Пцр эпштейн барр: Epstein Barr Virus, ДНК [реал-тайм ПЦР]

Содержание

Вирус Эпштейна-Барр: диагностика инфекционного мононуклеоза

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Вирус Эпштейна-Барр относится к семейству герпесвирусов, подсемейство g-герпесвирусов — вирус герпеса человека IV типа. Вирусная частица состоит из нуклеоида, капсида и оболочки.
Нуклеоид содержит двухцепочечную ДНК, он окружен капсидом, состоящим из белковых субъединиц. Нуклеоид и капсид (нуклеокапсид) окружены липидсодержащей внешней оболочкой, образующейся из ядерной или наружной мембраны клетки-хозяина, в которую ещё до начала сборки вирусной частицы встраиваются некоторые вирусные белки.
При инфицировании вирус проникает в эпителий ротоглотки и слюнных желёз человека и вызывает активную инфекцию с лизисом клеток и высвобождением вирусных частиц, в результате чего вирус обнаруживается в слюне.

Кроме того, он может проникать в В-лимфоциты и эпителий носоглотки и вызывать латентную инфекцию. Вирус Эпштейна-Барр можно обнаружить в оральных секретах здоровых, но латентно инфицированных людей. Вирус тропен к В-лимфоцитам, Т-лимфоциты он не поражает. Проникнув в лимфоциты, вирус Эпштейна-Барр может вызывать их трансформацию, в результате которой образуются способные к неограниченной пролиферации клоны атипичных лимфоцитов, содержащие кольцевую вирусную ДНК в виде плазмиды. Рецептором вируса на эпителиальных клетках и В-лимфоцитах служит молекула CD21, которая служит также рецептором фрагмента комплемента C3d. Вирус запускает как гуморальный, так и клеточный ответ. Среди образующихся антител есть специфические к антигенам вируса и неспецифические, гетерофильные. Последние появляются в результате поликлональной активации В-лимфоцитов (это может быть причиной интерференции при проведении ряда серологических исследований у людей с активной инфекцией вирусом Эпштейна-Барр). Главную роль в элиминации данной инфекции играет клеточный иммунитет.

При острой инфекции первичная репродукция вируса в В-лимфоцитах сменяется выраженной пролиферацией Т-лимфоцитов с соотношением CD4/CD8 меньше 1.

Острая инфекция вирусом Эпштейна-Барр известна под названиями инфекционный мононуклеоз, болезнь Филатова, моноцитарная ангина, идиопатическая железистая лихорадка, болезнь Афейффера, острый доброкачественный лимфобластоз.

Вирус Эпштейна-Барр — главная причина мононуклеоподобного синдрома (хотя острая первичная инфекция, вызванная этим вирусом, и инфекционный мононуклеоз не являются синонимами). Для острой инфекции характерно повышение температуры, боли в горле и увеличение заднешейных лимфоузлов (реже – переднешейных и локтевых, встречается генерализованное увеличение лимфоузлов). В 50% случаев выявляется увеличение селезенки, в 10 — 30% случаев – увеличение печени. Другими проявлениями инфекции могут быть сыпь и периорбитальный отек. Изредка наблюдаются осложнения, в том числе, неврологические, изменения со стороны системы крови в виде гемолитической или апластической анемии, нейтропении, тромбоцитопении. После перенесённого заболевания иногда подолгу сохраняется фарингит, увеличение лимфоузлов, утомляемость и неспособность концентрации внимания.
Заболевание малоконтагиозно. Инкубационный период (период активного размножения и распространения вируса по всей лимфоидной ткани) может длиться от 30 до 50 суток. Инфицирование данным вирусом в любом возрасте, а у детей особенно, в большинстве случаев может протекать бессимптомно или как респираторная инфекция. Доля серопозитивных лиц (имеющих специфические антитела к антигенам вируса) уже среди подростков в разных странах составляет от 50 до 90%, среди взрослых людей серологические признаки инфекции обнаруживаются почти в 100% случаев. Вирус выделяется со слюной, передается через поцелуи и другие контакты слизистой со слюной или загрязнёнными ею предметами. Трансплацентарная передача вируса происходит редко. Иммунитет при инфекционном мононуклеозе стойкий.

Хотя канцерогенность вируса окончательно не доказана, есть основания полагать, что он может играть роль в развитии ряда злокачественных новообразований – лимфомы Беркитта, рака носоглотки, лимфогранулематоза и ряда посттрансплантационных лимфопролиферативных синдромов. На фоне нарушения клеточного иммунитета (СПИД, иммуносупрессия при трансплантации и пр.) вирус Эпштейна — Барр может вызывать инфекционный мононуклеоз с летальным исходом или лимфопролиферативные синдромы с развитием В-клеточных лимфом.
Лабораторная диагностика инфекционного мононуклеоза
Диагностика инфекционного мононуклеоза основывается на клинической картине, характерных изменениях в клиническом анализе крови:
Ко второй неделе заболевания развивается относительный и абсолютный лимфоцитоз с присутствием 10 — 20% атипичных мононуклеаров. Гематологические изменения, напоминающие картину инфекционного мононуклеоза, могут наблюдаться и при цитомегаловирусной инфекции, токсоплазмозе, острых респираторных вирусных заболеваниях, ветряной оспе, кори, инфекционных гепатитах и других заболеваниях. Поэтому для постановки дифференциального диагноза целесообразно проведение серологических тестов. Антитела к антигенам вируса появляются достаточно быстро, и исследование в остром периоде заболевания даже однократное взятие сыворотки на разные виды антител может дать достаточно точное представление о наличии иммунитета или восприимчивости пациента к инфекции вирусом Эпштейна-Барр, текущей инфекции или реактивации.
Дополнительным подтверждением течения острых стадий инфекции может служить выявление ДНК вируса Эпштейна — Барр в крови и/или слюне методом ПЦР

ПЦР-тестирование особенно полезно для выявления данной инфекции у новорождённых, когда серологические исследования мало информативны вследствие незрелости иммунной системы, а также в сложных и сомнительных случаях.

Серологические тесты.

При литическом жизненном цикле вируса сначала появляются каскадом различные регуляторные белки ранней фазы (ранние антигены, early antigens, EA), к которым относятся используемые в различных тест-системах ЕА-D (p54), EA-R (p85), EA p138. Позже образуются структурные белки вируса — вирусные капсидные антигены (virus capsid antigens, VCA), мембранные белки (membrane antigens, MA). При латентной инфекции образуются только некоторые белки, в число которых входит Эпштейна-Барр ядерный (нуклеарный) антиген (Epstein-Barr nuclear antigens, EBNA, NA). Специфическая серологическая диагностика инфекции основана на использовании комбинации тестов, выявляющих наличие IgG и IgM антител к различным белкам-антигенам вируса, что позволяет дифференцировать инфекцию и уточнить стадию патологического процесса. В серологической диагностике острого мононуклеоза используется также тест на гетерофильные антитела.

ВАЖНО!

Информация проверена экспертом

Лишова Екатерина Александровна

Высшее медицинское образование, опыт работы — 19 лет

Анализы на вирус Эпштейн-Барр — цена в Санкт-Петербурге, сдать кровь на анализ в СЗЦДМ

Вирус Эпштейна-Барр (далее — ВЭБ), официально — Human gammaherpesvirus 4, — один из 8 известных науке типов герпесвирусов и, с высокой вероятностью, самый распространённый вирус человека.

Например, в США у более 90 % взрослых и 50 % детей есть признаки инфицирования ВЭБ. Американские врачи считают, что оставшиеся 10 % взрослых просто не обследованы. В России медики определяют уровень инфицированности взрослого населения 97 %.

Медики предполагают, что всё взрослое население земли заражено вирусом, потому что передаётся он чрезвычайно просто — со слюной (при поцелуе, пользовании общей посудой, чихании, когда вы делитесь пищей, которую уже откусили) и генитальным секретом, а сохраняется в организме до конца жизни. Выявлены случаи передачи вируса с кровью при её переливании и бытовом попадании «кровь в кровь».

Особый случай — инфицирование при пересадке органов. В связи с распространением трансплантаций подобные инфекции встречаются всё чаще и вызывают нетипичные осложнения и заболевания после трансплантации.

У большинства людей ВЭБ «хранится» в клетках в латентной форме и активируется при благоприятных ему условиях — критическом снижении иммунитета, стрессе, другом заболевании и т. д. Но часто реактивация происходит без видимых причин — учёным только предстоит выявить её причины.

Опасность вируса в том, что в активной форме он становится причиной инфекционного мононуклеоза, связан с возникновением лимфомы Беркитта, гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза, лимфомы Ходжкина, рака желудка, рака носоглотки, лимфомы центральной нервной системы, синдрома Алисы в стране чудес (нарушение восприятия), острой мозжечковой атаксии (нарушение походки, движений).

По данным, полученным врачами Cincinnati Children’s Hospital Medical Center — Медицинского центра Цинцинатти (США), ВЭБ может послужить причиной развития рассеянного склероза, целиакии, системной красной волчанки, диабета I типа, ювенильного идиопатического артрита, ревматоидного артрита. Даже хроническая усталость человека связана напрямую с ним.

Перейти к анализам

Показания к проведению анализа

У большинства людей заражение вирусом происходит бессимптомно или с незначительными проявлениями, которые быстро проходят. Организм вырабатывает к вирусу стойкий иммунитет, и человек живёт с «законсервированным» в клетке вирусом всю жизнь.

Но анализ на ВЭБ часто необходим, чтобы отличить одну инфекцию от другой и назначить эффективное лечение. Вирус «маскируется» под ОРВИ, гепатит, ангину с устойчиво высокой температурой (до 10 % всех случаев ангины), при которой увеличиваются лимфоузлы. В большинстве случаев ВЭБ вызывает инфекционный мононуклеоз. Особенно реактивна инфекция у подростков и в возрасте до 5 лет, причём у мальчиков она проходит в острой форме в 2 раза чаще, чем у девочек.

Симптомы заражения при постепенном развитии:

ухудшается самочувствие;
температура повышается до субфебрильных показателей — 37,1—38,0 °C;
появляются катаральные симптомы — отёчность носа и носоглотки, заложенность, слизистая носоглотки становится красной, нёбные миндалины тоже краснеют;
лимфатические узлы — подчелюстные, на затылке, шее) отёчные, на ранней стадии — неболезненные или со слабыми болезненными ощущениями.

Симптомы заражения при остром начале болезни:

резкое повышение температуры до 38—39 °C;
лихорадка с ознобом и повышенным потоотделением;
головная боль;
боль в скелетных мышцах;
боль в горле при сглатывании;
увеличение лимфоузлов.

У заражённых увеличиваются селезёнка, печень, появляется сыпь на 3—5 день. Иногда увеличенная селезёнка разрывается.

Однако единой, характерной симптоматики не существует — признаки заражения учёные объединили в «мононуклеозоподобный синдром». Потому при любых проявлениях необходимо сдать анализы на обнаружение вируса.

Анализы на вирус Эпштейна-Барр

Направление на анализы даёт терапевт, инфекционист, врач общей практики, педиатр. Исследование проводится на различном биоматериале — сыворотке крови, мазках и соскобах слизистой ротоглотки, урогенитального тракта, слюне, цереброспинальной жидкости, лейкоцитах периферической крови.

Для выявления инфекции чаще прочего проводят серологические тесты. Однако часто требуется комплексное тестирование, потому что серологические тесты в случаях переливания крови, иммунодефицита и некоторых других противоречат друг другу. Точную клиническую картину в сложных случаях даёт ПЦР-диагностика на ДНК ВЭБ.

Вирус определяется только лабораторными способами, причём в большинстве случаев требуется несколько тестов, чтобы исключить прочие инфекционные заболевания.

Общий анализ крови на вирус Эпштейна-Барр

Общий анализ крови не позволяет установить точно ВЭБ. Определение лейкоцитоза, лимфоцитоза, атипичных мононуклеаров свидетельствует лишь о наличии инфекционного заболевания, но не даёт его идентифицировать. Однако, если определено отсутствие лейкоцитоза, то можно с уверенностью говорить, что инфекционного мононуклеоза нет. Другими признаками против диагноза ВЭБ являются анемия и тромбоцитопения.

