Норма эпителий: Общий анализ мочи с микроскопией осадка (результат по полям зрения)

Эктопия шейки матки: что необходимо знать?

Определение заболевания

Эктопия шейки матки (цервикальная эрозия, цервикоз) – часто наблюдаемый дефект слизистой оболочки, при которой цилиндрический эпителий, присутствующий в норме только в шейке матки, перемещается в ее влагалищную часть.

Симптомы заболевания

Чаще всего протекает без выраженных симптомов и обнаруживается при гинекологическом обследовании случайно. Изредка причиной жалоб при цервикозе могут быть неприятные ощущения, возникающие на фоне вторичного воспаления.

В запущенных случаях признаками эктопии шейки матки могут стать выделения кровянистого характера после полового акта, а также обильные и болезненные менструации.

Причины появления заболевания

Эктопия шейки матки не классифицируется как самостоятельное заболевание. Однако она всегда является следствием патологического процесса: воспаления, механической травмы эпителия или гормонального дисбаланса.

Осложнения заболевания

У сексуально активных женщин частым осложнением эктопии шейки матки является развитие воспалительных процессов. Также, значительно увеличивается риск заражения как неспецифическими воспалительными агентами, так и болезнями, передающимися половым путем.

У беременных женщин, вследствие повышения активности циркуляции в органах малого таза, нередко наблюдается кровоточивость, сопровождающаяся незначительными болями.

После родов из-за общего снижения иммунитета, эрозированный участок эпителия часто становится воротами для инфекции, поэтому в этот период нужно соблюдать дополнительные меры предосторожности.

Однако самыми тяжелыми осложнениями цервикоза является перерождение в истинную эрозию или – гораздо реже – озлокачествление и развитие раковой опухоли.

Методы лечения заболевания

В большинстве случаев лечение эктопии шейки матки при отсутствии симптомов либо не требуется, либо заключается в назначении общей поддерживающей терапии, направленной на поддержание иммунитета.

При развитии вторичных осложнений в виде воспаления и кровоточивости проводится медикаментозная терапия с регулярным обследованием.

Если же лечение не дает должного результата, выполняют кольпоскопическое  вмешательство на пораженном участке. Такая операция в Киеве при цервикозе поможет быстро избавиться как от атипичных кожных наростов и деформаций шейки матки, так и от патологической кровоточивости.

Методы профилактики заболевания

Главным методом профилактики цервикоза является соблюдение личной интимной гигиены, своевременное выявление и лечение воспалительных процессов и регулярный осмотр у гинеколога.

Если вы хотите быть спокойной за свое здоровье, эксперты медицинского центра ilaya готовы провести полный кольпоскопический осмотр и предоставить профессиональную помощь. Приходите – и избавьтесь от проблем раз и навсегда!

Кольпоскопия | ТС Клиника — Краснодар

Кольпоскопия – простой, но информативный метод исследования в гинекологии. Его применяют для исследования состояния слизистой оболочки вульвы, влагалища и шейки матки, а также для обнаружения диспластических процессов.

Шейка матки – самая частая локализация злокачественных новообразований среди всех отделов репродуктивной системы. Рак шейки матки начинается с дисплазии эпителия, которая с течением времени прогрессирует и переходит в онкологию. Ежегодное профилактическое проведение кольпоскопии позволяет выявить очаги дисплазии и своевременно заняться лечением.

 

Виды кольпоскопии

С точки зрения терминологии, исследование включает в себя вульвоскопию, вагиноскопию и цервикоскопию (осмотр вульвы, влагалища и собственно влагалищной части шейки матки), но в клинической практике они все объединены под общим названием «кольпоскопия».

 

Разновидности исследования:

• Простая кольпоскопия – визуальный осмотр слизистых. Малоинформативный, но простой в исполнении метод.
• Расширенная кольпоскопия – исследование слизистых оболочек с применением специальных тестов. Отличается высокой диагностической ценностью для выявления патологически измененных участков.

Кольпоскопия также бывает диагностической и оперативной. Оперативная кольпоскопия предполагает одновременную визуализацию слизистой оболочки и проведение хирургического вмешательства на шейке матки или влагалище.

