Бактериофаг синегнойный инструкция: Бактериофаг псевдомонас аеругиноза (синегнойный), инструкция по применению, противопоказания. состав

Содержание

Бактериофаг синегнойный р-р для внутр наруж и местн примен фл 100мл микроген нпо фгуп мз рф

Состав

Препарат представляет собой стерильный фильтрат фаголизата бактерий синегнойной палочки. Бактериофаг псевдомонас аеругиноза (синегнойный) — прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности.

Форма выпуска

Флакон ,100 мл.

Фармакологическое действие

Бактериофаг псевдомонас аеругиноза (синегнойный) обладает способностью специфически лизировать бактерии синегнойной палочки.

Показание к применению

Лечение и профилактика гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний, вызванных синегнойной палочкой, а также дисбактериозов. Показания к применению: заболевания уха, горла, носа, дыхательных путей и легких — воспаления пазух носа, среднего уха, ангина, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония, плеврит, хирургические инфекции — нагноения ран, ожоги, абсцесс, флегмона, фурункулы, карбункулы, гидраденит, панариции, парапроктит, мастит, бурсит, остеомиелит, урогенитальные инфекции — уретрит, цистит, пиелонефрит, кольпит, эндометрит, сальпингоофорит. Энтеральные инфекции — гастроэнтероколит, холецистит, дисбактериоз. Генерализованные септические заболевания, гнойно-воспалительные заболевания новорожденных — омфалит, пиодермия, конъюнктивит, гастроэнтероколит, сепсис и др. Другие заболевания, вызванные синегнойной палочкой. С профилактической целью препарат используют для обработки послеоперационных и свежеинфицированных ран, а также для профилактики внутрибольничных инфекций по эпидемическим показаниям. Важным условием эффективной фаготерапии является предварительное определение фагочувствительности возбудителя.

Способ применения и дозы

Лечение гнойно-воспалительных заболеваний с локализованными поражениями должно проводиться одновременно как место, так и через рот 7-20 дней (по клиническим показаниям). В зависимости от характера очага инфекции бактериофаг применяют: Местно в виде орошения, примочек и тампонирования жидким фагом в количестве до 200 мл в зависимости от размеров пораженного участка. При абсцессах бактериофаг вводят в полость очага после удаления гноя с помощью пункции. Количество вводимого препарата должно быть несколько меньше объема удаленного гноя. При остеомиелите после соответствующей хирургической обработки в рану вливают бактериофаг по 10-20 мл. Введение в полости — плевральную, суставную и другие ограниченные полости до 100 мл бактериофага, после чего оставляют капиллярный дренаж, через который в течение нескольких дней повторно вводят бактериофаг. При циститах, пиелонефритах, уретритах препарат принимают внутрь. В случае, если полость мочевого пузыря или почечной лоханки дренированы, бактериофаг вводят через цистостому или нефростому 1-2 раза в день по 20-50 мл в мочевой пузырь и по 5-7 мл в почечную лоханку. При гнойно-воспалительных гинекологических заболеваниях препарат вводят в полость вагины, матки в дозе 5-10 мл ежедневно однократно. При гнойно-воспалительных заболеваниях уха, горла, носа препарат вводят в дозе 2-10 мл 1-3раза в день. Бактериофаг используют для полоскания, промывания, закапывания, введения смоченных турунд (оставляя их на 1 час). При кишечных формах заболевания, заболеваниях внутренних органов, дисбактериозе бактериофаг применяют через рот и в клизме. Через рот бактериофаг дают 3 раза в сутки натощак за 1 час до еды. В виде клизм назначают 1 раз в день вместо одного приема через рот.Применение бактериофагов не исключает использования других антибактериальных препаратов. В случае, если до применения бактериофага для лечения ран применялись химические антисептики, рана должна быть тщательно промыта стерильным раствором натрия хлорида. Применение бактериофага v детей (до 6 месяцев). При сепсисе, энтероколите новорожденных, включая недоношенных детей, бактериофаг применяют в виде высоких клизм (через газоотводную трубку или катетер) 2-3 раза в сутки (см. табл.). При отсутствии рвоты и срыгивания возможно применение препарата через рот. В этом случае он смешивается с грудным молоком. Возможно сочетание ректального (в клизмах) я перорального (через рот) применения препарата. Курс лечения 5-15 дней. При рецидивирующем течении заболевания возможно проведение повторных курсов лечения. С целью профилактики сепсиса и энтероколита при внутриутробном инфицировании или опасности возникновения внутрибольничной инфекции у новорожденных детей, бактериофаг применяют в виде клизм 2 раза в день в течение 5-7 дней. При лечении омфалитов, пиодермии, инфицированных ран препарат применяют в виде аппликаций ежедневно двукратно марлевую салфетку смачивают бактериофагом я накладывают на пупочную ранку или на пораженный участок кожи.

Противопоказания

Гиперчувствительность.

Особые указания

Применение бактериофага не исключает применение др. ЛС, в том числе антибактериальных и противовоспалительных препаратов.

Условия хранения

Препарат хранят и транспортируют при температуре от 2 до 10°С в сухом защищенном от света месте.

Допускается транспортирование всеми видами крытого транспорта при температуре от 2 до 25°С не более 1 месяца.

Примечание

Отпускается без рецепта.

Бактериофаг синегнойный :: Инструкция :: Цена :: Описание препарата

Бактериофаг синегнойный (Bacteriophage Pseudomonas aeroginosa)
Раствор Бактериофаг синегнойный содержит:
Стерильный очищенный фильтрат фаголизата бактерий Pseudomonas aeroginosa;
Консервант – хинозол.
Бактериофаг синегнойный – препарат, обладающий специфическим антибактериальным действием в отношении бактерий синегнойной палочки. Действие препарата основано на его способности закрепляться на мембранах бактерий и проникать внутрь бактериальной клетки, где фаговые частицы размножаются за счет энергетических ресурсов бактерий. После гибели бактерий отмечается выход зрелых фаговых частиц, способных заражать бактерии синегнойной палочки.
Перед началом терапии рекомендуется определить фагочувствительность возбудителей.
Бактериофаг синегнойный применяют для лечения пациентов, страдающих заболеваниями различной локализации, обусловленными синегнойной палочкой.
В частности бактериофаг применяют при заболеваниях уха, носа, горла и дыхательных путей, включая отит, синусит, ангину, трахеит, фарингит, ларингит, трахеит, пневмонию, бронхит и плеврит.

Бактериофаг синегнойный используют в хирургической практике при ожогах, нагноениях, флегмоне, абсцессах, фурункулах, гидрадените, карбункулах и бурсите.

Бактериофаг синегнойный применяют в лечении урогенитальных инфекций, включая цистит, пиелонефрит, уретрит, кольпит, сальпингоофорит и эндометрит.
Бактериофаг синегнойный назначают пациентам, страдающим холециститом, гастроэнтеритом, нарушениями микрофлоры кишечника, гнойно-воспалительными и генерализованными септическими заболеваниями.
Кроме того, Бактериофаг синегнойный используют для лечения пиодермии, конъюнктивита и язвенных поражений роговицы.
Бактериофаг синегнойный также применяют для профилактики инфицирования послеоперационных и свежих ран.

Бактериофаг синегнойный предназначен для местного, перорального и ректального применения. Перед применением раствора следует взболтать флакон, если отмечается изменение прозрачности раствора или видимый осадок применять препарат запрещено.

Раствор содержит питательную среду, для предупреждения заражения раствора микроорганизмами следует тщательно мыть руки перед использованием, обрабатывать колпачок антисептическим раствором, а также избегать контакта внутренней стороны пробки с другими предметами. Запрещено оставлять флакон открытым. Набор необходимой дозы препарата Бактериофаг синегнойный следует проводить стерильным шприцом.

В зависимости от локализации инфекции препарат Бактериофаг синегнойный помимо перорального применения используют для:
1) Орошений, примочек и тампонирования в дерматологической практике;
2) Введения в дренированные и ограниченные полости, аппликаций и промываний в хирургической практике;
3) Введения в дренированные почечные лоханки и мочевой пузырь в урологической практике;
4) Введение внутрь матки и влагалища, в том числе в виде орошений и тампонов, смоченных раствором;

5) Введения смоченных турунд в носовую полость и ухо в отоларингологической практике;
6) Ректального введения в гастроэнтерологической практике;
7) Введения турунд, соченных раствором, в пародонтальные каналы в стоматологической практике.

Как правило, перорально назначают прием разовой дозы препарата трижды в сутки.
Рекомендованная разовая доза бактериофага для детей до 6 месяцев составляет 5 мл перорально и 10 мл в клизме.
Рекомендованная разовая доза бактериофага для детей 6-12 месяцев составляет 10 мл перорально и 10-20 мл в клизме.
Рекомендованная разовая доза бактериофага для детей 1-3 лет составляет 15 мл перорально и 20-30 мл в клизме.
Рекомендованная разовая доза бактериофага для детей 3-8 лет составляет 15-20 мл перорально и 30-40 мл в клизме.
Рекомендованная разовая доза бактериофага для детей старше 8 лет и взрослых составляет 20-30 мл перорально и 40-50 мл в клизме.

Детям до 6 месяцев препарат вводят ректально в соответствующей разовой дозе, если у ребенка не отмечается развития рвоты, допускается переход на пероральный прием препарата.

Лечение локализованных гнойно-воспалительных поражений следует проводить, одновременно перорально и местно применяя Бактериофаг синегнойный.
Если перед местным применением бактериофага рана обрабатывалась антисептическим средством, следует промыть участок стерильный изотоническим раствором натрия хлорида.
Средняя продолжительность терапии составляет от 7 до 10 дней.

При применении препарата Бактериофаг синегнойный у пациентов не отмечалось развития нежелательных эффектов.
Нет противопоказаний к применению раствора Бактериофаг синегнойный.
Бактериофаг синегнойный в период беременности и кормления ребенка грудью может использоваться под контролем врача.
Бактериофаг синегнойный допускается применять одновременно с бактерицидными и бактериостатическими препаратами, а также лекарственными средствами различных групп.

Не было отмечено развития передозировки при применении препарата Бактериофаг синегнойный.
Раствор Бактериофаг синегнойный по 100 мл во флаконах стеклянных с пробкой и колпачком, в пачку из картона вкладывают 1 флакон.
Бактериофаг синегнойный необходимо хранить в помещениях, защищенных от солнечных лучей, с температурным режимом от 2 до 8 градусов Цельсия.
Срок годности препарата Бактериофаг синегнойный составляет 2 года после изготовления.
Допускается транспортировать препарат Бактериофаг синегнойный при температурном режиме от 8 до 25 градусов Цельсия в течение не более 30 дней.

Диарея и гастроэнтерит предположительно инфекционного происхождения (A09)

Другая септицемия (A41)

Септицемия неуточненная (A41.9)

Септицемия, вызванная другими грамотрицательными микроорганизмами (A41.5)

Другая уточненная септицемия (A41.8)

Дисбактериоз (K63.8.0*)

Кератит и кератоконъюнктивит при других инфекционных и паразитарных болезнях, классифицированных в других рубриках (h29.2*)

Язва роговицы (h26.0)

Pseudomonas aeruginosa mallei pseudomallei как причина болезней, классифицированных в других рубриках (B96.5)

Пневмония, вызванная Pseudomonas синегнойной палочкой (J15.1)

фаголизат бактерий Pseudomonas aeroginosa

Страна-производитель — Россия.

Инструкция составлена коллективом авторов и редакторов сайта Piluli. Список авторов справочника лекарств представлен на странице редакции сайта: Редакция сайта.

Ссылки на использованные источники информации.

Описание препарата «Бактериофаг синегнойный» на данной странице является упрощённой и дополненной версией официальной инструкции по применению. Перед приобретением или использованием препарата вы должны проконсультироваться с врачом и ознакомиться с утверждённой производителем аннотацией.
Информация о препарате предоставлена исключительно с ознакомительной целью и не должна быть использована как руководство к самолечению. Только врач может принять решение о назначении препарата, а также определить дозы и способы его применения.

Количество просмотров: 29529.

Бактериофаг синегнойной палочки инструкция по применению, цена, аналоги, показания, совместимость, отзывы

Архангельская областьАстраханская областьБрянская областьВладимирская областьВолгоградская областьВологодская областьВоронежская областьИвановская областьКалужская областьКировская областьКостромская областьКраснодарский крайКрасноярский крайКурская областьЛипецкая областьМосковская областьМурманская областьНижегородская областьНовгородская областьНовосибирская областьОмская областьОрловская областьПсковская областьРеспублика БашкортостанРеспублика КарелияРеспублика Марий ЭлРеспублика МордовияРеспублика ТатарстанРеспублика ЧувашияРязанская областьСмоленская областьТамбовская областьТульская областьЯрославская область

Архангельск Котлас Северодвинск

Брянск Новозыбков

Владимир Вязники Гусь-Хрустальный Ковров Кольчугино Муром

Волгоград Волжский Камышин

Вологда Сокол Череповец

Иваново Кинешма Родники Шуя

Калуга Обнинск

Кострома Нерехта

Новороссийск Туапсе

Железногорск Курск

Грязи Елец Липецк

Апатиты Мурманск Североморск

Ардатов Арзамас Балахна Богородск Бор Выкса Городец Дальнее Константиново Дзержинск Дивеево Заволжье Красные Баки Кстово Кулебаки Лысково Навашино Нижний Новгород Новинки Павлово Саров Семенов Сергач Урень Чкаловск Шахунья

Великий Новгород Старая Русса

Мелеуз Салават Стерлитамак Уфа

Волжск Йошкар-Ола Медведево

Ковылкино Рузаевка Саранск

Альметьевск Казань Лениногорск Нижнекамск

Алатырь Канаш Новочебоксарск Чебоксары Шумерля

Десногорск Сафоново Смоленск Ярцево

Алексин Ефремов Тула

Рыбинск Тутаев Ярославль

Выбрать

Бактериофаг и антибиотик избавили пациента от лекарственно-устойчивой инфекции

Прикрепление бактериофагов к поверхности бактериальной клетки. Фотография сделана с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Увеличение примерно в 200 тысяч раз.

Dr Graham Beards / Wikimedia Commons

Бактериофаг OMKO1 с антибиотиком цефтазидимом смог избавить пациента от инфекции, которую несколько лет безуспешно лечили традиционными антибиотиками, сообщается в Evolution, Medicine and Public Health. Пациенту с аневризмой аорты был установлен имплантат, но после операции у него развилась инфекция, вызванная синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa).

Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) обладает повышенной устойчивостью к большинству антибиотиков и относится к так называемым ESKAPE-патогенам — бактериям, вызывающим госпитальные инфекции по всему миру. В том числе она обнаруживается при абсцессах и гнойных ранах. Лечение инфекций, вызванных P. aeruginosa осложняется тем, что бактерии образуют на поверхности пораженного органа биопленки. Антибиотики на это бактериальное сообщество не действуют, а уничтожают только отдельные (планктонные) бактерии, которые испускает биопленка.

Для уничтожения ESKAPE-патогенов исследователи пробуют альтернативные варианты, в том числе лечение бактериофагами. Бактериальные вирусы могут проникать в биопленку и уничтожать бактерии, из которых она состоит. Метод лечения бактериофагами начали разрабатывать почти 100 лет назад, вскоре после открытия этих микроорганизмов. Однако у этого метода обнаружились недостатки: процедура подбора нужных фагов, действующих на тот или иной вид бактерий, занимает как минимум несколько дней, обработать ими можно только наружные поверхности организма или кишечник, к тому же фаги начинают размножаться при большой концентрации бактерий, уничтожение которых может вызвать у пациента токсический шок. К тому же, бактерии вырабатывают к бактериофагам устойчивость, как и к антибиотикам, поэтому в настоящее время бактериофаги используют достаточно редко.

Ученые из Йельского университета под руководством хирурга Дипака Нараяна (Deepak Narayan) и эволюционного биолога Пола Тернера (Paul Turner) решили использовать бактериофаг OMKO1 для лечения пациента с тяжелой госпитальной инфекцией. В 2012 году 76-летнему пациенту прооперировали аневризму дуги аорты и установили дакроновый имплантат. Вскоре после операции у пациента развилась инфекция, вызванная синегнойной палочкой. Для борьбы с ней мужчине неоднократно проводили хирургические чистки грудной клетки (делали дренажное отверстие, через которое выходил гной) и прописывали многократные продолжительные курсы антибиотиков. Но лечение не помогало, состояние пациента ухудшалось. Медики считали, что проводить повторную операцию было слишком рискованно, и приняли решение провести экспериментальное лечение бактериофагом и антибиотиком цефтазидимом, который применяется для лечения синегнойной палочки.

В качестве кандидата они выбрали фаг OMKO1, который был получен из образцов прудовой воды. Исследователи взяли их в пруду Додж в 65 километрах от Йельского университета. Как выяснили авторы исследования в своей предыдущей работе, OMKO1 прикрепляется к мембране синегнойной палочки, точнее, к белку-насосу, который «откачивает» антибиотик из клетки, прежде чем тот успевает подействовать. Исследователи предположили, что P. aeruginosa выработала устойчивость к фагу с помощью мутаций в мембранном насосе, которые препятствовали связыванию OMKO1. Но эти же мутации уменьшают эффективность «насоса» и делают бактерию уязвимой к антибиотику. Поэтому, по мнению ученых из Йеля, комбинированная терапия должна была помочь пациенту.

Схема действия лекарства, предложенная учеными. Антибиотик в терапевтических концентрациях не может проникнуть в биопленки из-за ее плохой проницаемости и угнетенного метаболизма ее компонентов. Но фаг OMKO1 способен размножаться в бактериях, образующих пленку. В результате, стабильность бактериальной пленки нарушается, а потом она начинает разрушаться. И тогда даже терапевтические количества антибиотика действуют на патогены. А бактерии, устойчивые к фагу, становятся более чувствительными к антибиотику.

Benjamin Chan et al. / Evolution, Medicine and Public Health

Прежде чем проводить лечение, авторы работы провели лабораторные эксперименты и убедились в эффективности действия цефтазидима и фага на биопленки синегнойной палочки, которая была получена из выделений пациента. Исследователи предположили, что OMKO1 уничтожает отдельные бактерии, дестабилизируя бактериальную пленку. После этого уже антибиотик получает доступ к отдельным бактериям, устойчивым к фагу, и уничтожает их.

В 2016 году, после успеха лабораторных экспериментов, и получения разрешения на операцию от FDA и администрации университета, медики ввели в грудную клетку пациента суспензию фага OMKO1 и цефтазидима. После процедуры ему прописали короткий курс цефтазидима. В результате, в течение 18 месяцев (до подачи статьи в печать) рецидивов инфекции у мужчины не наблюдалось.

Недавно сингапурские исследователи синтезировали полимер, которые эффективно разрушает ESKAPE-патогены, в том числе и синегнойную палочку. В отличие от антибиотиков, новое вещество малотоксично и не вызывает возникновения устойчивости у бактерий.

Екатерина Русакова

Бактериофаг синегнойный: инструкция, дозировка, лекарственная форма

В статье рассмотрим инструкцию к «Бактериофагу синегнойному».

Препарат используют для лечения и профилактики гнойных и воспалительных, а, кроме того, энтеральных заболеваний, которые вызваны синегнойной палочкой или дисбактериозом.

Форма выпуска

«Бактериофаг синегнойный» выпускают в жидкой форме для местного использования и приема внутрь. Средство выпускают во флаконах по 50 и 100 миллилитров. Этот препарат представляет собой фильтрат фаголизата, который активен в отношении синегнойной палочки.

Показания к применению

Согласно инструкции, «Бактериофаг синегнойный» применяется для терапии пациентов, которые страдают заболеваниями разной локализации, обусловленными синегнойной палочкой. В частности этот препарат применяют при наличии заболеваний ушей, носа и дыхательных каналов, включая наличие отита, синусита, ангины, трахеита, фарингита, ларингита, трахеита, пневмонии, бронхита и плеврита.

Список показаний у «Бактериофага синегнойного» обширный.

Это средство используется в хирургической практике при наличии у пациентов ожогов, нагноений, флегмона, абсцесса, фурункул, гидрадениа, карбункулов и бурсита. Применяется в лечении урогенитальной инфекции, включая циститы, пиелонефриты, уретриты, кольпиты, сальпингоофориты и эндометриты.

Что еще нам сообщает инструкция? «Бактериофаг синегнойный» назначается пациентам, которые страдают холециститами, гастроэнтеритом, нарушением кишечной микрофлоры, гнойными и воспалительными, а, кроме того, септическими заболеваниями. Кроме того, данное средство используют для терапии пиодермии, конъюнктивитов и язвенного поражения роговицы. «Бактериофаг синегнойный» применим и для профилактики инфицирования послеоперационной раны.

Способ применения

Как указывает инструкция, «Бактериофаг синегнойный» предназначен для местного, а, кроме того, для перорального и ректального использования. Непосредственно перед применением данного раствора его надо взболтать. В том случае, если есть изменение в прозрачности средства или какой-либо видимый осадок, то применять средство запрещено.

В растворе содержится питательная среда. В целях предупреждения заражения лекарства микроорганизмами надо тщательно помыть руки перед его использованием, обработав колпачок антисептическим раствором. Помимо этого, следует избегать контакта пробки с разными предметами. Запрещается оставлять этот флакон открытым. Набор необходимых доз препарата следует выполнять стерильным шприцом. Как правило, пациентам перорально назначается прием трехкратно в сутки:

Рекомендованная разовая дозировка «Бактериофага синегнойного» для детей до шести месяцев составляет 5 миллилитров перорально и 10 миллилитров в клизме.
Разовая доза для детей до двенадцати месяцев составляет 10 миллилитров перорально и 20 миллилитров в клизме.
Разовое дозирование для детей от одного года до трех лет составляет 15 миллилитров перорально и 20 миллилитров в клизме.
Доза «Бактериофага» в возрасте от трех до восьми лет составляет 20 миллилитров перорально и 40 миллилитров в клизме.
Доза для детей, которые старше восьми лет, и для взрослых составляет 30 миллилитров перорально и 50 миллилитров в клизме.

Отзывы о лекарстве

Отзывы о «Бактериофаге синегнойном» в интернете встречаются положительные. К примеру, люди часто в своих комментариях отмечают, что этот препарат эффективно справляется с лечением гнойных и воспалительных заболеваний, которые вызваны синегнойной палочкой или дисбактериозом. О каких-либо побочных эффектах не сообщается. Таким образом, отмечается, что этот препарат легко переносится детьми и взрослыми пациентами.

Использование лекарства у детей в возрасте до полугода, у недоношенных детей в том числе

Если у новорожденного энтероколит, сепсис, осуществляют постановку высоких клизм по 5-10 мл препарата трижды в сутки. Перорально использовать лекарство тоже можно путем перемешивания с грудным молоком. Терапию продолжают до 15 дней.

Чтобы предупредить энтероколит, сепсис при внутриутробном инфицировании или риск возникновения госпитальной инфекции у новорожденных детей, медикамент может быть использован 2 раза в день в форме клизм в течение недели.

Как лечат пиодермию, омфалит, септические раны? В данных случаях делают аппликации пропитанной марлевой салфеткой, которая накладывается на раневую поверхность 2 раза в сутки.

Синегнойная палочка

Это такая подвижная бактерия, которая является возбудителем огромного количества всевозможных инфекционных болезней. Опасность такой палочки состоит в том, что она весьма устойчива к подавляющему числу всевозможных противомикробных лекарств. Название свое эта бактерия получила потому, что ею окрашивается питательная среда, в которой она растет, в синий оттенок.

Рассмотрим подробнее симптомы и лечение синегнойной палочки.

Симптомы заболевания

Рассмотрим особенности симптомов заболеваний, которые вызывает синегнойная палочка:

При эндокардите у людей возникает лихорадка наряду с шумом в сердце и положительным посевом крови на синегнойную палочку. Кожная симптоматика проявляется в виде пятен Рота, узелков Ослера и кровоизлияний. Увеличивается селезенка.
При пневмонии у людей под воздействием этой палочки возникает кашель наряду с хрипами, лихорадкой, бледностью и цианозом, гипоксией, а иногда и шоком.
При поражении пищеварительной системы этой палочкой возникает лихорадка наряду с признаками обезвоживания, расстройствами желудка и кишечника и перитонитом.
Когда поражается кожа с мягкими тканями, возникает кровоизлияние наряду с районами некроза, которые окружаются эритемой, подкожными узелками, абсцессом, целлюлитом и фасциитом.

