Littman and Rudensky, 2010), тогда как CD8 ⁺ Т-клетки и γδ Т-клетки обнаруживаются во внутриэпителиальном компартменте (Cheroutre, et al.2011), действуя вместе с IgA-продуцирующими В-клетками, которые необходимы для поддержания толерантности к комменсальной флоре (Suzuki, et al., 2007). Однако молекулярные механизмы, которые регулируют функцию кишечных иммунных клеток при здоровье и болезни, полностью не определены.

Белки POZ и Kruppel / Zinc Finger и BTB (POK / ZBTB) представляют собой семейство факторов транскрипции, которые играют критическую роль в различных биологических процессах, таких как гаструляция, формирование конечностей, развитие клеточного цикла и образование гамет (Kelly and Даниил, 2006).В иммунной системе белки POK / ZBTB являются ключевыми регуляторами клеточной дифференцировки и функции (Lee and Maeda, 2012). Например, B-Cell CLL / Lymphoma 6 (BCL6, ZBTB27) имеет решающее значение для развития зародышевых центров (GC) после иммунизации или инфекции. BCL6 экспрессируется на высоких уровнях в GC B-клетках (Allman et al., 1996) и Т-фолликулярных хелперных клетках (T _FH ) (Нуриева и др., 2009), которые вместе контролируют реакцию зародышевого центра. Цинковый палец при промиелоцитарном лейкозе (PLZF, ZBTB16) необходим для развития NKT-клеток (Savage et al., 2008) и недавно было показано, что экспрессия PLZF идентифицирует мультипотентных предшественников врожденных лимфоидных клеток (ILCs) (Constantinides et al., 2014). POZ / Kruppel-подобный фактор, индуцирующий T-хелперы (ThPOK, ZBTB7B), является главным регулятором развития клеток T _H в тимусе (Wang et al., 2008; Muroi et al., 2008). Гиперметилированный при раке 1 (HIC1, ZBTB29) является членом этого семейства и, как было показано, регулирует пролиферацию и зависимую от р53 выживаемость в широком диапазоне опухолей. HIC1 эпигенетически подавляется посредством метилирования ДНК при различных раковых заболеваниях человека (Chen et al., 2003; Wales et al., 1995), и было высказано предположение, что HIC1-зависимая репрессия SIRT1 была критической для функции p53 (Chen et al., 2005). Однако роль HIC1 в иммунных клетках не изучалась.

В этом исследовании мы идентифицируем HIC1 как регулятор иммунных ответов кишечника в гомеостатических и воспалительных условиях. Мы демонстрируем, что HIC1 экспрессируется в иммунных клетках, в частности, в собственной пластинке кишечника, но не в других лимфоидных или нелимфоидных тканях в устойчивом состоянии.В отсутствие HIC1 в Т-клетках мы наблюдаем значительное снижение частоты Т-клеток в LP и интраэпителиальном компартменте, что совпадает с повышенными клеточными ответами T _H 17. Экспрессия HIC1 в LP регулируется метаболитом витамина А ретиноевой кислотой, и при воспалительных условиях в кишечнике потеря HIC1, в частности, в Т-клетках, делает мышей устойчивыми к развитию воспаления кишечника, что позволяет предположить, что HIC1 необходим для патогенности Т-клеток. in vivo.Таким образом, HIC1 играет центральную роль в иммунном гомеостазе кишечника и воспалении.

Чтобы начать рассмотрение роли HIC1 в иммунной системе, мы исследовали экспрессию HIC1 в лейкоцитах CD45 ⁺ в различных тканях мышей с флуоресцентным репортерным геном, встроенным в Локус Hic1 (мыши Hic1 ^Citrine ) (Поспичалова и др., 2011). Экспрессия цитрина в клетках CD45 ⁺ была ограничена кишечником, с единственными обнаруживаемыми цитрин-положительными клетками в собственной пластинке и интраэпителиальном пространстве (рис. 1а).Дальнейшая характеристика лейкоцитов в LP показала, что большая часть T-клеточных рецепторов β (TCRβ), экспрессирующих цепь CD4 ⁺ и CD8 ⁺ , и TCRγδ ⁺ CD8 ⁺ T-клеток в LP экспрессирует HIC1. (Рисунок 1b) и что TCRβ ⁺ CD8 ⁺ и TCRγδ ⁺ CD8 ⁺ интраэпителиальных лимфоцитов (IEL) также экспрессировали HIC1 (Рисунок 1c). Мы также обнаружили, что большинство макрофагов MHCII ⁺ CD11c ⁺ CD64 ^– -дендритных клеток (DC) и MHCII ⁺ CD64 ⁺ F4 / 80 ⁺ экспрессируют HIC1 (Рисунок 1 — Приложение 1 к рисунку).Однако экспрессия HIC1 не была обобщена для всех лимфоцитов в LP, поскольку В-клетки B220 ⁺ не экспрессировали HIC1 (рис. 1b). Таким образом, экспрессия HIC1 в иммунных клетках специфически идентифицирует популяции, проживающие в кишечнике.