 

Суть методики и порядок проведения

Кольпоскоп – это оптическая система с возможностью многократного увеличения исследуемого участка и трансляцией изображения на экран монитора. Процедура проводится в гинекологическом кресле после стандартного двуручного обследования пациентки. Шейку матки и влагалище сначала осматривают кольпоскопом при малом увеличении для того, чтобы получить общую картину о состоянии слизистой оболочки. Слизь или кровь, затрудняющие осмотр, убирают салфеткой, смоченной в физиологическом растворе. Для оценки состояния сосудистого русла используют специальный зеленый фильтр – он позволяет выявить аномальные сосуды.

 

Следующим этапом исследования является обработка влагалищной части шейки матки ватными тампонами, смоченными в растворе уксусной кислоты (3-5%). Через 10-15 секунд после нанесения раствора оставшаяся слизь с легкостью удаляется. После этого на шейку матки наносят раствор Люголя (97% воды, 2% калия йодида и 1% йода), выжидают 1-2 минуты и очищают ее от остатков. Водный раствор йода позволяет окрасить эпителий и оценить его состояние по степени прокрашивания определенных участков. Зоны интереса исследуются врачом под увеличением, исследование также может дополняться забором мазков или биопсией подозрительного участка.

 

Показания и противопоказания

Метод назначается в следующих случаях:

 

• Жалобы на наличие кровянистых выделений или белей.
• Генитальный герпес и кондиломы наружных половых органов или перианальной области.
• Боли в малом тазу во время полового акта, контактная кровоточивость.
• Подозрение на злокачественный процесс в шейке матки или влагалище.
• Истинная эрозия шейки матки.
• Отклонения в онкоцитологическом мазке.
• Контрольные обследования при уже выявленных гинекологических заболеваниях.
• Оценка эффективности проведенного курса лечения.

 

Кольпоскопия обязательно проводится пациенткам с установленной ВПЧ-инфекцией высокого онкогенного риска не реже одного раза в год, даже если у женщины отсутствуют какие-либо жалобы. ВПЧ-инфекция протекает бессимптомно в 70-85% случаев, обнаруживая себя только во время обследования при подозрении на рак шейки матки. Ежегодная кольпоскопия позволяет оценить состояние эпителия и вовремя выявить видоизмененные участки.

Метод безопасен, поэтому не имеет противопоказаний к проведению. Единственное ограничение – менструальное кровотечение. Кольпоскопию также проводят беременным независимо от срока при условии ее неосложненного течения.

 

Кольпоскопическая картина: норма и патология

Перед тем, как говорить о патологических процессах шейки матки, следует иметь представление о ее нормальном строении. Она представляет собой гладкомышечный орган длиной 2-4 см, располагающийся между телом матки и влагалищем. Часть шейки, вдающаяся во влагалище, покрыта многослойным плоским эпителием. Слой плоского эпителия тонкий, беден сосудами и имеет бледно-розовую окраску. Он стыкуется в области наружного зева с цилиндрическим эпителием, выстилающим цервикальный канал. Этот эпителий имеет более яркую окраску, сосочковую структуру и легко травмируется. Слизистая цервикального канала образует множественные складки глубиной до 5 мм и активно секретирует слизь.

 

В норме стык между плоским и цилиндрическим эпителием находится в области наружного зева, но в зависимости от возраста пациентки могут быть и другие варианты: например, у некоторых женщин цилиндрический эпителий может заходить на влагалищную часть шейки матки, а у пациенток в постменопаузе соединение между двумя типами эпителия расположено в цервикальном канале. Подобное состояние расценивается как эктопия и не считается патологией.

 

Под воздействием ряда внутренних и внешних факторов естественные процессы деления и роста клеток могут нарушаться, что приводит морфологическим изменениям в эпителиальной ткани. В клинической практике выделяют предраковые состояния эпителия (дисплазия, или ее относительно новое название – цервикальная интраэпителиальная неоплазия, CIN) и рак шейки матки. Отдельно рассматривается группа острых и хронических воспалительных заболеваний, также приводящих к изменению нормальной кольпоскопической картины слизистой оболочки.