Лечение

Симптомы и лечение синегнойной палочки взаимосвязаны.

Приведем далее схемы назначаемых препаратов при различных проявлениях синегнойных инфекций:

При эндокардите пациентам прописывают высокие дозы аминогликозидов, а, кроме того, пенициллинов или цефалоспоринов широкого спектра воздействия. Лечение продолжают до шести недель.
При пневмонии лечение начинают с двух антибиотиков, а по ходу улучшения самочувствия больного один из антибиотиков отменяют.
При бактериемии по причине опасности и тяжести патологического процесса антибактериальную терапию назначают до того, как приходят результаты кровяного посева. Больным получается «Аминогликозид» и «Пенициллин» либо цефалоспорины широкого спектра воздействия, иногда один из медикаментов меняется на «Ципрофлоксацин» или же на препарат «Рифампицин».
При менингите препаратом выбора выступает «Цефтазидим», к которому подключается «Аминогликозид». Антибиотикотерапия продолжается не меньше двух недель.
При поражении ушей обычно назначается сочетание антибиотиков и кортикостероидов (например, «Метипред»).

Таким образом, при синегнойной палочке лечение проводится в зависимости от района поражения организма.

Бактериофаг синегнойный р-р для внутр наруж и местн примен фл 100мл

Состав

Форма выпуска

Флакон ,100 мл.

Фармакологическое действие

Показание к применению

Способ применения и дозы

Противопоказания

Гиперчувствительность.

Особые указания

Условия хранения

Препарат хранят и транспортируют при температуре от 2 до 10°С в сухом защищенном от света месте.

Допускается транспортирование всеми видами крытого транспорта при температуре от 2 до 25°С не более 1 месяца.

Примечание

Отпускается без рецепта.

инструкция, показания к применению, дозировка, форма выпуска

В статье рассмотрим инструкцию к «Бактериофагу синегнойному».

Форма выпуска

Показания к применению

Список показаний у «Бактериофага синегнойного» обширный.

Способ применения

Рекомендованная разовая дозировка «Бактериофага синегнойного» для детей до шести месяцев составляет 5 миллилитров перорально и 10 миллилитров в клизме.
Разовая доза для детей до двенадцати месяцев составляет 10 миллилитров перорально и 20 миллилитров в клизме.
Разовое дозирование для детей от одного года до трех лет составляет 15 миллилитров перорально и 20 миллилитров в клизме.
Доза «Бактериофага» в возрасте от трех до восьми лет составляет 20 миллилитров перорально и 40 миллилитров в клизме.
Доза для детей, которые старше восьми лет, и для взрослых составляет 30 миллилитров перорально и 50 миллилитров в клизме.

Отзывы о лекарстве

Использование лекарства у детей в возрасте до полугода, у недоношенных детей в том числе

Синегнойная палочка

Рассмотрим подробнее симптомы и лечение синегнойной палочки.

Симптомы заболевания

Рассмотрим особенности симптомов заболеваний, которые вызывает синегнойная палочка:

При эндокардите у людей возникает лихорадка наряду с шумом в сердце и положительным посевом крови на синегнойную палочку. Кожная симптоматика проявляется в виде пятен Рота, узелков Ослера и кровоизлияний. Увеличивается селезенка.
При пневмонии у людей под воздействием этой палочки возникает кашель наряду с хрипами, лихорадкой, бледностью и цианозом, гипоксией, а иногда и шоком.
При поражении пищеварительной системы этой палочкой возникает лихорадка наряду с признаками обезвоживания, расстройствами желудка и кишечника и перитонитом.
Когда поражается кожа с мягкими тканями, возникает кровоизлияние наряду с районами некроза, которые окружаются эритемой, подкожными узелками, абсцессом, целлюлитом и фасциитом.

Лечение

Симптомы и лечение синегнойной палочки взаимосвязаны.

Приведем далее схемы назначаемых препаратов при различных проявлениях синегнойных инфекций:

При эндокардите пациентам прописывают высокие дозы аминогликозидов, а, кроме того, пенициллинов или цефалоспоринов широкого спектра воздействия. Лечение продолжают до шести недель.
При пневмонии лечение начинают с двух антибиотиков, а по ходу улучшения самочувствия больного один из антибиотиков отменяют.
При бактериемии по причине опасности и тяжести патологического процесса антибактериальную терапию назначают до того, как приходят результаты кровяного посева. Больным получается «Аминогликозид» и «Пенициллин» либо цефалоспорины широкого спектра воздействия, иногда один из медикаментов меняется на «Ципрофлоксацин» или же на препарат «Рифампицин».
При менингите препаратом выбора выступает «Цефтазидим», к которому подключается «Аминогликозид». Антибиотикотерапия продолжается не меньше двух недель.
При поражении ушей обычно назначается сочетание антибиотиков и кортикостероидов (например, «Метипред»).

Таким образом, при синегнойной палочке лечение проводится в зависимости от района поражения организма.

Характеристика фага C11 Pseudomonas aeruginosa и идентификация генов-хозяев, необходимых для созревания вириона

Чан, Б. К., Абедон, С. Т. и Лок-Каррильо, К. Фаговые коктейли и будущее фаговой терапии. Будущая микробиология 8, 769–783, DOI: 10.2217 / fmb.13.47 (2013).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Kutter, E. et al. Фаготерапия в клинической практике: лечение инфекций человека.Текущая фармацевтическая биотехнология 11, 69–86 (2010).

CAS Статья Google Scholar

Chaturongakul, S. & Ounjai, P. Взаимодействие фага-хозяина: примеры хвостатых фагов и грамотрицательных бактериальных патогенов. Границы микробиологии 5, 442, DOI: 10.3389 / fmicb.2014.00442 (2014).

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

Хайман, П.И Абедон, С. Т. Диапазон хозяев бактериофагов и устойчивость бактерий. Достижения в прикладной микробиологии 70, 217–248, DOI: 10.1016 / S0065-2164 (10) 70007-1 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Лабри, С. Дж., Самсон, Дж. Э. и Мойно, С. Механизмы устойчивости к бактериофагам. Обзоры природы. Microbiology 8, 317–327, DOI: 10.1038 / nrmicro2315 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Гольдфарб, Т.и другие. BREX — это новая система устойчивости к фагам, широко распространенная в микробных геномах. EMBO J. 34, 169–183, DOI: 10.15252 / embj.201489455 (2015).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Qimron, U., Marintcheva, B., Tabor, S. & Richardson, C.C. Общегеномный скрининг генов Escherichia coli, влияющих на рост бактериофага T7. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 103, 19039–19044, DOI: 10.1073 / pnas.0609428103 (2006).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Maynard, N. D. et al. Прямой генетический скрининг и динамический анализ зависимостей лямбда-фага от хозяина выявляют обширную сеть взаимодействия и новую противовирусную стратегию. PLoS genetics 6, e1001017, DOI: 10.1371 / journal.pgen.1001017 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Рейес-Кортес, Р., Martinez-Penafiel, E., Martinez-Perez, F., de la Garza, M. & Kameyama, L. Новая стратегия выделения мутантов клеточной оболочки, устойчивых к фаговой инфекции: бактериофагу mEp213 для проникновения необходимы липополисахариды в дополнение к FhuA. Escherichia coli K-12. Microbiology 158, 3063–3071, DOI: 10.1099 / mic.0.060970-0 (2012).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Cumby, N., Reimer, K., Mengin-Lecreulx, D., Дэвидсон, А. Р. и Максвелл, К. Л. Белок рулетки фагового хвоста, белок внутренней мембраны и периплазматический шаперон играют взаимосвязанные роли в процессе инъекции генома фага E. coli HK97. Молекулярная микробиология 96, 437–447, DOI: 10,1111 / mmi.12918 (2015).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Цвиркайте-Крупович В., Карбаллидо-Лопес Р. и Таварес П. Эволюция вируса в сторону ограниченной зависимости от несущественных функций хозяина: случай бактериофага SPP1.Журнал вирусологии 89, 2875–2883, DOI: 10.1128 / JVI.03540-14 (2015).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Филиппов А.А. и др. Устойчивые к бактериофагам мутанты Yersinia pestis: идентификация фаговых рецепторов и ослабление для мышей. PloS one 6, e25486, DOI: 10.1371 / journal.pone.0025486 (2011).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Чжан, Дж.и другие. Центральный олигосахарид и тиоредоксин Vibrio cholerae необходимы для связывания и размножения его типирующего фага VP3. Журнал бактериологии 191, 2622–2629, DOI: 10.1128 / JB.01370-08 (2009).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, J. et al. О-антиген является рецептором холерного вибриона серогруппы O1 El Tor, типирующего фаг VP4. Журнал бактериологии 195, 798–806, DOI: 10.1128 / jb.01770-12 (2013).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Shin, H. et al. Разнообразие рецепторов и взаимодействие с хозяином бактериофагов, инфицирующих Salmonella enterica, серовар Typhimurium. PloS one 7, e43392, DOI: 10.1371 / journal.pone.0043392 (2012).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Хо, Т.Д. и Слауч, Дж. М. OmpC является рецептором бактериофагов Gifsy-1 и Gifsy-2 сальмонелл. Журнал бактериологии 183, 1495–1498, DOI: 10.1128 / jb.183.4.1495-1498.2001 (2001).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Риччи В. и Пиддок Л. Дж. Использование роли TolC в патогенности: идентификация бактериофага для уничтожения сероваров Salmonella у домашней птицы. Прикладная и экологическая микробиология 76, 1704–1706, DOI: 10.1128 / AEM.02681-09 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Стовер, К. К. и др. Полная последовательность генома Pseudomonas aeruginosa PAO1, условно-патогенного микроорганизма. Nature 406, 959–964, DOI: 10.1038 / 35023079 (2000).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Листер, П. Д., Вольтер, Д.Дж. И Хэнсон, Н. Д. Устойчивые к антибактериальным препаратам Pseudomonas aeruginosa: клиническое воздействие и комплексная регуляция механизмов устойчивости, кодируемых хромосомами. Обзоры клинической микробиологии 22, 582–610, DOI: 10.1128 / CMR.00040-09 (2009).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Poole, K. Pseudomonas aeruginosa: устойчивость до макс. Границы микробиологии 2, 65, DOI: 10.3389 / fmicb.2011.00065 (2011).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Спеллберг, Б., Пауэрс, Дж. Х., Брасс, Э. П., Миллер, Л. Г. и Эдвардс, Дж. Э. мл. Тенденции в разработке противомикробных препаратов: последствия для будущего. Клинические инфекционные заболевания: официальная публикация Американского общества инфекционистов 38, 1279–1286, DOI: 10.1086 / 420937 (2004).

CAS Статья Google Scholar

Фиртель, Т.М., Риттер, К. и Хорц, Х. П. Вирусы против бактерий — новые подходы к фаговой терапии как инструменту против патогенов с множественной лекарственной устойчивостью. Журнал антимикробной химиотерапии 69, 2326–2336, DOI: 10.1093 / jac / dku173 (2014).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Пирес, Д. П., Вилас Боас, Д., Силланкорва, С. и Азередо, Дж. Фаговая терапия: шаг вперед в лечении инфекций, вызванных синегнойной палочкой.Журнал вирусологии 89, 7449–7456, DOI: 10.1128 / JVI.00385-15 (2015).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Rhoads, D. D. et al. Бактериофаговая терапия венозных язв ног у людей: результаты исследования безопасности фазы I. Журнал по уходу за ранами 18, 237-238, 240-233, DOI: 10.12968 / jowc.2009.18.6.42801 (2009).

Артикул Google Scholar

Мерабишвили, М.и другие. Мелкосерийное производство с контролируемым качеством четко определенного коктейля из бактериофагов для использования в клинических испытаниях на людях. PloS one 4, e4944, DOI: 10.1371 / journal.pone.0004944 (2009).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Райт, А., Хокинс, К. Х., Анггард, Э. Э. и Харпер, Д. Р. Контролируемое клиническое испытание терапевтического препарата бактериофага при хроническом отите, вызванном устойчивостью к антибиотикам Pseudomonas aeruginosa; предварительный отчет об эффективности.Клиническая отоларингология: официальный журнал ENT-UK; официальный журнал Нидерландского общества оторино-ларингологии и шейно-лицевой хирургии 34, 349–357, DOI: 10.1111 / j.1749-4486.2009.01973.x (2009).

CAS Статья Google Scholar

Грайех, С., Брегеон, Ф. и Ролайн, Дж. М. Терапия на основе бактериофагов при инфекциях Pseudomonas aeruginosa, связанных с муковисцидозом: обоснование и текущее состояние. Дизайн, разработка и терапия лекарств 9, 3653–3663, DOI: 10.2147 / DDDT.S53123 (2015).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Lavigne, R. et al. Многостороннее исследование остановки Pseudomonas aeruginosa вирулентным подовирусом LUZ19. mBio 4, e00061–00013, DOI: 10.1128 / mBio.00061-13 (2013).

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, X. et al. Глобальный транскриптомный анализ взаимодействий между Pseudomonas aeruginosa и бактериофагом PaP3.Научные отчеты 6, 19237, DOI: 10.1038 / srep19237 http://www.nature.com/articles/srep19237#supplementary-information (2016).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Chevallereau, A. et al. Подходы следующего поколения «-омик» выявляют значительное изменение метаболизма РНК хозяина во время бактериофаговой инфекции Pseudomonas aeruginosa. PLoS genetics 12, e1006134, DOI: 10.1371 / journal.pgen.1006134 (2016).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Данис-Влодарчик, К. и др. Характеристика недавно выделенных литических бактериофагов KTN6 и KT28 и их эффективность против биопленки Pseudomonas aeruginosa. PloS one 10, e0127603, DOI: 10.1371 / journal.pone.0127603 (2015).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Гарбе, Дж., Бунк, Б., Роде, М. и Шоберт, М. Секвенирование и характеристика фага Pseudomonas aeruginosa JG004. BMC микробиология 11, 102, DOI: 10.1186 / 1471-2180-11-102 (2011).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Ли, Л., Ян, Х. и Юэ, Х. Выделение и классификация бактериофагов Pseudomonas aeruginosa и их применение для контроля биопленок. Chin J Microbiol Immunol 31, 330–334 (2011).

CAS Google Scholar

Jiang, X. et al. Характеристики последовательности беномных концов Т4-подобного бактериофага IME08, выявленные с помощью высокопроизводительного секвенирования. Журнал вирусологии 8, 194, DOI: 10.1186 / 1743-422X-8-194 (2011).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Белэнджер М., Берроуз Л. и Лам Дж. С. Функциональный анализ генов, ответственных за синтез О-антигена В-диапазона липополисахарида О6 серотипа Pseudomonas aeruginosa.Microbiology 145 (Pt 12), 3505–3521, DOI: 10.1099 / 00221287-145-12-3505 (1999).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Lu, S. et al. Геномный и протеомный анализ концевого дублирующего генома фага PaP1 Pseudomonas aeruginosa: установление рода PaP1-подобных фагов. PloS one 8, e62933, DOI: 10.1371 / journal.pone.0062933 (2013).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Генри, М.и другие. Поиск терапевтических бактериофагов выявил одно новое подсемейство и два новых рода Myoviridae, инфицированных Pseudomonas. PloS one 10, e0117163, DOI: 10.1371 / journal.pone.0117163 (2015).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Ceyssens, P. J. & Lavigne, R. Бактериофаги Pseudomonas. Будущая микробиология 5, 1041–1055, DOI: 10.2217 / fmb.10.66 (2010).

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

Хендрикс, Р.В., Лоуренс, Дж. Г., Хэтфулл, Г. Ф. и Касьенс, С. Истоки и текущая эволюция вирусов. Тенденции в микробиологии 8, 504–508 (2000).

CAS Статья Google Scholar

Ceyssens, P.J. et al. Геномный анализ фагов Pseudomonas aeruginosa LKD16 и LKA1: установление подгруппы phiKMV в супергруппе T7. Журнал бактериологии 188, 6924–6931, DOI: 10.1128 / JB.00831-06 (2006).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Гарбе, Дж.и другие. Характеристика JG024, PB1-подобного pseudomonas aeruginosa фага широкого диапазона хозяев в условиях моделирования инфекции. BMC микробиология 10, 301, DOI: 10.1186 / 1471-2180-10-301 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Bommer, D., Schaferjohann, J. & Bowien, B. Идентификация cbbBc как дополнительного дистального гена хромосомного оперона фиксации cbb CO2 из Ralstonia eutropha.Архив микробиологии 166, 245–251 (1996).

CAS Статья Google Scholar

Койта К. и Рао К. В. Идентификация и анализ предполагаемых переносчиков оттока пентозного сахара в Escherichia coli. PloS one 7, e43700, DOI: 10.1371 / journal.pone.0043700 (2012).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Крушкал, Ю.и другие. Разнообразие генома семейства регуляторов транскрипции TetR в металлоредуцирующем бактериальном семействе Geobacteraceae и других видах микробов. Омикс: журнал интегративной биологии 15, 495–506, DOI: 10.1089 / omi.2010.0117 (2011).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Катбертсон, Л. и Нодвелл, Дж. Р. Семейство регуляторов TetR. Обзоры по микробиологии и молекулярной биологии: MMBR 77, 440–475, doi: 10.1128 / MMBR.00018-13 (2013).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Бейнерт, Х., Холм, Р. Х. и Манк, Э. Железно-серные кластеры: модульные многоцелевые структуры природы. Science 277, 653–659 (1997).

CAS Статья Google Scholar

Pastore, C. et al. YfhJ, молекулярный адаптер в образовании кластеров железо-сера или фратаксин-подобный белок? Структура 14, 857–867, DOI: 10.1016 / j.str.2006.02.010 (2006).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Maynard, N. D., Macklin, D. N., Kirkegaard, K. & Covert, M. W. Конкурирующие пути контролируют устойчивость хозяина к вирусу посредством модификации тРНК и запрограммированного сдвига рамки рибосом. Биология молекулярных систем 8, 567, DOI: 10.1038 / msb.2011.101 (2012).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Ким, Дж.Х., Боте, Дж. Р., Фредерик, Р. О., Холдер, Дж. К. и Маркли, Дж. Л. Роль IscX в биогенезе железо-серного кластера в Escherichia coli . Журнал Американского химического общества 136, 7933–7942, DOI: 10.1021 / ja501260h (2014).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Tam, W. et al. Белки кончика хвоста, связанные с бактериофагом лямбда gpL, координируют железо-серный кластер. Журнал молекулярной биологии 425, 2450–2462, DOI: 10.1016 / j.jmb.2013.03.032 (2013).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Bartual, S. G. et al. Строение кончика, связывающего рецептор длинного хвостового волокна бактериофага Т4. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 107, 20287–20292, DOI: 10.1073 / pnas.1011218107 (2010).

ADS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Ямасита, Э.и другие. Хозяин-связывающий домен шипа хвоста фага P2 обнаруживает тримерную железосвязывающую структуру. Acta crystallographica. Раздел F, Структурная биология и сообщения о кристаллизации 67, 837–841, DOI: 10.1107 / S174430

05999 (2011).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Челикани В., Ранджан Т. и Кондабагил К. Пересмотр упаковки генома в вирусах на основе уроков «гигантов».Вирусология 466–467, 15–26, DOI: 10.1016 / j.virol.2014.06.022 (2014).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Орам М. и Блэк Л. В. Структурная вирусология 203–219 (Королевское химическое общество, 2011).

Сан, С., Рао, В. Б. и Россманн, М. Г. Упаковка генома в вирусах. Текущее мнение в структурной биологии 20, 114–120, DOI: 10.1016 / j.sbi.2009.12.006 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Оливейра, Л., Таварес, П. и Алонсо, Дж. К. Упаковка ДНК в голову: бактериофаг SPP1 в качестве модельной системы. Исследование вирусов 173, 247–259, DOI: 10.1016 / j.virusres.2013.01.021 (2013).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Лефферс, Г. и Басавесвара Рао, В.Модель упаковки с прерывистой головкой для упаковки молекул ДНК с длиной меньше головы бактериофагом T4. Журнал молекулярной биологии 258, 839–850, DOI: 10.1006 / jmbi.1996.0291 (1996).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Нурмеммедов, Э., Кастельново, М., Медина, Э., Каталано, К. Э. и Эвилевич, А. Сложные ограничения упаковки и инфекционная способность фага λ. Журнал молекулярной биологии 415, 263–273, DOI: 10.1016 / j.jmb.2011.11.015 (2012).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Дрейк, Дж. У. Постоянная скорость спонтанной мутации у микробов на основе ДНК. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88, 7160–7164 (1991).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Санджуан, Р., Небот, М.Р., Кирико, Н., Мански, Л. М. и Белшоу, Р. Частота вирусных мутаций. Журнал вирусологии 84, 9733–9748, DOI: 10.1128 / JVI.00694-10 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Pan, X. et al. Генетические доказательства О-специфического антигена как рецептора фага K8 Pseudomonas aeruginosa и его геномный анализ. Границы микробиологии 7, DOI: 10.3389 / fmicb.2016.00252 (2016).

Li, L.и другие. Характеристика генома фага K5 Pseudomonas aeruginosa и идентификация его генов, связанных с рецепторами. J. Basic Microbiol. 56, 1–11, DOI: 10.1002 / jobm.201600116 (2016).

CAS Статья Google Scholar

Ли, Л., Ян, Х., Лин, С. и Цзя, С. Классификация 17 недавно выделенных вирулентных бактериофагов Pseudomonas aeruginosa. Канадский микробиологический журнал 56, 925–933, DOI: 10.1139 / w10-075 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Ян Х., Лян, Л., Лин, С. и Цзя, С. Выделение и характеристика вирулентного бактериофага AB1 из Acinetobacter baumannii. BMC микробиология 10, 131, DOI: 10.1186 / 1471-2180-10-131 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Сэмбрук, Дж. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство / Джозеф Сэмбрук, Дэвид В. Рассел. (Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, 2001 г.).

Болджер, А.М., Лозе, М. и Усадель, Б. Trimmomatic: гибкий триммер для данных последовательности Illumina. Биоинформатика 30, 2114–2120, DOI: 10.1093 / bioinformatics / btu170 (2014).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Зербино Д. Р. Использование ассемблера Velvet de novo для технологий короткого чтения. Текущие протоколы в биоинформатике / редакционный совет, Андреас Д. Баксеванис… [ et al .] Глава 11, Раздел 11 15, DOI: 10.1002/0471250953.bi1105s31 (2010).

Лоу, Т. М. и Эдди, С. Р. tRNAscan-SE: программа для улучшенного обнаружения генов транспортной РНК в геномной последовательности. Исследование нуклеиновых кислот 25, 955–964 (1997).

CAS Статья Google Scholar

Altschul, S. F. et al. Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска по базам данных белков. Исследование нуклеиновых кислот 25, 3389–3402 (1997).

CAS Статья Google Scholar

Грант, Дж.Р. и Стотард П. Сервер CGView: инструмент для сравнительной геномики кольцевых геномов. Исследование нуклеиновых кислот 36, W181–184, DOI: 10.1093 / nar / gkn179 (2008).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Nunn, D. N. & Lory, S. Компоненты аппарата выделения белка Pseudomonas aeruginosa процессируются препилинпептидазой типа IV. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 89, 47–51 (1992).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Валле, И., Олсон, Дж. У., Лори, С., Лаздунски, А., Филлу, А. Шаперонные / вспомогательные пути Pseudomonas aeruginosa: идентификация кластеров фимбриальных генов (чашки) и их участие в формировании биопленок . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 6911–6916, DOI: 10.1073 / pnas.111551898 (2001).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Брэдли, Т.Дж. И Хан, Н. Х. Производство внеклеточных липидов Pseudomonas Aeruginosa NCTC 2000 в стационарных жидких средах, содержащих макроголы. Журнал фармации и фармакологии 26, 900–902 (1974).

CAS Статья Google Scholar

Челночные векторы Schweizer, H.P. Escherichia-Pseudomonas, полученные из pUC18 / 19. Gene 97, 109–121 (1991).

CAS Статья Google Scholar

Секвенирование и характеристика фага Pseudomonas aeruginosa JG004 | BMC Microbiology

Стратева Т., Йорданов Д: Pseudomonas aeruginosa — феномен устойчивости бактерий. J Med Microbiol. 2009, 58: 1133-1148. 10.1099 / jmm.0.009142-0.