(a) Устойчивое состояние тимуса, селезенки, крови, легкого, брыжеечного лимфатического узла (mLN), пейеровского пятна (PP), собственной пластинки кишечника и интраэпителиальных лейкоцитов анализировали проточной цитометрией на предмет экспрессии репортера Hic1 ^Citrine в целом CD45 ⁺ лейкоцитов.(b) TCRβ ⁺ CD4 ⁺ T-клетки, TCRβ ⁺ CD8 ⁺ T-клетки, TCRγδ ⁺ T-клетки или B220 ⁺ B-клетки были проанализированы с помощью проточной цитометрии на экспрессию репортера цитрина Hic1 ^{. из собственной пластинки кишечника или (в) интраэпителиального компартмента. (a-c) Данные представляют 3 независимых эксперимента.}

Поскольку HIC1 экспрессировался во множестве популяций иммунных клеток в LP, мы затем попытались определить внутренние функции HIC1, сосредоточив внимание на его роли, в частности, в Т-клетках.Для этого мы скрестили мышей с сайтами loxP, фланкирующими ген Hic1 (мыши Hic1 ^{fl / fl} ), с мышами, которые экспрессируют рекомбиназу Cre под контролем энхансера и промотора Cd4 (мыши Cd4-Cre), чтобы получить мышей с T внутренняя делеция Hic1 (мыши Hic1 ^ΔT ). Мыши Hic1 ^ΔT демонстрировали нормальное развитие тимуса (Рисунок 2 – приложение к рисунку 1a, b) и имели нормальные частоты CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток в селезенке (Рисунок 2 – приложение к рисунку 1c) или мезентериальных лимфатических узлах. (млН) (Рисунок 2 — дополнение к рисунку 1d).HIC1 также не влиял на состояние активации CD4 ⁺ Т-клеток селезенки, поскольку мы наблюдали эквивалентную экспрессию CD62L и CD44 у мышей Hic1 ^{f / f} и Hic1 ^ΔT (Рисунок 2 — приложение к рисунку 1e). Наконец, HIC1 не требовался для развития FOXP3 ⁺ CD25 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток в селезенке или млN (Рисунок 2 — приложение к рисунку 1f). Таким образом, экспрессия HIC1 необходима для гомеостаза периферических Т-клеток. Однако мы обнаружили, что частота и количество CD4 ⁺ и CD8 ⁺ TCRβ ⁺ клеток в LP (рис. 2a, b) и CD8 ⁺ Т-клеток в интраэпителиальном компартменте (рис. 2a, c) был значительно снижен в отсутствие HIC1, демонстрируя, что внутренняя экспрессия HIC1 Т-клетками необходима для гомеостаза Т-клеток кишечника.

Собственную пластинку кишечника (LPL) и интраэпителиальные (IEL) лимфоциты выделяли от мышей Hic1 ^{fl / fl} или Hic1 ^ΔT . (a) Частота TCRβ ⁺ Т-клеток и (b, c) общее количество TCRβ ⁺ CD4 ⁺ и TCRβ ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. (d) анализ проточной цитометрии и (e) количественная оценка экспрессии поверхностных маркеров CD103 и CD69 из IEL и LPL TCRβ ⁺ CD4 ⁺ и TCRβ ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток.(a, d) Данные представляют 3 независимых эксперимента. (b, c, e) Данные объединены из 3 независимых экспериментов (n = 6-7 на группу). * Р <0,05. Планки погрешностей указывают на SEM.

Лимфоциты собственной пластинки (LPL) и интраэпителиальные лимфоциты (IEL) демонстрируют активированный фенотип памяти, который включает маркеры CD69 и CD103, молекулы клеточной поверхности, которые важны для удержания в микроокружении кишечника. Было показано, что CD69 негативно регулирует экспрессию сфингозин-1-фосфатного рецептора (S1PR1), которая должна подавляться, чтобы установить резидентность в тканях (Matloubian et al., 2004; Skon et al., 2013), тогда как CD103 связывается с экспрессируемым эпителиальными клетками E-cadherin и необходим для поддержания кишечных T-клеток (Schön et al., 1999). Мы обнаружили, что HIC1-дефицитные CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки в LP и внутриэпителиальном компартментах экспрессировали значительно сниженные уровни CD69 и CD103 (рис. 2d, e). Поразительно, но была почти полная потеря CD103 ⁺ CD69 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток в LP (рис. 2d, e).Таким образом, сниженная частота и количество CD4 ⁺ и CD8 ⁺ LPL и IEL у мышей Hic1 ^ΔT связаны со сниженной экспрессией CD69 и CD103.

В кишечном LP CD4 ⁺ T _H 17 и T _reg клетки встречаются с более высокой частотой, чем другие T _H подмножества ячеек. Анализ LPL CD4 ⁺ показал, что, хотя частота клеток FOXP3 ⁺ T _reg была эквивалентна у мышей Hic1 ^{fl / fl} и Hic1 ^ΔT , частота RORγt ⁺ , экспрессирующих IL-17A. T _H 17 клеток у мышей Hic1 ^ΔT был значительно увеличен (рис. 3a, b).Эти результаты предполагают, что помимо регулирования количества Т-клеток в кишечнике, дефицит HIC1 в Т-клетках оказывает специфическое влияние на дифференцировку клеток Т _H 17. Чтобы непосредственно изучить роль HIC1 в дифференцировке клеток T _H , мы стимулировали клетки T _H , которые были очищены из селезенки и периферических лимфатических узлов (pLN) наивных мышей Hic1 ^{fl / fl} и Hic1 ^ΔT ( Рисунок 3c) в различных поляризационных условиях. Дефицит HIC1 не влиял на развитие клеток T _H 1, T _H 2 или TGF-β, индуцированных T _reg (iT _reg ) (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1).В соответствии с нашими результатами in vivo, мы наблюдали значительное увеличение продукции IL-17A HIC1-дефицитными клетками T _H , активированными в условиях, стимулирующих клетки T _H 17, с повышенной частотой и средней интенсивностью флуоресценции IL- 17A ⁺ (фигура 3d), что привело к значительному увеличению уровней секретируемого IL-17A (фигура 3e), что также было связано с повышенной экспрессией Il17a в HIC1-дефицитных клетках T _H 17 (фигура 3f). .Ретровирусная трансдукция HIC1 в дифференцирующиеся клетки T _H 17 приводила к полному ингибированию продукции IL-17A (фиг. 3g, h). Взятые вместе, эти результаты предполагают, что HIC1 является внутренним негативным регулятором продукции IL-17A во время дифференцировки клеток T _H 17.