Если общий анализ крови вызывает подозрения на ВЭБ, проводят дополнительные исследования.

Биохимический анализ

В биохимическом анализе при инфицировании ВЭБ наблюдают:

повышение АЛТ, или аланинаминотрансферазы, — фермента печени, почек, поджелудочной железы;
повышение АСТ, или аспартатаминотрансферазы, — фермент преимущественно клеток сердца и печени;
повышение ЩФ, или щелочной фосфатазы;
повышение билирубина — главного компонента желчи;
понижение нейтрофилов;
понижение тромбоцитов.

Изменение биохимических показателей печени характерны для 90 % инфицированных.

Гетерофильный тест

Гетерофильный тест, или реакция Пауля и Буннеля, основана на определении в сыворотке крови противобараньих агглютининов. Тест выявляет гетерофильные антитела, и при титре 1:224 ставится диагноз мононуклеоза.

Гетерофильный тест даёт положительный результат у 60 % инфицированных спустя 2 недели после обнаружения симптомов и у 90 % инфицированных спустя месяц после первых клинических проявлений. Потому точность его невелика, а на начальной стадии он не помогает определить ВЭБ, т. к. титр гетерофильных тел повышается и в ответе на другую вирусную инфекцию.

Чувствительность теста у детей составляет менее 70 %, а способность идентифицировать вирус — менее 20 %. С возрастом пациентов польза теста и его чувствительность/специфичность увеличиваются.

Серологические исследования

Жизнедеятельность ВЭБ в организме (завершённый и незавершённый литический (активный) цикл, латентная фаза) происходит на фоне выработки специфических антител к белкам вируса. Исследование антител позволяет определить и дифференцировать острую форму, перенесённую инфекцию и хроническую инфекцию вирусом.

На ранних стадиях (3—4 недели после заражения и до 3—4 месяцев после) определяются иммуноглобулины IgG к ранним антигенам EA — их считают маркерами острой стадии инфекции, хотя нередко они выявляются и при хроническом инфицировании.

Иммуноглобулины IgG к VCA — капсидному белку — определяются в момент проявления болезни и считаются маркерами острого стадии болезни. Они пропадают через несколько недель. Однако есть люди, у которых VCA-IgM не определяются, потому всегда необходимо комплексное тестирование.

Антиген EBNA IgG не определяется на начальной стадии заболевания, потому свидетельствует о перенесённой или хронической инфекции. Последняя отличается высоким титром антигена.

ПЦР диагностика

ПЦР-диагностика относится к высокочувствительным тестам при инфицировании ВЭБ. Для её проведения используют лейкоцитарную фракцию крови.

Если ДНК вируса выявляется в плазме крови, то ставится диагноз инфекции в активной форме. ДНК вируса выявляется даже в период латентной фазы у людей, признанных клинически здоровыми — 0,1–1 копий/106 клеток. Хроническая и острая стадия выявляются количественной ПЦР.

Если вирусная нагрузка высока, она может ассоциироваться с большим риском тяжёлых осложнений и требует антивирусной терапии. ДНК в ликворе говорит, что вирус активно размножается в нервной системе — эту ПЦР-диагностику ВЭБ проводят, когда выявляют этиологию поражения нервной системы.

ПЦР проводят при выявлении опухолей, тяжёлых осложнений. В этом случае ДНК вируса обнаруживают в лимфоузлах, слизистой кишечника, биоптатах печени. ПЦР необходимо и при заболеваниях, возникших после трансплантации органов.

Однако отрицательный результат ПЦР-диагностики не исключает репликации вируса в лимфоузлах, костном мозге, дерме, желудке и кишечнике. Потому ПЦР рекомендовано использовать всегда в сочетании с серологическими методами диагностики ВЭБ.

Профилактика и рекомендации

Не заразиться ВЭБ в современном мире почти невозможно. Для этого пришлось бы исключить всякие контакты с людьми, причём с рождения, никого не целовать, не вступать в сексуальные отношения.

Как ни парадоксально, но лучше, если заражение случится в детском возрасте, потому что дети легче переносят инфекцию (как, к примеру, и ветряную оспу, вызванную также герпесвирусом, только 3 типа), у них вырабатывается стойкий иммунитет.

Инфицирование в детстве характерно для стран с низким уровнем жизни, в подростковом и взрослом — с высоким уровнем жизни. Играет роль санитарная культура, общая культура людей. Но она же приводит и к более серьёзным последствиям инфекции, потому что иммунный ответ человека, живущего в благоприятных условиях, намного слабее.

Только иммунитет способен защитить нас от вируса Эпштейна-Барр. Попав в организм, он сохраняется в нас до конца жизни в латентной фазе. Снижение иммунитета, вызванное заболеваниями, образом жизни, ведёт к реактивации ВЭБ и непредсказуемым последствиям — учёным пока удалось только выявить ассоциированные с вирусом заболевания (о чём мы говорили вначале), но не установить закономерность их развития.

Инфекции против ВЭБ также не существует. Обезопасить себя можно хотя бы от повторного заражения, не целуясь, не пользуясь чужой посудой, едой, зубными щётками и другими личными вещами.

При появлении каких-либо симптомов заболевания следует обратиться к врачу или самостоятельно прийти в лабораторию, чтобы сдать анализы на выявление ВЭБ.

Если заражение обнаружено (острая фаза), то нужно отказаться от выхода на работу, посещения общественных мест, потому что вы становитесь распространителем инфекции, обеспечить себе покой, обильное питьё, хорошо питаться. При возникновении тяжёлых симптомов следует немедленно обратиться к врачу — будет назначено симптоматическое лечение, поддерживающая терапия.

В обычной жизни хорошей профилактикой станет укрепление иммунитета — спорт, здоровый образ жизни, отказ от ежедневного применения дезинфицирующих средств, например — спиртовых гелей, антибактериального мыла и подобных. Ваш иммунитет должен ежедневно испытывать напряжение, чтобы «оставаться в форме», а иммунный ответ был высоким.

Стоимость тестирование на вирус Эпштейна—Барр в АО «СЗДЦМ»

В АО «СЗДЦМ» вы сможете пройти все тесты на определение ВЭБ по низкой цене. Так как диагностика в большинстве случаев требует комплексного тестирования, исследования в медицинских центрах и лабораторных терминалах АО «СЗДЦМ» не станет финансово обременительным для вас — стоимость услуги в наших медучреждениях доступна для всех категорий населения.

Наши врачи-специалисты назначат вам только необходимые анализы, которые позволят поставить точный диагноз. Первое исследование и общий анализ крови можно сделать и без назначения врача, но последующие (если будут подозрения) мы рекомендуем делать только по назначению, чтобы не проводить бесполезных в вашем случае тестов.

Где сдать анализы на вирус Эпштейн—Барр

Сдать любые анализы на ВЭБ вы можете в наших медицинских центрах и лабораторных терминалах. Выбрать ближайшее к вам медучреждение можно по карте, таблице или выпадающему меню.

Рядом с названием медучреждения вы увидите точный адрес, часы работы, а по карте легко составить маршрут для посещения лаборатории на общественном транспорте или личном автомобиле.

Анализы на ДНК вируса Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus) (кровь), цены в лаборатории KDL

Вирус Эпштейна-Барр – вирус герпеса IV типа, известен как основной возбудитель инфекционного мононуклеоза. Классические проявления: высокая температура (до 39 – 40 градусов), увеличение лимфатических узлов, боли в горле, ангина, увеличение печени и селезенки — встречаются нечасто. В большинстве случаев протекает по типу ОРВИ и остаётся незамеченным при заражении. Как и все герпетические инфекции, вирус Эптшейна – Барр отличается высокой заразностью, сохраняется в организме человека пожизненно в спящем состоянии и активируется при снижении иммунитета. Его наличие связывают с развитием лимфопролиферативных заболеваний (лимфомы, назофарингеальная карцинома).

Выявление ДНК вируса Эпштейна-Барр – прямой метод диагностики, выполняется методом ПЦР. Появление вируса в крови характерно для острого периода заболевания, но иногда он может циркулировать в период активации хронической инфекции.

В каких случаях обычно назначают исследование на определение ДНК вируса Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus) в крови?

Признаки инфекционного мононуклеоза:

— увеличение лимфатических узлов в сочетании с ангиной

— увеличение печени и селезенки (гепатоспленомегалия)

— ОРВИ с лихорадкой до 40^о

— появление в клиническом анализе крови реактивных лимфоцитов и/или атипичных мононуклеаров

Обследование новорожденных с подозрением на инфекцию, вызванную вирусом Эпштейна-Барр, т.к. нет достаточной выработки антител вследствие незрелости иммунной системы.
Для дифференциальной диагностики герпетической инфекции

Что означают результаты теста?

Референсные значения: не обнаружено

Результат – обнаружено

Выявление ДНК вируса Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus) свидетельствует о наличии возбудителя. Вирус может выявляться у клинически здоровых лиц. Результаты исследования оцениваются лечащим врачом в комплексе с клиническими проявлениями и другими лабораторными данными.

Сроки выполнения теста.

1-2 дня.

Как подготовиться к анализу?

Без специальной подготовки. Можно сдавать кровь через 3 часа после необильного приёма пищи.

Анализы в KDL. ДНК вируса Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus), количественно

Выберите требуемый вид биоматериала

Соскобы из урогенитального тракта не берутся в течение суток после местной терапии (свечи, мази, спринцевания), после полового контакта и во время менструации у женщин. После кольпоскопии, интравагинального УЗИ должно пройти 48 часов. В случае наличия признаков острого воспаления необходимость взятия мазка определяется лечащим врачом. Если необходимо получить соскоб из уретры, то перед взятием материала нужно не мочиться 1,5 — 2 часа. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на исследование методом ПЦР возможно не ранее, чем через 28 дней после окончания приема антибиотиков, на микробиологические исследования не ранее,чем через 14 дней.

Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.

Мокроту можно собрать только при наличии кашля! Перед сбором мокроты рекомендуется почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой. Избегать попадания в мокроту слюны и носовой слизи. Мокрота по мере откашливания собирается в стерильный контейнер. Кашель можно вызвать с помощью нескольких глубоких вдохов.

Первая порция утренней мочи собирается после тщательного туалета наружных половых органов. Перед исследованием не применять местно антибактериальное мыло и антисептические средства.

Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.

Накануне исследования не применять местные лекарственные препараты и процедуры, исключить половой акт. При взятии соскоба из уретры не мочиться в течение 1,5-2 часов до процедуры. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на исследование методом ПЦР возможно не ранее, чем через 28 дней после окончания приема антибиотиков, на микробиологические исследования не ранее,чем через 14 дней.

Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.

Материал рекомендуется собирать до местного применения антибиотиков или антисептиков, до еды, (или не менее чем через 2 часа после еды), можно утром натощак (воду пить и чистить зубы можно).

Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.

Пациент собирает материал самостоятельно путем мастурбации в стерильный контейнер.

Смешанный соскоб урогенитального тракта не берется на фоне местной терапии (свечи, мази, спринцевания) и во время менструации у женщин. После кольпоскопии, интравагинального УЗИ или полового контакта должно пройти 48 часов. Если есть необходимость взятия материала из уретры, то перед взятием материала нужно не мочиться 1,5 — 2 часа. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на исследование возможно через 14-21 день после окончания приема антибиотиков.

Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.

Накануне взятия материала не применять местные антибиотики и антисептики в виде спреев, полоскания, капель, мазей. Материал берется натощак или не ранее, чем через 2 часа после еды. Чистить зубы (пастой без антибактериальных компонентов) можно.

Материал для исследования можно взять утром натощак или в течение дня, не ранее чем через 2 часа после еды. Чистить зубы и пить воду можно. Накануне взятия материала не применять местно антибиотики или антисептики в виде полосканий, капель или спреев. Повторное исследование для контроля излеченности целесообразно не ранее, чем через 4 недели.