PubMed CAS Статья Google Scholar

Ливермор DM: Настала ли эра неизлечимых инфекций ?. J Antimicrob Chemother. 2009, 64 (Приложение 1): i29-36.

PubMed CAS Статья Google Scholar

Скурник М., Штраух Э: Фаготерапия: факты и вымысел. Int J Med Microbiol. 2006, 296: 5-14.

PubMed CAS Статья Google Scholar

Саммерс WC: Бактериофаговая терапия. Annu Rev Microbiol. 2001, 55: 437-451. 10.1146 / annurev.micro.55.1.437.

PubMed CAS Статья Google Scholar

Bergh O, Børsheim KY, Bratbak G, Heldal M: Большое количество вирусов, обнаруженных в водной среде.Природа. 1989, 340: 467-468. 10.1038 / 340467a0.

PubMed CAS Статья Google Scholar

Rohwer F: Глобальное разнообразие фагов. Клетка. 2003, 113: 141-10.1016 / S0092-8674 (03) 00276-9.

PubMed CAS Статья Google Scholar

Breitbart M, Rohwer F: Здесь вирус, там вирус, везде один и тот же вирус ?. Trends Microbiol. 2005, 13: 278-284.10.1016 / j.tim.2005.04.003.

PubMed CAS Статья Google Scholar

Casjens SR: Сравнительная геномика и эволюция хвостатых бактериофагов. Curr Opin Microbiol. 2005, 8: 451-458. 10.1016 / j.mib.2005.06.014.

PubMed CAS Статья Google Scholar

Ackermann HW: 5500 Фаги исследовали в электронном микроскопе. Arch Virol.2007, 152: 227-243. 10.1007 / s00705-006-0849-1.

PubMed CAS Статья Google Scholar

10.

Кван Т., Лю Дж., ДюБоу М., Грос П., Пеллетье Дж .: Полные геномы и протеомы 27 бактериофагов Staphylococcus aureus . Proc Natl Acad Sci USA. 2005, 102: 5174-5179. 10.1073 / pnas.0501140102.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

11.

Кулаков Л.А., Н.К., Шляпников М.Г., Кочетков В.В., Дель Казале А., Аллен ЦКР, Ларкин М.Дж., Джейссенс П.Дж., Лавин Р. Геномы «phiKMV-подобных вирусов» Pseudomonas aeruginosa содержат локализованные однонитевые прерывания. Вирусология. 2009, 391: 1-4. 10.1016 / j.virol.2009.06.024.

PubMed CAS Статья Google Scholar

12.

Ceyssens PJ, Noben JP, Ackermann HW, Verhaegen J, De Vos D, Pirnay JP, Merabishvili M, Vaneechoutte M, Chibeu A, Volckaert G, Lavigne R: Обзор Pseudomonas phagesinosa: и его секвенирование пептидов de novo как новый инструмент для оценки разнообразия вирусов, собранных во всем мире.Environ Microbiol. 2009, 11: 1303-1313. 10.1111 / j.1462-2920.2008.01862.x.

PubMed CAS Статья Google Scholar

13.

Uchiyama J, Maeda Y, Takemura I., Chess-Williams R, Wakiguchi H, Matsuzaki S: Кинетика крови четырех внутрибрюшинно введенных терапевтических бактериофагов у здоровых и нейтропенических мышей. Microbiol Immunol. 2009, 53: 301-304. 10.1111 / j.1348-0421.2009.00125.x.

PubMed CAS Статья Google Scholar

14.

Knezevic P, Kostanjsek R, Obreht D, Petrovic O: Выделение Pseudomonas aeruginosa специфических фагов с широким спектром активности. Curr Microbiol. 2009, 59: 173-180. 10.1007 / s00284-009-9417-8.

PubMed CAS Статья Google Scholar

15.

Verma V, Harjai K, Chhibber S: Характеристика Т7-подобного литического бактериофага Klebsiella pneumoniae B5055: потенциального терапевтического агента. Curr Microbiol.2009, 59: 274-281. 10.1007 / s00284-009-9430-л.

PubMed CAS Статья Google Scholar

16.

Coyne MJ, Russell KS, Coyle CL, Goldberg JB: Ген Pseudomonas aeruginosa algC кодирует фосфоглюкомутазу, необходимую для синтеза полного липополисахаридного ядра. J Bacteriol. 1994, 176: 3500-3507.

PubMed CAS PubMed Central Google Scholar

17.

Мартин Д. В., Шурр М. Дж., Мадд М. Х., Гован Дж. Р., Холлоуэй Б. В., Деретик В. Механизм преобразования в мукоидию у Pseudomonas aeruginosa , инфицирующих пациентов с муковисцидозом. Proc Natl Acad Sci USA. 1993, 90: 8377-8381. 10.1073 / pnas.90.18.8377.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

18.

Гован Дж. Р., Деретик В. Микробный патогенез муковисцидоза: мукоидный Pseudomonas aeruginosa и Burkholderia cepacia .Microbiol Rev.1996, 60: 539-574.

PubMed CAS PubMed Central Google Scholar

19.

Loessner MJ, Inman RB, Lauer P, Calendar R: Полная нуклеотидная последовательность, молекулярный анализ и структура генома бактериофага A118 из Listeria monocytogenes : значение для эволюции фага. Mol Microbiol. 2000, 35: 324-340. 10.1046 / j.1365-2958.2000.01720.x.

PubMed CAS Статья Google Scholar

20.

Lowe TM, Eddy SR: tRNAscan-SE: программа для улучшенного обнаружения генов транспортной РНК в геномной последовательности. Nucleic Acids Res. 1997, 25: 955-964. 10.1093 / nar / 25.5.955.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

21.

Кропински А.М., Сиббальд М.Дж .: Гены трансферной РНК и их значение для использования кодонов в бактериофаге Pseudomonas aeruginosa ламбоидный D3. Может J Microbiol. 1999, 45: 791-796.

PubMed CAS Статья Google Scholar

22.

Гордон Л., Червоненкис А.Ю., Гаммерман А.Дж., Шахмурадов И.А., Соловьев В.В.: Ядро выравнивания последовательностей для распознавания промоторных областей. Биоинформатика. 2003, 19: 1964–1971. 10.1093 / биоинформатика / btg265.

PubMed CAS Статья Google Scholar

23.

Кингсфорд К.Л., Аянбуле К., Зальцберг С.Л.: Быстрое, точное, вычислительное открытие Rho-независимых терминаторов транскрипции проливает свет на их связь с захватом ДНК.Genome Biol. 2007, 8: R22-10.1186 / GB-2007-8-2-r22.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

24.

Бейли Т.Л., Элкан К. Подбор модели смеси путем максимизации ожидания для обнаружения мотивов в биополимерах. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 1994, 2: 28-36.

PubMed CAS Google Scholar

25.

Stover CK, Pham XQ, Erwin AL, Mizoguchi SD, Warrener P, Hickey MJ, Brinkman FS, Hufnagle WO, Kowalik DJ, Lagrou M, Garber RL, Goltry L, Tolentino E, Westbrock-Wadman S, Юань И, Броуди Л.Л., Колтер С.Н., Фолгер К.Р., Кас А., Ларбиг К., Лим Р., Смит К., Спенсер Д., Вонг Г.К., Ву З., Полсен И.Т., Рейзер Дж., Сайер М.Х., Хэнкок Р.Э., Лори С., Олсон М.В. : Полная последовательность генома Pseudomonas aeruginosa PAO1, условно-патогенного микроорганизма.Природа. 2000, 406: 959-964. 10.1038 / 35023079.

PubMed CAS Статья Google Scholar

26.

Бесемер Дж, Бородовский М: Эвристический подход к построению моделей для поиска генов. Nucleic Acids Res. 1999, 27: 3911-3920. 10.1093 / nar / 27.19.3911.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

27.

Debarbieux L, Leduc D, Maura D, Morello E, Criscuolo A, Grossi O, Balloy V, Touqui L: Бактериофаги могут лечить и предотвращать Pseudomonas aeruginosa инфекции легких.J Infect Dis. 2010, 201: 1096-1101. 10.1086 / 651135.

PubMed CAS Статья Google Scholar

28.

Рао В.Б., Фейсс М: Двигатель упаковки ДНК бактериофага. Анну Рев Жене. 2008, 42: 647-681. 10.1146 / annurev.genet.42.110807.0

PubMed CAS Статья Google Scholar

29.

Абуладзе Н.К., Джинджери М., Цай Дж., Эйзерлинг Ф.А.: Определение длины хвоста у бактериофага Т4.Вирусология. 1994, 199: 301-310. 10.1006 / viro.1994.1128.

PubMed CAS Статья Google Scholar

30.

Янг И., Ван И., Крыша В. Д.: Фаги вылетят: стратегии лизиса клеток-хозяев. Trends Microbiol. 2000, 8: 120-128. 10.1016 / S0966-842X (00) 01705-4.

PubMed CAS Статья Google Scholar

31.

Miller ES, Heidelberg JF, Eisen JA, Nelson WC, Durkin AS, Ciecko A, Feldblyum TV, White O, Paulsen IT, Nierman WC, Lee J, Szczypinski B, Fraser CM: Полная последовательность генома вибриофаг широкого диапазона хозяев KVP40: сравнительная геномика T4-родственного бактериофага.J Bacteriol. 2003, 185: 5220-5233. 10.1128 / JB.185.17.5220-5233.2003.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

32.

Ceyssens PJ, Lavigne R, Mattheus W, Chibeu A, Hertveldt K, Mast J, Robben J, Volckaert G: Геномный анализ фагов Pseudomonas aeruginosa LKD16 и LKA1: создание phiKMV подгруппы супергруппа. J Bacteriol. 2006, 188: 6924-6931. 10.1128 / JB.00831-06.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

33.

Weigele PR, Pope WH, Pedulla ML, Houtz JM, Smith AL, Conway JF, King J, Hatfull GF, Lawrence JG, Hendrix RW: Геномный и структурный анализ Syn9, цианофага, заражающего морских животных Prochlorococcus и Synechococcus . Environ Microbiol. 2007, 9: 1675-1695. 10.1111 / j.1462-2920.2007.01285.x.

PubMed CAS Статья Google Scholar

34.

Mann NH, Clokie MRJ, Millard A, Cook A, Wilson WH, Wheatley PJ, Letarov A, Krisch HM: Геном S-PM2, «фотосинтетического» бактериофага Т4-типа, который инфицирует штаммы морских Synechococcus . J Bacteriol. 2005, 187: 3188-3200. 10.1128 / JB.187.9.3188-3200.2005.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

35.

Ю. Т., Шефер Дж .: РЕДОР ЯМР-характеристика упаковки ДНК в бактериофаге Т4.J Mol Biol. 2008, 382: 1031-1042. 10.1016 / j.jmb.2008.07.077.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

36.

Darling ACE, Mau B, Blattner FR, Perna NT: Mauve: множественное выравнивание консервативной геномной последовательности с реаранжировками. Genome Res. 2004, 14: 1394-1403. 10.1101 / gr.2289704.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

37.

Lavigne R, Darius P, Summer EJ, Seto D, Mahadevan P, Nilsson AS, Ackermann HW, Kropinski AM: Классификация бактериофагов Myoviridae с использованием сходства белковых последовательностей. BMC Microbiol. 2009, 9: 224-10.1186 / 1471-2180-9-224.

PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

38.

Ceyssens P, Miroshnikov K, Mattheus W, Krylov V, Robben J, Noben J, Vanderschraeghe S, Sykilinda N, Kropinski A, Volckaert G, Mesyanzhinov V, Lavigne R: Сравнительный анализ широко распространенного и сохраненного -подобные вирусы, поражающие Pseudomonas aeruginosa .Environ Microbiol. 2009, 11: 2874-2883. 10.1111 / j.1462-2920.2009.02030.x.

PubMed CAS Статья Google Scholar

39.

Blankenfeldt W, Giraud MF, Leonard G, Rahim R, Creuzenet C, Lam JS, Naismith JH: Очистка, кристаллизация и предварительная структурная характеристика глюкозо-1-фосфат-тимидилилтрансферазы (RmlA), первого фермента путь синтеза dTDP-L-рамнозы из Pseudomonas aeruginosa .Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000, 56: 1501-1504. 10.1107 / S0

40040.

PubMed CAS Статья Google Scholar

40.

Кинг Дж., Коцинкова Д., Вестман Э., Лам Дж.: Биосинтез липополисахаридов в Pseudomonas aeruginosa . Врожденный иммунитет. 2009, 15: 261-312. 10.1177 / 1753425

6436.

PubMed CAS Статья Google Scholar

41.

Лау П., Линдхаут Т., Беверидж Т., Датчер Дж., Лам Дж.: Дифференциальное закрытие ядра липополисахаридом приводит к количественным и коррелированным изменениям механических и структурных свойств в биопленках Pseudomonas aeruginosa . J Bacteriol. 2009, 191: 6618-6631. 10.1128 / JB.00698-09.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

42.

Пун К.К., Вестман Е.Л., Виноградов Э., Джин С., Лам Дж.С.: Функциональная характеристика MigA и WapR: предполагаемые рамнозилтрансферазы, участвующие в биосинтезе олигосахаридов внешнего ядра Pseudomonas aeruginosa .J Bacteriol. 2008, 190: 1857-1865. 10.1128 / JB.01546-07.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

43.

Chou HT, Kwon DH, Hegazy M, Lu CD: транскриптомный анализ катаболизма агматина и путресцина в Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 2008, 190: 1966-1967. 10.1128 / JB.01804-07.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

44.

Kulasekara HD, Ventre I, Kulasekara BR, Lazdunski A, Filloux A, Lory S: Новая двухкомпонентная система контролирует экспрессию генов Pseudomonas aeruginosa flmbrial cup. Mol Microbiol. 2005, 55: 368-380.

PubMed CAS Статья Google Scholar

45.

О’Тул Г.А., Колтер Р.: Инициирование образования биопленок у Pseudomonas fluorescens WCS365 происходит через множественные конвергентные пути передачи сигналов: генетический анализ.Mol Microbiol. 1998, 28: 449-461. 10.1046 / j.1365-2958.1998.00797.x.

PubMed Статья Google Scholar

46.

Garbe J, Wesche A, Bunk B, Kazmierczak M, Selezska K, Rohde C, Sikorski J, Rohde M, Jahn D, Schobert M: характеристика JG024, широкого хозяина, подобного Pseudomonas aeruginosa PB1 диапазон фага в условиях моделирования инфекции. BMC Microbiol. 2010, 10: 301-10.1186 / 1471-2180-10-301.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

47.

Pajunen M, Kiljunen S, Skurnik M: Бактериофаг phiYeO3-12, специфичный для Yersinia enterocolitica серотипа O: 3, связан с колифагами T3 и T7. J Bacteriol. 2000, 182: 5114-5120. 10.1128 / JB.182.18.5114-5120.2000.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

48.

Moineau S, Durmaz E, Pandian S, Klaenhammer TR: дифференциация двух абортивных механизмов с помощью моноклональных антител, направленных против капсидных белков лактококкового бактериофага.Appl Environ Microbiol. 1993, 59: 208-212.

PubMed CAS PubMed Central Google Scholar

49.

Wheeler DL, Church DM, Federhen S, Lash AE, Madden TL, Pontius JU, Schuler GD, Schriml LM, Sequeira E, Tatusova TA, Wagner L: Ресурсы базы данных Национального центра биотехнологии. Nucleic Acids Res. 2003, 31: 28-33. 10.1093 / нар / gkg033.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

50.

Альтшул С.Ф., Мэдден Т.Л., Шеффер А.А., Чжан Дж., Чжан З., Миллер В., Липман Д.Д.: Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска в базе данных белков. Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3389-3402. 10.1093 / nar / 25.17.3389.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

51.

Ларкин М.А., Блэкшилдс Дж., Браун Н.П., Ченна Р., МакГеттиган П.А., МакВильям Х., Валентин Ф., Уоллес И.М., Уилм А., Лопес Р., Томпсон Дж. Д., Гибсон Т. Дж., Хиггинс Д. Г.: Кластал В и Кластал Х версия 2.0. Биоинформатика. 2007, 23: 2947-2948. 10.1093 / биоинформатика / btm404.

PubMed CAS Статья Google Scholar

52.

Grote A, Hiller K, Scheer M, Münch R, Nörtemann B, Hempel DC, Jahn D: JCat: новый инструмент для адаптации использования кодонов целевого гена к его потенциальному хозяину для экспрессии. Nucleic Acids Res. 2005, 33: W526-531. 10.1093 / нар / gki376.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

53.

Münch R, Hiller K, Grote A, Scheer M, Klein J, Schobert M, Jahn D: Virtual Footprint и PRODORIC: интегративная основа для предсказания регулонов у прокариот. Биоинформатика. 2005, 21: 4187-4189. 10.1093 / биоинформатика / bti635.

PubMed Статья Google Scholar

54.

Данн Н.В., Холлоуэй Б.В.: Плейотрофия устойчивых к парафенилаланину и гиперчувствительных к антибиотикам мутантов Pseudomonas aeruginosa .Genet Res. 1971, 18: 185-197. 10.1017 / S0016672300012593.

PubMed CAS Статья Google Scholar

55.

Раме Л.Г., Стивенс Э.Дж., Вольфорт С.Ф., Шао Дж., Томпкинс Р.Г., Аусубель Ф.М.: Общие факторы вирулентности для бактериальной патогенности у растений и животных. Наука. 1995, 268: 1899-1902. 10.1126 / science.7604262.

PubMed CAS Статья Google Scholar

56.

Клаузен М., Хейдорн А., Рагас П., Ламбертсен Л., Ааес-Йоргенсен А., Молин С., Толкер-Нильсен Т.: Формирование биопленки с помощью Pseudomonas aeruginosa дикого типа, мутантов пили жгутиков и типа IV. Mol Microbiol. 2003, 48: 1511-1524. 10.1046 / j.1365-2958.2003.03525.x.

PubMed CAS Статья Google Scholar

57.

Daniels C, Griffiths C, Cowles B, Lam JS: Pseudomonas aeruginosa Длину цепи О-антигена определяют перед лигированием к ядру липида А.Environ Microbiol. 2002, 4: 883-897. 10.1046 / j.1462-2920.2002.00288.x.

PubMed CAS Статья Google Scholar

58.

Abeyrathne PD, Daniels C, Poon KKH, Matewish MJ, Lam JS: Функциональная характеристика WaaL, лигазы, связанной со связыванием полисахарида О-антигена с ядром липополисахарида Pseudomonas aeruginosa . J Bacteriol. 2005, 187: 3002-3012. 10.1128 / JB.187.9.3002-3012.2005.

PubMed CAS PubMed Central Статья Google Scholar

Исследование большой коллекции бактериофагов Pseudomonas aeruginosa, собранных из единого источника окружающей среды в Абиджане, Кот-д’Ивуар

Выделение фагов из сточных вод

Чтобы способствовать выделению различных фагов, мы выбрали, в дополнение к эталонным штаммам PAO1 и PA14, шесть клинических штаммов (C3-16, C7-6, C5-2, C8-14, C8-20 и C50), которые, как ранее было показано, устойчивы к большой коллекции фагов разных родов (в том числе из испытанной партии Pyo-Phage), и трем клиническим штаммам (C9-11, C2-10, SCH) с большой восприимчивостью к этим фаги [26].Точечный анализ выполняли с супернатантом, и фаги, присутствующие в зонах лизиса, очищали с помощью нескольких циклов выделения отдельных бляшек. Когда на одном образце наблюдались различные морфологии бляшек, их выделяли и очищали. После этого было выбрано ограниченное количество штаммов амплификации для хорошего уровня роста фага, причем наиболее часто использовались PAO1 и C2-10. Происхождение пробы воды, дата выделения и бактериальные штаммы, использованные для выделения и амплификации новых фагов, обобщены в таблице 1.Интересно, что фаг Ab22 продуцировал как прозрачные, так и мутные бляшки на штамме C2-10 в зонах высокой плотности, и этот фенотип наблюдался даже после репликации прозрачной или мутной бляшки (S1 фиг.). Подобный фенотип ранее наблюдался с фагом p2-10 _0r, LUZ24-подобным фагом, выделенным в Орсе, Франция [26], и с другими фагами этого рода [44]. Фаг Ab05 продуцировал прозрачные бляшки на PA14 и PA01, а на PA14 был виден ореол. Фаг 1-15 _pyo, ɸKMV-подобный фаг, выделенный из Pyo-Phage и используемый здесь в качестве контроля, образовывал аналогичные бляшки с ореолом на PAO1 [26].

Все геномы фагов были переварены разными рестрикционными ферментами, что показало, что картина полос была идентична или очень похожа у некоторых фагов, тогда как у других были специфические профили (данные не показаны). Комбинируя результаты различных ферментативных перевариваний, фаги Ab05, Ab09, Ab22, Ab26, Ab30 и Ab31 оказались уникальными, в то время как другие фаги попали в пять групп, включая двенадцать, пять, четыре и три члена соответственно.

Секвенирование всего генома

Секвенирование всех 30 фагов было выполнено с использованием технологии Illumina, и считанные данные были собраны, давая один контиг.В некоторых фагах при выравнивании считываний с собранными последовательностями и в соответствии с предыдущим наблюдением для Ab01 высокие пики считываний можно было наблюдать в двух положениях, ограничивая прямой концевой повтор (DTR) на концах генома (S2 рис.) . Собранные геномы были сопоставлены со всеми доступными P . aeruginosa геномов фага, чтобы определить ближайший из них. Для всех фагов, кроме Ab31 и группы Ab18 (Ab18, Ab19, Ab20, Ab21), выравнивание было возможным на 85–95% по всей последовательности известного генома.Размер генома новых фагов и род, к которому они принадлежат, указаны в таблице 2. Некоторые последовательности генома оказались почти идентичными, что позволяет предположить, что один и тот же фаг был изолирован несколько раз независимо. 30 выделенных фагов соответствуют 22 отдельным фагам. Интересно, что содержание GC у большинства фагов значительно уступало бактериальной хромосоме (66,6% для PAO1), за исключением фагов родов YuA и DMS3, а также для Ab05. Предполагаемые ORF были идентифицированы для каждого фага, и аннотация была выполнена путем сравнения с близкородственными генами.Белки были разделены на различные функциональные группы: морфогенез и упаковка, репликация ДНК, модификация и рекомбинация, регуляторные функции, синтез нуклеотидов. Всего 21 из 22 независимых фагов можно отнести к девяти известным родам, которые описаны ниже, а один фаг, Ab31, представлял собой комбинацию вирулентного и умеренного фага. Подробный анализ Ab31, который показал ограниченную гомологию на уровне ДНК с несколькими лямбда-подобными фагами, был опубликован независимо [36].

PAK_P1-подобных вирусов.

Двенадцать фагов из этого вирулентного рода фагов, включая ранее описанный фаг Ab01 [26], были выделены в четырех разных местах в Абиджане в основном в 2010 году, но также один раз в 2011 году. Они были разделены на пять различных подгрупп, внутри которых последовательности генома различались всего несколькими нуклеотидами. Они продемонстрировали более чем 90% сходство с геномами PAK_P1 из Франции [45], PAP1 из Китая [25] и JG004 из Германии [24]. Для всех двенадцати фагов этого рода были обнаружены DTR размером 1153 п.н. (Ab01, Ab07) или 1165 п.н. (Ab02, Ab08, Ab10, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab23, Ab24 и Ab25), аналогично тем, которые наблюдались у близкородственных PAK_P1-подобные геномы.Разница в размере DTR была связана с вставкой / удалением нескольких пар оснований. Все геномы обладали 14 генами тРНК и кодировались для собственной ДНК-полимеразы и для контроля метаболизма нуклеотидов. На рис. 1 показана организация ORF на фаге Ab02, а в таблице S1 перечислены ORF с предполагаемой функцией. Один геном каждой подгруппы был выбран для множественных выравниваний, выявляющих участки высокой гетерогенности, но также и несколько областей (3–9 т.п.н.) только с несколькими однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) (S3 Fig).Участки последовательностей, показывающие высокий уровень дивергенции и низкие значения dN / dS, наблюдались в первых 17 т.п.н. генома, отражая события горизонтального генетического переноса (HGT) [46]. Напротив, некоторые области были лишены следов HGT и отличались несколькими SNP и высокими значениями dN / dS. Было отмечено наличие / отсутствие последовательностей. Ab08 обладал геном, кодирующим предполагаемую эндонуклеазу с мотивом H-N-H (Ab08 ORF38, между ORF 39 и ORF40 Ab02). Этот ген отсутствует у других фагов из Абиджана, но присутствует в JG004 (PJG4_036) и PAK_P2 (00161c).В Ab02 последовательность 759 пар оснований, кодирующая ORF 104, была вставлена в ген полимеразы, разделив его на два гена, кодирующих часть I ДНК-полимеразы (ORF103) и часть II (ORF105). Вставка была связана с интроном, описанным в гене ДНК-полимеразы LUZ24 (PPLUZ24_gp35), и кодирующим его собственную эндонуклеазу. Сравнение с другими фагами того же рода (JG004, PaP1 и PAK_P1) показало более высокий уровень разнообразия, что отражено в представлении минимального остовного дерева (рис. 2). Очень высокий уровень сходства последовательностей африканских фагов в областях генома, не затронутых HGT, свидетельствует в пользу недавней диверсификации от общего основателя.Наблюдалась замечательная консервация белковых последовательностей, например, для основного капсидного белка, который был идентичен во всех фагах, как описано ранее [25]. Область размером 827 п.н., присутствующая только в JG004 (положения от 34 438 до 35 264), охватывает ген эндонуклеазы (PJG4_070), вставленный между генами, гомологичными ORF62 Ab02 и ORF63.