(a, b) Стабильная собственная кишечная пластинка (LPL) CD4 ⁺ Т-клетки были выделены из мышей Hic1 ^{fl / fl} или Hic1 ^ΔT и проанализированы с помощью проточной цитометрии на внутриклеточную экспрессию RORγt, FOXP3 и IL. -17А.Данные объединены из 3 независимых экспериментов (n = 5-6 на группу). Hic1 ^{fl / fl} или Hic1 ^ΔT CD4 ⁺ селезенки Т-клетки были активированы в условиях поляризации клеток T _H 17 и проанализированы на: (c) экспрессию мРНК Hic1 с помощью количественной ОТ-ПЦР, (d) внутриклеточную Частота RORγt и IL-17A и средняя интенсивность флуоресценции (MFI) по данным проточной цитометрии, (e) продукция белка IL-17A с помощью ELISA и (f) экспрессия мРНК Il17a с помощью qRT-PCR. Данные объединены из 4 независимых экспериментов (n = 4-8 на группу).(g-h) Анализ экспрессии IL-17A из T _H 17 клеточно-поляризованных клеток, которые были ретровирусно трансдуцированы экспрессирующими векторами MigR1-IRES GFP (пустой вектор) или MigR1-Hic1-IRES GFP. GFP ⁺ указал на успешную ретровирусную инфекцию. (h) Данные объединены из 3 независимых экспериментов (n = 3 на группу). * Р <0,05. Планки погрешностей указывают на SEM.

Метаболит витамина A RA играет решающую роль в иммунном гомеостазе кишечника (Brown and Noelle, 2015a).Предыдущие исследования показали, что у мышей, выращенных на диете, не содержащей витамина А (диета с дефицитом витамина А (VAD)), наблюдаются дефекты активации клеток T _H и миграции кишечника, что приводит к общему нарушению иммунных ответов, вызванных Т-клетками, в организме человека. кишечник (Iwata et al., 2004; Johansson-Lindbom et al., 2005; Hall et al., 2011). Чтобы проверить, влияет ли RA на экспрессию HIC1 в клетках T _H кишечника, мы выращивали мышей Hic1 ^Citrine на диете VAD. Мы обнаружили, что клетки LP T _H от мышей VAD не смогли экспрессировать HIC1 (фиг. 4a), предполагая, что экспрессия HIC1 в клетках T _H в LP зависит от присутствия RA.В соответствии с этим добавление RA к клеткам T _H , выделенным из селезенки или лимфатических узлов мышей, активированных in vitro антителами против CD3 и CD28, приводило к усилению регуляции HIC1 на уровнях мРНК и белка (рис. 4b, c). Анализ экспрессии HIC1 с использованием мышей Hic1 ^Citrine дополнительно продемонстрировал, что обработка активированного T _H с помощью RA приводила к увеличению экспрессии HIC1 (фиг. 4d). Экспрессия HIC1 зависела от активации клеток T _H , поскольку добавление RA к клеткам T _H в отсутствие стимуляции рецептора Т-клеток не влияло на экспрессию мРНК Hic1 (фиг. 4e).Таким образом, эти результаты идентифицируют HIC1 как чувствительный к RA ген в активированных клетках T _H .

(a) Экспрессия репортера HIC1 в собственной пластинке кишечника (LP) CD4 ⁺ Т-клеток от мышей Hic1 ^Citrine , получавших контрольную диету, мышей Hic1 ^Citrine , получавших диету с дефицитом витамина A (VAD), и контрольных мышей, получавших контрольный рацион анализировали методом проточной цитометрии.Данные представляют 3 независимых эксперимента. (bd) клетки селезенки T _H были активированы антителами против CD3 и CD28 в присутствии или в отсутствие 10 нМ RA, и уровни HIC1 измеряли с помощью (b) количественной ОТ-ПЦР (c) вестерн-блоттинга и (d) репортера HIC1. выражение. (b) Данные объединены из 2 независимых экспериментов (n = 4 на группу). (c и d) Данные представляют 2 независимых эксперимента. (e) Экспрессию Hic1 в наивных CD4 ⁺ Т-клетках селезенки, обработанных 10 нМ RA в течение 16 часов, анализировали с помощью qRT-PCR.Данные объединены из 2 независимых экспериментов (n = 4 на группу). * Р <0,05. Планки погрешностей указывают на SEM.

RA имеет решающее значение для миграции иммунных клеток в кишечник (Iwata et al., 2004) посредством активации молекул кишечного хоминга, включая интегрин α4β7 и CCR9 (Johansson-Lindbom et al. , 2005). Наши результаты, показывающие, что у мышей Hic1 ^ΔT было пониженное количество кишечных Т-клеток, могло быть связано со сниженной экспрессией кишечных молекул хоминга, что приводило к нарушению миграции в кишечнике.Однако мы не смогли наблюдать какого-либо снижения экспрессии α4β7 и CCR9 на клетках T _H в присутствии или в отсутствие HIC1 после активации в присутствии RA (рис. 5а). Кроме того, мы обнаружили, что клетки T _H , выделенные из пятен Пейера или mLN мышей Hic1 ^ΔT , не обладали дефицитом экспрессии CCR9 (Рисунок 5 — рисунок в приложении 1). Эти результаты демонстрируют, что другие HIC1-зависимые механизмы, такие как сниженная экспрессия CD69 и CD103, были ответственны за малочисленность клеток T _H в LP и что HIC1 не обязателен для RA-зависимой индукции кишечных хоминговых молекул.