Дисплазия – это нарушение нормального клеточного строения эпителия с появлением атипичных (необычных по морфологическому строению) клеток. В зависимости от распространенности процесса, выделяют три степени дисплазии. На последней стадии поражается больше 2/3 толщины эпителиальной выстилки. Дисплазия считается предраковым заболеванием, поэтому требует постоянного наблюдения, а при необходимости – лечения. Она протекает бессимптомно, поэтому одним из самых простых методов ее обнаружения является расширенная кольпоскопия.

 

Кольпоскопическое исследование позволяет заподозрить дисплазию, благодаря последовательной обработке уксусной кислотой и йодом. После нанесения уксусной кислоты, возможно появление участков просветления эпителиальных клеток – ацетобелого эпителия. Степень выраженности ацетобелых участков – единственный критерий, позволяющий оценить выраженность дисплазии. Чем они более плотные, тем тяжелее имеющаяся неоплазия.

 

Последующая обработка йодом помогает уточнить распространенность и контуры измененного эпителия. В отличие от здоровых, атипичные клетки никогда не окрашиваются йодом и не приобретают характерный коричневый оттенок. На фоне здоровых тканей остаются бледные участки эпителия с четкими контурами. Еще один кольпоскопический признак дисплазии – появление мозаичной сетки из мелких капилляров. Внутри сетки имеются межсосудистые пространства округлой или многоугольной формы.

 

Наличие у пациентки подобной кольпоскопической картины требует проведения дополнительного обследования для исключения или подтверждения предраковых и раковых заболеваний шейки матки. Кольпоскопия является скрининговым методом исследования, поэтому дополняется онкоцитологическим мазком (ПАП-тест) и биопсией подозрительного участка с последующим гистологическим изучением.

 

Воспалительные процессы слизистой оболочки шейки матки или влагалища выглядят по-разному и во многом зависят от вида инфекционного возбудителя и формы заболевания (острая или хроническая).

В случае острого цервицита (воспаления шейки матки) слизистая оболочка резко отечна, имеет насыщенный красный цвет, легко кровоточит при заборе мазков и контакте с инструментами. Во влагалище при этом скапливаются обильные выделения различного характера. При тяжелых инфекционно-воспалительных процессах на поверхности слизистой влагалищной части шейки матки определяется гнойное отделяемое, после удаления которого становится видна отечная слизистая с множественными красными пятнами.

 

Хронические заболевания имеют иную картину. Длительно существующее воспаление сопровождается дистрофическими процессами в эпителии, нередко нарушается рельеф слизистой, появляются очаги гиперкератоза. На фоне хронической инфекционной болезни, складки слизистой цервикального канала утолщаются, становятся слегка отечными, а в просвете шейки имеется обилие слизи с отмирающими дистрофически измененными клетками эпителия.

 

Инфекции, передающиеся половым путем, могут иметь свою специфическую кольпоскопическую картину, которая позволяет предположить диагноз во время исследования. Так, в случае герпетического поражения на слизистых определяются множественные поверхностные эрозии (язвочки) с желтым ободком вокруг, возникающие после самостоятельного вскрытия пузырьков. При хламидиозе слизистая красная и отечная, а под эпителием видны небольшие пузырьки со светло-желтым содержимым. Для трихомониаза характерны обильные пенистые выделения в просвете шейки матки и влагалища, слизистая оболочка воспалена, местами имеются участки гиперплазии эпителия.

 

Папилломавирусная инфекция – основное заболевание, требующее регулярного кольпоскопического обследования и проведения онкоцитологических мазков. С вирусом папилломы человека (ВПЧ) связано развитие рака шейки матки, реже – рака влагалища и вульвы. При осмотре шейки матки у пациенток с ВПЧ-инфекцией, возможно обнаружение кондилом – эпителиальных выростов в виде розовых возвышений на слизистой с подходящими к ним капиллярами. Множественные кондиломы, сливающиеся в один очаг, при простой кольпоскопии могут напоминать предраковые заболевания шейки матки.