Рис. 1. Геномная организация PAK_P1-подобного фага Ab02.

ORF показаны стрелками. Различные цвета соответствуют предполагаемой функции: желтый, неопознанный, красный, метаболизм нуклеотидов, оранжевый, терминаза, зеленый, морфогенез и упаковка, темно-синий, репликация ДНК, голубой, DTR.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g001

Рис. 2. Представление минимального остовного дерева геномов PAK_P1-подобных фагов.

Цифры, указанные на каждой ветви, представляют количество SNP, образующих эту ветвь. Всего было идентифицировано 12125 SNP, размер дерева составляет 19714, что указывает на высокий уровень гомоплазии. Гомоплазия может быть результатом независимых событий HGT с неизвестными фагами, заражающими другие виды Pseudomonas . Цветами обозначена страна происхождения фагов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g002

Полиморфизм 21 п.н. у фагов этой группы соответствовал длине короткой дупликации. Он кодировал пептид из семи аминокислот (VGAPWYS), часть гипотетической ORF75 фага Ab02, содержащий предполагаемый домен, подобный лейциновой молнии. Фаги Ab02, Ab15, Ab24 и Ab25 имели одну копию, тогда как другие фаги имели две копии, и этот полиморфизм был подтвержден амплификацией ПЦР (данные не показаны).

KPP10-подобных вирусов.

Пять фагов (Ab03, Ab04, Ab06, Ab11, Ab17), выделенные в 2010 и 2011 годах в четырех разных местах в Абиджане, принадлежали к роду вирулентных фагов, подобных KPP10. Все они были разными и имели 88-96% идентичность последовательностей с геномами KPP10 из Японии [27] и PAK_P3 из Франции [23,45]. В позиции 23000 во всех фагах, кроме Ab17, наблюдалась область с очень низким охватом считыванием, соответствующая области, богатой AT. Был обнаружен предполагаемый DTR из 771 п.н. (Ab03, Ab04, Ab11, Ab17), показывающий внутреннюю делецию 15 п.н. в Ab06, определяющую концы генома.Предполагаемое положение нуклеотида в одном положении отличалось от указанного первого нуклеотида фага KPP10. Геномы пяти фагов были аннотированы (Ab06 показан на фиг. 3), показывая, что в целом организация ORF была очень похожа на организацию родственных фагов с некоторыми отличиями для некоторых очень коротких гипотетических белков. В соответствии с KPP10, эти фаги имели три гена тРНК (тРНК ^Asn, тРНК ^Tyr и тРНК ^Gln). При выравнивании пяти геномов с помощью Geneious было обнаружено несколько областей изменчивости внутри в остальном во многом схожих последовательностей (S4 фиг.).В регионах, наиболее часто встречающихся с HGT, процент SNP составлял 20% по сравнению с 0,1% в среднем в остальной части генома, а отношения dN / dS были низкими. Подобно фагам PAK_P1, первые 22 kb и последние 8 kb показали самые большие следы HGT. Интересно отметить, что некоторые сайты рекомбинации оказались внутри кодирующих областей, что привело к продукции предполагаемых белков с высоким уровнем гетерогенности. Так было, например, в случае ORF14, кодирующего гипотетический белок, соответствующий ORF120 в KPP10, который сильно отличался у пяти фагов и, по-видимому, представлял собой лоскутное одеяло из коротких участков из разного происхождения.Подобно PAK_P1-подобным фагам пять KPP10-подобных фагов из Абиджана сгруппированы на большом генетическом расстоянии от фагов, выделенных в других странах (Рис. 4). Между разными фагами наблюдали несколько областей коротких вставок / делеций, что иногда приводило к слиянию двух предполагаемых ORF. В Ab17 отсутствует область 3271 п.н., охватывающая семь гипотетических ORF (ORF89 — ORF96 в Ab06), полностью консервативных в других фагах. В результате предполагаемая РНК-лигаза (ORF91 в Ab17) была сформирована путем слияния начала ORF89 и ORF97 (также предполагаемой РНК-лигазы в других фагах) в Ab06.Эта область соответствует нуклеотидам от 22 874 до 26 077 в KPP10, а также включает семь предполагаемых генов с неизвестной функцией (от ORF34 до ORF40). Другой участок длиной 528 п.н. отсутствовал в Ab03 и Ab06 и соответствовал ДНК без гомологии в Genbank / EMBL на нуклеотидном уровне.

Рис. 3. Геномная организация KPP10-подобного фага Ab06.

Различные ORF окрашены в соответствии с их предполагаемой функцией: желтый, неизвестный; красный, метаболизм нуклеотидов; апельсин, терминаз; зеленый, морфогенез; синий, репликация ДНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g003

Рис. 4. Представление минимального остовного дерева генома KPP10-подобных фагов.

Цифры, указанные на каждой ветви, представляют собой количество SNP, составляющих эту ветвь. Всего было идентифицировано 9097 SNP, а размер дерева составил 12233, что указывает на значительный уровень гомоплазии. Цветами обозначена страна происхождения фагов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g004

PB1-подобных вирусов.

Три фага (Ab27, Ab28 и Ab29) имели в среднем 97% -ный уровень сходства с несколькими PB1-подобными вирулентными фагами, такими как JG024 из Германии (66,275 п.н.) [47], KPP12 из Японии (64,144 п.н.) [48], NH-4 из Ирландии (66,116 п.н.) [49] и SN из России (66,390 п.н.) [50]. Присутствие категории прочтений с одним фиксированным окончанием предварительно обозначило положение концов генома фагов, но не было никаких указаний на DTR. Основываясь на этой информации, первый нуклеотид может быть расположен примерно на 7500 п.н. выше, чем указано для фага PB1.Выравнивание трех фаговых геномов показало, что Ab27 и Ab29 были довольно похожими, за исключением первых 4400 п.н. и последних 11400 п.н., где можно было видеть следы событий рекомбинации (S5 Рис.), Характеризующихся высокой плотностью вариаций нуклеотидов. Ab28 сильно отличался от двух других на уровне нуклеотидов, но ORF были удивительно хорошо консервативными в трех фагах и других PB1-подобных фагах. Геномная организация фага Ab27 показана на рис. 5. РНК-полимеразы не было, но, по-видимому, существовал полный механизм репликации ДНК, наблюдаемый у других PB1-подобных фагов.Между ORF60 для Ab27 и ORF61 (положение 36 360) считывания содержали 9 или 10 G, что указывает на возможность изменения фазы в этом сайте. Интересно, что последовательность из 30 п.н. (GATGCCCCGGCGAACCGGGGCGGGGTGGTT) в положении 8,087–8,187 фагового генома присутствовала в качестве спейсера в кластерной регулярной области (CRISPR) нескольких P . aeruginosa геномов. Эта структура является частью адаптивной иммунной системы, которая, как полагают, играет роль в P . aeruginosa устойчивость к бактериофагам и плазмидам [51], но обычно не связана с устойчивостью к литическим фагам.Несколько исследований показали, что в P . aeruginosa , CRISPR несут в основном последовательности умеренных фагов [26,51]. Наши наблюдения показывают, что система CRISPR-Cas может играть роль в регуляции инфекции PB1-подобных фагов.

Рис. 5. Геномная организация PB1-подобного фага Ab27.

Различные ORF окрашены в соответствии с их предполагаемой функцией: желтый, неизвестный; метаболизм красных нуклеотидов; апельсин, терминаз; зеленый, морфогенез; синий — репликация ДНК; пурпурный, лизис.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g005

N4-подобный вирус.

Длина генома Ab09 составляла 72 028 п.н. Он показал в среднем 93% сходства с литическим фагом LIT1, N4-подобным вирусом, выделенным в Бельгии (72 544 п.н.) [52], хотя некоторые области имели менее 80% сходства с этим фагом. Напротив, среднее сходство на уровне нуклеотидов с фагом LUZ7, другим N4-подобным вирусом из Бельгии, составляло только 65%. Было обнаружено, что DTR размером 641 п.н. соответствует DTR 655 п.н. LIT1.Геном кодировал 83 гипотетических белка, среди которых гигантский белок из 3398 аминокислот (ORF66), характерные инкапсулированные вирионами РНК-полимеразы N4-подобных вирусов (рис. 6) [52], которые позволяют транскрипцию ранних генов в этих фагах. Ab09, как и другие N4-подобные фаги, кодировал второй тип РНК-полимеразы (ORF18 и ORF19), гетеродимерную Т7-подобную РНКП. Подобно ORF 56 в фаге LUZ7, ORF48 Ab09 выровнен с ORF52 и ORF53 LIT1, оба предполагаемых хвостовых белка разделены 195 нуклеотидами [52].Гены тРНК не идентифицированы. Подобно другим литическим фагам с большими геномами, на одном конце генома была обнаружена группа небольших гипотетических открытых рамок считывания.

Рис. 6. Геномная организация N4-подобного фага Ab09.

Различные ORF окрашены в соответствии с их предполагаемой функцией: желтый, неизвестный; серый — транскрипция; зеленый, морфогенез; синий — репликация ДНК; пурпурный, лизис.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g006

ɸKMV-подобных вирусов.

Ab05 (43 639 пар оснований) продемонстрировал в среднем 98% сходство последовательностей с литическими фагами LUZ19 из Бельгии (43 548 пар оснований) [53] и ɸKMV из России (42 519 пар оснований) [54]. Наблюдался DTR 431 п.н., аналогичный LUZ19 (472 п.н. DTR). В целом организация предполагаемых генов аналогична ɸKMV-подобных фагам [10,55] (Рис. 7). В отличие от вирусов с большим геномом, описанных выше, Ab05 и другие ɸKMV-подобные геномы были более компактными и по существу экспрессировали гены морфогенеза и репликации в дополнение к группе небольших гипотетических открытых рамок считывания.Обнаружена РНК-полимераза (ORF31), что обычно наблюдается у фагов этого рода. Первая область генома, оканчивающаяся после гена РНК-полимеразы и включающая гены преобразования хозяина и репликации ДНК (ранняя область), была областью, показывающей наибольшее разнообразие [55]. Кассета для лизиса, состоящая из пинхолина (ORF49), эндолизина (ORF50) и спанинов (ORFs 51–52), была аналогична кассете, описанной в KMV-подобных фагах [56]. Интересно, что предполагаемые ORF не были обнаружены в первых 1900 нуклеотидах, в области, содержащей от трех до пяти сильных промоторов в других ɸKMV-подобных фагах.Каноническая нуклеотидная последовательность 5’-CGACXXXXXCCTACTCCGG-3 ’, локализованная в предполагаемых сайтах для одноцепочечных прерываний ДНК [57], была обнаружена трижды в геноме Ab05 (стрелки на рис. 7). Ab05 показал, кроме того, вариантную последовательность 5’-GGGCXXXXXCCTACTCCGG-3 ’. В этих положениях можно было наблюдать избыток считываний секвенирования. По сравнению с другими геномами ɸKMV-подобных фагов наблюдались четыре делеции предполагаемых генов, а также множество областей с низким уровнем сходства на уровне нуклеотидов, что отражает события рекомбинации.Две меньшие делеции соответствуют в фаге LKD6 области, содержащей предполагаемый промотор, и межгенной последовательности [55]. Делеция 3 охватывает короткую ORF17.1 phiKF [58]. Делеция 4 охватывает gp20 в LUZ19, короткой ORF, присутствующей во всех секвенированных ɸKMV-подобных фагах.

Рис. 7. Геномная организация ɸKMV-подобного фага Ab05.

Различные ORF окрашены в соответствии с их предполагаемой функцией: желтый, неизвестный; апельсин, терминаз; зеленый, морфогенез; синий — репликация ДНК; пурпурный, лизис.Вертикальные стрелки указывают положение разрывов одноцепочечной ДНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g007

LUZ24-подобный вирус.

Геном Ab22 имел длину 45 808 п.н. и показал 86–96% сходства с литическим фагом LUZ24 из Бельгии (45 625 п.н.; AM

0 [59]) и лизогенным фагом PaP3 из Китая (45 503 п.н. NC_004466 [60]). Геном также был близок к геному фага 1-14 _Or01, который мы ранее изолировали во Франции [26]. Ab22 обладал DTR 184 п.н., как наблюдали для 1-14 _Or01 (182 п.н.) [26].Аннотация предсказала существование 71 предполагаемой ORF и трех тРНК (тРНК ^Pro, тРНК ^Tyr и тРНК ^Asn) (рис. 8). Для сравнения, LUZ24 показал 74 ORF и две тРНК, а PaP3 — 71 ORF и 4 тРНК. Наблюдали несколько областей вставки или делеции по отношению к LUZ24. Самый длинный (1206 п.н.) присутствовал в Ab22 (ORF17) и отсутствовал в LUZ24, а также во всех других близкородственных P . aeruginosa фагов. Он показал 100% идентичность с гибридным белком транспозазы фага TL из России (YP_00

04), что позволяет предположить, что этот ген, возможно, способствует встраиванию генома фага в бактериальную ДНК.Второй по величине областью различия был фрагмент длиной 665 п.н., отсутствующий в Ab22, кодирующий эндонуклеазу gp35 (самосплайсинговый интрон) в LUZ24, разделяющий полимеразные части II и III (ORF34 и ORF36). Эти два гена были слиты в одну ORF в Ab22 (ORF38). Первые 1000 нуклеотидов не кодировали какой-либо предполагаемый белок и, вероятно, содержали промоторы, хотя консенсусная последовательность, описанная Ceyssens et al. [59] не может быть найден на этой позиции. В шести положениях (стрелки на фиг.8) избыточное количество прочтений соответствовало последовательности 5′-GTACTATGAC-3 ‘или варианту 5′-GTACTGTGAC-3’, отмечающему прерывания одноцепочечной ДНК, наблюдаемые в вирусном геноме. .Мы и другие ранее сообщали о существовании таких сайтов с фагами семейства LUZ24 [26,61].

Рис. 8. Геномная организация LUZ24-подобного фага Ab22.

Различные ORF окрашены в соответствии с их предполагаемой функцией: желтый, неизвестный; красный — биосинтез; зеленый, морфогенез; синий — репликация ДНК; пурпурный, лизис. Вертикальные стрелки указывают положение разрывов одноцепочечной ДНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g008

YuA-подобных вирусов.

Ab18, Ab19, Ab20 и Ab21, выделенные в 2010 и 2011 годах в двух местах и показывающие связанные профили рестрикции, оказались YuA-подобными фагами. Секвенирование генома показало, что на самом деле было только три разных фага, причем Ab19 и Ab21 были идентичными. При секвенировании считывания выровнены как кольцевой геном без аномальных пиков считываний, и, следовательно, первый нуклеотид был назначен путем сравнения с ближайшим геномом YuA из России (58 663 п.н.) [62]. Геном трех фагов показал в лучшем случае 70% сходство с геномом YuA и MP1412 из Южной Кореи (61 167 п.н.) [63].На уровне белка можно было наблюдать дополнительные сходства, особенно в структурных белках. Более того, ДНК-полимераза (ORF18) и ген терминазы (ORF46) также показали повышенную степень гомологии с таковыми из YuA. На рис. 9 показана организация 76 открытых рамок считывания для Ab18, все они ориентированы в одном направлении. В целом организация была организацией YuA с некоторыми заметными различиями, особенно на уровне небольших ORF с неизвестной функцией. ORF6 и ORF7 Ab18 и Ab19 кодируют малые и большие субъединицы рибонуклеазредуктазы класса Ia, что соответствует одному гену в YuA.Присутствовали предполагаемый репрессор (ORF21) и интеграза (ORF22), демонстрирующие 55% идентичность с таковой YuA, что позволяет предположить, что фаг, возможно, может лизогенизировать своего хозяина. Другие части генома не имели гомологии ни с одним фагом в общедоступных базах данных ни на уровне нуклеотидов, ни на уровне белков. Геномы Ab18, Ab19 и Ab20 показали в среднем 95% сходства друг с другом и показали несколько областей вставки / удаления. Геномы были выровнены, показывая, что в целом SNP были распределены равномерно, за исключением одной большой области с низким процентом сходства, охватывающей гены белков хвостовых волокон (S6, фиг.).Это контрастирует с высоким уровнем дивергенции, наблюдаемым с ближайшим фагом YuA, и обеспечивает прямую оценку относительной роли мутации по происхождению по сравнению с рекомбинацией в этой гомогенной группе фагов. Сообщалось, что геномы YuA-подобных фагов устойчивы ко многим рестрикционным ферментам, включая Eco RI, хотя в их геномах существуют сайты рестрикции Eco RI [7,62]. Мы наблюдали аналогичную устойчивость у четырех фагов из Абиджана, что позволяет предположить наличие модификаций ДНК.

Рис. 9. Геномная организация YuA-подобного фага Ab18.

Различные ORF окрашены в соответствии с их предполагаемой функцией: желтый, неизвестный; апельсин, терминаз; красный — восстановление ДНК; зеленый, морфогенез; синий — репликация ДНК; фиолетовый, лизис, розовый, вставка профага.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g009

PA73-подобный вирус.

Геном

Ab26 имел длину 43 055 п.н. и кодировал 52 предполагаемых белка (рис. 10). Он показал 87% гомологию с vB_Pae-Kakheti25 из Джорджии (42 844 п.н .; NC 007806), считающимся литическим фагом [64], и с PA73 из набора Линдберга (42 999 п.н .; DQ163913) [65].Концы фагов и ориентация карты генома были выровнены с таковыми у родственных фагов, и выравнивание показало высокую общую консервацию генной организации между этими фагами, за исключением трех областей. 296 п.н. в начале генома, кодирующие белок, обнаруженный в кассете лизиса в фаге vB_Pae-Kakheti25, сильно различались у трех фагов. Интересно, что Ab26 обладал хорошо законсервированными генами холина, эндолизина, Rz и Rz1-спанина (от ORF01 до ORF04), формируя кассету лизиса, подобную той, что описана в KMV-подобных фагах [56].Одна область длиной 1600 п.н., кодирующая белки, обнаруженные в зрелых вирионах (ORF21-ORF22), показала примерно 70% сходства с vB_Pae-Kakheti25, но 95% с PA73. Наконец, с позиции 36000, после гена, кодирующего предполагаемую примазу / геликазу (ORF35), до конца генома наблюдалась серия коротких гипотетических ORF, показывающих высокую степень дивергенции по сравнению с двумя ближайшими фагами. Не было четко идентифицировано ни интегразы, ни другого белка, который мог бы участвовать в лизогении. Однако было показано, что ORF31, recA-подобная рекомбиназа, принадлежит к семейству белков sak4, почти исключительно связанных с умеренными фагами [66].

Рис. 10. Геномная организация PA73-подобного фага Ab26.

Различные ORF окрашены в соответствии с их предполагаемой функцией: желтый, неизвестный; апельсин, терминаз; красный — биосинтез; зеленый, морфогенез; синий — репликация ДНК; пурпурный, лизис.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g010

D3112 / B3-подобный вирус.

Ab30 имел геном 37 238 пар оснований и показал от 91 до 99% сходства с мобильным фагом DMS3 из США (36 415 пар оснований) [67] и фагами MP38 (36 885 пар оснований; EU272037) и D3112 из России (37 611 пар оснований) [68 ].Эти фаги родственны фагу Mu Escherichia coli , который реплицируется путем транспозиции [69] и имеет на конце своего генома фрагменты хромосомной ДНК различного размера. Присутствие характерного гена репрессора c (ORF01) и генов транспозаз A (ORF06) и B (ORF07) в области раннего генома предполагает сходный механизм литико-лизогенного переключения (Рис. 11). Подобно другим фагам этого рода, Ab30 обладал обширной мозаичной структурой, но генная организация хорошо сохранилась.Сопоставление с фагом DMS3 выявило области с большим разнообразием, такие как ORF01, и дополнительные гены, кодирующие короткие гипотетические белки. Ранее было показано, что ингибирование образования биопленок, а также роение подвижности DMS3-лизогенных бактерий опосредовано системой CRISPRs-Cas [67]. Атипичные гены, способные инактивировать бактериальную систему CRISPR-Cas, были идентифицированы в геномах Mu-подобных фагов [70,71]. По сравнению с опубликованными последовательностями Mu-подобных фагов, группа гипотетических генов, кодирующих ORF36-ORF39, может представлять анти-CRISPR-область.

Рис. 11. Геномная организация D3112 / B3-подобного фага Ab30.

Различные ORF окрашены в соответствии с их предполагаемой функцией: желтый, неизвестный; красный — обмен веществ; зеленый, морфогенез; розовый, транспозиция.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130548.g011

Спектр диапазона хостов

Диапазон хозяев фага был определен на коллекции P . aeruginosa штаммов, использованных для выделения фагов, включенных в данное исследование, и дополнительных штаммов, выбранных по их устойчивости к пиофагу [26].Полный результат показан в таблице S2, а в таблице 3 показан спектр вирулентности одного фага для каждого рода и спектр вирулентности четырех фагов, выделенных из Pyo-Phage (p1-14 _pyo, p8-13 _pyo, p1-15 _pyo и p2-10 _pyo). Члены рода обычно проявляли сходную вирулентность по отношению к выбранной группе бактериальных штаммов, за некоторыми исключениями. Вместе существующая коллекция литических фагов (все миовирусы и подовирусы, кроме Ab31), принадлежащих к шести родам, могла лизировать 16 из 20 протестированных штаммов.Четыре штамма, C5-13, C8-14, C8-15 и C8-20, были устойчивы ко всем фагам. Фаги рода PAK_P1 показали самую высокую вирулентность как по спектру, так и по эффективности посева. Семь из них показали высокую эффективность посева на C7-6, устойчивый к пиофагам штамм, в котором они образовывали большие прозрачные бляшки. На одном и том же штамме Ab01, Ab15 и Ab23 показали в десять раз меньший рост, а Ab24 и Ab25 не выросли. На C7-6 не наблюдалось четких бляшек ни у одного фага, принадлежащего к другим родам.Точно так же большинство фагов рода PAK_P1 могут лизировать два других штамма, устойчивых к пиофагам, C8-5 и C8-7. Три PB1-подобных фага показали широкий диапазон хозяев, заражая устойчивые к пиофагам штаммы C7-12, C7-25, C9-5 и C9-6, но с меньшей эффективностью по сравнению с ростом на PAO1, SCH и C3. -16. Это напоминало широкий спектр родственных T4-подобных вирусов. Как было показано ранее [72], KPP10-подобные фаги были очень специфичны по отношению к определенным клиническим штаммам и проявляли сильную вирулентную активность в отношении штамма PAO1, на котором наблюдались прозрачные бляшки.Они производили мутные бляшки у ограниченного числа других штаммов. Могли быть получены несколько членов литических PAK_P1, PB1 и KPP10-подобных фагов, что, возможно, отражает широкий диапазон хозяев для первых двух родов. Однако это более удивительно для KPP10-подобных фагов, эффективный рост которых ограничен PAO1 в нашей коллекции штаммов. Это может означать, что P . aeruginosa не является предпочтительным хозяином для этого рода. Ab22, фаг, подобный LUZ-24, продуцировал прозрачные и мутные бляшки у штамма C2-10 (рис. 1) и однородные мутные маленькие бляшки у штамма PAO1.Диапазон хозяев KMV-подобного фага Ab05 был подобен таковому для фага p1-15 _pyo, другого KMV-подобного фага, но с другой эффективностью, причем Ab05 был явно менее вирулентным. В частности, p1-15 _pyo продуцировал большие бляшки с ореолом, характерным для этого рода в штамме PAO1 [10], тогда как Ab05 продуцировал бляшки с небольшим ореолом только на PA14. N4-подобный фаг Ab09 имел довольно широкий спектр вирулентности, но отличался от такового у PAK_P1-подобных фагов. Он образовывал прозрачные бляшки размером 1-2 мм на PAO1 без ореола, в отличие от других P . aeruginosa N4-подобных фагов [52].