(a) клетки селезенки T _H были активированы антителами против CD3 и CD28 в присутствии 10 нМ RA; Уровни α4β7 ⁺ и CCR9 измеряли с помощью проточной цитометрии и количественной ОТ-ПЦР. Данные объединены из 2 независимых экспериментов (n = 4 на группу). (b) CD4 ⁺ Т-клетки селезенки активировали в условиях поляризации клеток T _H 17 в присутствии или в отсутствие 10 нМ RA и анализировали на внутриклеточный IL-17A и FOXP3 с помощью проточной цитометрии.Данные представляют 3 независимых эксперимента. * Р <0,05. Планки погрешностей указывают на SEM.

Несколько исследований продемонстрировали, что RA может отрицательно влиять на дифференцировку клеток T _H 17 (Mucida et al., 2007; Hill et al. , 2008; Schambach et al., 2007), хотя точные механизмы остаются неясными. Основываясь на наших данных, показывающих повышенную продукцию IL-17A клетками HIC1-deficeint T _H 17 in vitro и in vivo, мы предположили, что экспрессия HIC1 потребуется для RA-зависимого снижения дифференцировки клеток T _H 17.В отличие от наших ожиданий, добавление RA к HIC1-достаточным или дефицитным клеткам T _H привело к значительному снижению экспрессии IL-17A (рис. 5b). Таким образом, хотя HIC1 активируется с помощью RA в клетках T _H и Hic1-дефицитные клетки T _H 17 экспрессируют повышенные уровни IL-17A in vitro и in vivo, HIC1 необходим для RA-зависимой регуляции T _H 17 клеточные ответы in vitro.

Далее мы исследовали, оказывает ли дисрегулируемый клеточный ответ T _H , наблюдаемый у наивных мышей Hic1 ^ΔT , какое-либо влияние на развитие воспаления кишечника.Несмотря на пониженное количество клеток T _H в LP мышей Hic1 ^ΔT и нарушение регуляции продукции IL-17A Hic1-дефицитными клетками T _H 17, мы не смогли наблюдать каких-либо значительных различий в архитектуре кишечника между наивными мышами. Hic1 ^{fl / fl} или Hic1 ^ΔT мышей (рис. 6а, левые панели). После индукции воспаления кишечника внутрибрюшинной инъекцией моноклонального антитела против CD3 (Rutz et al., 2015; Esplugues et al., 2011; Merger et al., 2002), мыши Hic1 ^ΔT демонстрировали меньшее воспаление кишечника по сравнению с контрольными мышами Hic1 ^{fl / fl} (фиг. 6a, b). Хотя мы наблюдали меньше CD4 ⁺ Т-клеток в кишечнике обработанных мышей Hic1 ^ΔT (рис. 6c), мы действительно наблюдали увеличение количества CD4 ⁺ Т-клеток в LP обработанных мышей Hic1 ^ΔT . по сравнению с наивными мышами Hic1 ^ΔT (фиг. 2a, b), что дополнительно демонстрирует, что кишечная миграция не полностью нарушается в отсутствие HIC1.Анализ продукции цитокинов клетками T _H из LP мышей, обработанных анти-CD3, выявил повышенную частоту продуцирующих IL-17A клеток T _H без каких-либо изменений в частоте клеток, продуцирующих IFN-γ (рис. 6c). ), аналогично нашим результатам в стационарных условиях. Таким образом, экспрессия HIC1, присущая Т-клеткам, модулирует воспаление в кишечнике, потенциально за счет негативного регулирования продукции IL-17A.

Мыши получали антитело против CD3ε внутрибрюшинной инъекцией. (a) Через 48 часов после инъекции мышей умерщвляли и анализировали на патологию кишечной ткани и воспалительный инфильтрат путем окрашивания H&E. Масштабная шкала соответствует 100 мкм. (б) Гистологические оценки. (c) Общее количество TCRβ ⁺ CD4 ⁺ T-клеток собственной пластинки кишечника (LPL) определяли количественно с помощью проточной цитометрии. (d) Внутриклеточную экспрессию IL-17A и IFN-γ из LPL CD4 ⁺ Т-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии.(a-d) Данные взяты из 3 независимых экспериментов (n = 8-9 на группу). * Р <0,05. Планки погрешностей указывают на SEM.

Чтобы непосредственно оценить присущую клеткам роль HIC1 в воспалении кишечника, мы использовали модель кишечного воспаления с переносом Т-клеток (Powrie et al., 1993). Мы адоптивно перенесли наивные CD4 ⁺ CD25 ^— CD45RB ^high Т-клетки, выделенные от мышей Hic1 ^{fl / fl} или Hic1 ^ΔT , в мышей Rag1 ^{— / —} .Мыши Rag1 ^{— / —} , которые получали контрольные Т-клетки от мышей Hic1 ^{fl / fl} , начали терять вес примерно через 4 недели после переноса (фигура 7a) и показали значительное воспаление кишечника через 6 недель после переноса (фигура 7b). Поразительно, что мы обнаружили, что мыши Rag1 ^{— / —} , которые получали Т-клетки от мышей Hic1 ^ΔT , продолжали набирать вес и у них не развивалось тяжелое воспаление кишечника (фиг. 7a-c). В связи с уменьшением заболеваемости в кишечной LP было значительно меньше CD4 ⁺ Т-клеток (фигура 7d).Кроме того, в соответствии с нашими результатами в гомеостатических условиях, а также после лечения α-CD3, мы обнаружили, что отсутствие HIC1 в Т-клетках приводило к повышенной продукции IL-17A без значительного влияния на частоту IFN-γ-положительных клеток. (Рисунок 7e). Таким образом, экспрессия HIC1 в Т-клетках критически необходима для развития воспаления кишечника, возможно, за счет ограничения экспрессии IL-17A.