Материал берется до начала терапии. Накануне не использовать антисептики, в течение двух часов исключить любые местные процедуры (промывания, капли). В случае невозможности взятия материала в медицинском офисе, Вы можете получить бесплатно расходный материал и обратиться к Вашему врачу- офтальмологу.

Сдать анализ: Эпштейнa-Барр вирус (EBV), плазма крови, слюна (методом ПЦР)

Описание анализа:

Вирус Эпштейна-Барр (плазма крови, слюна) методом ПЦР – исследование, определяющее, есть ли в крови пациента генетический материал вируса герпеса человека 4-го типа, называемого также вирусом Эпштейна-Барр и являющегося возбудителем инфекционного мононуклеоза. Этот микроорганизм из семейства герпесвирусов очень широко распространен: по некоторым данным, вирус поражает порядка 90% людей.

Вирус чаще всего попадает в организм воздушно-капельным путем (с частичками слюны зараженного человека), после чего начинается инкубационный период (4-6 недель). Из-за распространенности вируса заражение происходит еще в детстве и болезнь зачастую проходит в бессимптомной форме либо же со смазанными симптомами, не позволяющими её распознать. Если же симптомы проявляются, значит развивается инфекционный мононуклеоз, для которого характерны: повышение температуры, боль в горле, ангина, увеличение лимфоузлов, миндалин, селезенки и печени.

Инфекционный мононуклеоз может осложняться воспалением легких, анемиями, поражениями печени (гепатиты), сердца (миокардит) и нервной системы (энцефалит, менингит).

Симптомы могут наблюдаться до двух недель, после чего вирус переходит в скрытую форму, при которой он сохраняется в клетках крови – В-лимфоцитах. Реактивация латентного вируса герпеса 4-го типа в результате ослабления иммунитета способствует развитию рака носоглотки, болезни Ходжкина, лимфомы Беркитта и В-клеточной лимфомы. В редких случаях развивается хроническая инфекция, при которой симптомы могут сохраняться более полугода.

Исследование методом полимеразной цепной реакции нацелено на поиск самого вируса, а не антител к нему, и позволяет достоверно установить факт его наличия в организме.

Показания к назначению анализа

Результаты теста могут быть полезны инфекционистам, терапевтам, педиатрам, ЛОРам, неврологам и гематологом. Поводом для назначения анализа могут выступать:

проявления инфекционного мононуклеоза;
поиск причин ангины или хронического тонзиллита;
дифференциальная диагностика болезней, вызванных герпесвирусами;
подавление иммунитета после пересадки органов;
наличие вируса иммунодефицита человека.

Интерпретация результатов

Исследование качественное и предусматривает определение факта инфицирования пациента. Если результат анализа положителен, значит пациент заражен вирусом Эпштейна-Барр и является вирусоносителем. Отрицательный результат значит, что пациент здоров либо же концентрация вируса в крови слишком низка.

Подготовка к обследованию: не требуется.

Материал для исследования: плазма венозной крови, слюна.

Метод исследования: полимеразная цепная реакция – ПЦР.

Срок готовности: 2 рабочих дня.

Запись на анализы

ПЦР. Вирус Эпштейна-Барр (ДНК VEB) (качественный)

Срок выполнения, дней: 1

Код исследования: Р14

Вирус Эпштейна- Барр, вызывает инфекционный мононуклеоз, лимфому Беркитта и саркому Капоши у больных СПИДом.

Патогенез инфекционного мононуклеоза характеризуется репликацией вируса в верхних дыхательных путях и региональных лимфоузлах. Возбудитель индуцирует появление популяции реактивных Т-клеток (атипичные лимфоциты), поликлональную активацию В-клеток и их дифференцировку в плазмоциты. При этом геном вируса может сохраняться в В-лимфоцитах. Подобная латентная инфекция встречается у многих людей.

Единственным источником инфекции является человек. Вирус передается воздушно-капельным, реже трансмиссивным, либо половым путем.

Подготовка пациента: Общие правила подготовки к сдаче анализов.

Материал: Соскоб эпителиальных клеток,осадок мочи, слюна, спинномозговая жидкость.

Стабильность пробы: В течение 2-х недель при t 6-8ºC.

Метод: ПЦР качественный анализ.

Анализатор: RotorGene.

Тест – система: АмплиСенс.

Референсные значения (норма): Не обнаружено.

Основные показания к назначению анализа:
1. При наличии признаков инфекции, ассоциированной с вирусом Эпштейна-Барр, к которым относятся боли в горле, повышение температуры тела, снижение работоспособности, немотивированная слабость, увеличение разных групп лимфатических узлов;
2. Женщины на этапе планирования беременности.

Интерпретация результатов:

Положительный результат:
1. Обнаружено.

Отрицательный результат:
1. Не обнаружено.

Вирус Эпштейна-Барра (EBV) в крови, в слюне

Вирус Эпштейна-Барра (EBV) в крови, в слюне — исследование, позволяющее выявить в крови ДНК возбудителя инфекционного мононуклеоза – вируса Эпштейна – Барр методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразная цепная реакция отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Методом ПЦР можно определить ДНК вируса качественно или количественно. Благодаря качественному методу подтверждается присутствие возбудителя в организме и его активное размножение. Вирус Эпштейна – Барр – это широко распространённый вирус семейства Herpesviridae, который размножается преимущественно в B-лимфоцитах, но также может инфицировать Т-лимфоциты и эпителиальные клетки. Путь передачи – воздушно-капельный. Пик заболеваемости – 15-25 лет. Первый контакт с вирусом Эпштейна – Барр происходит, как правило, в детском возрасте (до 10 лет), что вызывает развитие латентной бессимптомной или малосимптомной инфекции. Инфицирование у взрослых людей приводит к инфекционному мононуклеозу, который у большинства заболевших сопровождается лихорадкой, интоксикацией, а также поражением лимфоузлов (лимфоаденопатией), нёбных и глоточных миндалин. Вирус Эпштейна – Барр инфицирует свыше 90 % здоровой популяции и сохраняется в небольших количествах в В-клетках памяти. Соответственно, около 90 % взрослых людей являются вирусоносителями. Вирус сохраняется в В-лимфоцитах и клетках эпителия на протяжении всей жизни и при снижении иммунитета (например, при ВИЧ-инфекции или иммуносупрессивной терапии) может способствовать развитию лимфопролиферативных заболеваний, назофарингеальной карциномы или – наиболее часто – инфекционного мононуклеоза. С вирусом Эпштейна — Барр связывают также этиологию некоторых онкологических, преимущественно лимфопролиферативных заболеваний. Имеются данные о том, что этот вирус может быть причиной так называемого «синдрома хронической усталости». Подтверждением течения острых стадий инфекции может служить выявление ДНК вируса Эпштейна – Барр в крови и/или слюне методом ПЦР. Определение ДНК вируса особенно полезно для выявления данной инфекции у новорожденных, когда серологические исследования мало информативны вследствие незрелости иммунной системы, а также в сложных и сомнительных случаях.

Подготовка к исследованию

Биоматериал кровь : Специальной подготовки не требуется.

Биоматериал слюна: в день исследования не чистить зубы.

Показания к исследованию

Для диагностики инфекционного мононуклеоза.
Для дифференциальной диагностики герпетических инфекций.
Для дифференциальной диагностики при ангинах и тонзиллитах.
Для выявления реактивации вируса Эпштейна – Барр при трансплантации органов и тканей.
При клинических (гепатоспленомегалия, тонзиллофарингит, припухлость околочелюстных и шейных лимфатических узлов) и лабораторных (атипичные лимфоциты в периферической крови) признаках инфекционного мононуклеоза на ранних этапах заболевания (до нарастания титра антител).
При ВИЧ-инфекции.
При проведении иммуносупрессивной терапии после трансплантации органов или костного мозга.

Интерпретация

Референсные значения: отрицательно.
Причины положительного результата — инфицирование вирусом Эпштейна – Барр или вирусоносительство; реактивация инфекции, вызванной вирусом Эпштейна – Барр.
Причины отрицательного результата — отсутствие инфекции, вызванной вирусом Эпштейна – Барр;
низкое содержание вируса Эпштейна – Барр в крови.

На результаты могут влиять

Предшествующая противовирусная терапия.
Загрязнение пробы посторонними молекулами ДНК может приводить к ложноположительному результату.

Назначается в комплексе c

Epstein Barr Virus капсидный белок (VCA), IgM
Epstein Barr Virus капсидный белок (VCA), IgG
Epstein Barr Virus ядерный антиген (EBNA), IgG
Epstein Barr Virus, ДНК, ПЦР в мононуклеарах

ПЦР на вирус Эпштейна-Барра в реальном времени для диагностики первичных инфекций EBV и реактивации EBV

Задний план: Серологический диагноз первичных инфекций вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ) часто затруднен, в то время как актуальность повышенных антител иммуноглобулина G (IgG) против раннего антигена (ЕА) для диагностики реактивации ВЭБ становится все более спорной.Недавно в качестве диагностического инструмента была добавлена ПЦР ВЭБ. Положительный результат ПЦР на ВЭБ был продемонстрирован в сыворотке крови пациентов с первичной инфекцией ВЭБ и реактивацией ВЭБ.

Цели: Сравнить классический серологический диагноз первичной инфекции EBV и реактивации EBV с ПЦР EBV в реальном времени.

Дизайн исследования: Сыворотки 45 пациентов были отобраны с обнаруживаемыми антителами иммуноглобулина М (IgM) против вирусного капсидного антигена (VCA) EBV, и 62 сыворотки были отобраны с профилем реактивации.ПЦР EBV в реальном времени была проведена с ДНК, выделенной из этих сывороток.

Результаты: На основании серологических данных диагноз первичной ВЭБ-инфекции был установлен у 24 из 45 IgM-VCA-положительных пациентов. При проведении ПЦР было диагностировано семь дополнительных случаев первичной инфекции, у которых не удалось обнаружить гетерофильных антител. В пяти случаях первичной инфекции ДНК ВЭБ не была обнаружена с помощью ПЦР.Только в двух из 62 сывороток с реактивационным серопрофилем можно было обнаружить ДНК ВЭБ.

Выводы: Основываясь на этих данных, мы предполагаем, что для диагностики первичных инфекций ПЦР ВЭБ может привести к увеличению более чем на 16% числа положительных диагнозов за счет подтверждения положительного IgM VCA в отсутствие гетерофильных антител. Более того, ПЦР на EBV дает положительный результат только в 3% сывороток с повышенным уровнем антител против EA, что вызывает сомнения относительно применимости титров EA для диагностики реактивации EBV.

Количественный анализ вирусной нагрузки Эпштейна-Барра с помощью ПЦР в реальном времени

J Clin Microbiol. 1999 Jan; 37 (1): 132–136.

Хироши Кимура

Кафедра педиатрии медицинского факультета Нагойского университета, ¹ Лаборатория вирусной онкологии Научно-исследовательского института онкологического центра Айти, ² и отделение гематологии / онкологии Детского медицинского центра, Японский Красный Крест Нагоя Первый Госпиталь, ³ Нагоя, Япония

Макото Морита

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии, Научно-исследовательский институт, Онкологический центр Айти, ² и Отделение гематологии / онкологии, Детское Медицинский центр, Первая больница Японского Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

Юми Ябута

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии Научно-исследовательского института Онкологического центра Айти, ² и отделение гематологии / онкологии, Детский медицинский центр, Первая больница Японского Красного Креста в Нагое, 9 0029 3 Нагоя, Япония

Киётака Кузусима

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии, Научно-исследовательский институт, Онкологический центр Айти, ² и отделение гематологии / онкологии Детского медицинского центра , Первая больница Японского Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

Кодзи Като

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии, Исследовательский институт Онкологического центра Айти, ² и отделение отделения гематологии / онкологии, Детский медицинский центр, Первая больница Японского Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

Сэйдзи Кодзима

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Нагойского университета, ¹ Лаборатория вирусной онкологии, Исследовательский институт, Аити Онкологический центр, ² и отделение гематологии / онкологии, Детский медицинский центр, Японский Красный C Росс Нагоя Первая больница, ³ Нагоя, Япония

Такахару Мацуяма

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии Научно-исследовательского института Онкологического центра Айти, ² и отделение гематологии / Онкология, Детский медицинский центр, Первая больница Японского Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

Цунео Моришима

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии, Исследовательский институт Онкологического центра Айти, ² и отделение гематологии / онкологии, Детский медицинский центр, Первая больница японского Красного Креста, Нагоя, ³ Нагоя, Япония

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии, Научно-исследовательский институт, Онкологический центр Айти, ² и отделение гематологии / онкологии, Детский медицинский центр, Джапа Первая больница Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

^* Автор, ответственный за переписку.Почтовый адрес: Департамент педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, 65 Tsuruma-cho, Showa-ku, Nagoya 466-8550, Япония. Телефон: 81-52-744-2303. Факс: 81-52-744-2974. Электронная почта: pj.ca.u-ayogan.dem@arumikh.