Сифовирусы P . aeruginosa в основном являются фагами умеренного климата, и мы ожидали, что они будут иметь довольно специфический диапазон хозяев. Группа фагов, родственных YuA (Ab18, Ab19-Ab21, Ab20), показала различные профили вирулентности, но самая высокая эффективность посева была отмечена с PAO1, на котором они образовывали небольшие прозрачные бляшки (0,5-1 мм). Интересно, что только фаги этой группы инфицировали широко распространенный европейский штамм C50 (эталонный штамм для клона C), который также устойчив к пиофагам.Ab26 эффективно рос только на штамме SCH и вызывал более ограниченный рост на нескольких других штаммах. Фаг vB_Pae-Kakheti25, принадлежащий к тому же роду, обладает очень большим диапазоном хозяев по отношению к клиническим штаммам [64]. Ab30 проявлял литическую активность только в отношении PA14.

Способность фагов из трех групп сифовирусов образовывать лизогены проверяли по присутствию вирусной ДНК с помощью ПЦР в устойчивых колониях, выделенных из центра мутных бляшек, а затем пассированных не менее трех раз.Лизогены для Ab30 могут быть получены в штамме Tr60, о чем свидетельствует стабильное присутствие фагового генома и индукция вирионов митомицином С. Лизогены для Ab18 не могли быть получены в штамме PAO1, наиболее чувствительном штамме для этого фага, как сообщалось для YUA, и несмотря на присутствие гена интегразы в геноме фага. В штамме C2-18, в котором наблюдался только умеренный рост, ДНК Ab18 сохранялась в течение нескольких поколений, но исчезла при дальнейшем репликации, что свидетельствует о псевдолизогенном состоянии.Геномы Ab26 могут быть обнаружены в устойчивых вариантах SCH, штамме, который поддерживает его рост, но не могут быть получены стабильные лизогены.

Смешивая по одному представителю каждого рода в настоящей коллекции, мы смогли лизировать все P . aeruginosa изолятов, за исключением четырех, которые, по-видимому, также устойчивы к ɸKZ-подобным вирусам [26]. Диапазон хозяев зависит от взаимодействий между волокнами хвоста фага и бактериальным рецептором, но в чувствительность бактерий к фагам участвуют дополнительные механизмы.Неудача фаговой инфекции может быть связана с исключением суперинфекции, поскольку большинство штаммов, выделенных от пациентов с МВ, обладают одним или несколькими профагами [26]. Действительно, наличие профагов в бактериальной хромосоме иммунизирует бактерии против инфекции фагами той же природы [73]. Во время лизогении D3-подобные фаги модифицируют рецепторы LPS, делая бактерии устойчивыми к LPS-зависимым фагам, включая вирулентные фаги [74]. Другой механизм специфичности вирулентных фагов может быть связан с ингибированием общего механизма защиты от фагов, созданного системой CRISPR-Cas.Недавние исследования показали, что система CRISPR-Cas может быть фактором устойчивости бактерий к вирулентным фагам [75].

бактериофагов могут лечить и предотвращать инфекции легких, вызванные синегнойной палочкой | Журнал инфекционных болезней

Аннотация

Устойчивые к антибиотикам бактерии угрожают жизни во всем мире. Хотя новых антибиотиков мало, использование бактериофагов, вирусов, заражающих бактерии, редко предлагается как средство восполнения этой нехватки.По-прежнему широко распространены сомнения в эффективности фаговой терапии, несмотря на недавние обнадеживающие результаты. Используя биолюминесцентный штамм Pseudomonas aeruginosa , мы контролировали и количественно оценивали эффективность лечения бактериофагом у мышей во время острой легочной инфекции. Лечение бактериофагами не только эффективно спасало животных от смертельной инфекции, но также способствовало предотвращению легочной инфекции при введении за 24 часа до бактериальной инфекции, тем самым расширяя возможности использования бактериофагов в качестве терапевтических агентов для борьбы с бактериальной инфекцией легких.

Легочные инфекции — одна из основных причин смертности во всем мире. По оценкам, ежегодно от острых респираторных инфекций умирает около 2 миллионов детей в возрасте до 5 лет [1]. Кроме того, количество бактериальных инфекций, вероятно, увеличивается из-за устойчивости к антибиотикам. Оппортунистические патогены становятся все более устойчивыми к нескольким антибиотикам, что побуждает нас искать другие терапевтические подходы, поскольку новых антибактериальных соединений мало [2].

Фаговая терапия — один из нескольких потенциальных терапевтических подходов, который рассматривается с конца 1980-х годов [3–6].Бактериофаги — это вирусы, поражающие только бактерии. С середины 20 века исследования бактериофагов помогли выяснить фундаментальные клеточные процессы, и теперь бактериофаги являются одними из самых известных биологических объектов на молекулярном уровне. Два важных фактора поддерживают рассмотрение фаговой терапии: (1) она использовалась в течение десятилетий в Восточной Европе и до сих пор используется для лечения инфекций у людей [7, 8]; и (2) биология бактериофагов сегодня изучена гораздо лучше, чем в середине 20-го века, когда ее игнорировали в пользу антибиотиков [9–11].Три основных характеристики отличают терапию бактериофагами от терапии антибиотиками: (1) бактериофаги размножаются в очаге инфекции; (2) они нацелены только на определенные бактерии, не влияя на комменсальную флору; и (3) они могут адаптироваться к резистентным бактериям.

Бактерия Pseudomonas aeruginosa вызывает острую пневмонию с высокой смертностью у пациентов с ослабленным иммунитетом; у пациентов с муковисцидозом (МВ) он вызывает хроническое воспаление, которое приводит к разрушению легких [12].Интересно, что большое количество бактериофагов P. aeruginosa было обнаружено в большом количестве, а 38 полных геномов теперь доступны в базах данных Национального центра биотехнологической информации [13]. Однако в нескольких статьях описано использование бактериофагов Pseudomonas в терапевтических экспериментах, и, насколько нам известно, испытаний на модели легочной инфекции не проводилось [14–16]. В этой работе мы стремились определить, может ли природный бактериофаг, выделенный из окружающей среды, быть подходящим для терапевтического использования в модели инфекции легких животных.Мы использовали биолюминесцентный штамм P. aeruginosa для записи в реальном времени изображения легочной инфекции, что позволило нам отслеживать пространственное и временное развитие инфекций у мелких живых животных [17]. Это позволило количественно оценить эффективность лечения бактериофагами у живых животных, что однозначно демонстрирует его потенциал для лечения бактериальных инфекций легких.

Методы

P. aeruginosa штаммов. Биолюминесцентный штамм PAK (PAK lumi), использованный в этом исследовании, был описан в другом месте [18] и был любезно предоставлен R.Рампал (Гейнсвилл, Флорида). Мы получили 10 штаммов первичной колонизации и 10 штаммов хронической колонизации P. aeruginosa из французского центра сбора штаммов муковисцидоза (P. Plésiat, Гренобль, Франция).

Выделение, приготовление и характеристика бактериофагов. Бактериофаг PAK-P1 был выделен из сточных вод, как описано в Приложении, которое появляется только в онлайн-версии Journal . Крупномасштабное приготовление бактериофагов проводили из 1 л жидкой культуры, как описано Буланже [19].Для экспериментов на животных бактериофаги, полученные ультрацентрифугированием хлорида цезия, разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS).

Анализы

бляшек проводили для определения эффективности посева на клинических штаммах P. aeruginosa в соответствии со стандартными протоколами.

Электронно-микроскопический анализ был проведен на препаратах бактериофага хлорида цезия [20], а наблюдения были выполнены после окрашивания уранилацетатом с помощью электронного микроскопа JEOL 1200 EXII.

Секвенирование генома (20-кратное покрытие) было выполнено Eurofins с использованием технологии 454 на ДНК, полученной с помощью стандартных процедур. Полная последовательность генома бактериофага PAK-P1 доступна в GenBank (номер доступа GQ422154).

Микропоследовательность основного белка капсида была определена с помощью средства микросеквенирования Института Пастера после разделения целых белков бактериофага на геле додецилсульфата натрия с последующим расщеплением трипсином в геле. Пептиды были идентифицированы только после добавления геномной последовательности бактериофага PAK-P1 в базу данных идентификации пептидов.38 полностью секвенированных геномов бактериофага P. aeruginosa доступны на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genlist.cgi?taxidp10239&typep6&namepPhages).

Заявление об этике. Мыши (самцы Balb / c в возрасте 8 недель) были предоставлены Center d’élevage R. Janvier и размещены в помещении для животных в соответствии с руководящими принципами Института Пастера и в соответствии с европейскими рекомендациями.Еда и напитки предоставлялись без ограничений.

Инфекции животных. Мышей перед заражением анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции смеси кетамин-ксилазин. Инфекционная доза составляла 1 × 10 ⁷ люминесцентных бактерий, ресуспендированных в 50 мкл PBS. В лечебных экспериментах после бактериальной инстилляции регистрировали биолюминесценцию и вводили 30 мл бактериофагов интраназально, пока мыши еще спали (ингаляция изофлураном).В профилактических экспериментах за 24 ч до заражения животные получали интраназально 30 мкл бактериофагов или PBS под легким наркозом посредством ингаляции изофлуорана.

Люминесцентные измерения. Фотонное излучение люминесцентных бактерий в легких инфицированных мышей было количественно определено с использованием системы визуализации IVIS 100 (Xenogen Biosciences). После заражения мышей анестезировали с помощью ингаляции изофлуорана и регистрировали люминесценцию бактерий с помощью камеры устройства с зарядовой связью, связанной с программным пакетом LivingImage (версия 3.1; Ксеноген). Было сгенерировано цифровое изображение испускания фотонов в искусственных цветах, и фотоны были подсчитаны в пределах постоянной определенной области, соответствующей поверхности грудной клетки и охватывающей всю область легкого. Все данные были нормализованы путем вычитания среднего фонового уровня, полученного от неинфицированных животных. Эмиссия фотонов выражалась в фотонах / с / см ² / стерадиан. Изображения, показанные для каждого эксперимента, были непосредственно взяты из программного обеспечения LivingImage, в котором цветовая шкала была идентична для каждого отдельного изображения.

Бронхоальвеолярный лаваж и анализ воспаления. Бронхоальвеолярные лаважи (БАЛ; 4 лаважа по 0,5 мл каждый) выполняли в указанные моменты времени после инфицирования после эвтаназии (внутрибрюшинное введение пентобарбитала). Одну часть жидкостей БАЛ центрифугировали при 1400 об / мин в течение 10 мин, а затем определяли концентрации мышиных цитокинов с использованием наборов для иммуноферментного анализа DuoSet (R&D Systems). Другую часть жидкостей БАЛ центрифугировали при 6000 об / мин в течение 10 мин, супернатанты разбавляли и наносили на чашки, покрытые штаммом PAK, для определения количества свободных бактериофагов, тогда как осадки ресуспендировали в PBS и серийные разведения наносили на чашки Luria- Чашки с агаром Бертани для определения количества жизнеспособных бактерий.

Статистический анализ. Значения P были рассчитаны с помощью непарного теста t с использованием программного обеспечения XLStat (версия 2008.7; Addinsoft). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Результаты

Зависимое от дозы и времени действие бактериофагов на инфицированных мышей. Мы выделили из сточных вод бактериофаг, специфичный к штамму PAK P. aeruginosa , который мы назвали PAK-P1 (характеристики см. Ниже).Чтобы установить влияние бактериофага PAK-P1 на инфекцию в модели инфекции легких живых животных, мышей инфицировали биолюминесцентным штаммом PAK, а затем обрабатывали бактериофагами. И бактерии, и бактериофаги вводили путем интраназальной инстилляции. После предварительного эксперимента, который показал, что бактериофаг PAK-P1 был активен in vivo, задерживая смерть сильно инфицированных животных (данные не показаны), был разработан эксперимент для определения количества этого бактериофага, необходимого для полного излечения инфицированных мышей (рис. А ).Хотя мыши, не обработанные фагом, умерли в течение 48 часов после инокуляции PAK (большинство из них были все еще живы через 24 часа), мыши, обработанные бактериофагами в соотношении фаг-бактерия 1:10, умерли в течение 5 дней после инокуляции ПАК. Мыши, получавшие более высокое соотношение бактериофагов к бактериям (1: 1 и 10: 1), выживали до конца эксперимента (12 дней). В 2 независимых экспериментах 100% животных, получавших дозу 10: 1, выжили, тогда как 100% и 80% животных, получавших дозу 1: 1, выжили, что привело нас к выбору соотношения бактериофагов к бактериям. 10: 1 в качестве стандартной дозы для будущих экспериментов.

Рисунок 1.

Влияние обработки бактериофагом на смертельную инфекцию у мышей. A , Кривые выживаемости инфицированных животных, получавших фосфатно-солевой буфер (PBS) или бактериофаги при указанных соотношениях бактериофагов и бактерий. Количество бактерий, необходимое для индукции смертельной легочной инфекции у мышей Balb / c путем интраназальной инстилляции (по данным Balloy et al [35]), было установлено равным 1 × 10 ⁷ бактерий, поскольку мы обнаружили, что 100% мышей выжил при заражении 5 × 10 ⁷ бактериями в течение до 4 дней, а доза — 1.5 × 10 ⁷ бактерий оказались на 100% летальными в течение 24 часов. B , Пример временных изображений мышей, инфицированных биолюминесцентным Pseudomonas aeruginosa и обработанных PBS ( слева ) или обработанных бактериофагом PAK-P1 при соотношении бактериофагов и бактерий 10: 1 ( справа ). C , Количественное определение излучаемого света дано как соотношение между двумя временными точками ( слева, , 4 часа / 2 часа; справа, , 6 часов / 4 часа). Количество света, испускаемого из области грудной клетки инфицированных мышей ( n = 12 из 2 независимых экспериментов), обработанных PBS ( белых столбиков, ) или обработанных бактериофагом PAK-P1 при соотношении фагов к бактериям 10 : 1 ( черных полос, ) было определено количественно.Столбцы показывают среднее значение, а столбцы ошибок показывают стандартную ошибку. п / с / см ² / ср, фотоны / с / см ² / стерадиан.

Рисунок 1.

Для лечения животных требовался активный бактериофаг. Мыши, обработанные раствором бактериофага PAK-P1, убитого нагреванием, через 2 часа после заражения умирали с той же скоростью, что и необработанные животные (данные не показаны). Более того, чтобы определить, было ли лечение бактериофагом PAK-P1 безвредным для животных, группе мышей ( n = 8) вводили интраназальную дозу, которая была в 10 раз выше, чем определенная выше как стандартная доза ( n = 8), и их поведение было изменено. наблюдали 10 дней.Эти мыши не проявляли неустойчивого поведения, их шерсть оставалась ровной, и они прибавляли в весе, что говорит о том, что раствор бактериофага не оказал на них отрицательного воздействия.

Скорость, с которой бактериофаг PAK-P1 был способен уничтожить бактерии in vivo, оценивалась путем количественной оценки света, излучаемого биолюминесцентными бактериями у живых животных в течение первых часов инфекции (рис. 1 B ). Животных сначала инокулировали штаммом PAK, а затем бактериофагом PAK-P1 через 2 часа.Между 2 и 4 часами после бактериальной инфекции количество света, испускаемого от обработанных фагом мышей, и количество света, испускаемого от мышей, не обработанных фагом, не показали статистически значимой разницы, демонстрируя, что начальная эволюция инфекции была аналогичной. в обеих группах в течение первых 4 ч (рис. 1 C ). Однако через 6 часов (то есть через 4 часа после введения бактериофага) количество света, испускаемого от обработанных фагом мышей, было статистически значимо снижено по сравнению с количеством света, испускаемого от мышей, не обработанных фагом. предполагая быстрое уничтожение бактерий бактериофагами.Через 24 часа после начала заражения мыши, обработанные фагом, не показали или показали только слабые пятна света, тогда как мыши, не обработанные фагом, были мертвыми или сильно люминесцентными (данные не показаны). Это говорит о том, что количество бактерий сильно снижено у животных, обработанных фагами, и, таким образом, они могут пережить летальную бактериальную инфекцию.

Мы измерили бактериальную нагрузку и количество бактериофагов в БАЛ через 24 часа после заражения. Как и ожидалось, бактериофаг не был обнаружен в ЖБАЛ мышей, не обработанных фагом, и среднее количество бактерий составляло 1.6 × 10 ⁸ бактерий / мл ( n = 2). Напротив, только 1,5 × 10 ² бактерий / мл вместе с 2 × 10 ⁷ бактериофагов / мл было выделено из БАЛ обработанных фагом мышей ( n = 4). Для сравнения, бактериофаг PAK-P1 был обнаружен в концентрации 3,1 × 10 ⁶ бактериофагов / мл в БАЛ неинфицированных мышей, обработанных фагом ( n = 4), что подтвердило, что бактериофаги размножались в легких как инфицированных, так и инфицированных. неинфицированные животные, обработанные бактериофагом.

В вышеупомянутых экспериментах растворы бактериофагов закапывали через 2 часа после инокуляции бактериями, но этот момент времени мог не соответствовать статусу инфекции. Чтобы получить больше информации об этом статусе инфекции, мы измерили уровень лактатдегидрогеназы (фермент, высвобождаемый при нарушении целостности клетки), присутствующий в БАЛ через 6 часов после начала инфекции. По сравнению с контролем (мыши, получавшие PBS, и мыши, получавшие только бактериофаг), уровни лактатдегидрогеназы как у мышей, не получавших фаг, так и у мышей, получавших фаг, составляли 3.В 7 раз и 3,1 раза соответственно выше, что ясно показывает, что в этот момент повреждение легких было эквивалентным в этих 2 группах инфицированных животных (данные не показаны).

Снижение воспалительной реакции после обработки бактериофагом. Мы предположили, что если бактериофаги способны убивать бактерии in vivo, что приводит к уменьшению количества этих бактерий в легких, то воспалительная реакция (первая линия защиты хозяина от вторжения патогенов) должна быть ниже.Через 24 часа после инфицирования уровни 2 воспалительных маркеров, фактора некроза опухоли α (TNF-α) и интерлейкина 6 (IL-6; известно, что он индуцируется бактериальным заражением) оценивали в БАЛ от мышей, не получавших фаг, и обработанные фагом мыши (рис. 2) [21–23]. И IL-6, и TNF-α увеличивались у PAK-инфицированных животных (как тех, которые лечили бактериофагом, так и тех, которые не получали бактериофаг) по сравнению с неинфицированным контролем, подтверждая, что инфекция началась в обеих группах. Однако эти уровни были статистически значимо снижены в группе, обработанной бактериофагом, по сравнению с группой, не получавшей лечения, подтверждая, что уменьшение количества бактерий обработкой бактериофагом ослабляло воспалительную реакцию хозяина.Через 48 часов после инфицирования уровни IL-6 и TNF-α вернулись к исходным значениям в группе, обработанной фагом (данные не показаны). Следует также отметить, что уровни IL-6 и TNF-α были такими же низкими у неинфицированных животных, получавших раствор бактериофага, как уровни у животных, которым вводили раствор PBS, что показывает, что бактериофаги сами по себе, по-видимому, не стимулировали воспалительный ответ (рисунок 2).

Рисунок 2.

Уменьшение воспаления с помощью обработки бактериофагом.Уровни цитокинов измеряли в бронхоальвеолярных лавадах мышей ( n = 4) через 24 часа после инстилляции фосфатно-солевого буфера (PBS) ( черных столбцов ), PBS и бактериофага PAK-P1 ( белых столбцов ), бактерий с PBS через 2 часа ( заштрихованных столбцов, ) или бактерии с бактериофагом PAK-P1 2hlater ( серых столбцов ). Столбцы показывают среднее значение, а столбцы ошибок показывают стандартную ошибку. IL6, интерлейкин 6; TNF-α, фактор некроза опухоли α.

Рисунок 2.

Сроки обработки бактериофагом. Затем мы определили максимально возможную задержку лечения бактериофагом для поддержания выживаемости животных на уровне 100% путем введения лечения через 2, 4 или 6 часов после заражения. Хотя 100% мышей выжили в группе, обработанной фагами, через 2 часа после заражения, через 24 часа только 75% мышей остались живы в группах, обработанных через 4 или 6 часов после заражения. Через 72 часа выживаемость была близкой для 2-часовой группы (100% мышей) и 4-часовой группы (75% мышей), но упала до 25% для 6-часовой группы (рис. 3 A ).Эти результаты можно было ожидать при изучении изображений биолюминесценции в ранние временные точки (Рисунок 3 B ). Эти эксперименты показали, что обработка бактериофагом должна быть проведена через 2 часа после заражения, чтобы достичь 100% выживаемости инфицированных животных.

Рисунок 3.

Временные изображения обработки бактериофагом. A , Кривые выживаемости инфицированных мышей, получавших фосфатно-солевой буфер (PBS) ( ромбов, ) или бактериофаг PAK-P1 при соотношении фага к бактерии 10: 1 за 2 часа ( квадратов ) , Через 4 часа ( треугольников, ) или через 6 часов ( кругов, ) после начала заражения. B , изображения, соответствующие ранним временным точкам эксперимента, представлены на панели A . п / с / см ² / ср, фотоны / с / см ² / стерадиан.

Рисунок 3.

Эффективность бактериофагов на клинических штаммах. Чтобы оценить диапазон хозяев бактериофага PAK-P1 против клинических штаммов, мы определили его эффективность против панели из 20 штаммов P. aeruginosa , выделенных от пациентов с муковисцидозом. Мы протестировали 10 штаммов от пациентов с первичной колонизацией и 10 штаммов от пациентов с хронической колонизацией.Бактериофаг PAK-P1 был способен эффективно лизировать 50% первичных штаммов колонизации, но лишь умеренно лизировал 10% хронических штаммов (таблица 1).

Таблица 1.

Эффективность посева бактериофага PAK-P1 на штаммы Pseudomonas aeruginosa , полученные от пациентов с муковисцидозом

Таблица 1.

с муковисцидозом

Инфекция у мышей, обработанных бактериофагом, не развивалась. Поскольку бактериофаги, вводимые неинфицированным животным, сохранялись в разумных количествах в легких в течение как минимум 24 часов, мы проверили, может ли предварительная обработка бактериофагом предотвратить последующее инфицирование. Две группы мышей, 1 группа, получавшая интраназально 1 × 10 ⁸ бактериофагов PAK-P1 и 1 группа, обработанная интраназально буфером, были инфицированы через 24 часа 1 × 10 ⁷ бактериями. Через 2 часа после бактериальной инокуляции количество света, испускаемого от мышей в группе, предварительно обработанной бактериофагом, было в ~ 5 раз ниже, чем излучаемое от мышей в группе, предварительно обработанной буфером (рис. 4).Мониторинг в следующие моменты времени подтвердил, что бактериальная нагрузка снизилась у животных, предварительно обработанных бактериофагом, и увеличилась у животных, предварительно обработанных буфером (фиг. 4). Наконец, 100% животных, предварительно обработанных бактериофагом, выжили до конца эксперимента (16 дней), тогда как 100% необработанных животных умерли в течение 2 дней.

Рисунок 4.

Эффективность предварительной обработки бактериофагом за 24 часа до заражения. Показана динамика света, излучаемого (в фотонах / с) из грудной клетки мышей, предварительно обработанных фосфатно-солевым буфером (PBS) ( белых столбцов ) или бактериофагом PAK-P1 ( черных столбцов ) за 24 часа до заражение Pseudomonas aeruginosa ( n = 4 для каждой группы).Столбцы показывают среднее значение, а столбцы ошибок показывают стандартную ошибку.

Рисунок 4.

Эффективность предварительной обработки бактериофагом за 24 часа до заражения. Показана динамика света, излучаемого (в фотонах / с) из грудной клетки мышей, предварительно обработанных фосфатно-солевым буфером (PBS) ( белых столбцов ) или бактериофагом PAK-P1 ( черных столбцов ) за 24 часа до заражение Pseudomonas aeruginosa ( n = 4 для каждой группы). Столбцы показывают среднее значение, а столбцы ошибок показывают стандартную ошибку.