CD4 ⁺ CD25 – CD45RB ^hi наивные Т-клетки (4 × 10 ⁵ ) от мышей Hic1 ^{fl / fl} или Hic1 δ ^T переносили в Rag1 ^{— / —} мышей и наблюдали за колитом. . (а) Потеря веса (процент от исходного веса) была рассчитана для каждой мыши за 6 недель. (b) Через 6 недель после переноса мышей умерщвляли и анализировали на патологию кишечной ткани и воспалительный инфильтрат путем окрашивания H&E. Масштабная шкала соответствует 100 мкм. (c) Гистологические баллы.(d) Общее количество TCRβ ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток, выделенных из собственной пластинки кишечника (LPL). (e) Внутриклеточную экспрессию IL-17A и IFN-γ из LPL CD4 ⁺ Т-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. (a-e) Данные объединены в 2 из 4 независимых экспериментов (n = 4-8 на эксперимент). Статистические данные сравнивают мышей Rag1 ^{— / —} , которые получали Т-клетки Hic1 ^{fl / fl} , с мышами, которые получали Т-клетки Hic1 ^ΔT . * Р <0,05. Планки погрешностей указывают на SEM.

Было показано, что помимо прямого репрессирования генов-мишеней, HIC1 негативно регулирует экспрессию генов с помощью нескольких механизмов, включая рекрутирование корепрессоров, таких как CtBP, NuRD и комплексы polycomb repressive complex 2 (PRC2) для нацеливания на гены, чтобы опосредовать репрессию генов (Van Rechem et al., 2010; Boulay et al., 2012). Кроме того, также было показано, что HIC1 косвенно репрессирует транскрипцию путем связывания с активаторами транскрипции и предотвращения связывания с генами-мишенями. Было показано, что HIC1 взаимодействует и ингибирует связывание ДНК с факторами транскрипции, такими как Т-клеточный фактор-4 (TCF4), β-катенин и STAT3 (Valenta et al., 2006; Lin et al., 2013; Hu et al., 2016). Поскольку HIC1-дефицитные клетки T _H 17 продуцируют повышенные уровни целевого гена STAT3 IL-17A (Durant et al., 2010), мы предположили, что повышенная активность STAT3 была связана с дефицитом HIC1.Сначала мы исследовали уровни IL-6-индуцированного активного фосфорилированного STAT3 (pSTAT3) в HIC1-достаточных и дефицитных клетках T _H 17 с помощью проточной цитометрии. Мы обнаружили, что потеря HIC1 не влияла на частоту pSTAT3-положительных клеток T _H (фиг. 8a), предполагая, что HIC1 не влиял на активацию вышестоящего STAT3. Однако исследования коиммунопреципитации на клетках T _H 17 либо нативного HIC1 (фиг. 8b), либо ретровирусно-трансдуцированного FLAG-меченного HIC1 (фиг. 8c) продемонстрировали, что HIC1 и STAT3 взаимодействуют в клетках T _H 17.Таким образом, наши результаты предполагают, что HIC1 ограничивает дифференцировку клеток T _H 17 путем связывания с STAT3, ингибируя его связывание с ДНК и активацию транскрипции. В соответствии с этой гипотезой мы обнаружили повышенное связывание STAT3 с промотором Il17a в отсутствие HIC1 (фиг. 8d), тогда как не было никакой разницы в связывании на нерелевантном сайте (промотор Il5). Взятые вместе, наши результаты указывают на важную роль HIC1 в ограничении экспрессии IL-17A в клетках T _H 17 путем ингибирования связывания ДНК STAT3.

CD4 ⁺ Т-клетки активировались в условиях поляризации клеток T _H 17. (а) Проточно-цитометрический анализ фосфорилирования STAT3 из клеток T _H 17, рестимулированных с помощью или без IL-6 в течение 15 минут. Цифры представляют собой среднюю интенсивность флуоресценции. Данные представляют 2 независимых эксперимента. (b) Входные данные, иммунопреципитаты (IP) против STAT3 и нормальная IP сыворотки крысы из клеток T _H 17 подвергали иммуноблоттингу с антителами против STAT3 и против HIC1.1 и 2 представляют собой дубликаты культур Т _Н 17. Данные представляют 2 независимых эксперимента. (c) Входные данные и IP анти-FLAG от T _H . 17 клеток, ретровирусно трансдуцированных векторами MigR1 (пустой) или MigR1 FLAG-HIC1, подвергали иммуноблоттингу с помощью антитела против STAT3. Данные представляют 2 независимых эксперимента. (d) Иммунопреципитационный анализ хроматина (ChIP) связывания STAT3 с промоторами Il17a и Il5 в клетках T _H 17. Данные взяты из 3 независимых экспериментов (n = 6 на группу).* Р <0,05. Планки погрешностей указывают на SEM.

Мы определили транскрипционный фактор HIC1 как новый регулятор иммунного гомеостаза кишечника. В устойчивом состоянии HIC1 специфически экспрессируется в иммунных клетках кишечной LP и интраэпителиальных ниш RA-зависимым образом, а у мышей с внутренней делецией HIC1 Т-клетками наблюдается резкое снижение количества Т-клеток в тканях кишечника. . Дефицит HIC1 приводит к повышенной экспрессии IL-17A, возможно, из-за потери ингибирования STAT3.При воспалительных условиях экспрессия HIC1 в Т-клетках необходима для патологии кишечника, что позволяет идентифицировать HIC1 как потенциальную терапевтическую мишень для лечения воспаления кишечника.