Поступило 2 июля 1998 г .; Изменения запрошены 20 августа 1998 г .; Принято 13 октября 1998 г.

Abstract

Чтобы измерить вирусную нагрузку у пациентов с симптоматической инфекцией вируса Эпштейна-Барра (EBV), мы использовали анализ ПЦР в реальном времени для количественного определения количества ДНК EBV в крови.Анализ ПЦР в реальном времени может обнаружить от 2 до более 10 ⁷ копий ДНК EBV с широким линейным диапазоном. Мы оценили вирусную нагрузку в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMNC) у пациентов с симптоматической инфекцией EBV. Среднее число копий ДНК EBV в PBMNC составляло 10 ^3,7 копий / мкг ДНК у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями, связанными с EBV, 10 ^4,1 копий / мкг ДНК у пациентов с хроническими активными инфекциями EBV и 10 ^2,2 копий / мкг ДНК у пациентов с инфекционным мононуклеозом.Эти числа были значительно больше, чем у пациентов, перенесших трансплантацию, или у пациентов с иммунокомпетентной контрольной группой без заболеваний, связанных с ВЭБ. У пациента с инфекционным мононуклеозом вирусная нагрузка уменьшалась по мере исчезновения симптомов. Число копий ДНК EBV в PBMNC от симптоматических EBV-инфекций коррелировало с числом EBV-положительных клеток, определенным с помощью анализа гибридизации in situ ( r = 0,842; P <0,0001). Эти результаты показывают, что анализ ПЦР в реальном времени полезен для диагностики симптоматической инфекции EBV и для мониторинга вирусной нагрузки.

Вирус Эпштейна-Барра (EBV) является возбудителем инфекционного мононуклеоза (IM) и злокачественных новообразований, связанных с EBV, таких как лимфома Беркитта и карцинома носоглотки. Во время первичной инфекции ВЭБ инфицирует и иммортализирует В-лимфоциты, которые размножаются в периферической крови и лимфатических узлах. После появления EBV-специфического иммунитета количество EBV-инфицированных B-клеток регулируется в основном цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) и остается на уровне от 1 до 10 ⁵ B-лимфоцитов (25).У ограниченного числа людей иммунитет хозяина неспособен регулировать EBV-инфицированные клетки, и возникает хроническая активная EBV-инфекция (CAEBV) (13, 24, 31). У хозяев с ослабленным иммунитетом, таких как пациенты со СПИДом или реципиенты трансплантата, EBV-инфицированные клетки снова пролиферируют и вызывают оппортунистическую B-клеточную лимфому, лимфопролиферативное заболевание (LPD) (6, 22).

Для диагностики CAEBV и LPD важно измерить нагрузку EBV либо в образце биопсии, либо в периферической крови (19, 23, 24, 27, 33).Биопсия — инвазивный и трудоемкий процесс, поэтому было разработано несколько методов определения вирусной нагрузки в периферической крови для ранней диагностики LPD и CAEBV. Спонтанный рост EBV-инфицированных B-клеток in vitro (27, 30), гибридизация in situ (ISH) с использованием зонда с малой РНК, кодируемой EBV (EBER) (18), и количественные ПЦР-анализы теперь используются для определения нагрузки EBV в периферических тканях. мононуклеарные клетки крови (PBMNC) (2, 26, 27, 29). Ранее мы сообщали, что количественная ПЦР была полезна для диагностики и мониторинга ВЭБ-инфекций (37).Однако количественный анализ ПЦР требует для завершения не менее 3 дней, поскольку анализ включает стадии гель-электрофореза и гибридизации по Саузерну. Более того, линейный диапазон количественной ПЦР слишком узок для измерения множества образцов, потому что в образцах с большим количеством шаблона количество амплифицированного продукта выходит на плато после логарифмической фазы реакции (34).

Недавно была разработана новая количественная ПЦР в реальном времени (7, 36). Этот метод измеряет накопление продуктов ПЦР с помощью флуорогенного зонда и путем лазерного сканирования в режиме реального времени в 96-луночном планшете.Поскольку этот анализ не требует обработки после пробы, возможны гораздо более быстрые анализы. Анализ имеет очень большой динамический диапазон определения целевой молекулы, поскольку измерение продукта ПЦР в реальном времени позволяет нам количественно определять амплифицированные продукты в логарифмической фазе реакции (7). В этом исследовании метод ПЦР в реальном времени применялся для измерения ДНК ВЭБ в периферической крови. Мы измерили вирусную нагрузку у пациентов с симптоматической инфекцией ВЭБ и сравнили ее с нагрузкой у пациентов без симптомов, связанных с инфекцией ВЭБ.ПЦР в реальном времени также сравнивали с ISH и традиционными качественными анализами ПЦР.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты и образцы.

Восемнадцать пациентов с симптомами EBV-инфекции были включены в это исследование (четыре с CAEBV, пять с LPD и девять с IM). Возраст этих пациентов от 1 до 19 лет (средний возраст 6,5 лет). CAEBV диагностировали в соответствии с ранее опубликованными рекомендациями (19, 24). Клинические особенности некоторых из этих случаев описаны в других источниках (10, 13, 15, 17).Всем пациентам с LPD, кроме 2-летнего мальчика с врожденным иммунодефицитом, была проведена трансплантация печени. LPD подозревался у пациентов с лимфаденопатией, легочной инфильтрацией, кровотечением из желудочно-кишечного тракта или необъяснимой дисфункцией аллотрансплантата. Диагноз LPD был установлен на основании патологии или обнаружения EBER с помощью теста ISH (18, 33). ИМ был диагностирован на основании клинических данных и серологических исследований следующим образом: положительный на антивирусный капсидный антиген (VCA), иммуноглобулин G (IgG) и / или IgM и отрицательный на антитело против ядерного антигена EB (EBNA).В качестве контрольной группы 10 пациентов, перенесших трансплантацию печени или костного мозга, были проспективно обследованы на наличие ВЭБ-инфекций. Этим пациентам было от 1 до 17 лет (средний возраст 5,8 лет), и у них не было симптомов, характерных для LPD. Либо реципиент, либо донор были серопозитивными на ВЭБ. Кроме того, 13 иммунокомпетентных пациентов (от 2 до 16 лет; средний возраст 6,7 лет), у которых изначально предполагалось наличие первичной инфекции EBV, были включены в контрольную группу. Эти пациенты были положительными как на антитела против VCA IgG, так и на EBNA, что указывает на то, что они ранее были инфицированы EBV.

У пациентов брали кровь, обработанную гепарином или ЭДТА, и разделяли PBMNC и плазму с помощью Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.). Для анализа ПЦР ДНК экстрагировали из PBMNC и фракции плазмы с использованием набора для крови QIAamp (QIAGEN Inc., Чатсуорт, Калифорния) и хранили при -20 ° C до использования.

Количественная ПЦР в реальном времени с флуорогенным зондом.

Праймеры для ПЦР для этого анализа были выбраны в гене BALF5, кодирующем вирусную ДНК-полимеразу (1).Последовательности праймеров выше и ниже были 5′-CGGAAGCCCTCTGGACTTC-3 ‘и 5′-CCCTGTTTATCCGATGGAATG-3′ соответственно. Флуорогенный зонд (5’-TGTACACGCACGAGAAATGCGCC-3 ‘) с последовательностью, расположенной между праймерами ПЦР, был синтезирован PE Applied Biosystems (Фостер-Сити, Калифорния). Реакцию ПЦР проводили с использованием набора TaqMan PCR (PE Applied Biosystems), как описано ранее (14). Вкратце, либо 250 нг ДНК из PBMNC, либо экстракционный раствор из 50 мкл плазмы добавляли к смеси для ПЦР, содержащей 10 мМ Трис (pH 8.3), 50 мМ KCl, 10 мМ ЭДТА, 5 мМ MgCl ₂, 100 мкМ dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 0,2 мкМ каждого праймера, 0,1 мкМ флуорогенного зонда и 1,25 ед. AmpliTaq Gold (PE Applied Biosystems) . После активации AmpliTaq Gold в течение 10 минут при 95 ° C с помощью детектора последовательности модели 7700 (PE Applied Biosystems) было выполнено от 45 до 50 циклов по 15 секунд при 95 ° C и 1 мин при 62 ° C. Были проведены измерения флуоресценции в реальном времени, и значение порогового цикла (C _T) для каждого образца было рассчитано путем определения точки, в которой флуоресценция превышала пороговый предел (10-кратное стандартное отклонение от базовой линии) (7).Для положительного контроля плазмида, содержащая ген BALF5, была сконструирована из вектора pGEM-T (Promega, Мэдисон, Висконсин) и названа pGEM-BALF5. Был построен стандартный график значений C _T, полученных для серийно разведенных pGEM-BALF5. Значения C _T из клинических образцов наносили на стандартную кривую, а количество копий рассчитывали автоматически с помощью Sequence Detector версии 1.6 (PE Applied Biosystems), программного пакета для анализа данных. Каждый образец был протестирован в двух экземплярах, и среднее из двух значений было показано как количество копий образца.Образцы считались отрицательными, если значения C _T превышали 50 циклов.

Качественный ПЦР-анализ.

Качественный анализ ПЦР с использованием вложенных праймеров был выполнен с небольшими модификациями ранее описанного метода (37). Вкратце, внешние праймеры, которые были сконструированы в области Bam HI W гена EBV (положения с 1544 по 1568 для 5′-праймера и с 1653 по 1677 для 3′-праймера), были использованы для первого раунда ПЦР. (12). Тот же объем раствора для экстракции ДНК, который использовался для анализа ПЦР в реальном времени, был добавлен к 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис (pH 8.3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl ₂, 100 мкМ dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 0,2 мкМ каждого праймера и 1,25 ед. Полимеразы Taq (TaKaRa, Ohtsu, Япония). Амплификации проводили в течение 30 циклов с помощью термоциклера для ПЦР (TaKaRa). После первой амплификации 2 мкл амплифицированных продуктов использовали для второй амплификации, которая состояла из 30 циклов с использованием внутренних праймеров (положения с 1572 по 1591 для 5′-праймера и с 1642 по 1661 для 3′-праймера) (12) . Амплифицированные продукты разделяли на 1.2% агарозный гель, окрашенный бромистым этидием и визуализированный УФ-светом. Качественный анализ ПЦР может выявить две копии контрольной плазмиды, содержащей фрагмент Bam HIW. Поскольку фрагмент расположен во внутренних повторах и один геном EBV содержит 10 или более фрагментов Bam HI (12), качественная ПЦР была более чувствительной, чем анализ ПЦР в реальном времени. С другой стороны, область не была выбрана для количественных анализов в реальном времени, поскольку количество повторов варьировало среди штаммов EBV.

Анализ ISH для обнаружения EBER.

Анализ ISH проводили с использованием зонда EBER, как описано ранее (9). Для анализа ISH 10 ⁵ отделенных PBMNC наносили на предметные стекла, покрытые силаном, и сушили. Каждое слайд гибридизовали с меченным щелочной фосфатазой зондом EBER, промывали и вводили в реакцию с 5-бром-4-хлор-3-индилфосфатом для визуализации. Положительные клетки подсчитывали и выражали как количество клеток на 10 ⁵ PBMNC.