 

Оперативная кольпоскопия

Лечение диспластических и онкологических процессов шейки матки осуществляется под кольпоскопическим контролем, поэтому эта область применения методики рассматривается как оперативная кольпоскопия. Она сочетается со следующими методами хирургического лечения патологии шейки матки:

 

• Аргоноплазменная абляция
• Фотодинамическая терапия
• Электрорадиохирургическое иссечение
• Криотерапия
• Лазерная аблация
• Петлевая электроэксцизия и конизация

 

Кольпоскопия помогает визуализировать патологический участок под многократным увеличением, что делает применение хирургических методов лечения шейки матки более безопасным. Использование кольпоскопии позволяет провести хирургическое вмешательство с минимальной травматизацией и полностью удалить атипичный эпителий в пределах здоровых тканей.

 

Налет на языке. Норма или патология?

Налет на языке. Норма или патология?

Налет на языке – это тонкие или плотные отложения, которые частично или полностью покрывают поверхность языка и тем самым изменяют его цвет.

Из чего состоит налет:

• Слюна, эпителий, остатки пищи
• Бактерии и грибы, которые питаются компонентами из первого пункта
• Лейкоциты, которые, поедают грибы и бактерии.

Различают налет по нескольким признакам:
Толщина. Он может быть тонким, при нем просматривается нормальный цвет языка. Толстый налет не позволяет увидеть цвет языка. Это налет хронических болезней и инфекций в организме.

Цвет. Цвет налета может варьироваться от белого к желтому, серому, а при тяжелых заболеваниях зеленому или даже черному. На цвет влияет не только возможное заболевание, но и питье, еда или курение.

Локализация. Диффузный налет покрывает весь язык сплошной пеленой, локальный может располагаться одним или несколькими очагами разных размеров в разных участках языка.

Легкость отделения от языка.

Мягкий утренний налет, который быстро сходит, является нормой и не должен вызывать опасений. Существует плотный налет и мягкий налет, который сам слущивается с языка пятнами, а затем быстро образуется снова

Характерными признаками физиологического налёта, позволяющими отличить его от патологии, являются:
• отсутствие какого-либо запаха изо рта;
• белого либо слегка желтоватого цвета;
• прозрачный;
• отсутствует воспаление слизистой языка;
• сосочки не изменены;
• легко удаляется.

Лечение налета на языке:

Прежде всего, необходимо соблюдать гигиену полости рта, так как бактерии быстро размножаются в налёте и могут привести к развитию инфекционного процесса в ротовой полости. Необходимо ежедневно чистить зубы и язык специальными щётками. Правильная гигиена полости рта является залогом здоровья и свежего дыхания.
При выявлении у себя налета, отличающегося от нормы,

необходимо обратиться к врачу для консультации.

Материал подготовила: врач-стоматолог-терапевт
высшей квалификационной категории Вейгандт И.А.

Регуляция объема клеток эпителия в норме и при патологии | Пономарчук

1. Mongin A.A. and Orlov S.N. Mechanisms of cell volume regulation and possible nature of the cell volume sensor // Pathophysiology. 2001; 8 (2): 77–88.

2. Macknight A.D. and Leaf A. Regulation of cellular volume in Membrane Physiology. Springer, 1987: 311–328.

3. Lang, F. et al. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms // Physiological reviews. 1998; 78 (1): 247–306.

4. Murao H. et al. Cell shrinkage evoked by Ca2+‐free solution in rat alveolar type II cells: Ca2+ regulation of Na+–H+ exchange // Experimental physiology. 2005; 90 (2): 203–213.

5. Hosoi K. et al. Terbutaline-induced triphasic changes in volume of rat alveolar type II cells: the role of cAMP // The Japanese journal of physiology. 2002; 52 (6): 561– 572.

6. Hosoi K. et al., Delayed shrinkage triggered by the Na+– K+ pump in terbutaline‐stimulated rat alveolar type II cells // Experimental physiology. 2004; 89 (4): 373–385.

7. Hoffmann E.K., Lambert I.H. and Pedersen S.F. Physiology of cell volume regulation in vertebrates // Physiol Rev. 2009; 89 (1): 193–277.

8. MacLeod R. and Hamilton J. Ca 2+/calmodulin kinase II and decreases in intracellular pH are required to activate K+ channels after substantial swelling in villus epithelial cells // Journal of Membrane Biology. 1999; 172 (1): 59–66.