Наши результаты предполагают, что микронутриент RA регулирует экспрессию HIC1 в иммунных клетках кишечника. В подтверждение этого два неродственных скрининга экспрессии генов в клетках T _H , регулируемых передачей сигналов RA, идентифицировали HIC1 как RA / RARα-зависимый ген, хотя функциональный анализ не проводился (Kang et al., 2011; Brown et al., 2015b). Эти результаты согласуются с исследованием in silico, показывающим, что ген Hic1 содержит множественные элементы ответа рецептора RA (RAREs) (Lalevée et al., 2011). Однако HIC1 незаменим для RA-опосредованной экспрессии кишечных хоминговых молекул и RA-зависимого подавления продукции IL-17A in vitro, предполагая, что ось RA-HIC1 играет специфическую роль в регуляции гомеостаза кишечных Т-клеток, что еще предстоит определить.

Делеция HIC1, присущая Т-клеткам, привела к значительному снижению частоты и количества Т-клеток в кишечном микроокружении.Интересно, что у мышей, выращенных на диете VAD, также наблюдается пониженное количество кишечных Т-клеток (Iwata et al., 2004). Поскольку было показано, что RA регулирует экспрессию кишечных хоминговых молекул, таких как интегрин CCR9 и α4β7, мы сначала заподозрили, что дефектный транспорт в кишечник ответственен за малочисленность Т-клеток в кишечнике мышей Hic1 ^ΔT ; однако мы не наблюдали каких-либо дефектов способности Hic1-дефицитных Т-клеток экспрессировать CCR9 или α4β7. Кроме того, мы наблюдали значительный приток Т-клеток в ткани кишечника после индукции воспаления, что также позволяет предположить, что миграция в кишечник не регулируется экспрессией HIC1.Однако мы действительно наблюдали, что Hic1-дефицитные Т-клетки, присутствующие в кишечнике в устойчивом состоянии, экспрессировали значительно более низкие уровни поверхностных молекул CD69 и CD103. Эти молекулы экспрессируются резидентными клетками ткани и необходимы для удержания в тканях. Действительно, аналогично нашим результатам, у мышей с дефицитом CD103 наблюдается серьезное снижение количества Т-клеток в кишечнике (Schön et al., 1999). Таким образом, HIC1, по-видимому, необходим для оптимальной экспрессии CD69 и CD103 и удержания Т-клеток в кишечном микроокружении.

Кроме того, CD69 и CD103 являются характерными маркерами подмножества Т-клеток памяти, известных как резидентные Т-клетки памяти (T _RM ). Клетки T _RM представляют собой долгоживущие покоящиеся клетки, которые, как считается, произошли от эффекторных Т-клеток, которые мигрировали в нелимфоидные ткани. Интересно, что HIC1, как было показано, контролирует фундаментальные клеточные процессы, такие как рост и выживание клеток (Rood and Leprince, 2013; Dehennaut et al., 2012). Было показано, что HIC1 взаимодействует и регулирует ключевые факторы транскрипции, участвующие в развитии клеточного цикла и клеточном метаболизме (Van Rechem et al., 2010; Ли и др., 2012). Напр., HIC1 участвует в регуляторной петле обратной связи с деактеилазой SIRT1 (Chen et al., 2005), которая является ключевым регулятором окисления жирных кислот (Gerhart-Hines et al., 2007). Кроме того, было продемонстрировано, что метаболизм жирных кислот является ключом к развитию и выживанию Т-клеток памяти (van der Windt and Pearce, 2012; Pearce et al., 2009). Таким образом, возможно, что в дополнение к прямому регулированию удержания Т-клеток в тканях, HIC1 может также потребоваться в Т-клетках для обеспечения покоя посредством метаболических путей.Будущие исследования будут стремиться охарактеризовать роль HIC1 в покое Т-клеток и развитии памяти.

Другим наблюдением было увеличение частоты продуцирующих IL-17A клеток T _H 17 в кишечнике мышей Hic1 ^ΔT . Было показано, что клетки T _H 17 играют важную роль в защите хозяина от внеклеточных бактерий и грибов (Annunziato et al., 2015). Однако они также были описаны как патогенные при множественных воспалительных заболеваниях, таких как псориаз и ревматоидный артрит, и нацеливание на IL-17A оказалось эффективным лечением (Papp et al., 2012; Леонарди и др., 2012; Genovese et al., 2010). Однако роль IL-17A в воспалительном заболевании кишечника противоречива. Первоначальные исследования с использованием модели колита с переносом Т-клеток предоставили первое доказательство того, что клетки T _H 17, управляемые IL-23, являются патогенными (Ahern et al., 2010). Однако таргетная терапия против IL-17A при болезни Крона оказалась неэффективной (Targan et al., 2012; Hueber et al., 2012), а недавние исследования показали, что IL-17A важен для поддержания целостности кишечного барьера и обладает защитным действием. роль в развитии колита (Lee et al., 2015; Максвелл и др., 2015). Кроме того, становится все более очевидным, что линия клеток T _H 17 имеет степень гетерогенности в отношении патогенности. Например, клетки T _H 17, дифференцированные в присутствии TGFβ, менее патогенны и продуцируют более высокие уровни IL-10, в то время как клетки, дифференцированные в присутствии IL-23, являются более патогенными и могут продуцировать IFN-γ (Lee et al. , 2012; McGeachy et al., 2007). Кроме того, клетки T _H 17 обладают определенной степенью пластичности, и исследования картирования судеб показали, что клетки ex-T _H 17 теряют способность полностью продуцировать IL-17A и в определенных условиях продуцировать только IFN-γ. (Hirota et al., 2011). Поскольку наши исследования показывают повышенную продукцию IL-17A из клеток T _H 17 и отсутствие патогенности на множестве моделей кишечного воспаления на мышах, мы предполагаем, что в отсутствие HIC1 клетки T _H 17 смещены в сторону более защитная линия и не переходят в патогенные клетки. Точные молекулярные механизмы того, как HIC1 регулирует патогенность Т-клеток, еще предстоит полностью выяснить.