Статистический анализ.

Для анализа данных использовали программный пакет Statview J 4.02 (Abacus Concepts Inc., Беркли, Калифорния). Тест Стьюдента t использовали для сравнения среднего числа копий ДНК EBV в каждой группе. Коэффициент корреляции Пирсона использовался для сравнения анализов ПЦР в реальном времени и ISH.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Создание ПЦР-анализа в реальном времени для количественного определения EBV-ДНК.

Последовательно разведенный pGEM-BALF5 тестировали с помощью ПЦР в реальном времени, и строили стандартную кривую значений C _T, полученных с использованием положительного контроля.Был установлен широкий линейный диапазон (от 10 копий до 10 ⁷ копий контрольной плазмиды) (рис. А). Система могла обнаружить минимум две копии плазмиды (данные не показаны).

(A) Стандартная кривая для ПЦР в реальном времени. Серийно разведенную плазмиду pGEM-BALF5 амплифицировали с растворами для экстракции ДНК из крови или без них и анализировали в реальном времени с помощью детектора последовательности модели 7700. Значения C _T наносили на график в зависимости от количества копий для построения стандартной кривой.Пояснения к символам: нет, плазмида со вставкой EBV; PBMNC, PBMNC от EBV-серонегативного пациента плюс плазмида со вставкой EBV; плазма, плазма от EBV-отрицательного пациента плюс плазмида со вставкой EBV. (B) Влияние гепарина на количественное определение плазмидной ДНК. Серийно разведенные контрольные плазмиды амплифицировали с различными растворами для экстракции ДНК или без них и анализировали с использованием детектора последовательности модели 7700. Пояснения к символам: нет, плазмида со вставкой EBV; сыворотка, сыворотка серонегативного пациента по EBV плюс плазмида со вставкой EBV; сыворотка + EDTA, сыворотка и EDTA плюс плазмида со вставкой EBV; сыворотка + гепарин, сыворотка и гепарин плюс плазмида со вставкой EBV.

Для подтверждения специфичности праймеров и зонда, EBV-отрицательная клеточная линия лимфомы, другие вирусы герпеса человека (вирус простого герпеса типа 1 и 2, цитомегаловирус, вирус ветряной оспы и вирус герпеса человека 8) и PBMNC из EBV -серонегативные пациенты были протестированы с помощью этой системы. Все были отрицательными на ДНК ВЭБ. Затем мы исследовали EBV-положительную линию клеток мартышки (B95-8), две линии клеток лимфомы Беркитта (Raji и Daudi) и четыре линии лимфобластоидных клеток. Все клеточные линии были положительными на ДНК EBV по результатам анализа ПЦР в реальном времени.По стандартной кривой расчетное количество геномов ДНК ВЭБ варьировалось от 5,2 до 31 на клетку в этих клеточных линиях, что приблизительно равно ранее сообщенным значениям (25).

Обнаружение ингибитора в гепаринизированной крови.

Гепарин ингибирует ПЦР (3, 16). Поскольку некоторые из наших образцов представляли собой гепаринизированную кровь, мы провели исследования по реконструкции, чтобы подтвердить удаление ингибитора из этих образцов с помощью набора для экстракции ДНК. Гепаринизированную кровь брали у пациента, который был серонегативен по ВЭБ, и разделяли PBMNC и плазму.Раствор для экстракции ДНК из фракции PBMNC или плазмы добавляли к серийно разведенным контрольным плазмидам. Раствор для экстракции ДНК из PBMNC не ингибировал ПЦР. Однако раствор из плазмы ингибировал реакцию, и выход амплифицированных продуктов снизился примерно в 1-100 раз (рис. A). Например, значение C _T, равное 10 ⁵ копий плазмиды во фракции плазмы, приблизительно равнялось значению 10 ⁷ копий одной плазмиды.Чтобы подтвердить, что остаточный гепарин в плазме был ингибитором, растворы для экстракции ДНК из сыворотки, сыворотки с ЭДТА и сыворотки с гепарином были исследованы в исследовании реконструкции. EDTA или гепарин добавляли к сыворотке, свободной от EBV, в стандартных концентрациях, используемых для антикоагуляции (конечные концентрации, 3 мМ и 25 Ед / мл, соответственно). Набор для экстракции ДНК использовали в попытке удалить эти антикоагулянты, и каждый раствор для экстракции смешивали с контрольной плазмидой. Только образец сыворотки плюс гепарин ингибировал реакцию ПЦР (рис.Б). Эти результаты показывают, что гепарин является ингибитором и не может быть удален из плазмы. Результаты также показывают, что количественный анализ ПЦР в реальном времени полезен для определения присутствия ингибиторов.

Количественное определение ДНК ВЭБ у пациентов с симптоматической инфекцией ВЭБ.

Затем мы оценили вирусную нагрузку в крови пациентов с симптоматической инфекцией ВЭБ с помощью ПЦР в реальном времени. Поскольку реконструктивное исследование показало, что плазма из гепаринизированной крови непригодна для количественного определения, а кровь большинства пациентов с симптоматической инфекцией ВЭБ была взята с гепарином, для анализа использовались PBMNC.Среднее количество геномов ДНК EBV в PBMNC составляло 10 ^3,7 копий / мкг ДНК у пациентов с LPD, 10 ^4,1 копий / мкг ДНК у пациентов с CAEBV и 10 ^2,2 копий / мкг ДНК в пациенты с ИМ (рис.). Эти числа были значительно больше, чем у пациентов после трансплантации без заболеваний, связанных с EBV (10 ^1,3 копий / мкг ДНК; P <0,0001 для LPD и CAEBV, P = 0,02 для IM) или у иммунокомпетентных и EBV- серопозитивные контроли (10 ^1.2 копий / мкг ДНК; P <0,0001 для LPD и CAEBV, P = 0,004 для IM).

Количественное определение ДНК ВЭБ с помощью ПЦР в реальном времени. ДНК была извлечена из PBMNC, полученного от пациентов с симптоматической инфекцией EBV или контрольных пациентов без заболеваний, связанных с EBV. Двести пятьдесят нанограммов ДНК использовали для анализа ПЦР в реальном времени, и показано количество копий ДНК EBV на микрограмм ДНК. Для некоторых пациентов были протестированы несколько образцов, поскольку требовались повторные оценки.Столбцы показывают средние значения и стандартные отклонения для каждой группы. Пунктирная линия показывает предел обнаружения анализа.

Последовательные образцы от 19-летней женщины с ИМ были получены и протестированы с использованием анализа ПЦР в реальном времени. Поскольку кровь пациента бралась с ЭДТА, которая не влияла на реакцию, для анализа использовали как PBMNC, так и плазму. По мере исчезновения симптомов вирусная нагрузка снижалась (рис.).

Изменение вирусной нагрузки у пациента с ИМ. Были получены последовательные образцы от пациента с IM, и PBMNC и плазма были проанализированы с помощью анализа ПЦР в реальном времени.Количество копий ДНК EBV указано на микрограмм ДНК. Количество копий ДНК EBV указано на миллилитр плазмы. Пунктирная линия показывает предел обнаружения для каждого образца.

Специфичность анализа ПЦР в реальном времени.

Мы предположили, что 10 ^2,5 копий на мкг ДНК PBMNC было достаточно для диагностики симптоматических инфекций EBV, потому что у всех пациентов с LPD и CAEBV было больше копий генома ДНК EBV, чем это число (рис.). Для оценки диагностической эффективности анализа ПЦР в реальном времени использовалось всего 60 образцов.Когда 10 ^2,5 копий на мкг ДНК PBMNC использовалось в качестве критерия для диагностики симптоматических инфекций EBV, анализ ПЦР в реальном времени был высокоспецифичным (как специфичность, так и прогностическая ценность положительного результата составляли 93%, как показано в таблице). Затем этот новый количественный метод сравнивали с качественным методом с использованием традиционной ПЦР. Образцы крови, протестированные с помощью анализа ПЦР в реальном времени, также оценивали с помощью качественного анализа ПЦР с использованием фракции PBMNC, фракции плазмы или того и другого. Качественный анализ ПЦР с использованием PBMNC был очень чувствительным, но его специфичность была низкой, поскольку анализ был настолько чувствительным, что латентный EBV в PBMNC был обнаружен у лиц без заболеваний, связанных с EBV (таблица).С другой стороны, когда для качественного анализа ПЦР использовали плазму, анализ был специфическим и таким же диагностическим, как анализ ПЦР в реальном времени (как специфичность, так и прогностическая ценность положительного результата составляли 92%, как показано в таблице). Этот результат согласуется с нашими предыдущими выводами (37).

ТАБЛИЦА 1

Проведение анализа ПЦР в реальном времени для диагностики симптоматических инфекций ВЭБ и сравнения с качественным анализом ПЦР

Тип анализа	No.образцов ^a	Чувствительность (%)	Специфичность (%)	Положительная PV ^b (%)	Отрицательная PV ^b (%)
ПЦР в реальном времени ^c	60	85	93	93	83
Качественный ПЦР
PBMNC	51 ^d	100	57		54 ^d	82	92	92	83

Чтобы продемонстрировать точность анализа ПЦР в реальном времени, мы сравнили его с другим количественным методом, анализом ISH.PBMNC от пациентов с симптоматической инфекцией ВЭБ использовались как для ПЦР в реальном времени, так и для анализов ISH. Количество копий ДНК EBV, измеренное с помощью анализа ПЦР в реальном времени, сильно коррелировало с количеством EBV-положительных клеток с помощью анализа ISH ( r = 0,842; P <0,0001 [Рис.]). Взятые вместе со сравнением с качественным анализом ПЦР, эти результаты показали, что анализ ПЦР в реальном времени был достаточно чувствительным и специфическим методом для диагностики симптоматических инфекций ВЭБ и для мониторинга вирусной нагрузки.

Корреляция результатов ПЦР в реальном времени и гибридизации in situ. PBMNC были получены от пациентов с симптоматическими заболеваниями EBV, и 20 образцов были проанализированы с использованием как ПЦР в реальном времени, так и анализов ISH. Были нанесены на график числа копий ДНК EBV, измеренные с помощью анализа ПЦР в реальном времени, и числа EBV-положительных клеток, измеренные с помощью анализа ISH, и рассчитан коэффициент корреляции ( r ).

ОБСУЖДЕНИЕ

Лазерное сканирование в реальном времени в сочетании с флуорогенным зондом — это новый метод, который позволяет нам быстро и точно количественно определять большое количество амплифицированных продуктов (7, 35).Используя эту систему, можно проанализировать более 40 образцов за 2–3 часа, даже если они тестируются в двух экземплярах. Мы показали, что эта система применима для количественного определения нагрузки ВЭБ у пациентов с симптоматической инфекцией ВЭБ. Этот метод обнаружил ингибиторы ПЦР и оценил эффективность методов экстракции, оба из которых особенно важны для точного и воспроизводимого количественного определения нагрузки EBV. Кроме того, эта система устраняет меры предосторожности, которые необходимо соблюдать с амплифицированными продуктами, чтобы избежать загрязнения, поскольку методика выполняется в полностью закрытых лунках.Это большое улучшение по сравнению с обычными ПЦР-анализами, которые имеют значительный риск переходящего загрязнения. Благодаря своей скорости, точности и способности обрабатывать множество образцов, анализ ПЦР в реальном времени должен заменить используемые в настоящее время количественные методы ПЦР.