Последовательность генома и характеристика бактериофага PAK-P1. Наблюдения под электронным микроскопом показали, что бактериофаг PAK-P1 является членом семейства Myoviridae, того же семейства, что и бактериофаг T4 из Escherichia coli (рис. 5) [13]. Согласно недавнему предложению рациональной схемы номенклатуры вирусов [24], этот бактериофаг должен называться «vB_PaeM_PAK_P1», который в этой статье мы сокращаем как «PAK-P1».Проведено полное секвенирование генома бактериофага PAK-P1. По сравнению с размерами генома 38 полностью секвенированных бактериофагов P. aeruginosa , размер генома бактериофага PAK-P1 (93 398 нуклеотидов, между размером генома бактериофага LMA2 [66 530 нуклеотидов] и размером генома бактериофага EL [ 211 215 нуклеотидов]) предположил, что это потенциально новый бактериофаг P. aeruginosa . Нуклеотидная последовательность в 6 кадрах была транслирована, и каждая открытая рамка считывания (ORF) ≥60 аминокислот использовалась в качестве запроса для инструмента поиска базового локального выравнивания для белков (BLASTP) по базе данных классификации мобильных генетических элементов (ACLAME) [ 25, 26].Результаты были просканированы на соответствие следующим ключевым словам: интеграза, рекомбиназа, репрессор и эксцизионаза (считающиеся маркерами умеренных бактериофагов; см. Приложение, которое появляется только в онлайн-версии журнала). Статистически значимого сходства BLASTP выявлено не было. Следовательно, бактериофаг PAK-P1 следует рассматривать как вирулентный бактериофаг. Мы также проанализировали основной белок капсида с помощью масс-спектрометрии (рис. 5). Затем ORF из 344 аминокислот (39,4 кДа) был идентифицирован как главный белок капсида (фиг. 5).Поиск BLASTP в базе данных nr (Национальный центр биотехнологической информации) выявил сходство с несколькими предполагаемыми белками, связанными с бактериофагами (лучший результат показал 33% идентичность со значением E , равным 4 × 10 ⁻⁴¹), среди которых только 1 был аннотирован как белок капсида бактериофага Felix 01 (с 28% идентичностью и значением E , равным 6 × 10 ^-30) (рис. 5). Этот результат демонстрирует, что бактериофаг PAK-P1 состоит из нового главного капсидного белка.Взятые вместе, эти данные подтверждают, что бактериофаг PAKP1 является новым вирулентным бактериофагом P. aeruginosa.

Рисунок 5.

Характеристика бактериофага PAK-P1. А. Электронно-микроскопический анализ бактериофага PAK-P1 (масштабная линейка, 100 нм). B , Гель додецилсульфата натрия белков бактериофага PAK-P1, окрашенный кумасси синим (стрелка указывает на основной белок капсида). C , Полная аминокислотная последовательность основного белка капсида. D , Инструмент поиска базового локального выравнивания для белков (BLASTP) результат поиска основного капсидного белка бактериофага PAK-P1 (запрос), совпадающего с основным капсидным белком бактериофага Felix 01 (субъект).

Рисунок 5.

Обсуждение

Наши эксперименты демонстрируют, что неинвазивная биолюминесцентная технология чрезвычайно полезна для оценки эффективности лечения бактериофагами и особенно для изучения кинетики инфекции на ранних этапах времени без принесения в жертву животных.Например, в ходе эксперимента по определению оптимального времени для введения бактериофага после начала инфекции изображения биолюминесценции помогли нам понять, почему ранняя инокуляция бактериофага (через 2 часа после заражения) была так важна для устранения инфекции PAK. Именно на этой ранней стадии инфекции (что подтверждается уровнем лактатдегидрогеназы) размножение бактерий происходит быстрее всего. В таких условиях восприимчивость бактерий к бактериофаговой инфекции также максимальна.Таким образом, инфекция быстро снижается со снижением воспалительной реакции у хозяина, о чем свидетельствуют уровни IL-6 и TNF-α. Это преимущество, поскольку чрезмерная воспалительная реакция может быть вредной [21–23]. Быстрая эффективность бактериофагов в уничтожении бактерий внутри легких предполагает, что не существует специфического клеточного фактора (например, протеаз), который был бы достаточно активным, чтобы предотвратить заражение бактериями бактериофагов. Следовательно, ожидается, что бактериофаг, эффективный in vitro, может быть эффективным in vivo.Эту гипотезу еще нужно доказать, и если бы она была подтверждена для легких, она не обязательно применима к другим органам. Наши данные также согласуются с математической моделью терапии бактериофагами, недавно предложенной Cairns et al [27].

Бактериофаг PAK-P1, описанный в этой статье, был более эффективен против клинических штаммов, выделенных от пациентов с первичной колонизацией, чем против штаммов от пациентов с хронической инфекцией, что согласуется с тем фактом, что бактериофаг был выделен из планктонных культур.В случае хронической инфекции описанный здесь бактериофаг, вероятно, не самый подходящий. Для таких ситуаций должны быть специально выделены более подходящие бактериофаги, или существующие бактериофаги могут быть «отобраны» путем их культивирования на бактериях, растущих в биопленках, чтобы сделать их более эффективными [28, 29]. Hanlon и др. [30] продемонстрировали активность бактериофагов на биопленках P. aeruginosa , изготовленных из альгинатов, за счет использования фермента деполимеразы, высвобождаемого лизированными бактериями.

Наш выбор использовать естественный путь заражения и лечения позволил нам продемонстрировать, что дыхательные пути от верхних отделов к нижним частям можно обрабатывать бактериофагами. Что еще более интересно, мы продемонстрировали, что бактериофаги могут активно предотвращать возникновение инфекции и обеспечивать 100% защиту при введении за 24 часа до смертельной бактериальной инфекции. Наши результаты показали, что бактериофаги не выводятся в легких быстро. Такого эффекта не ожидали, поскольку обычно сообщается, что бактериофаги быстро выводятся из организма [31].Это наблюдение предполагает, что профилактическое лечение все еще может быть эффективным, если бактериофаги вводятся за 48 или 72 часа до начала инфекции, или если количество бактериофагов снижается при введении за 24 часа до заражения. Такие возможности расширят область применения бактериофагов для предотвращения возникновения инфекций. На основании низкого уровня цитокинов, индуцируемого раствором бактериофага, заманчиво предположить, что профилактический эффект обусловлен только бактериофагами, а не воспалительной реакцией.Однако мы не можем исключить возможность того, что бактериофаги могут индуцировать фагоцитарную активность клеток, таких как макрофаги, по отношению к бактериям (что не обязательно требует производства цитокинов). Заражение бактерий местными бактериофагами быстро снижает количество патогенных бактерий, снижая шансы бактерий запустить активный процесс инфекции и спровоцировать повреждение легких. Недавно Golshahi et al [32] представили доказательства того, что бактериофаги, вводимые с помощью распыления, должны эффективно распределяться в легких, что согласуется с описанным нами профилактическим эффектом.Взятые вместе, эти результаты явно открывают возможность использования бактериофагов для профилактики бактериальных инфекций легких. Например, одной из возможностей является предварительное лечение групп риска по таким инфекциям (пациенты с ослабленным иммунитетом или пациенты с муковисцидозом) для снижения вероятности заражения в местах, где пациенты с большей вероятностью могут быть инфицированы бактериями (например, центры ухода или больницы). Это особенно актуально в ситуациях, когда был идентифицирован эпидемический штамм и для которых можно использовать профилактическое лечение специфическими бактериофагами для ограничения его распространения.О таких эпидемических штаммах сообщалось ранее для P. aeruginosa в центрах лечения муковисцидоза [33]. Еще одна ситуация, в которой можно было бы предложить профилактическое лечение, — это пандемия гриппа. Согласно недавним исследованиям, преобладающей причиной смерти во время пандемии гриппа 1918 г. была пневмония, а не сам грипп [34]. В случае новой пандемии гриппа можно было бы предусмотреть превентивное лечение бактериофагами против пневмонии с использованием коктейля бактериофагов, нацеленного на наиболее распространенные легочные патогены, и, вероятно, существенно снизить количество смертей.

По очевидным причинам следует определить последовательность генома природного бактериофага, который может рассматриваться для терапевтического использования. Однако полная аннотация генома бактериофага требует глубокого биоинформатического анализа, потому что кодирующие гены последовательности, обнаруженные в бактериофагах, сильно изменчивы; кроме того, несколько геномов бактериофагов были глубоко проанализированы. Вместо этого мы предлагаем краткий анализ, направленный на подтверждение вирулентной природы бактериофага. Воспользовавшись базой данных ACLAME, мы определили, что среди всех потенциальных ORF в 6 рамках считывания не было обнаружено значимого совпадения с белками, аннотированными как интеграза, репрессор, транспозаза и эксцизионаза.Поскольку целью базы данных ACLAME является сбор и аннотирование всех белков из мобильных генетических элементов, мы пришли к выводу из нашего анализа, что бактериофаг PAKP1 не является умеренным бактериофагом. Наконец, идентификация главного капсидного белка подтвердила, что бактериофаг PAK-P1 является новым вирулентным бактериофагом P. aeruginosa.

В заключение, наша работа поддерживает потенциальное использование бактериофагов для борьбы с патогенами, вызывающими легочные инфекции, и для разработки приложения для предотвращения возникновения таких инфекций.Более того, с использованием биолюминесцентных бактерий теперь можно сравнить несколько бактериофагов (с использованием небольшого количества животных), чтобы установить классификацию кандидатов для лечения на основе их реальной эффективности in vivo, а не их эффективности in vitro.

Благодарности

Мы благодарим R. Ramphal за биолюминесцентный штамм PAK Pseudomonas aeruginosa ; М.-А. Никола из Plate-Forme d’Imagerie Dynamique (Imagopole), G.Пехау-Арнауде из Plate-Forme de Microscopie Ultrastructurale (Imagopole) и Т. Анжелик из Animalerie Centrale за их помощь; и команду «Биология молекулар дю жен шез ле экстремофилов» за их поддержку.

Список литературы

1.,,,,.

Оценки глобального распределения детской смертности от острых респираторных инфекций

Lancet Infect Dis

2002

, vol.

(стр.

—

) 2..

Откуда появятся новые антибиотики?

Nat Rev Microbiol

2003

, т.

(стр.

—

) 3.,,.

Перспективы бактериофаговой терапии в западной медицине

Nat Rev Drug Discov

2003

, vol.

(стр.

489

—

497

) 4 ..

Фаговая терапия: опыт Escherichia coli

Microbiology

2005

, vol.

151

(стр.

2133

—

2140

) 5.,.

Терапия и профилактика бактериофагами: новое открытие и новая оценка потенциала

Trends Microbiol

1997

, vol.

(стр.

268

—

271

) 6.,.

Эффективность фагов при лечении экспериментальной диареи Escherichia coli у телят, поросят и ягнят

J Gen Microbiol

1983

, vol.

129

(стр.

2659

—

2675

) 7.,. ,.

Бактериофаговая терапия у людей

Бактериофаги: биология и применение

2005

Бока-Ратон, Флорида

CRC Press

(стр.

381

—

436

) 8.,,, И др.

Бактериофаговая терапия для лечения инфекций

Curr Opin Investig Drugs

2009

, vol.

(стр.

766

—

774

) 9 ..

Геномика бактериофагов

Curr Opin Microbiol

2008

, vol.

(стр.

447

—

453

) 10 ..

Будущее биологии бактериофагов

Nat Rev Genet

2003

, vol.

(стр.

471

—

477

) 11 ..

Бактериофаговая терапия

Annu Rev Microbiol

2001

, т.

(стр.

437

—

451

) 12.,. ,,.

Pseudomonas aeruginosa

Принципы и практика инфекционных болезней.6-е изд

2004

New York, NY

Elsevier

(стр.

2587

—

2587

) 13 ..

5500 Фаги, исследованные в электронном микроскопе

Arch Virol

2007

, vol. .

152

(стр.

227

—

243

) 14.,,, Et al.

Использование бактериофага в лечении бактериемии экспериментальных животных от имипенем-резистентной Pseudomonas aeruginosa

Int J Mol Med

2006

, vol.

(стр.

309

—

317

) 15.,,, Et al.

Эффективность бактериофаговой терапии против кишечного сепсиса, вызванного Pseudomonas aeruginosa у мышей

Противомикробные агенты Chemother

2007

, vol.

(стр.

446

—

452

) 16.,,,,,.

Антибактериальная эффективность фагов против инфекций Pseudomonas aeruginosa у мышей и Drosophila melanogaster

Противомикробные агенты Chemother

2009

, vol.

(стр.

2469

—

2474

) 17.,.

Применение биолюминесцентной визуализации для изучения инфекционных заболеваний

Cell Microbiol

2007

, vol.

(стр.

2315

—

2322

) 18.,,,,.

Высокопроизводительный гомогенный биолюминесцентный анализ для ингибиторов гиразы Pseudomonas aeruginosa и других ДНК-повреждающих агентов

J Biomol Screen

2007

, vol.

(стр.

855

—

864

) 19 ..

Очистка бактериофагов и SDS-PAGE анализ структурных белков фагов от частиц-призраков

Методы Mol Biol

2009

, vol.

502

(стр.

227

—

238

) 20 ..

Базовая электронная микроскопия фагов

Методы Мол Биол

2009

, т.

501

(стр.

113

—

126

) 21.,,.

Роль TNF α в патофизиологии легких

Respir Res

2006

, vol.

(стр.

125

—

125

) 22.,,,.

Функциональный геномный анализ острого повреждения легких: роль аппаратов ИВЛ и механический стресс

Proc Am Thorac Soc

2005

, vol.

(стр.

188

—

194

) 23.,.

Молекулы стресса при сепсисе и синдроме системного воспалительного ответа

FEBS Lett

2007

, vol.

581

(стр.

3723

—

3733

) 24.,,.

Позиционный документ: создание рациональной схемы номенклатуры вирусов Бактерий и Архей

Environ Microbiol

2009

, т.

(стр.

2775

—

2777

) 25.,,,.

ACLAME: классификация мобильных генетических элементов

Nucleic Acids Res

2004

, vol.

(стр.

D45

—

D49

) 26 ..

Поиск гомологов в аминокислотных последовательностях с использованием сетевого поиска BLAST

Curr Protoc Bioinformatics

2003

27.,,,,.

Количественные модели динамики бактериофаг-хозяин in vitro и их применение в фаготерапии

PLoS Pathog

2009

, vol.

(стр.

1000253

—

1000253

) 28.,.

Колориметрический метод микротитрационного планшета для оценки действия фага на биопленку Pseudomonas aeruginosa

J Microbiol Methods

2008

, vol.

(стр.

114

—

118

) 29.,,.

Pseudomonas fluorescens биопленок, подвергнутых воздействию фага phiIBB-PF7A

BMC Biotechnol

2008

, vol.

(стр.

—

) 30.,,,.

Снижение вязкости экзополисахарида как средство проникновения бактериофагов через биопленки Pseudomonas aeruginosa

Appl Environ Microbiol

2001

, vol.

(стр.

2746

—

2753

) 31.,.

Фаготерапия: факты и вымысел

Int J Med Microbiol

2006

, vol.

296

(стр.

—

) 32.,,,.

К современной ингаляционной бактериофаговой терапии: распыление бактериофагов комплекса Burkholderia cepacia

J Aerosol Med Pulm Drug Deliv

2008

, vol.

(стр.

351

—

360

) 33.,,, Et al.

Доказательства распространения клонального штамма Pseudomonas aeruginosa среди клиник кистозного фиброза

J Clin Microbiol

2003

, vol.

(стр.

2266

—

2267

) 34.,,.

Преобладающая роль бактериальной пневмонии как причины смерти при пандемическом гриппе: последствия для готовности к пандемическому гриппу

J Infect Dis

2008

, vol.

198

(стр.

962

—

970

) 35.,,,,,.

Роль флагеллина в сравнении с подвижностью при остром заболевании легких, вызываемом Pseudomonas aeruginosa

J Infect Dis

2007

, vol.

196

(стр.

289

—

296

)

Бактериофаг Podoviridae для биоконтроля синегнойной палочки в дождевой воде

Бактериофаги, нацеленные на Pseudomonas spp. были изолированы и охарактеризованы для предварительной обработки дождевой воды с помощью биоконтроля. Бактериофаги PAW33 и PFW25 были охарактеризованы как члены семейств Podoviridae и Myoviridae соответственно.Бактериофаг PAW33 проявлял специфическую активность против штаммов Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa ) и применялся в небольших испытаниях предварительной обработки бактериофагом (8 и 24 часа) для ограничения размножения в окружающей среде P. aeruginosa S1 68 штамм. В дальнейшем соответствующие образцы (предварительно обработанные бактериофагом и необработанные образцы) подвергали обработке в небольших системах параболических коллекторов SODIS (SODIS-CPC) в течение 4 часов при естественном солнечном свете.Для 8-часовой предварительной обработки и испытаний SODIS-CPC аналогичные общие логарифмические сокращения количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл и копий гена (ГК) на мл были получены для предварительно обработанного бактериофага [3,68 log (КОЕ) и 2,34 log (GC)] и необработанные образцы [3,74 log (КОЕ) и 2,33 log (GC)]. Напротив, для 24-часового испытания (за которым последовал SODIS) было зарегистрировано более высокое логарифмическое сокращение КОЕ на мл для предварительно обработанного образца (4,61 log) по сравнению с необработанным образцом (3,91 log), со сравнимыми результатами. получены с помощью EMA-qPCR.Анализ экспрессии генов показал, что предварительная обработка PAW33 в течение 24 часов влияла на способность P. aeruginosa S1 68 запускать механизмы стрессового ответа (снижение экспрессии генов recA и lexA ) во время обработки SODIS-CPC и приводила к в сниженной экспрессии гена phzM (фактор вирулентности, ответственный за продукцию пиоцианина). Таким образом, бактериофаг PAW33 перспективен в качестве стратегии предварительной очистки дождевой воды, поскольку он ограничивает распространение P.aeruginosa и может повысить эффективность методов первичной дезинфекции.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

Фаготерапия высокоэффективна против хронических инфекций легких, вызванных Pseudomonas aeruginosa

Хронические инфекции легких, вызванные Pseudomonas aeruginosa , связанные с такими заболеваниями, как муковисцидоз (CF), бронхоэктазы без CF и ХОБЛ, часто не поддаются лечению антибиотиками.С ростом числа бактериальных патогенов с множественной лекарственной устойчивостью возрос интерес к терапевтическому потенциалу бактериофагов (фагов) в качестве альтернативы или дополнения к обычным антибиотикам1. Хотя был достигнут прогресс в использовании фаговой терапии против P. aeruginosa. инфекций при хроническом отите2 и ожоговых ранах, 3 исследования при хронических инфекциях легких ограничены ограниченным числом доклинических оценок.4 Предыдущие исследования на животных моделях продемонстрировали потенциал, но они были нацелены на краткосрочные острые респираторные инфекции, 5, 6 или были очень короткие промежутки времени между первоначальным началом инфекции и терапевтическим применением.7, 8 Кроме того, в большинстве моделей хронической респираторной инфекции используются гранулы агара, пропитанные бактериями, которые не отражают естественный процесс инфицирования. Из-за этих ограничений предыдущие исследования не были предназначены для проверки эффективности фагов против установленных хронических респираторных инфекций с P. aeruginosa .

Недавно мы разработали новую мышиную модель P. aeruginosa с хронической легочной инфекцией9, в которой используется естественный респираторный путь заражения путем ингаляции.В этой модели P. aeruginosa LESB65 (представитель наиболее распространенного клона P. aeruginosa , выделенного от пациентов с МВ в Великобритании, эпидемический штамм Ливерпуля) адаптируется к своей хозяйской нише в носоглотке, что приводит к миграции и последующее закрепление в легких (как это происходит при хронической инфекции легких у человека) и позволяет проводить эксперименты в течение гораздо более длительных периодов времени (свыше 21–28 дней) .9 Инфекция связана с экспрессией генов, связанных с биопленками (как в CF), а «адаптированные к хозяину» бактерии, извлеченные из модели, лучше способны вызывать легочные инфекции при повторном введении наивным мышам.9 Чтобы обеспечить более строгий тест возможностей фаговой терапии на клинически релевантной модели хронической легочной инфекции P. aeruginosa , мы использовали ранее описанный фаг 10 для заражения устоявшихся популяций штамма LESB65 (или адаптированного к хозяину производного штамма NP22_29. ), варьируя продолжительность времени между возникновением начальной инфекции и применением терапевтического агента.

Методология, связанная с мышиной моделью (с использованием мышей BALB / c в возрасте 6–8 недель), была описана ранее.9 Исследование было проведено с одобрения и в строгом соответствии со стандартами Министерства внутренних дел Великобритании и Комитета по этике исследований Ливерпульского университета. Мышей инфицировали интраназально свежей дозой в средней логарифмической фазе 2 × 10 ⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ) P. aeruginosa в 50 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Количество 2 × 10 ⁷ фага (фаг PELP2010) или контроль PBS вводили тем же путем в указанные моменты времени. Мышей забивали в заранее определенные сроки после инфицирования путем смещения шейки матки.Легкие собирали, гомогенизировали, серийно разводили и высевали на планшеты для селекции Pseudomonas (Oxoid, UK) для получения количества КОЕ выделенных бактерий. Каждый эксперимент повторяли дважды с пятью мышами на группу, чтобы получить в общей сложности десять мышей на группу на момент времени. Статистический анализ проводился с использованием двухфакторного дисперсионного анализа.

Мы впервые подтвердили эффективность фага против штамма LESB65 на модели искусственной биопленки со средой мокроты9, разработанной так, чтобы она напоминала ключевые физико-химические особенности легких пациента с МВ, включая присутствие аминокислот, муцина и внеклеточной ДНК (рисунок 1). .Было 3-логарифмическое снижение P. aeruginosa КОЕ, извлеченных из обработанной фагом биопленки (через 24 часа), что указывает на то, что PELP20 может проникать и убивать бактерии в связанной с биопленкой CF легкоподобной среде (рисунок 1).

Рисунок 1

Активность фага против Pseudomonas aeruginosa (LESB65 дикого типа (WT) и адаптированный штамм NP22_2) в модели искусственной среды мокроты (ASM). Фаг PELP20 (1 × 10 ⁸ бляшкообразующих единиц) вводили через 72 часа после установления P.зрелая биопленка aeruginosa в модели ASM; на рисунке показаны колониеобразующие единицы (КОЕ) / мл через 24 часа после введения фага. Достоверные различия определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (** p≤0,01). Планки погрешностей указывают на стандартную ошибку среднего SEM (n = 6 биологических повторов, средние значения получены из трех образцов). Не было существенной разницы в уменьшении кратности после обработки фагом между LESB65 WT и NP22_2.

В наших первоначальных экспериментах на мышиной модели после инфицирования мышей P.aeruginosa LESB65, фаг вводили либо (а) через 24 и 36 часов после заражения, при этом бактериальные КОЕ считали через 48 часов (обработка 1), либо (б) вводили фаг через 48 и 60 часов после заражения, при этом бактериальные КОЕ считали при 72 часов (лечение 2). В обоих случаях был достигнут полный клиренс P. aeruginosa из легких (рис. 2). При использовании инактивированного ультрафиолетом фага, не обладающего литической активностью, снижения КОЕ не наблюдалось (данные не показаны). Мы дополнительно увеличили интервал лечения между инфицированием и применением фага до 6 дней после инфицирования, используя адаптированный штамм NP22_2, производный от LESB65, который легко вызывает хроническую инфекцию в легких мыши.9 Здесь фаг вводили через 144 часа (6 дней) и 156 часов (6,5 дней) после заражения, с подсчетом КОЕ через 168 часов (7 дней) после заражения (обработка 3). Фаговая терапия снова оказалась высокоэффективной против установленной 6-дневной легочной инфекции , полностью удаляла бактерии из легких у 70% мышей и значительно сокращала количество КОЕ у остальных 30% мышей по сравнению с контролем (фигура 2).