9. Fernández-Fernández J.M. et al. Maxi K+ channel mediates regulatory volume decrease response in a human bronchial epithelial cell line // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2002; 283 (6): C1705–C1714.

10. Vázquez E., Nobles M. and Valverde M.A. Defective regulatory volume decrease in human cystic fibrosis tracheal cells because of altered regulation of intermediate conductance Ca2+-dependent potassium channels // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001; 98 (9): 5329–5334.

11. Wu X. et al. Regulatory volume decrease by SV40- transformed rabbit corneal epithelial cells requires ryanodine-sensitive Ca2+-induced Ca2+ release // Journal of Membrane Biology. 1997; 158 (2): 127–136.

12. Harron S.A. et al. Volume regulation in the human airway epithelial cell line Calu-3 // Canadian journal of physiology and pharmacology. 2009; 87 (5): 337–346.

13. Jentsch T.J. VRACs and other ion channels and transporters in the regulation of cell volume and beyond // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2016; 17 (5): 293–307.

14. Hazama A. and Okada Y. Ca2+ sensitivity of volume‐ regulatory K+ and Cl‐channels in cultured human epithelial cells // The Journal of Physiology. 1988; 402 (1): 687–702.

15. Hoffmann E.K., Holm N.B. and Lambert I.H. Functions of volume‐sensitive and calcium‐activated chloride channels // IUBMB life. 2014; 66 (4): 257–267.

16. Mummery J.L., Killey J. and Linsdell P. Expression of the chloride channel CLC-K in human airway epithelial cells // Canadian journal of physiology and pharmacology. 2005; 83 (12): 1123–1128.

17. Almaça J. et al. TMEM16 proteins produce volumeregulated chloride currents that are reduced in mice lacking TMEM16A // Journal of Biological Chemistry. 2009; 284 (42): 28571–28578.

18. Xie C. et al. Mechanosensitivity of wild-type and G551D cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) controls regulatory volume decrease in simple epithelia // The FASEB Journal. 2016; 30 (4): 1579– 1589.

19. Missan S. et al. Contribution of KCNQ1 to the regulatory volume decrease in the human mammary epithelial cell line MCF-7 // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2007; 293 (3): C1010–C1019.

20. Lan W.Z., Wang P.Y. and C.E. Hill, Modulation of hepatocellular swelling-activated K+ currents by phosphoinositide pathway-dependent protein kinase C // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2006; 291 (1): C93–C103.

21. Dube L., Parent L. and Sauve R. Hypotonic shock activates a maxi K+ channel in primary cultured proximal tubule cells // American Journal of Physiology-Renal Physiology. 1990; 259 (2): F348–F356.

22. Urbach V. et al. Mechanosensitive calcium entry and mobilization in renal A6 cells // The Journal of membrane biology. 1999; 168 (1): 29–37.

23. Wang J., S. Morishima and Y. Okada. IK channels are involved in the regulatory volume decrease in human epithelial cells // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2003; 284 (1): C77–C84.

24. Lauf P.K. et al., Apparent intermediate K conductance channel hyposmotic activation in human lens epithelial cells // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2008; 294 (3): C820–C832.

25. Roman R. et al. Molecular characterization of volumesensitive SKCa channels in human liver cell lines // American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 2002; 282 (1): G116–G122.

26. Gamba G. Molecular physiology and pathophysiology of electroneutral cation-chloride cotransporters // Physiological reviews. 2005; 85 (2): 423–493.

27. Hebert S.C., Mount D.B. and Gamba G. Molecular physiology of cation-coupled Cl− cotransport: the SLC12 family // Pflügers Archiv. 2004; 447 (5): 580–593.

28. Mercado A. et al. Functional comparison of the K+-Cl− cotransporters KCC1 and KCC4 // Journal of Biological Chemistry. 2000; 275 (39): 30326–30334.

29. Race J.E. et al. Molecular cloning and functional characterization of KCC3, a new K-Cl cotransporter // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1999; 277 (6): C1210–C1219.

30. Capó-Aponte J.E., Iserovich P. and Reinach P. Characterization of regulatory volume behavior by fluorescence quenching in human corneal epithelial cells // Journal of Membrane Biology. 2005; 207 (1): 11–22.