Было показано, что гепарин является фактором ингибирования ПЦР (3, 16). Используя анализ ПЦР в реальном времени, мы показали, что гепарин не удалялся из плазмы с помощью стандартных методов экстракции ДНК и что выход амплифицированных продуктов снизился от 1 до 100 раз.Гепарин не ингибировал ПЦР при использовании PBMNC в качестве матриц, вероятно, потому, что любой гепарин вымывался из PBMNC во время разделения с помощью Ficoll-Paque. В этом исследовании мы использовали фракции PBMNC для большей части количественного анализа из-за отсутствия ингибирования. Поскольку EBV остается латентным в лимфоцитах, фракция PBMNC обычно используется для оценки вирусной нагрузки в периферической крови. При первичных или хронических активных инфекциях бесклеточный вирус продуцируется и высвобождается из клеток в литических циклах (25).Мы и другие ранее сообщали, что присутствие ДНК ВЭБ в плазме является диагностическим признаком первичной инфекции ВЭБ (4, 37), что было подтверждено в настоящем исследовании. Поскольку сыворотку и плазму получить легко, они могут быть лучшими источниками для количественной оценки вирусной нагрузки. Можно использовать сыворотку и плазму, обработанную ЭДТА, поскольку они не ингибируют ПЦР. Если доступна только гепаринизированная кровь, сообщается, что гепариназа полезна для удаления гепарина из раствора для экстракции ДНК (16, 21).

Поскольку даже у здоровых людей латентный ВЭБ содержится в крови, наличие геномов ВЭБ не всегда указывает на активную инфекцию ВЭБ или связанное с ВЭБ заболевание. Для диагностики заболеваний, связанных с ВЭБ, необходимо определить значительную вирусную нагрузку. Когда мы использовали 10 ^2,5 копий / мкг ДНК PBMNC в качестве критерия, анализ ПЦР в реальном времени был достаточно специфичным, чтобы диагностировать симптоматические инфекции EBV. У всех пациентов с LPD и CAEBV было более 10 ^2,5 копий / мкг ДНК (рис.). Напротив, у 2 из 14 (14%) пациентов, перенесших трансплантацию, без этих проявлений заболевания уровень ДНК был выше 10 ^2,5 копий / мкг (рис.). Насколько нам известно, только две статьи определили значительную вирусную нагрузку при симптоматических инфекциях EBV, и в обеих заявлено, что 500 копий / 10 ⁵ клеток достаточно для диагностики LPD (26, 29). В этом исследовании мы количественно определили количество ДНК, экстрагированной из PBMNC, и использовали фиксированное количество ДНК в анализе ПЦР в реальном времени (250 нг).Использование заданного объема раствора для экстракции ДНК из фиксированного количества PBMNC проще, но может вызвать смещение, вызванное различиями в эффективности экстракции для каждого образца. Если 10 ⁵ лимфоцитов продуцируют 0,5 мкг ДНК, как указано в руководстве производителя (QIAamp Blood Kit; QIAGEN), то 500 копий / 10 ⁵ PBMNC равны 10 ^3,0 копий / мкг ДНК, что немного больше, чем наш критерий 10 ^2,5 копий / мкг ДНК. Соответственно считаем 10 ^2.5 копий / мкг ДНК — подходящий уровень отсечения для отличия связанного с EBV LPD или CAEBV от латентных EBV-инфекций или бессимптомной реактивации вируса. У некоторых пациентов с ИМ было меньше копий ДНК ВЭБ, чем 10 ^2,5 копий / мкг ДНК. У пациентов с IM может быть меньше вирусной нагрузки в периферической крови по сравнению с пациентами с CAEBV или LPD. Следовательно, использование вышеуказанного критерия для диагностики ИМ может быть неуместным. Другая возможная причина того, что у IM-пациентов было меньше копий ДНК ВЭБ, может заключаться в том, что некоторые из этих образцов хранились более 5 лет.

У пациентов, перенесших трансплантацию костного мозга или солидных органов, LPD является острым, опасным для жизни заболеванием. Его диагностика иногда затруднена, и болезнь часто быстро прогрессирует (5, 11). LPD обычно устойчив как к химиотерапии, так и к противовирусным препаратам (32). Однако в недавних статьях сообщается, что инфузии донорских лейкоцитов или ВЭБ-специфичных CTL полезны для лечения LPD (8, 20, 28). Руни и др. подчеркивают важность раннего или упреждающего введения ВЭБ-специфичных ЦТЛ при лечении ДПН (27).Мы считаем, что анализ ПЦР в реальном времени является полезным методом для быстрой диагностики LPD и для мониторинга вирусной нагрузки для оценки эффективности лечения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баер Р., Банкир А. Т., Биггин М. Д. и др. Последовательность ДНК и экспрессия генома вируса Эпштейна-Барра B95-8. Природа. 1984; 310: 207–211. [PubMed] [Google Scholar] 2. Бай X, Хослер Г., Роджерс Б. Б., Доусон Д. Б., Шойерманн Р. Х. Количественная полимеразная цепная реакция для диагностики вируса герпеса человека и измерения нагрузки вируса Эпштейна-Барра при посттрансплантационном лимфопролиферативном расстройстве.Clin Chem. 1997; 43: 1843–1849. [PubMed] [Google Scholar] 3. Beutler E, Gelbart T, Kuhl W. Вмешательство гепарина в полимеразную цепную реакцию. Биотехнологии. 1990; 9: 2–3. [PubMed] [Google Scholar] 4. Ган И. Дж., Салливан Дж. Л., Сиксби Дж. В. Обнаружение внеклеточной ДНК вируса Эпштейна-Барра в сыворотке во время острого инфекционного мононуклеоза. J Infect Dis. 1994; 170: 436–439. [PubMed] [Google Scholar] 5. Гратама Дж. В. Эпштейн-Барр. Вирусные инфекции у реципиентов трансплантации костного мозга. В: Форман С. Дж., Блюм К. Г., Томас Д. Д., редакторы.Трансплантация костного мозга. Бостон, Массачусетс: Научные публикации Блэквелла; 1994. С. 429–442. [Google Scholar] 6. Hanto DW, Frizzera G, Gajl-Peczalska KJ, Sakamoto K, Purtilo DT, Balfour H, Jr, Simmons RL, Najarian JS. Эпштейна-Барр-индуцированная В-клеточная лимфома после трансплантации почки: терапия ацикловиром и переход от поликлональной к пролиферация моноклональных В-клеток. N Engl J Med. 1982; 306: 913–918. [PubMed] [Google Scholar] 7. Хайд К. А., Стивенс Дж., Ливак К. Дж., Уильямс П. М. Количественная ПЦР в реальном времени.Genome Res. 1996; 6: 986–994. [PubMed] [Google Scholar] 8. Heslop H E, Ng C Y, Li C, Smith C. A, Loftin S. K, Krance R. A, Brenner M K, Rooney C. M. Долгосрочное восстановление иммунитета против инфекции вируса Эпштейна-Барра путем адоптивного переноса генетически модифицированных вирус-специфичных Т-лимфоцитов. Nat Med. 1996; 2: 551–555. [PubMed] [Google Scholar] 9. Хиронака Т., Нагасаки М., Морикава С., Хираи К. Обнаружение транскриптов вируса Эпштейна-Барра в химически или иммунологически активированных клетках и в нулевой клеточной линии (HLN-STL-C) путем гибридизации in situ с олигонуклеотидом, связанным с щелочной фосфатазой зонды.J Virol Methods. 1993; 44: 141–154. [PubMed] [Google Scholar] 10. Имаи С., Сугиура М., Оикава О. и др. Линии Т-клеток, несущие и экспрессирующие вирус Эпштейна-Барра (EBV), созданные в результате тяжелой хронической активной инфекции EBV. Кровь. 1996; 87: 1446–1457. [PubMed] [Google Scholar] 11. Имашуку С., Гото Т., Мацумура Т., Ная М., Ямори М., Ходжо М., Хиби С., Тодо С. Неудачная трансфузия CTL в случае пост-BMT-вируса Эпштейна-Барра лимфопролиферативного расстройства (EBV-LPD) Трансплантация костного мозга . 1997. 20: 337–340.[PubMed] [Google Scholar] 13. Кимура Х., Цуге И., Имаи С., Ямамото М., Кузусима К., Осато Т., Моришима Т. Презентация интактного антигена для ЦТЛ, специфичных к вирусу Эпштейна-Барра (ВЭБ), линией лимфобластоидных клеток, полученной от пациента с тяжелой хронической активной инфекцией ВЭБ . Med Microbiol Immunol. 1995. 184: 63–68. [PubMed] [Google Scholar] 14. Kimura H, Wang Y, Pesnicak L, Cohen J I, Hooks J J, Straus S. E, Williams R.K. Рекомбинантные гликопротеины E и I вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая: иммунологические ответы и клиренс вируса в модели хронического увеита у морских свинок.J Infect Dis. 1998. 178: 310–317. [PubMed] [Google Scholar] 15. Кузушима К., Ямамото М., Кимура Х., Андо Ю., Кудо Т., Цуге И., Моришима Т. Установление клеточного иммунитета против вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ) путем адаптивного переноса вирус-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов от HLA-совместимого брата или сестры пациенту с тяжелой хронической активной инфекцией ВЭБ. Clin Exp Immunol. 1996. 103: 192–198. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Лин Х. Дж., Танванде Т., Холлингер Ф. Б. Улучшенные методы количественной оценки РНК вируса иммунодефицита человека 1 типа и РНК вируса гепатита С в крови с использованием технологии спин-колонки и хемилюминесцентных анализов продуктов ПЦР.J Med Virol. 1997; 51: 56–63. [PubMed] [Google Scholar] 17. Морита М., Цуге И., Мацуока Х., Ито Ю., Итосу Т., Ямамото М., Моришима Т. Кальцификация базальных ганглиев с хронической активной инфекцией вируса Эпштейна-Барра. Неврология. 1998. 40: 1485–1488. [PubMed] [Google Scholar] 18. Накадзава Ю., Чисува Х., Икегами Т., Хашикура Ю., Мацунами Х., Итикава Т., О-иши Т., Кавасаки С. Эффективность количественного анализа лимфоцитов периферической крови, инфицированных вирусом Эпштейна-Барра, путем гибридизации EBER1 in situ после родственных живых организмов. трансплантация печени: история болезни.Трансплантация. 1997; 63: 1363–1366. [PubMed] [Google Scholar] 19. Окано М., Мацумото С., Осато Т., Сакияма Ю., Тиле Г. М., Пуртило Д. Т. Тяжелый хронический активный синдром инфекции вируса Эпштейна-Барра. Clin Microbiol Rev.1991; 4: 129–135. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20. Пападопулос Э. Б., Ладаньи М., Эмануэль Д. и др. Инфузии донорских лейкоцитов для лечения лимфопролиферативных заболеваний, связанных с вирусом Эпштейна-Барра, после аллогенной трансплантации костного мозга. N Engl J Med. 1994; 330: 1185–1191.[PubMed] [Google Scholar] 21. Пардо И. Ю., Михалак Т. И. Обнаружение вирусной ДНК гепатита В и гепатита сурков в плазме и мононуклеарных клетках гепаринизированной крови с помощью полимеразной цепной реакции. J Virol Methods. 1995; 51: 277–288. [PubMed] [Google Scholar] 22. Purtilo D T, Strobach R S, Okano M, Davis J R. Лимфопролиферативные заболевания, связанные с вирусом Эпштейна-Барра. Lab Investig. 1992; 67: 5–23. [PubMed] [Google Scholar] 23. Рандхава П.С., Джаффе Р., Деметрис А.Дж., Налесник М., Старзл Т.Е., Чен Ю.И., Вайс Л.М.Экспрессия кодируемой вирусом Эпштейна-Барра малой РНК (геном EBER-1) в образцах печени реципиентов с посттрансплантационным лимфопролиферативным заболеванием. N Engl J Med. 1992; 327: 1710–1714. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Рикинсон А. Б. Хроническая симптоматическая инфекция вируса Эпштейна-Барра. Иммунол сегодня. 1986; 7: 13–14. [PubMed] [Google Scholar] 25. Рикинсон А. Б., Кифф Э. Вирус Эпштейна-Барра. В: Филдс Б. Н., Книп Д. М., Хоули П. М., редакторы. Вирусология. Филадельфия, Пенсильвания: издательство Lippincott-Raven Publishers; 1996 г.С. 2397–2446. [Google Scholar] 26. Риддлер С.А., Брейниг М.С., Макнайт Дж. Л. Повышенные уровни циркулирующих лимфоцитов, инфицированных вирусом Эпштейна-Барра (ВЭБ), и снижение ответов антител к ядерному антигену ВЭБ связаны с развитием посттрансплантационного лимфопролиферативного заболевания у реципиентов трансплантата твердых органов. Кровь. 1994; 84: 972–984. [PubMed] [Google Scholar] 27. Руни С. М., Лофтин С. К., Холладей М. С., Бреннер М. К., Кранс Р. А., Хеслоп Х. Э. Раннее выявление посттрансплантационного лимфопролиферативного заболевания, связанного с вирусом Эпштейна-Барра.Br J Haematol. 1995. 89: 98–103. [PubMed] [Google Scholar] 28. Руни С. М., Смит С. А., Нг С. Й., Лофтин С., Ли С., Кранс Р. А., Бреннер М. К., Хеслоп Н. Е. Использование генетически модифицированных вирус-специфичных Т-лимфоцитов для контроля лимфопролиферации, связанной с вирусом Эпштейна-Барра. Ланцет. 1995; 345: 9–13. [PubMed] [Google Scholar] 29. Роу Д. Т., Ку Л., Рейес Дж., Джаббур Н., Юнис Э., Патнэм П., Тодо С., Грин С. Использование количественной конкурентной ПЦР для измерения нагрузки генома вируса Эпштейна-Барра в периферической крови педиатрических пациентов после трансплантации с лимфопролиферативными расстройствами.J Clin Microbiol. 1997; 35: 1612–1615. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30. Savoie A, Perpete C, Carpentier L, Joncas J, Alfieri C. Прямая корреляция между нагрузкой лимфоцитов, инфицированных вирусом Эпштейна-Барра, в периферической крови педиатрических пациентов после трансплантации и риском лимфопролиферативного заболевания. Кровь. 1994; 83: 2715–2722. [PubMed] [Google Scholar] 31. Страус С. Э. Синдром хронического мононуклеоза. J Infect Dis. 1988. 157: 405–412. [PubMed] [Google Scholar] 32. Страус С. Э., Коэн Дж. И., Тосато Дж., Мейер Дж.Конференция NIH. Инфекции вируса Эпштейна-Барра: биология, патогенез и лечение. Ann Intern Med. 1993. 118: 45–58. [PubMed] [Google Scholar] 33. Swerdlow S H. Посттрансплантационные лимфопролиферативные расстройства: морфологический, фенотипический и генотипический спектр заболеваний. Гистопатология. 1992; 20: 373–385. [PubMed] [Google Scholar] 34. Ван А. М., Марк Д. Ф. Количественная ПЦР. В: Иннис М.А., Гельфанд Д. Х., Снинский Дж. Дж., Уайт Т. Дж., Редакторы. Протоколы ПЦР. Сан-Диего, Калифорния: Academic Press, Inc .; 1990. С. 70–75.[Google Scholar] 35. Уильямс П. М., Уильямс С. Дж., Швер С., Кришнарао А. С., Хейд С., Каргер Б. Л., Уильямс П. М. Количественная ПЦР в реальном времени. Количественная конкурентная полимеразная цепная реакция: анализ амплифицированных продуктов гена gag ВИЧ-1 с помощью капиллярного электрофореза с детектированием лазерно-индуцированной флуоресценции. Genome Res. 1996. 6: 146–152. [PubMed] [Google Scholar] 36. Уильямс С.Дж., Швер С., Кришнарао А.С., Хейд С., Каргер Б.Л., Уильямс П.М. Количественная конкурентная полимеразная цепная реакция: анализ амплифицированных продуктов гена gag ВИЧ-1 с помощью капиллярного электрофореза с обнаружением лазерно-индуцированной флуоресценции.Анальная биохимия. 1996; 236: 146–152. [PubMed] [Google Scholar] 37. Ямамото М., Кимура Х., Хиронака Т., Хираи К., Хасегава С., Кузусима К., Шибата М., Моришима Т. Обнаружение и количественная оценка вирусной ДНК в плазме пациентов с заболеваниями, связанными с вирусом Эпштейна-Барра. J Clin Microbiol. 1995; 33: 1765–1768. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Количественный анализ вирусной нагрузки Эпштейна-Барра с помощью анализа ПЦР в реальном времени