Рисунок 2

Активность фага против инфекции Pseudomonas aeruginosa (LESB65 дикого типа и адаптированный штамм NP22_2) в легких мыши.На рисунке показаны колониеобразующие единицы (log КОЕ на легкое), присутствующие в легких мышей после интраназального инфицирования LESB65 (обработка 1 и 2) и NP22_2 (обработка 3). Мышей случайным образом распределяли в группы и впоследствии обрабатывали фагом PELP20 или фосфатно-солевым буфером в качестве контроля с использованием трех различных протоколов лечения: (1) введение фага через 24 и 36 часов после заражения, с подсчетом бактериальных КОЕ через 48 часов; (2) введение фага через 48 и 60 часов после заражения, с подсчетом бактериальных КОЕ через 72 часа; (3) фаг, вводимый через 144 и 156 часов после заражения, с подсчетом КОЕ через 168 часов.Значимые различия, определенные с использованием двустороннего дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Бонферрони в качестве апостериорного анализа, обозначены звездочками (*** p≤0,001). Выбранные временные точки для отбора проб были основаны на нашем предыдущем исследовании.9

Это первое исследование, в котором сообщается об эффективности фаговой терапии в течение 7 дней после заражения в модели, в которой P. aeruginosa создает естественное долгосрочное хроническое легкое. инфекция. Следовательно, мы считаем, что это представляет собой серьезнейшую проблему для эффективности фаговой терапии в модельной системе респираторной инфекции.Мы показываем, что фаг, вводимый интраназально в течение 6 дней после установления хронической легочной инфекции, эффективно уменьшал количество бактерий в легких мышей, инфицированных P. aeruginosa , демонстрируя потенциал фаговой терапии при лечении устоявшихся и устойчивых хронических респираторных заболеваний. инфекции тракта. Существуют хорошо обсуждаемые потенциальные ограничения в отношении фаговой терапии с точки зрения диапазона хозяев, потенциальной токсичности и развития резистентности.Тем не менее, ключевая проблема без ответа все еще остается, может ли фаг получить доступ и убить бактерии в пространственно сложных смешанных сообществах, связанных с биопленками, присутствующих, например, в легких при МВ. Мы обнаружили, что на мышиной модели хронической инфекции легких, связанной с биопленкой, и на модели биопленки с искусственной мокротой фаг может эффективно убивать P. aeruginosa . Несмотря на то, что еще предстоит проделать большую работу по разработке коктейлей с фагами с достаточным диапазоном, эти данные предполагают, что фаговая терапия может быть эффективным терапевтическим подходом против хронических респираторных инфекций, либо отдельно против устойчивых к антибиотикам бактерий, либо в сочетании с обычными противомикробными средствами.

Благодарности

Авторы выражают признательность Марине Годердзишвили и Нине Чанишвили Элиава (Институт бактериофагов, микробиологии и вирусологии, Тбилиси, Грузия) за предоставление смеси фагов, из которой был выделен фаг PELP20.

Жидкокристаллические капли фага образуют окклюзионные оболочки, которые инкапсулируют и защищают инфекционные палочковидные бактерии

Значимость

В этом исследовании мы исследуем, как молекулы фага, секретируемые патогенными бактериями Pseudomonas aeruginosa , стимулируют толерантность к антибиотикам, образуя разделенные по фазам жидкие кристаллы. отсеки вокруг бактериальных клеток.Это исследование охватывает пространственные масштабы, сочетая определение атомной структуры с помощью электронной криомикроскопии с клеточной электронной криотомографией, оптической микроскопией и биохимическим восстановлением. Мы показываем, что инкапсуляция палочковидных бактерий веретенообразными жидкокристаллическими каплями, состоящими из молекул фага, представляет собой процесс, на который в значительной степени влияет комплементарность формы и размера.

Abstract

Условно-патогенный микроорганизм Pseudomonas aeruginosa является основной причиной устойчивых к антибиотикам инфекций у людей. P. aeruginosa уклоняется от применения антибиотиков в бактериальных биопленках за счет активации экспрессии симбиотического нитчатого иновирусного профага Pf4. Мы исследовали механизм фаго-опосредованной толерантности к антибиотикам с использованием биохимического восстановления в сочетании со структурной биологией и клеточной визуализацией с высоким разрешением. Мы разрешили электронную криомикроскопию атомные структуры Pf4 с линейным однонитевым ДНК-геномом и без него, а также изучили сборку Pf4 в жидкокристаллические капли с помощью оптической микроскопии и электронной криотомографии.Путем биохимической репликации условий, необходимых для защиты от антибиотиков, мы обнаружили, что жидкокристаллические капли фага образуют разделенные по фазам окклюзионные компартменты вокруг палочковидных бактерий, что приводит к увеличению выживаемости бактерий. Инкапсуляция этими отсеками наблюдалась даже тогда, когда неодушевленные коллоидные палочки использовались для имитации палочковидных бактерий, предполагая, что комплементарность формы и размера глубоко влияет на процесс. Нитчатые иновирусы распространены среди прокариот, и, в частности, несколько грамотрицательных бактериальных патогенов, включая Neisseria meningitidis , Vibrio cholerae, и Salmonella enterica , содержат эти профаги.Мы предполагаем, что биофизическая окклюзия, опосредованная секретируемыми нитевидными молекулами, такими как Pf4, может быть общей стратегией выживания бактерий в суровых условиях.

Pseudomonas aeruginosa — условно-патогенный бактериальный патоген, ответственный за инфекции легких, костей и ран человека (1). P. aeruginosa приспосабливается к агрессивным средам, образуя микрометровые поверхностно-прикрепленные сообщества клеток, заключенных в матрицу внеклеточного полимерного вещества, называемую биопленками (2). Инфекции, вызванные P. aeruginosa , трудно вылечить из-за повышенной устойчивости бактериальных клеток к антибиотикам (3). Следовательно, существует острая необходимость в понимании фундаментальных механизмов устойчивости бактерий к антибиотикам для разработки стратегий лечения инфекций, вызванных P. aeruginosa .

Предыдущие исследования с использованием микроматриц показали, что по сравнению с планктонными бактериями гены, кодирующие профаги, называемые Pf, подвергаются наибольшей повышающей регуляции в биопленках P. aeruginosa (4), что указывает на то, что фаги Pf составляют важную часть P.aeruginosa образ жизни биопленки. Фаги Pf также играют важную роль в инфекциях человека, поскольку большой процент образцов мокроты от пациентов с муковисцидозом оказался положительным на фаги Pf (5). Кроме того, анализ клинических изолятов P. aeruginosa от хронических раневых инфекций показал, что присутствие Pf в изолятах коррелирует с наиболее стойкими инфекциями (6).

Фаги Pf способствуют выживанию P. aeruginosa в суровых условиях за счет нескольких независимых механизмов.Во время бактериальных инфекций Pf4 (фаг Pf) действует как приманка для иммунной системы хозяина, вызывая противовирусный ответ, тем самым нарушая бактериальный клиренс в месте инфекции (6). Pf4 также способствует толерантности к антибиотикам P. aeruginosa путем самосборки в жидкокристаллические структуры более высокого порядка (7). Эти жидкокристаллические структуры обладают чистым отрицательным электрическим зарядом из-за присутствия большого количества фаговой ДНК, и поэтому было предложено изолировать положительно заряженные антибиотики, такие как тобрамицин (7).

Pf4 и другие фаги Pf являются членами семейства Inoviridae , которое, как недавно было показано, распространено среди всех прокариот (8). Иновирусы имеют нитевидную и палочковидную форму диаметром примерно шесть нм, которые содержат геном одноцепочечной ДНК (оцДНК) (9). Структура капсида и топология ДНК-генома иновирусов были изучены с помощью дифракции рентгеновских лучей на нитчатых фагах, содержащих ДНК (fd) (9), Pf1 (10), и с помощью электронной криомикроскопии (крио-ЭМ) на фаге IKe (11). .Эти структурные исследования показали спиральный массив субъединиц белка оболочки капсида, окружающий кольцевой геном оцДНК. Такая организация генома в вирионе была предложена для семейства Inoviridae (9), хотя подтверждение этого ожидания с помощью атомарного разрешения пока недоступно.

В этом исследовании мы исследовали молекулярный механизм Pf4-опосредованной толерантности к антибиотикам в пространственных масштабах от атомных структур до клеточной физиологии, сочетая определение крио-ЭМ структуры с клеточной электронной криотомографией (крио-ЭТ), оптической микроскопией и биохимическим восстановлением.Мы решили атомную структуру фага Pf4 и связали ее с процессом динамической самосборки фага в разделенные на фазы жидкокристаллические капли. Путем биохимического воспроизведения условий, необходимых для защиты от антибиотиков, в сочетании с визуализацией клеток, мы обнаружили, что жидкокристаллические капли фага образуют защитные отсеки вокруг палочковидных бактериальных клеток. На формирование этих окклюзионных отсеков в значительной степени влияет комплементарность жидких кристаллов по форме и размеру палочковидным бактериям, и это наблюдалось даже тогда, когда бактерии были заменены неодушевленными коллоидными стержнями сопоставимой формы и размера.

В области клеточной биологии наблюдается большой интерес к разделению жидких и жидких фаз (12). Здесь мы представляем захватывающий пример разделения фаз у бактерий, имеющий выдающееся медицинское значение, где мы изучаем биофизические процессы снизу вверх, от уровня атомов до жидкокристаллических капель микрометрового размера, опосредующих окклюзию вокруг бактериальных клеток. Наши данные позволяют нам предположить, что биофизическая окклюзия может быть общей стратегией выживания бактерий в суровых условиях.

Результаты

Крио-ЭМ структура фага Pf4 вместе с его линейным геномом оцДНК.

Мы очистили эндогенно экспрессированный фаг Pf4 из биопленок P. aeruginosa PAO1 и подтвердили его идентичность, чистоту и инфекционность ( SI Приложение , рис. S1). Мы визуализировали очищенный фаг с помощью крио-ЭМ ( SI Приложение , Methods ) и наблюдали стержневидные нити диаметром ∼60 Å (рис. 1 A ), что согласуется с предыдущими исследованиями бактериофагов Pf (10).Мы использовали спиральную реконструкцию в реальном пространстве (13, 14), чтобы разрешить структуру фага Pf4 с разрешением 3,2 Å (рис. S1). Все плотности боковых цепей для зрелого белка оболочки B из 46 остатков (CoaB) Pf4 однозначно обозначены на нашей карте (рис. 1 B — D ). Субъединицы CoaB имеют α-спиральную структуру длиной 77 Å, с С-концом, направленным к сердцевине фага, а N -концом, направленным к внешней стороне цилиндрической нити (рис.1 C и D ). Филаменты Pf4 показывают подъем и вращение на субъединицу на 3,14 Å и 65,90 °, соответственно, позволяя множеству молекул CoaB плотно упаковываться вокруг оси филамента в встречно-гребенчатый массив (рис. 1 E и F ). Структура показывает, что волокна Pf4 имеют диаметр ∼62 Å и внутреннюю полость диаметром ∼22 Å (рис. 1 F ). При реконструкции не наблюдается значительной анизотропии разрешения, что указывает на то, что CoaB образует жесткую структуру в собранном фаге ( SI Приложение , рис.S2 A — D ), что согласуется с предыдущими структурными исследованиями на иновирусах (10, 11). Сравнение структуры Pf4 с недавно опубликованной крио-ЭМ структурой IKe, фага класса I (11, 15), показывает, что основные белки оболочки обоих фагов имеют аналогичную удлиненную α-спиральную структуру [Cα среднеквадратичный отклонение (RMSD) 1,5 Å], несмотря на общую низкую гомологию последовательностей ( SI Приложение , фиг. S3 A и C ). Оба собранных фага имеют одинаковые диаметры 62 и 64 Å, соответственно, с полостью 22 Å, в которой находится геномная ДНК ( SI Приложение , рис.S3 B ), однако спиральная симметрия отличается (сравните вращение и подъем фага IKe на 38,5 ° и 16,77 Å с вращением и подъемом Pf4 на 65,9 ° и 3,14 Å), что приводит к разному общему расположению мономеров капсида.

Рис. 1.

Крио-ЭМ структура фага Pf4 с разрешением 3,2 Å. ( A ) Крио-ЭМ изображение нативного фага Pf4 (желтые стрелки), очищенного от биопленок (красный прямоугольник представляет реконструированный сегмент). ( B ) Одночастичная крио-ЭМ реконструкция фага Pf4 (фильм S1).Плотность крио-ЭМ показана серой изоповерхностью, а уточненные атомные координаты субъединиц белка Pf4 CoaB показаны в виде лент ( N — и отмечен С-конец одного CoaB). ( C ) Плотность и атомная модель для одного белка CoaB. ( D ) Поперечный разрез крио-ЭМ-структуры показывает, что геном оцДНК Pf4 является линейным. Карта ослаблена с коэффициентом B (50 Å ² по сравнению с B и C ) для облегчения визуализации оцДНК.( E ) Вид сбоку Pf4, показывающий встречно-гребенчатое расположение субъединиц CoaB внутри оболочки капсида (отображаются только передние субъединицы CoaB). ( F ) Вид сверху Pf4, показывающий линейную оцДНК во внутренней полости 22 Å.

Плотность генома оцДНК внутри полости 22 Å в ядре фага Pf4 четко определена (рис. 1 D ). Неожиданно эта плотность показывает, что геном оцДНК Pf4 является линейным, а не кольцевым оцДНК, что было ожидаемой парадигмой для членов семейства Inoviridae , поскольку она была предложена для родственного бактериофага Pf1 (10), а также fd (9 ).Четкая плотность фосфатного остова генома оцДНК разрешена (рис. 1 D ), но не наблюдается плотности для второго антипараллельного фосфатного остова, как можно было бы ожидать для кольцевой оцДНК. Хотя фосфатный остов четко разделен, основания размазаны из-за усреднения по геному Pf4 (рис. 1 D ). Шаг линейной оцДНК составляет 15,7 Å ( SI Приложение , рис. S2 E ), что означает, что существует ровно один белок CoaB на каждое основание оцДНК в геноме фага.В предыдущей крио-ЭМ структуре фага IKe плотность отдельных оснований ДНК и фосфатного остова кольцевого генома оцДНК не была определена, но ДНК, по-видимому, стабилизировалась электростатическими взаимодействиями с положительно заряженными остатками аргинина и лизина в капсид, приводящий к нецелочисленному отношению нуклеотида к субъединице белка ~ 2,4, в отличие от отношения нуклеотида к белку, равного точно 1 в Pf4. В соответствии с наблюдением Pf4, содержащего только линейную оцДНК в полости, электростатический потенциал в полости Pf4 ниже, чем в IKe ( SI Приложение , рис.S3 B ) из-за большего количества положительно заряженных остатков на С-конце IKe p8, которые выстилают поры полости ( SI Приложение , рис. S3 C ).

Фаг Pf4 без генома оцДНК сохраняет целостность нитчатого капсида.

В наборе данных крио-ЭМ нативного Pf4 мы обнаружили средние по классам, в которых внутренняя полость фага казалась пустой. Мы предположили, что в нашем наборе данных присутствовали два варианта состава Pf4, с геномом оцДНК или без него.Они были представлены средними значениями класса с высокой плотностью в сердцевине фаговой нити (66% частиц, рис. 2 A ) и средними значениями без этой плотности в сердцевине филамента, соответственно (34% частиц, рис. В ). Мы обработали частицы из средних значений класса с пустой внутренней полостью и выяснили структуру с разрешением 3,9 Å (рис. 2 C , SI, приложение , рис. S4 и таблица S1, и фильм S2). Структура показала явное отсутствие линейного генома оцДНК, что подтверждает нашу гипотезу.Помимо отсутствия генома оцДНК, была сохранена общая структура белковой оболочки CoaB и ее упаковка вокруг оси филаментов ( SI Приложение , рис. S4 E ), которая определяет морфологию филаментов. Расчетные параметры симметрии филаментов Pf4 с оцДНК или без них были идентичными, а белок CoaB почти не обнаруживал конформационных различий в двух структурах (RMSD 0,35 Å, рис. 2 D ). Это демонстрирует, что геном оцДНК не требуется для поддержания целостности фага Pf4, в отличие от того, что было предложено для других иновирусов (9).Анализ взаимодействия между субъединицами белка CoaB и линейным геномом оцДНК (в структуре Pf4 с оцДНК, рис. 1) показывает слабые контакты между 44 остатками аргинина и фосфатным остовом ДНК (рис. 2 E ). Других значимых белков нет: взаимодействия ДНК, что объясняет, почему отсутствие ДНК оставляет структуру белка практически неизменной. Отсутствие генома ДНК в некоторых филаментах не наблюдалось у других иновирусов и, возможно, является следствием этого слабого, но кооперативного взаимодействия капсид: ДНК.Сама оболочка капсида сравнительно плотно упакована и поддерживается несколькими гидрофобными взаимодействиями между субъединицами CoaB (Fig. 2 F ), которые повторяются вдоль филамента, вероятно, обеспечивая большую чистую стабильность структуры фага.

Рис. 2.

Крио-ЭМ структура филамента Pf4 без оцДНК при разрешении 3,9 Å. ( A ) Двумерное среднее значение класса Pf4 с оцДНК, показывающее плотность в ядре фага, обозначенную пиком на горизонтальном профиле плотности, наложенном в среднем (синяя кривая).( B ) Среднее значение класса Pf4 без оцДНК; на горизонтальном профиле плотности в центре среднего (красная кривая) наблюдается провал. ( C ) Вид сверху крио-ЭМ-структуры Pf4 без оцДНК с разрешением 3,9 Å. Плотность отображается серой изоповерхностью, а субъединицы CoaB — лентами. Структура подтверждает отсутствие оцДНК во внутренней полости 22 Å. ( D ) Сравнение структуры CoaB из филаментов Pf4 с (синий) и без оцДНК (красный) показывает, что структуры почти идентичны (RMSD 0.35 Å, см. Фильм S2). ( E ) Увеличенное изображение взаимодействий CoaB: ssDNA в нативной структуре Pf4 (из фиг. 1). Фосфаты (черный) линейной оцДНК (красный) слабо координированы 44 остатками аргинина (оранжевый) CoaB (расстояние 5,4 Å). ( F ) Увеличенное изображение взаимодействий CoaB: CoaB внутри филаментов Pf4 показывает межсубъединичные гидрофобные взаимодействия, которые стабилизируют капсид.

Сборка фага Pf4 в жидкие кристаллические капли является динамичной с высокой степенью ориентационного упорядочения.

Pf4 образует структуры более высокого порядка при смешивании с биополимерами, такими как альгинат, анионный полисахарид, изобилующий бактериальными биопленками, или гиалуронан, полимер, обнаруживаемый в дыхательных путях человека (7). При смешивании Alexa-488 (A488), меченного Pf4, с альгинатом натрия (приложение SI, дополнительные материалы и методы ) смесь самопроизвольно разделяется на две сосуществующие водные фазы: одна фаза, богатая биополимером, другая фаза, богатая частицами Pf4. Последняя фаза образовывала капли с характерной веретенообразной формой ( SI Приложение , рис.S5), результат взаимодействия между упругими эффектами, закреплением и поверхностным натяжением (16, 17). Такие жидкокристаллические капли называют тактоидами (7, 18). Разделение жидкокристаллических фаз было быстрым, так как сразу после смешивания реагентов наблюдались мелкие жидкокристаллические капли ( SI Приложение , рис. S5 A ). Они выросли до более чем 4 мкм в длину ( SI Приложение , рис. S5 A — F ), и наблюдались случаи, когда маленькие капли сливались в более крупные капли, что указывает на динамическую сборку.Чтобы подтвердить динамическую природу нитей внутри веретенообразных жидкокристаллических капель, мы использовали флуоресцентную микроскопию в реальном времени. Небольшая область тактоида Pf4 подвергалась фотообесцвечиванию несколько раз, и было измерено восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) (фиг. 3 A — D и Movie S3). Сигнал флуоресценции восстанавливается в течение нескольких секунд после нескольких событий фотообесцвечивания, доказывая, что отдельные волокна, составляющие жидкие кристаллические капли, динамичны в тактоиде.

Рис. 3. Сборка

Pf4 в жидкие кристаллические капли является динамической с сильным ориентационным упорядочением нитей. ( A ) Область внутри жидкокристаллической капли многократно подвергалась фотообесцвечиванию, и измеряли FRAP с течением времени (Movie S3). График показывает среднюю интенсивность флуоресценции области, намеченной для фотообесцвечивания (ось y ), в зависимости от времени (ось x ). События фотообесцвечивания обозначаются вертикальными серыми полосами. ( B — D ) Флуоресцентные изображения в различные моменты времени во время эксперимента FRAP.Из изображений был удален фон (желтый, высокий сигнал; синий, низкий сигнал). (Шкала: B — D , 5 мкм.) ( B ) Жидкокристаллическая капля Pf4 перед фотообесцвечиванием. ( C ) Фотообесцвечивание области внутри жидкокристаллической капли Pf4, обозначенной белым кружком. ( D ) Восстановление сигнала флуоресценции в фотообесцвеченной области, указывающее на то, что нити Pf4 динамичны в жидкокристаллической фазе. ( E и F ) Cryo-ET жидкокристаллических капель Pf4 (плотность белка черный) показывает продольное совмещение нитей Pf4 с осью веретена (фильм S4).Изогнутые нити Pf4 видны по краям жидкокристаллической капли. ( G — I ) Призраки Pf4 после химического удаления оцДНК могут собираться в жидкокристаллические капли так же, как нативный Pf4. A488-Pf4 (зеленый, G ) и A568-Pf4 (красный, H ) смешивали с альгинатом натрия с образованием жидкокристаллических капель. Оба композиционных варианта фага Pf4 совместно локализованы в одних и тех же жидкокристаллических каплях ( I ). (Шкала: G — I , 10 мкм.)

Чтобы изучить ультраструктуру восстановленных жидкокристаллических капель, мы применили крио-ЭТ к более мелким тактоидам, которые были подвержены крио-ЭМ, чтобы разрешить каждую отдельную фаговую нить внутри веретена (рис. 3 E ). На томограммах длинные оси филаментов фага Pf4 выровнены в продольном направлении относительно оси веретена жидкокристаллических капель (Movie S4). Спонтанное упорядочение нитей имеет энтропийное происхождение и дополнительно стимулируется биополимером, который, скорее всего, вызывает привлекательное истощающее взаимодействие между нитями, где биополимер предпочтительно исключен (19).Ориентационная упорядоченность, но хаотичность расположения нитей Pf4 являются убедительным признаком нематической жидкокристаллической фазы (18). Нити в центре капель, где веретено имеет самый широкий диаметр, плотно упакованы и прямые, тогда как нити на краях веретена кажутся более изогнутыми (рис. 3 E и F и Movies S4 и S5 G и H ).

Формирование жидко-кристаллической капли Pf4 не зависит от генома оцДНК.

Поскольку отрицательно заряженная оцДНК Pf4 участвует в связывании положительно заряженных антибиотиков, таких как тобрамицин (7), мы исследовали роль генома оцДНК в сборке жидкокристаллических капель. Эндогенно очищенный нативный Pf4 представляет собой смешанную популяцию филаментов с оцДНК и без нее (рис. 1 и 2). Мы получили филаменты Pf4, в которых геном оцДНК был извлечен из препарата, названного призраками Pf4, путем химической обработки хлоридом лития (20). После удаления ДНК инфекционность снизилась на несколько порядков, в то время как морфология филаментов Pf4 не изменилась ( SI Приложение , рис.S6 A , B и E ), что подтверждает стабильность филаментов Pf4 без оцДНК (рис. 2). Измерения длины филаментов на основе крио-ЭМ изображений нативного Pf4 выявляют популяцию размером ~ 3,8 мкм, вероятно соответствующую фагам Pf4, содержащим полный геном оцДНК, на основании рассчитанного отношения капсидов к нуклеотидам, вместе со спиральной симметрией филаментов, наблюдаемой в нашем примере криоЭМ структура разрешения (рис. 1). Наряду с этими полноразмерными фагами Pf4 наблюдалась значительная популяция более коротких филаментов нативного Pf4, предположительно лишенных полного генома оцДНК.Соответствующие измерения длины призрачных филаментов Pf4 показали, что одновременно с потерей генома оцДНК средняя длина призрачных филаментов Pf4 была уменьшена, а популяция филаментов размером 3,8 мкм не наблюдалась ( SI Приложение , рис. S6 C и D ). Затем мы проверили, могут ли призраки Pf4 образовывать жидкие кристаллические капли, чтобы оценить роль оцДНК в сборке тактоидов. Призраки Pf4 ( SI Приложение , Рис. S6 E — G ), помеченные Alexa-568 (A568), смешанными с альгинатом натрия, давали веретенообразные жидкокристаллические капли с идентичной морфологией ( SI Приложение , Рис.S6 F и G ) в виде капель, сделанных из природного Pf4 ( SI Приложение , рис. S6 I и J ). Кроме того, фантомные волокна A568-Pf4 собраны вместе с A488-Pf4 в одну и ту же жидкокристаллическую каплю (рис. 3 G — I ). Это демонстрирует, что отрицательно заряженная оцДНК Pf4 не является необходимой для сборки фага в жидкие кристаллические капли и что нитевидные стержни, сделанные из белков капсида фага, достаточны для образования этих тактоидов более высокого порядка.