31. Strange K., Emma F. and P.S. Jackson. Cellular and molecular physiology of volume-sensitive anion channels // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1996; 270 (3): C711–C730.

32. Kirk K. and Strange K. Functional properties and physiological roles of organic solute channels // Annual Review of Physiology. 1998; 60 (1): 719–739.

33. Holm J.B., Grygorczyk R. and Lambert I.H. Volumesensitive release of organic osmolytes in the human lung epithelial cell line A549: role of the 5-lipoxygenase // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2013; 305 (1): C48–C60.

34. Di Ciano-Oliveira C. et al. Is myosin light-chain phosphorylation a regulatory signal for the osmotic activation of the Na+-K+-2Cl− cotransporter? // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2005; 289 (1): C68–C81.

35. Russell J.M. Sodium-potassium-chloride cotransport // Physiological Reviews. 2000; 80 (1): 211–276.

36. O’Neill, W.C., Physiological significance of volume-regulatory transporters // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1999; 276 (5): C995– C1011.

37. Bookstein C. et al. Characterization of the rat Na+/ H+ exchanger isoform NHE4 and localization in rat hippocampus // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1996; 271 (5): C1629–C1638.

38. Bookstein, C. et al. A unique sodium-hydrogen exchange isoform (NHE-4) of the inner medulla of the rat kidney is induced by hyperosmolarity // Journal of Biological Chemistry. 1994; 269: 29704–29704.

39. Good D.W., Di Mari J.F. and B.A. Watts. Hyposmolality stimulates Na+/H+ exchange and HCO3− absorption in thick ascending limb via PI 3-kinase // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2000; 279 (5): C1443– C1454.

40. Soleimani M. et al. Effect of high osmolality on Na+/H+ exchange in renal proximal tubule cells // Journal of Biological Chemistry. 1994; 269 (22): 15613–15618.

41. Alexander R.T. et al. Membrane curvature alters the activation kinetics of the epithelial Na+/H+ exchanger, NHE3 // Journal of Biological Chemistr. 2007; 282 (10): 7376–7384.

42. Wehner, F. and H. Tinel, Role of Na+ conductance, Na+‐H+ exchange, and Na+‐K+‐2Cl− symport in the regulatory volume increase of rat hepatocytes // The Journal of Physiology. 1998; 506 (1): 127–142.

43. Pedersen S. et al. Physiology and pathophysiology of Na+/H+ exchange and Na+-K+-2Cl− cotransport in the heart, brain, and blood // American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 2006; 291 (1): R1–R25.

44. Haberich F., Aziz O. and Nowacki P. Über einen osmoreceptorisch tätigen Mechanismus in der Leber // Pflüger’s Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 1965; 285 (1): 73–89.

45. Beck F.X., Dörge A. and Thurau K. Cellular osmoregulation in renal medulla // Kidney and Blood Pressure Research. 1988; 11 (3–5): 174–186.

46. Bierens J.J. et al. Physiology of drowning: a review // Physiology. 2016; 31 (2): 147–166.

47. De Boer J. et al. The effects of aspirated and swallowed water in drowning // Anesthesiology. 1970; 32 (1): 51–59.

48. Lambert I., Hoffmann E. and Pedersen S. Cell volume regulation: physiology and pathophysiology // Acta physiologica. 2008; 194 (4): 255–282.

49. Burg M.B., Kwon E.D. and Kültz D. Osmotic regulation of gene expression // The FASEB Journal. 1996; 10 (14): 1598–1606.

50. Burg M.B. Molecular basis for osmoregulation of organic osmolytes in renal medullary cells // Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological Genetics and Physiology. 1994; 268 (2): 171–175.

51. Beck F. et al. Intra-and extracellular element concentrations of rat renal papilla in antidiuresis // Kidney international. 1984; 25 (2): 397–403.

52. Pedersen S.F., Hoffmann E.K. and I. Novak. Cell volume regulation in epithelial physiology and cancer // Frontiers in physiology. 2013. 4: 233.