Таким образом, мы идентифицировали транскрипционный фактор HIC1 как RA-чувствительный клеточный внутренний регулятор функции Т-клеток в кишечнике.Благодаря взаимодействию со STAT3, HIC1 ограничивает продукцию IL-17A клетками T _H 17 и необходим для развития воспаления кишечника. Вместе эти результаты предполагают, что HIC1 является привлекательной терапевтической мишенью для лечения воспалительных заболеваний кишечника, таких как болезнь Крона, и потенциально других заболеваний, связанных с дисрегулируемыми клеточными ответами T _H 17.

Эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Британской Колумбии (номер протокола A15-0196) и проводились в соответствии с Канадскими рекомендациями по исследованиям на животных.

Было описано поколение мышей Hic1 ^Citrine (Pospichalova et al., 2011), а поколение мышей Hic1 ^{fl / fl} будет описано в другом месте (рукопись находится в стадии подготовки). Мыши Cd4-Cre были получены от Taconic. Животные содержались в особой среде, свободной от патогенов, в животноводческом центре Биомедицинского исследовательского центра.

Диета с дефицитом витамина А (TD.09838) была приобретена у Harlan Teklad Diets. На 14.5 день беременности беременным самкам вводили диету с дефицитом витамина А и поддерживали диету до отъема помета.После отъема самок возвращали к стандартной диете, тогда как отъемышей содержали на специальной диете до использования.

Абсолютное количество клеток определяли с помощью гемоцитометра или латексных шариков для образцов LP. Окрашивание внутриклеточных цитокинов (IC) выполняли путем стимуляции клеток форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA), иономицином и брефельдином-A (Sigma) в течение 4 часов и фиксации / пермеабилизации клеток с использованием буферного набора IC eBioscience. Все разведения антител и окрашивание клеток проводили с помощью PBS, содержащего 2% FCS, 1 мМ EDTA и 0.05% азид натрия. Краситель Fixable Viability Dye eFluor 506 был приобретен у eBioscience, чтобы исключить мертвые клетки из анализов. Перед окрашиванием образцы блокировали Fc с помощью буфера, содержащего анти-CD16 / 32 (93, eBioscience) и 1% крысиной сыворотки, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител. Клетки окрашивали флуоресцентно конъюгированными анти-CD11b (M1 / 70; in house), анти-CD4 (GK1.5), анти-CD8 (53-6.7), анти-TCRβ (H57-597), анти-MHCII (IA / IE) (M5 / 114.15.2), анти-CD11c (N418), анти-F4 / 80 (BM8), анти-IL17a (17B7), анти-FOXP3 (FJK-16s), анти-B220 (RA3-6B2 ), анти-TCRγδ (eBioGL3), анти-CD45 (30-F11), анти-CD45RB (C363.16A) анти-α4β7 (DATK32), анти-CCR9 (eBioCW-1.2), анти-IFN-γ (XMG1.2), CD25 (PC61.5), IL-13 (eBio13A), приобретенные у eBioscience, анти-CD103 ( M290), анти-CD69 (h2.2F3), анти-CD62L (MEL-14), анти-CD44 (IM7), анти-CD64 (X54.5 / 7.1.1), анти-pSTAT3 (pY705), приобретенные у BD. Биологические науки. Данные были получены на проточном цитометре LSR II (BD Biosciences) и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar). Выделение РНК

Ткани механически гомогенизировали и РНК экстрагировали с использованием метода TRIzol в соответствии с инструкциями производителя (Ambion).кДНК получали с использованием наборов для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Biosystems). Количественную ПЦР проводили с использованием SYBR FAST (Kapa Biosystems) и наборов оптимизированных для SYBR green праймеров, запускаемых на машине для ПЦР в реальном времени ABI 7900 (Applied Biosystems). Значения порога цикла (C _T ) были нормализованы относительно экспрессии гена бета-актина (Actb). Используемые праймеры были синтезированы de novo:

Hic1:

прямое 5′-AACCTGCTAAACCTGGACCAT-3 ‘

обратное 5′-CCACGAGGTCAGGGATCTG-3′

Il17a:

обратное 5′-AGCAG3

5′-AGCAG ‘-TCACAGAGGGATATCTATCAGGGTC-3’

Ifng:

вперед 5′-GGATGCATTCATGAGTATTGCC-3 ‘

назад 5′-CCTTTTCCGCTTCCTGAGG-3’TTTT

Il13GCCTGAGG-3’TTT

Il13GCCT 50003

GGTCTTGTGTGATGTTGCTCA-3 ‘

Foxp3:

вперед 5′-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3′

обратный 5′-TTCTCACAACCAGGCCACTTG-3TA-

CCTGATGATGAT

Actb 935GCCT

Actb: 9000GCCTGAT

Actb: 9000GCCAT 3 ‘.Культура клеток

CD4 ⁺ Т-клетки выделяли из селезенки и LN путем отрицательной селекции с использованием набора для выделения Т-клеток EasySep Mouse CD4 ⁺ (StemCell Technologies). 5 x 10 ⁵ Клеток CD4 ⁺ культивировали до 5 дней в среде DMEM с добавлением 10% инактивированного нагреванием FBS, 2 мМ глутамина, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 25 мМ HEPES и 5 x 10 ^-5 2-ME с 1 мкг / мл плашки связали анти-CD3 (145-2C11) и анти-CD28 (37,51). CD4 ⁺ Т-клетки поляризовались под действием 17 клеток T _H (20 нг / мл IL-6, 10 нг / мл IL-23, TNF-α, IL-1β, 1 нг / мл TGF-β1, 10 мкг / мл анти-IFN-γ и анти-IL-4), T _H 1 клетка (10 нг / мл IL-2, IL-12 и 5 мкг / мл анти-IL-4), T _H 2 клетки (10 нг / мл IL-2, IL-4 и 5 мкг / мл анти-IFN-γ) или iT _reg клетки- (10 нг / мл IL-2 и TGFβ1), способствующие условиям.В некоторых случаях клетки высевали, как указано выше, в присутствии 10 нМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich).

Продукция IL-17A анализировалась из супернатантов, взятых на 4 день культивирования CD4 ⁺ Т-клеток in vitro, с использованием коммерчески доступных пар антител (eBioscience).

Мышам вводили 30 мкг анти-CD3ε-антитела (145-2C11) в 400 мкл PBS путем внутрибрюшинной инъекции. За животными ежедневно наблюдали после инъекции и умерщвляли через 48 часов после инъекции.В конечном итоге срезы дистального отдела подвздошной кишки фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали парафином и окрашивали H&E. Гистологическое воспаление оценивали вслепую по шкале от 0 до 4, где 0 представляло нормальную подвздошную кишку, а 4 — тяжелое воспаление. Учитывались такие специфические аспекты, как инфильтрация иммунных клеток, длина крипт, эрозия эпителия и толщина мышц.

Клетки CD4 ⁺ были обогащены из селезенки и периферических LN (pLN) мышей Hic1 ^{fl / fl} или Hic1 ^ΔT с помощью набора EasySep Mouse CD4 ⁺ для выделения Т-клеток (StemCell Technologies) и окрашивали анти-CD4, анти-CD25 и анти-CD45RB.Наивные CD4 ⁺ CD25 ^— CD45RB ^hi клетки очищали сортировкой клеток. CD4 ⁺ CD25 ^— CD45RB ^hi наивных Т-клеток (4 × 10 ⁵ ) вводили внутрибрюшинно мышам Rag1 ^{— / —} того же возраста и пола, за которыми наблюдали потерю веса и забивали 6 недели после начала эксперимента. В конечной точке проксимальный отдел толстой кишки фиксировали, заделывали и окрашивали H&E. Гистологическое воспаление оценивали, как указано выше.

Пятна Пейера были удалены из тонкой кишки, которую разрезали в продольном направлении, на короткое время промывали ледяным PBS и разрезали на кусочки размером 1,5 см. Ткань инкубировали в 2 мМ EDTA PBS в течение 15 минут при 37 ° C и интенсивно встряхивали. Супернатанты собирали и осаждали, затем ресуспендировали в 30% растворе Перколла и центрифугировали в течение 10 минут при 1200 об / мин. Осадок собирали и использовали в качестве интраэпителиальных лейкоцитов. Оставшаяся ткань была переварена с помощью Collagenase / Dispase (Roche) (0.5 мг / мл) на шейкере при 250 об / мин, 37 ° C, в течение 60 минут, интенсивно встряхивают и фильтруют через фильтр для ячеек 70 мкм. Суспензию проточных клеток центрифугировали при 1500 об / мин в течение 5 мин. Осадок клеток повторно суспендировали в 30% растворе Перколла и центрифугировали в течение 10 минут при 1200 об / мин. Осадок собирали и использовали в качестве лейкоцитов собственной пластинки.

Клетки лизировали и проводили иммунопреципитацию с использованием антител против STAT3 (C-20; Santa Cruz) и FLAG (M2; Sigma).Иммуноблоттинг проводили с использованием антител против STAT3, HIC1 (H-123; Santa Cruz) и GAPDH (GA1R; in house).

Наивные CD4 ⁺ Т-клетки были активированы и Т _H 17 поляризованы в течение 3 дней с последующим сшиванием в течение 8 минут 1% (об. / Об.) Формальдегидом. Клетки собирали, лизировали и обрабатывали ультразвуком. После предварительной очистки агарозными шариками с протеином А (Upstate) клеточные лизаты подвергали иммунопреципитации в течение ночи при 4 ° C с анти-STAT3 (C-20, Santa Cruz) или нормальным кроличьим IgG (Cell Signaling).После промывки и элюирования сшивки обращали в течение 4 ч при 65 ° C. Элюированную ДНК очищали и образцы анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на системе 7900 Real-Time PCR (Applied Biosystems). Для анализа использовались следующие наборы праймеров: промотор Il17a, прямой 5’-CACCTCACACGAGGCACAAG-3 ’и обратный 5’-ATGTTTGCGCGTCCTGATC-3’; Промотор Il5 направляет 5’-AAGTCTAGCTACCGCCAATA-3 ’и обратный 5’-AGCAAAGGTGAGTTCAATCT-3’. Каждое значение Ct было нормализовано к соответствующему входному значению.

Platinum E клетки временно трансфицировали с использованием кальций-фосфатного метода плазмидами экспрессии MigR1, кодирующими только GFP или FLAG-HIC1.