P. aeruginosa Защита от антибиотиков, обеспечиваемая жидкими кристаллическими каплями Pf4, не требует наличия отрицательно заряженной геномной ДНК фага. Было показано, что фаги

Pf4 способствуют толерантности к аминогликозидным антибиотикам P. aeruginosa (7). Было высказано предположение, что положительно заряженные аминогликозидные антибиотики секвестрируются полианионами, такими как ДНК (21). Мы проверили эту гипотезу в лаборатории и обработали культуры PAO1 ΔPA0728 (без интегразы Pf4) тобрамицином или гентамицином в присутствии или в отсутствие жидкокристаллических капель Pf4 (рис.4 A и B ). Жидкокристаллические капли, образованные как нативным Pf4 (с оцДНК), так и призраками Pf4 (без оцДНК), защищали P. aeruginosa от тобрамицина или гентамицина значительно сильнее, чем только отрицательно заряженный альгинат натрия ( P <0,0001 и P <0,05 соответственно) или только филаментов Pf4 ( P <0,0001 и P <0,05, рис. 4, A и B ). Однако не было значительной разницы между защитным действием жидкокристаллических капель Pf4 и фантомных жидкокристаллических капель Pf4 для любого из антибиотиков (рис.4 A и B ). Чтобы определить, можно ли воспроизвести этот защитный эффект с другими классами антибиотиков, мы протестировали колистин, антибиотик, используемый против P. aeruginosa . Как видно на примере аминогликозидных антибиотиков тобрамицина и гентамицина, жидкие кристаллические капли нативного Pf4 и Pf4 могут защитить бактерий P. aeruginosa от колистина значительно сильнее, чем один отрицательно заряженный альгинат натрия ( P <0.05, рис.4 C ). Эти наблюдения с различными антибиотиками показывают, что присутствие жидкокристаллических структур, а не отрицательно заряженных молекул, таких как альгинат или ДНК, имеет решающее значение для защиты от антибиотиков P. aeruginosa . Чтобы дополнительно охарактеризовать защитный эффект жидкокристаллических структур Pf4, мы исследовали влияние концентрации антибиотика и фага Pf4 на выживаемость бактерий ( SI Приложение , рис. S7 A и B ).Повышение концентрации тобрамицина отменяет опосредованную жидкокристаллическими каплями защиту Pf4, указывая на то, что эффект зависит от дозы ( SI Приложение , рис. S7 A ). Концентрации фага Pf4 выше 0,5 мг / мл (что соответствует ∼5 × 10 ⁶ БОЕ / мл, SI Приложение , Рис. S7 C ) были способны защитить P. aeruginosa от тобрамицина ( SI Приложение , Рис. S7 B ). Эта концентрация Pf4 значительно ниже ∼10 ¹¹ БОЕ / мл, сообщенных для P.aeruginosa (22), предполагая, что защита с помощью Pf4-опосредованного механизма будет совместима со сценарием in vivo в биопленках.

Рис. 4. Жидкокристаллические капли

Pf4 с оцДНК и без нее защищают клетки P. aeruginosa от антибиотиков. ( A ) Гистограмма показывает колониеобразующие единицы (КОЕ) на мл, показатель жизнеспособности клеток P. aeruginosa после обработки тобрамицином (ось y ) в присутствии различных реагентов (ось x ) .Жидкокристаллические капли Pf4 (нативный) и Pf4-призрак (без оцДНК) защищают P. aeruginosa от тобрамицина в значительно большей степени, чем при использовании одного альгината натрия ( P <0,0001). Однако не наблюдается значительной разницы между обработками жидкокристаллическими каплями Pf4 и паразитными жидкокристаллическими каплями Pf4. Показанные значения представляют собой среднее значение шести независимых экспериментов (полосы ошибок показывают стандартное отклонение). ( B ) График показывает КОЕ / мл (ось y ) в присутствии различных реагентов (ось x ).Жидкокристаллические капли Pf4 обладали значительным защитным эффектом по сравнению с одним альгинатом натрия ( P <0,05) против гентамицина, но не было значительной разницы между жидкокристаллическими каплями Pf4 и призрачными жидкокристаллическими каплями Pf4. ( C ) Жидкокристаллические капли Pf4 обладали значительным защитным эффектом по сравнению с одним альгинатом натрия ( P <0,05) против колистина, но не было значительной разницы между жидкокристаллическими каплями Pf4 и призрачными жидкокристаллическими каплями Pf4.Показанные значения представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов (полосы ошибок показывают стандартное отклонение). n.s, не имеет значения.

Жидкокристаллические капли Pf4 инкапсулируют

клеток P. aeruginosa в процессе, на который сильно влияет комплементарность размера и формы.

Для изучения механизма толерантности к антибиотикам, опосредованной жидкокристаллическими каплями, мы исследовали культуры, эквивалентные таковым из анализа защиты, описанного на рис. 4 A (полоса 4, дополненная A488-меченным Pf4) с помощью флуоресцентной микроскопии.Мы наблюдали, что каждая из бактериальных клеток P. aeruginosa была окружена оболочкой, состоящей из жидкокристаллической капли Pf4 (рис. 5 A и B и SI Приложение , рис. S8 A и B ). Чтобы количественно оценить морфологические параметры этих сборок, мы сегментировали плотности, соответствующие жидкокристаллическим каплям и клеткам ( n = 417) в автоматическом режиме ( SI Приложение , рис. S8 C ).Попарные ориентационные различия между длинными осями бактериальных клеток и жидкокристаллических капель были небольшими (в среднем 7,0 ± 8,3 °), что свидетельствует о том, что ассоциация стержневидных клеток и веретеновидных жидкокристаллических капель не является стохастической (рис. 5 C). ). Средняя длина жидкокристаллических капель вокруг клеток (4,3 ± 0,9 мкм) была на 1,1 мкм больше, чем средняя длина бактериальных клеток (3,2 ± 1,0 мкм), что позволяло жидкокристаллическим каплям инкапсулировать бактериальные клетки ( SI Приложение , стр. Инжир.S8 D и E ). Чтобы дополнительно охарактеризовать процесс инкапсуляции, мы проверили влияние концентрации биополимера и фага ( SI Приложение , рис. S9). Инкапсуляция клеток P. aeruginosa наблюдалась при концентрациях альгината 1 мг / мл и выше ( SI Приложение , рис. S9 A — C ), а также при замене альгината другим биополимерным гиалуронаном при концентрации 0,5 мг / мл и выше ( SI Приложение , рис.S9 D — F ), предполагая, что скучивающий эффект биополимера, а не его химический эффект, приводит к образованию жидких кристаллических капель и инкапсуляции бактерий. Титрование концентрации Pf4 против постоянного количества биополимера показало, что концентрации, которые могут эффективно инкапсулировать P. aeruginosa ( SI Приложение , рис. S9 G — I ), способны защитить P. aeruginosa от антибиотиков. ( SI Приложение , рис.S7 B ), что указывает на корреляцию между инкапсулированием и защитой от антибиотиков.

Рис. 5. Жидкокристаллические капли

Pf4 образуют защитную оболочку вокруг клеток P. aeruginosa . ( A ) Оптическая микроскопия состояния из анализа антибиотической защиты, представленного на фиг. 4, содержащего клеток P. aeruginosa, , альгинат и Pf4 (фиг. 4 A , столбец 4, без антибиотика). Канал проходящего света показывает бактерии (красный псевдоцвет), а зеленый флуоресцентный канал показывает Pf4 (зеленый).( B ) Увеличенное изображение ячейки показывает тесную ассоциацию жидких кристаллических капель вокруг ячейки. ( C ) Гистограмма парных ориентационных различий между бактериальными клетками и ассоциированными жидкокристаллическими каплями из автоматической сегментации флуоресцентных изображений ( n = 417). ( D ) Коллоидные стержни (с морфологией, сходной с бактериями), смешанные с жидкокристаллическими каплями Pf4, демонстрируют такой же эффект инкапсуляции. ( E ) Крио-ET срез, показывающий жидкокристаллическую фазу Pf4, связанную с бактериальной клеткой и обволакивающую ее (фильм S5).

Чтобы исследовать специфичность процесса инкапсуляции, мы проверили, будут ли жидкокристаллические капли Pf4 ассоциироваться с каким-либо предметом в форме стержня, заменив бактерии неодушевленными коллоидными стержнями (23). Мы наблюдали аналогичные события инкапсуляции с помощью флуоресцентной микроскопии (Рис. 5 D и SI Приложение , Рис. S9 J — L ), предполагая, что процесс инкапсуляции зависит от размера и комплементарности формы между бактериями и жидкостью. кристаллические капли, хотя лежащая в основе биохимия Pf4 и P.aeruginosa также могут играть определенную роль. Трехмерное (3D) конфокальное изображение культуры для анализа защиты, описанной на рис. 4 A (полоса 4), показало, что толщина инкапсулированных бактерий вместе с соответствующим жидким кристаллом составляет не менее 2 мкм ( SI Приложение , рис. S8 F — H ). Такие толстые образцы не подходят для крио-ЭМ визуализации из-за ограниченной проникающей способности электронного луча. Тем не менее, мы выполнили крио-ET визуализацию тонких участков культуры для анализа защиты, где бактерии были частично инкапсулированы.Это показало, что филаменты Pf4 обвиваются вокруг клеток (рис. 5 E и Movie S5) или выстраиваются в непосредственной близости от внешней мембраны, разделенные только липополисахаридом и другими молекулами клеточной поверхности, которые, как известно, присутствуют во внешней мембране Грамотрицательные бактерии, включая P. aeruginosa ( SI Приложение , рис. S8 I ) при большом количестве копий (24, 25). Эти крио-ET изображения представляют собой снимки ассоциации жидкокристаллических капель Pf4 и P.aeruginosa , что указывает на то, что филаменты Pf4 могут деформироваться и оборачиваться вокруг палочковидных бактериальных клеток, чтобы начать инкапсуляцию.

Для дальнейшего изучения связи между бактериальной инкапсуляцией и защитой от антибиотиков, опосредованной жидкокристаллическими каплями Pf4, мы исследовали жизнеспособность отдельных клеток в культурах из анализа защиты на рис. 4 A с использованием окрашивания йодидом пропидия (PI), которое позволяет идентифицировать мертвых клеток (26). Сравнение обработанных тобрамицином культур, содержащих жидкие кристаллические капли Pf4, с одним только альгинатом показало, что значительно меньший процент клеток был окрашен положительным PI, когда присутствовали жидкие кристаллические капли Pf4 (рис.6 A и B ) в отличие от одного альгината и в отсутствие жидкокристаллических капель Pf4 ( P <0,0001, рис. 6 C и D , количественное определение, рис. 6 E ) . В целом, меньшее количество клеток наблюдалось при использовании одного альгината ( P <0,01, фиг. 6, F ), что свидетельствует об увеличении гибели клеток из-за действия антибиотика. Что наиболее важно, PI-положительные клетки на изображениях образцов, содержащих жидкие кристаллические капли Pf4, не были инкапсулированы (рис.6 A и B ). Вместе эти данные показывают, что инкапсуляция жидких кристаллических капель Pf4 необходима для защиты от антибиотиков. Одна из возможных причин того, что инкапсулированные клетки менее чувствительны к антибиотикам, может заключаться в том, что они метаболически неактивны. Чтобы проверить эту гипотезу, мы визуализировали жидкокристаллическую каплю Pf4, инкапсулированную бактерий P. aeruginosa , с течением времени, используя оптическую микроскопию. Мы наблюдали, что инкапсулированные клетки способны расти и делиться, что позволяет предположить, что они метаболически активны ( SI Приложение , рис.S10). Интересно, что жидкие кристаллические капли Pf4 были способны перестраиваться, чтобы приспособиться к вновь разделенным клеткам, отражая их динамическую природу, что подтверждает наблюдение филаментов Pf4, оборачиваемых вокруг клеток P. aeruginosa , наблюдаемых в крио-ET ( SI Приложение , рис. S10 и Фильм S6).

Рис. 6. Инкапсуляция

жидких кристаллических капель Pf4 из P. aeruginosa предотвращает гибель клеток при лечении антибиотиками. ( A ) Оптическая микроскопия анализа антибиотической защиты, представленного на рис.4, содержащий клеток P. aeruginosa, , альгинат, Pf4 и тобрамицин (фиг. 4 A , столбец 4), окрашенные PI. Бактерии показаны красным цветом (псевдоцвет канала проходящего света), жидкокристаллические капли Pf4 — зеленым, а окраска PI — синим. ( B ) Увеличение A показывает, что бактерии, инкапсулированные в жидкие кристаллические капли Pf4, не окрашиваются PI (живые клетки обозначены белыми стрелками, а мертвые клетки обозначены желтыми стрелками). ( C ) Оптическая микроскопия состояния, в котором отсутствуют филаменты Pf4, из анализа антибиотикозащиты, представленного на рис.4, содержащий клеток P. aeruginosa , альгинат и тобрамицин (фиг. 4 A , столбец 3), окрашенные PI. ( D ) Увеличенное изображение C показывает окрашивание клеток PI. Из всех флуоресцентных изображений вычитали фон. ( E ) Столбчатая диаграмма, показывающая количественное окрашивание PI с процентным содержанием клеток, окрашенных PI (ось y ) в присутствии или отсутствии жидкокристаллических капель Pf4 (ось x ). ( F ) Гистограмма, показывающая среднее количество клеток, наблюдаемых на изображении, в случайно собранных полях образца (ось y ) в присутствии или отсутствии жидкокристаллических капель Pf4 (ось x ).Показаны средние значения, а полосы ошибок обозначают SE. Эксперимент проводился в трех повторностях ( n = 30 изображений).

Discussion

Разделение жидкой и жидкой фаз в настоящее время наблюдается во множестве эукариотических систем, где оно играет ключевую роль в формировании субклеточных безмембранных компартментов, таких как ядрышки, центросомы и стрессовые гранулы (12). Инкапсуляция и защита P. aeruginosa с помощью жидкокристаллических капель Pf4 является типичным примером разделения фаз в прокариотической системе, которая здесь действует для ограничения целых бактериальных клеток.Мы показали, что жидкокристаллические капли фага образуют безмембранные компартменты в присутствии биополимеров, защищая бактерии от антибиотиков.

В этом исследовании мы исследовали механизм опосредованной фагом Pf4 толерантности к антибиотикам в различных пространственных масштабах, от атомной структуры Pf4 до его роли в формировании жидкокристаллических нанокамер вокруг палочковидных бактерий (рис. 7). На атомном уровне, хотя несколько структур капсидов иновирусных фагов были описаны ранее (10, 11), детали атомной структуры о топологии геномов оцДНК иновирусов трудно разрешить.Основываясь на наблюдении параксиальных фосфатов в экспериментах по дифракции волокон на фаге Pf1, для всех фагов Pf был предложен кольцевой геном оцДНК (10). Pf4 обладает последовательностью капсида, идентичной Pf1, и в этом исследовании было показано, что он содержит линейный геном оцДНК. Учитывая диаметр ∼22 Å внутренней полости Pf4, которая заряжена только слабо положительно по сравнению с другими иновирусными фагами, такими как IKe, трудно представить, как вторая цепь оцДНК будет размещена внутри этого пространства в кольцевом геноме оцДНК. (Рис.7). Ранее предполагалось, что линейность геномов иновирусов, особенно интегративных фагов (9), подтверждается предложенной схемой расположения генома. Еще одно неожиданное открытие из наших атомных структур заключалось в том, что капсид мог сохранять свою нитевидную структуру в отсутствие оцДНК, поскольку геном оцДНК ранее считался каркасом, обеспечивающим стабильность капсида (9).

Рис. 7.

Схематическая модель механизма опосредованной фагом Pf4 толерантности к антибиотикам, выявленной в этом исследовании.Отдельные фаговые нити Pf4 самоорганизуются в динамические веретенообразные жидкокристаллические капли более высокого порядка, называемые тактоидами, в присутствии биополимеров. Жидкокристаллические капли Pf4 инкапсулируют клеток P. aeruginosa , образуя закрывающие нанокамеры, которые увеличивают выживаемость P. aeruginosa после лечения антибиотиками. На этот процесс в значительной степени влияет комплементарность формы и размера между бактериальными клетками и жидкими кристаллами, поскольку жидкие кристаллические капли Pf4 могут также заключать в капсулу неодушевленные коллоидные стержни сравнимого размера и формы с P.aeruginosa бактерий.

Жидкокристаллические капли, образованные стержнеобразными объектами, были предметом интенсивных исследований в области биофизики (18). В данном исследовании мы проанализировали веретенообразные жидкокристаллические капли с использованием FRAP и крио-ET высокого разрешения и описали расположение фагов Pf4 в жидкокристаллической фазе. Эксперименты с FRAP показали динамическое расположение Pf4 внутри капли, а наши данные крио-ET показали деформированные волокна Pf4 на краях капель.Это наблюдение может объяснить способность жидкокристаллических капель Pf4 деформировать и инкапсулировать палочковидные бактерии, образуя защитные нанокамеры. Поскольку жидкокристаллические капли Pf4 без отрицательно заряженной оцДНК защищают P. aeruginosa как от аминогликозидов, так и от колистина (рис.4), наши данные показывают, что связывание антибиотиков на основе электрического заряда (7) не является единственной основой опосредованного Pf4 толерантность к антибиотикам. В соответствии с этой картиной биофизической инкапсуляции, опосредующей защиту от антибиотиков, жидкие кристаллические капли были способны инкапсулировать неодушевленные коллоидные стержни сравнимого размера и формы с P.aeruginosa (рис. 7), хотя лежащая в основе биохимия фага Pf4 и P. aeruginosa также может играть роль, особенно в сложной среде биопленок. Окрашивание PI вместе с оптической микроскопией продемонстрировало, что инкапсулированные клетки были защищены от действия антибиотиков, но все же были способны расти и делиться, что свидетельствует о том, что метаболическая неактивность не является причиной того, что инкапсулированные клетки менее чувствительны к антибиотикам. Делящиеся клетки были приспособлены путем перегруппировки инкапсулирующих жидких кристаллических капель Pf4, снова подчеркивая динамическую и текучую природу этих объектов.

Недавно было показано, что иновирусы распространены среди всех прокариот, включая архей (8). Иновирусные фаги, подобные Pf4, присутствуют в других патогенных грамотрицательных бактериях, таких как Neisseria meningitidis , Vibrio cholerae , Klebsiella pneumoniae , Salmonella enterica, и Escherichia coli (Escherichia coli ). их глубокое влияние на бактериальную вирулентность было продемонстрировано (27), хотя точные механизмы остаются предметом исследования.Мы предполагаем, что биофизическая окклюзия антибиотиков и других вредных молекул нитевидными частицами, такими как Pf4 или другими олигомерными молекулами, может быть общей стратегией повышения выживаемости бактерий в суровых условиях.

Методы

Приготовление фага Pf4.

Нативный фаг Pf4 первоначально был получен из статической биопленки штамма P. aeruginosa PAO1, затем амплифицирован путем инфицирования PAO1 на чашках Luria-Bertani и выделен осаждением полиэтиленгликолем, как описано ранее (20) и более подробно в SI Приложение , Материалы и методы .

Сбор данных Cryo-EM и Cryo-ET.

Крио-ЭМ данные фага Pf4 были собраны в виде стеков кадров фильма с использованием программного обеспечения EPU на микроскопе Titan Krios (ThermoFisher), работающем при 300 кВ, оснащенном энергетическим фильтром Quantum и детектором прямых электронов K2 Summit (Gatan), работающим в режим подсчета. Данные серии наклона для крио-ET были собраны на том же микроскопе с использованием программного обеспечения SerialEM (29) в двух направлениях, начиная от 0 ° между ± 60 ° с шагом наклона 1 °.Дополнительные сведения о подготовке сетки и условиях сбора данных приведены в Приложении SI , «Материалы и методы» и в таблице S1.

Крио-ЭМ обработка изображений и анализ данных.

Крио-ЭМ уточнение было выполнено с использованием процедуры спиральной реконструкции в реальном пространстве, реализованной в Relion 3.0 (30). Преобразования Фурье средних значений классов, полученные с помощью программного обеспечения Spring (31), которые показали особенности высокого разрешения, были проиндексированы для определения начальных параметров спиральной симметрии, используемых для 3D-уточнения в Relion.Вариация состава Pf4 была учтена путем разделения набора данных на сегменты из классов, показывающих плотность в сердцевине волокна, и классов, где эта плотность отсутствовала. Построение модели выполнялось итеративно с использованием Coot (32) вместе с уточнением в реальном пространстве по карте плотности в PHENIX (33). Более подробная информация представлена в Приложении SI , Материалы и методы .

Реконструкция томограммы по данным Cryo-ET.

Совмещение серии наклона с использованием золотых реперных точек и реконструкция томограммы были выполнены с использованием набора программ обработки, моделирования и отображения изображений (IMOD) (34), как описано ранее (35).Визуализацию данных проводили в IMOD и UCSF Chimera (36).

Флуоресцентная микроскопия и FRAP.

Образцы для флуоресцентной микроскопии были либо иммобилизованы на агаровых подушках, сконструированных с использованием Gene Frames (ThermoFisher), либо нанесены непосредственно на предметные стекла и визуализированы с использованием широкоугольного микроскопа Zeiss AxioImager M2 или конфокального микроскопа Zeiss LSM Exciter соответственно. Для экспериментов с FRAP образцы помещали в капилляр на предметное стекло, а интересующие области отбеливали с использованием программного режима отбеливания Zen на конфокальном микроскопе возбудителя Zeiss LSM.Более подробная информация о подготовке образцов, условиях визуализации и анализе изображений представлена в Приложении SI , Материалы и методы .

Доступность материалов и данных.

Крио-ЭМ карты, представленные в этом исследовании, депонированы в банке данных электронной микроскопии с кодами доступа EMD-10593 и EMD-10594. Атомарные модели были депонированы в банке данных белков с кодами PDB 6TUP и 6TUQ. Реагенты, созданные в этом исследовании, будут доступны по запросу, но мы можем потребовать оплату и / или заполненное Соглашение о передаче материалов, если есть возможность коммерческого применения.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить профессора Патрика Секора (Университет Монтаны) за любезно предоставленный штамм PAO1 ΔPA0728 , г-жу Карлу Фернандес-Рико за предоставленные стержни SU-8 и доктора Шарлотту Мелиа, г-на Яну Бёнингу и г-ну Сию Чену за полезные советы. Мы благодарим профессора Майка Глейзера за помощь в измерениях двойного лучепреломления и г-на Адама Костина за помощь в сборе крио-ЭМ данных. Эта работа была поддержана благотворительным фондом «Action Medical Research for Children Charity» (код гранта GN2634) и фондом Cystic Fibrosis Trust.T.A.M.B. является стипендиатом сэра Генри Дейла, совместно финансируемого Wellcome Trust и Королевским обществом (грант 202231 / Z / 16 / Z).

Сноски

Вклад авторов: A.K.T. и T.A.M.B. спланированное исследование; A.K.T., A.v.K., A.J.M. и T.A.M.B. проведенное исследование; D.G.A.L.A. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; A.K.T., A.v.K., A.J.M., США, D.G.A.L.A. и T.A.M.B. проанализированные данные; и A.K.T. и T.A.M.B. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.
Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.
Размещение данных: Крио-ЭМ карты, представленные в этой статье, депонированы в Банке данных электронной микроскопии (EMDB), https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb (номера доступа EMD- 10593 и EMD-10594). Крио-ЭМ атомные модели, представленные в этой статье, были депонированы в банке данных белков (PDB) (коды PDB ID 6TUP и 6TUQ).
См. В Интернете сопутствующий контент, например, комментарии.
Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1
6117/-/DCSupplemental.