J Clin Microbiol. 1999 Jan; 37 (1): 132–136.

Хироши Кимура

Макото Морита

Юми Ябута

Киётака Кузусима

Кодзи Като

Сэйдзи Кодзима

Такахару Мацуяма

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии Научно-исследовательского института Онкологического центра Айти, ² и отделение гематологии / Онкология, Детский медицинский центр, Первая больница Японского Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

Цунео Моришима

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии, Научно-исследовательский институт, Онкологический центр Айти, ² и отделение гематологии / онкологии, Детский медицинский центр, Джапа Первая больница Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

Поступило 2 июля 1998 г .; Изменения запрошены 20 августа 1998 г .; Принято 13 октября 1998 г.

Abstract

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты и образцы.

Количественная ПЦР в реальном времени с флуорогенным зондом.

Качественный ПЦР-анализ.

Анализ ISH для обнаружения EBER.

Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Создание ПЦР-анализа в реальном времени для количественного определения EBV-ДНК.

Обнаружение ингибитора в гепаринизированной крови.

Количественное определение ДНК ВЭБ у пациентов с симптоматической инфекцией ВЭБ.

Специфичность анализа ПЦР в реальном времени.

ТАБЛИЦА 1

Тип анализа	No.образцов ^a	Чувствительность (%)	Специфичность (%)	Положительная PV ^b (%)	Отрицательная PV ^b (%)
ПЦР в реальном времени ^c	60	85	93	93	83
Качественный ПЦР
PBMNC	51 ^d	100	57		54 ^d	82	92	92	83

ОБСУЖДЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Количественный анализ вирусной нагрузки Эпштейна-Барра с помощью анализа ПЦР в реальном времени

J Clin Microbiol. 1999 Jan; 37 (1): 132–136.

Хироши Кимура

Макото Морита

Юми Ябута

Киётака Кузусима

Кодзи Като

Сэйдзи Кодзима

Такахару Мацуяма

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии Научно-исследовательского института Онкологического центра Айти, ² и отделение гематологии / Онкология, Детский медицинский центр, Первая больница Японского Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

Цунео Моришима

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии, Научно-исследовательский институт, Онкологический центр Айти, ² и отделение гематологии / онкологии, Детский медицинский центр, Джапа Первая больница Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

Поступило 2 июля 1998 г .; Изменения запрошены 20 августа 1998 г .; Принято 13 октября 1998 г.

Abstract

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты и образцы.

Количественная ПЦР в реальном времени с флуорогенным зондом.

Качественный ПЦР-анализ.

Анализ ISH для обнаружения EBER.

Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Создание ПЦР-анализа в реальном времени для количественного определения EBV-ДНК.

Обнаружение ингибитора в гепаринизированной крови.

Количественное определение ДНК ВЭБ у пациентов с симптоматической инфекцией ВЭБ.

Специфичность анализа ПЦР в реальном времени.

ТАБЛИЦА 1

Тип анализа	No.образцов ^a	Чувствительность (%)	Специфичность (%)	Положительная PV ^b (%)	Отрицательная PV ^b (%)
ПЦР в реальном времени ^c	60	85	93	93	83
Качественный ПЦР
PBMNC	51 ^d	100	57		54 ^d	82	92	92	83

ОБСУЖДЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Количественный анализ вирусной нагрузки Эпштейна-Барра с помощью анализа ПЦР в реальном времени

J Clin Microbiol. 1999 Jan; 37 (1): 132–136.

Хироши Кимура

Макото Морита

Юми Ябута

Киётака Кузусима

Кодзи Като

Сэйдзи Кодзима

Такахару Мацуяма

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии Научно-исследовательского института Онкологического центра Айти, ² и отделение гематологии / Онкология, Детский медицинский центр, Первая больница Японского Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

Цунео Моришима

Кафедра педиатрии, Медицинский факультет Университета Нагоя, ¹ Лаборатория вирусной онкологии, Научно-исследовательский институт, Онкологический центр Айти, ² и отделение гематологии / онкологии, Детский медицинский центр, Джапа Первая больница Красного Креста в Нагое, ³ Нагоя, Япония

Поступило 2 июля 1998 г .; Изменения запрошены 20 августа 1998 г .; Принято 13 октября 1998 г.

Abstract

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты и образцы.

Количественная ПЦР в реальном времени с флуорогенным зондом.

Качественный ПЦР-анализ.

Анализ ISH для обнаружения EBER.

Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Создание ПЦР-анализа в реальном времени для количественного определения EBV-ДНК.

Обнаружение ингибитора в гепаринизированной крови.

Количественное определение ДНК ВЭБ у пациентов с симптоматической инфекцией ВЭБ.

Специфичность анализа ПЦР в реальном времени.

ТАБЛИЦА 1

Тип анализа	No.образцов ^a	Чувствительность (%)	Специфичность (%)	Положительная PV ^b (%)	Отрицательная PV ^b (%)
ПЦР в реальном времени ^c	60	85	93	93	83
Качественный ПЦР
PBMNC	51 ^d	100	57		54 ^d	82	92	92	83

ОБСУЖДЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Вирус Эпштейна-Барра (EBV) Количественная ПЦР

Количественная ПЦР на вирус Эпштейна-Барра (EBV)

Средний сбор:

Розовая верхняя пробирка 6 мл (K2-EDTA)

Минимум:

6 мл цельной крови или 3 мл плазмы. Тестирование требуется специальная трубка для сбора. Пробирка для образца должна остаются бесплодными. Молекулярное тестирование ВЭБ не может быть добавлено к ранее открытая пробирка Vacutainer ^®.

Turn Around Время:

Пакетный тест проводится во вторник и пятницу

Эталонный диапазон:

отрицательный

Пояснительные данные:

Аналитический диапазон значений log10:
2,7 — 8,48 МЕ / мл (500-300000000 МЕ / мл не логарифмически преобразованный значения)

Положительные результаты менее 500 МЕ / мл будут представлены как «POS

». Анализ откалиброван в соответствии с международным стандартом ВОЗ.

Комментарии:

Этот тест используется только в качестве вспомогательного средства для мониторинга ВЭБ-вируса. болезнь.

Не подходит для диагностики мононуклеоза; заказать серологическое исследование Epstein-Barr Viral Ab Panel (LAB4584) вместо.

Образцы, хранящиеся при 4 ° C, принимаются до 72 часов после коллекция. Если> 72 часов, центрифугируйте и заморозьте плазму.

Рабочие характеристики этого теста были определены Лаборатория микробиологии и молекулярной патологии Университета Айовы.Он не был одобрен или одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Администрация (FDA). FDA определило, что такое разрешение или одобрение не требуется. Этот тест предназначен для клинических целей. Это не следует рассматривать как исследовательский или исследовательский. В лаборатория сертифицирована в рамках усовершенствования клинической лаборатории Поправки 1988 г. (CLIA) как квалифицированные для выполнения высокой сложности клинические лабораторные исследования.

Методология:

ПЦР-амплификация

Инструкции:

 Обработка образцов:
Центрифуга в течение 20 минут при 1600 x g в течение 4 часов после сбора.С соблюдением правил асептики введите пробирку и аликвотируйте плазму в стерильные пробирки.
Хранить при 2-8 ° C в течение 72 часов или от -20 до -80 ° C в течение длительного времени.

Инструкции по транспортировке:
Поместите пакеты с охлаждающей жидкостью в контейнер из пенополистирола.
Положите заявку во внешний карман сумки.
Защищают образец, завернув его в пузырчатую пленку или полотенце.
Порекомендуйте экспресс-почту или эквивалент, если не пользуетесь курьерской службой.

Выявление и типирование вируса Эпштейна-Барра (EBV) с помощью ПЦР: вклад в диагностический скрининг EBV-положительной лимфомы Беркитта | Диагностическая патология

Rickinson AB, Kieff EN: вирус Эпштейна-Барра. Области вирусологии. Отредактировано: Knipe DM, Howley PM. 2001, Филадельфия, Липпинкотт-Рэйвен, 2575–2627.

Google Scholar

Küppers R: В-клетки под воздействием: Трансформация В-клеток вирусом Эпштейна-Барра. Nature Rev Immunol. 2003, 3: 801-811. 10.1038 / nri1201.

Артикул Google Scholar

Тирни Р.Дж., Стивен Н., Янг Л.С., Рикинсон А.Б.: Латентность вируса Эпштейна-Барра в мононуклеарных клетках крови: анализ транскрипции вирусного гена во время первичной инфекции и в состоянии носительства.J Virol. 1994, 68: 7374-7385.

PubMed Central CAS PubMed Google Scholar

Декер Л.Л., Кламан Л.Д., Торли-Лоусон Д.А.: Обнаружение латентной формы ДНК вируса Эпштейна-Барра в периферической крови здоровых людей. J Virol. 1996, 70: 3286-3299.

PubMed Central CAS PubMed Google Scholar

Hsu JL, Glaser SL: Злокачественные новообразования, связанные с вирусом Эпштейна-Барра: эпидемиологические закономерности и этиологические последствия.Crit Rev Oncol Hematol. 2000, 34: 27-53.

CAS Статья PubMed Google Scholar

Thompson MP, Kurzrock MP: Вирус Эпштейна-Барра и рак. Clin Cancer Res. 2004, 10: 803-821. 10.1158 / 1078-0432.CCR-0670-3.

CAS Статья PubMed Google Scholar

Янг Л.С., Рикинсон А.Б.: Вирус Эпштейна-Барра: 40 лет спустя. Природа Rev Cancer. 2004, 4: 757-768.10.1038 / nrc1452.

CAS Статья Google Scholar

Rao CR, Guttierrez M, Bhatia K, Fend F, Franklin J, Appaji L, Gallo G, O’Conor G, Lalitha N, Magrath I. Две ассоциации лимфомы Беркитта с вирусом Эпштейна-Барра. развивающиеся страны. Лимфома лейка. 2000, 39: 329-337.

CAS Статья PubMed Google Scholar

Делеклюз Х. Дж., Хаммершмидт В. Генетический подход к вирусу Эпштейна-Барра: от базовой вирусологии до генной терапии.J Clin Pathol. 2000, 53: 270-279.

CAS Google Scholar

10.

Luppi M, Barozzi P, Potenza L, Riva G, Morselli M, Torelli G: Пришло ли время обновить протоколы лечения лимфом с помощью новых антивирусных систем ?. Лейкемия. 2004, 18: 1572-1575. 10.1038 / sj.leu.2403447.

CAS Статья PubMed Google Scholar

11.

Tsuchiya S: Диагностика заболеваний, связанных с вирусом Эпштейна-Барра.Crit Rev Oncol / Hematol. 2002, 44: 227-238. 10.1016 / S1040-8428 (02) 00114-2.

Артикул Google Scholar

12.

Галли ML: Молекулярная диагностика заболеваний, связанных с вирусом Эпштейна-Барра. J Mol Diagn. 2001, 3: 1-10.

PubMed Central CAS Статья PubMed Google Scholar

13.

Ambinder RF, Mann RB: Обнаружение и характеристика вируса Эпштейна-Барра в клинических образцах.Am J Pathol. 1994, 145: 239-252.

PubMed Central CAS PubMed Google Scholar

14.

Рабочая группа МАИР по оценке канцерогенных рисков для людей: вирус Эпштейна-Барра и герпесвирус саркомы Капоши / вирус герпеса человека 8. 1997, Лион, Международное агентство по изучению рака, 47-373.

Google Scholar

15.

Харрис Н., Яффе Э.С., Стейн Х., Бэнкс П.М., Чан Дж.К.С., Клири М.Л., Дельсол Дж., Де Вольф-Питерс С., Фалини Б., Гаттер К.С., Гроган Т.М., Исааксон П.Г., Ноулз Д.М., Мейсон Д.Й. , Muller-Hermelink HK, Pileri SA, Piris MA, Ralflciaer E, Warnke RA: Пересмотренная европейско-американская классификация лимфоидных новообразований: предложение Международной исследовательской группы лимфомы.Кровь. 1994, 84: 1361-1392.

CAS PubMed Google Scholar

16.

Bacchi CE, Bacchi MM, Rabenhorst SH, Soares FA, Fonseca LE, Barbosa HS, Weiss LM, Gown AM: лимфома, связанная со СПИДом, в Бразилии. Гистопатология, иммунофенотип и связь с вирусом Эпштейна-Барра. Am J Clin Pathol. 1996, 105: 230-237.

CAS PubMed Google Scholar

17.

Эльги де Оливейра Д., Фуртадо Монтейро Т.А., Аленкар де Мело В., Амарал Ребукас Морейра М., Альваренга М., Бакки CE: Отсутствие инфекции вируса Эпштейна-Барра в карциномах шейки матки.Arch Pathol Lab Med. 1999, 123: 1098-1100.

CAS PubMed Google Scholar

18.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. 1989, Нью-Йорк, Колд-Спринг-Харбор, 14-9. 2

Google Scholar

19.

Стефанофф К.Г., Хассан Р., Гонсалес А.С., Ботельо Андраде Л.А., Табак Д., Романо С., Зальцберг И.Р.: Лабораторные стратегии для эффективного обращения с залитыми парафином тканями для молекулярного обнаружения клональности в неходжкинских лимфомах.Diagn Molec Pathol. 2003, 12: 79-87. 10.1097 / 00019606-200306000-00003.

CAS Статья Google Scholar

20.

Van Baarle D, Hovenjkamp E, Kersten MJ, Klein MR, Miedema F, van Oers MHJ: Прямое типирование вируса Эпштейна-Барра (EBV) на мононуклеарных клетках периферической крови: нет связи между инфекцией EBV типа 2 или суперинфекция и развитие неходжкинской лимфомы, связанной с синдромом приобретенного иммунодефицита. Кровь. 1999, 93: 3949-3955.

CAS PubMed Google Scholar

21.

Лоуренс Дж. Б., Вильнаве, Калифорния, Зингер Р. Х .: Чувствительное картирование хроматина и хромосом с высоким разрешением in situ: присутствие и ориентация двух тесно интегрированных копий EBV в клеточной линии лимфомы. Клетка. 1988, 52: 51-61. 10.1016 / 0092-8674 (88) -2.

CAS Статья PubMed Google Scholar

22.

Маграт I: Патогенез лимфомы Беркитта.Adv Cancer Res. 1990, 55: 133-270.

CAS Статья PubMed Google Scholar

23.

avdar AO, Gozdasoglu S, Yavuz G, Babacan E, Unal E, Uluoglu O, Yucesan S, Magrath IT, Akar N: лимфома Беркитта между африканским и американским типами у турецких детей: клиническая вирусная (EBV) и молекулярные исследования. Med Pediatr Oncol. 1993, 21: 36-42.

Артикул PubMed Google Scholar

24.

Anwar N, Kingma DW, Bloch AR, Mourad M, Raffeld M, Magrath I, El Bolkain N, Jaffe ES: Исследование вирусных последовательностей Эпштейна-Барра в 41 случае лимфомы Беркитта из Египта. Эпидемиологические соображения. Рак. 1995, 76: 1245-1252. 10.1002 / 1097-0142 (19951001) 76: 7 <1245 :: AID-CNCR2820760723> 3.0.CO; 2-D.

CAS Статья PubMed Google Scholar

25.

Араужо I, Фосс HD, Биттенкурт А., Хаммель М., Демель Дж., Мендонса Н., Хербст Н., Штейн Н.: Экспрессия продуктов гена вируса Эпштейна-Барра в лимфоме Беркитта на северо-востоке Бразилии.Кровь. 1996, 87: 5279-5286.

CAS PubMed Google Scholar

26.

Sandlund JT, Fonseca T, Leiming T, Verissimo L, Ribeiro R, Lira V, Berard CW, Sixbey J, Crist WM, Mao L, Chen G, Pui CH, Heim M, Pedrosa P: преобладание и характеристика лимфомы Беркитта среди детей с неходжкинской лимфомой в северо-восточной Бразилии. Лейкемия. 1997, 11: 743-746. 10.1038 / sj.leu.2400609.

CAS Статья PubMed Google Scholar

27.

Klumb CE, Hassan R, Elgui de Oliveira D, Magalhães De Resende LM, Carriço MK, Dobbin JA, Pombo-De-Oliveira MS, Bacchi CE, Maia RC: Географические вариации лимфомы Беркитта, ассоциированной с EBV, у детей из Бразилии. Int J Cancer. 2004, 108: 66-70. 10.1002 / ijc.11443.

Артикул PubMed Google Scholar

28.

Drut RM, Day S, Meisner L: Демонстрация вирусной ДНК Эпштейна-Барра в залитых парафином тканях лимфомы Беркитта из Аргентины с использованием полимеразной цепной реакции и гибридизации in situ.Pediatr Pathol. 1994, 14: 101-109.

CAS Статья PubMed Google Scholar

29.

Gutierrez M, Bathia K, Barriga F, Diez B, Muriel FS, de Andreas ML, Epelman S, Risueno C, Magrath IT: Молекулярная эпидемиология лимфомы Беркитта из Южной Америки: различия в расположении точек останова и эпштейновской Ассоциация вируса Барра с опухолями в других регионах мира. Кровь. 1992, 79: 3261-3266.

CAS PubMed Google Scholar

30.

Chabay P, De Matteo E, Maglio S, Grinstein S, Preciado MV: Оценка ассоциации вируса Эпштейна-Барра с детской неходжкинской лимфомой у иммунокомпетентных пациентов и пациентов с ослабленным иммунитетом в Аргентине. Arch Pathol Lab Med. 2002, 126: 331-335.

PubMed Google Scholar

31.

Stevens SJC, Vervoort MBHJ, van den Brule AJC, Meenhorst PL, Meijer CJLM, Middeldorp JM: Мониторинг ДНК-нагрузки вируса Эпштейна-Барра в периферической крови с помощью количественной конкурентной ПЦР.J Clin Microbiol. 1999, 37: 2852-2857.

PubMed Central CAS PubMed Google Scholar

32.

Карслен Ф., Калантари М., Читемерере М., Йоханссон Б., Хагмар Б. Модификации дезоксирибонуклеиновой кислоты человека и вируса путем фиксации формальдегидом. Lab Invest. 1994, 71: 604-610.

Google Scholar

33.

Hummel M, Anagnostopoulos I, Korbjuhn P, Stein H: вирус Эпштейна-Барра в B-клеточных неходжкинских лимфомах: неожиданные модели инфекции и различная частота инфицирования в низко- и высокозлокачественных типах.J Pathol. 1995, 175: 263-271. 10.1002 / путь.1711750303.

CAS Статья PubMed Google Scholar

34.

Ohshima K, Kikuchi M, Eguchi F, Masuda Y, Sumiyoshi Y, Mohtai H, Takeshita M, Kimura N: Анализ вирусных геномов Эпштейна-Барра при лимфоидных злокачественных новообразованиях с использованием Саузерн-блоттинга, полимеразной цепной реакции и in situ гибридизация. Virchows Arch B Cell Pathol. 1990, 59: 383-390.

CAS Статья Google Scholar

35.

Weiss LM, Chen YY, Liu XF, Shibata D: вирус Эпштейна-Барра и болезнь Ходжкина. Соответствующее исследование гибридизации in situ и полимеразной цепной реакции. Am J Pathol. 1991, 139: 1259-1265.

PubMed Central CAS PubMed Google Scholar

36.

D’Amore F, Johansen P, Houmand A, Weisenburger DD, Mortensen LS: Геном вируса Эпштейна-Барра в неходжкинских лимфомах, встречающихся у иммунокомпетентных пациентов: самая высокая распространенность в нелимфобластной Т-клеточной лимфоме и корреляция с Неблагоприятный прогноз.