53. Shiima‐Kinoshita C. et al. β2‐adrenergic regulation of ciliary beat frequency in rat bronchiolar epithelium: potentiation by isosmotic cell shrinkage // The Journal of physiology. 2004; 554 (2): 403–416.

54. Reuss L. and Cotton C.U. Volume regulation in epithelia: transcellular transport and cross-talk // Cellular and Molecular Physiology of Cell Volume Regulation. 1994: 31–47.

55. Lang F., Messner G. and Rehwald W. Electrophysiology of sodium-coupled transport in proximal renal tubules // American Journal of Physiology-Renal Physiology. 1986; 250 (6): F953–F962.

56. Harvey B.J. Crosstalk and epithelial ion transport. Current opinion in nephrology and hypertension. 1994; 3 (5): 523–528.

57. Schultz S. and Dubinsky W. Sodium absorption, volume control and potassium channels: in tribute to a great biologist // Journal of Membrane Biology. 2001; 184 (3): 255–261.

58. Furlong T.J. and Spring K.R. Mechanisms underlying volume regulatory decrease by Necturus gallbladder epithelium // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1990; 258 (6): C1016–C1024.

59. Breton S. et al. Cell volume increases of physiologic amplitude activate basolateral K and CI conductances in the rabbit proximal convoluted tubule // Journal of the American Society of Nephrology. 1996; 7 (10): 2072–2087.

60. Bachmann O. et al. Basolateral ion transporters involved in colonic epithelial electrolyte absorption anion secretion and cellular homeostasis // Acta physiologica. 2011; 201(1): 33–46.

61. Verkman A., Song Y. andThiagarajah J.R. Role of airway surface liquid and submucosal glands in cystic fibrosis lung disease // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2003; 284 (1): C2–C15.

62. Greger R. et al. The Na+ 2Cl–K+ cotransporter in the rectal gland of Squalus acanthias is activated by cell shrinkage // Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 1999; 438 (2): 165–176.

63. Foskett J.K., Wong M.M. and Robertson M.A. Isosmotic modulation of cell volume and intracellular ion activities during stimulation of single exocrine cells // Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological Genetics and Physiology. 1994; 268 (2): 104–110.

64. Wangemann P. Comparison of ion transport mechanisms between vestibular dark cells and strial marginal cells // Hearing research. 1995; 90 (1): 149–157.

65. Dissing S. et al. Inhibitory effects of amitriptyline on the stimulation-induced Ca2+ increase in parotid acini // European journal of pharmacology. 1990; 177 (1–2): 43–54.

66. Sun A.M. and Hebert S.C. Volume regulation in renal medullary nephron segments // Cellular and Molecular Physiology of Cell Volume Regulation, 1993: 49.

67. Ussing H. and Eskesen K. Mechanism of isotonic water transport in glands // Acta Physiologica. 1989; 136 (3): 443–454.

68. Hoffmann E.K. and Ussing H.H. Membrane mechanisms in volume regulation in vertebrate cells and epithelia in Membrane transport in biology. Springer, 1992: 317–399.

69. Nedergaard S., Larsen E.H. and Ussing H.H. Sodium recirculation and isotonic transport in toad small intestine // The Journal of membrane biology. 1999; 168 (3): 241–251.

70. Larsen E.H. and Møbjerg N. Na+ recirculation and isosmotic transport // The Journal of membrane biology. 2006; 212 (1): 1–15.

71. Larsen E.H., Sørensen J.B. and Sørensen J.N. Analysis of the sodium recirculation theory of solute‐coupled water transport in small intestine // The Journal of physiology. 2002; 542 (1): 33–50.

72. Wehner F. et al. Cell volume regulation: osmolytes, osmolyte transport, and signal transduction, in Reviews of physiology, biochemistry and pharmacology. Springer, 2003: 80.

73. Häussinger D. et al. Involvement of microtubules in the swelling-induced stimulation of transcellular taurocholate transport in perfused rat liver // Biochemical Journal. 1993; 291 (2): 355–360.

74. Wettstein M., Noe B. and Häussinger D. Metabolism of cysteinyl leukotrienes in the perfused rat liver: the influence of endotoxin pretreatment and the cellular hydration state // Hepatology. 1995; 22 (1): 235–240.

75. Gillin A.G., Star R.A. and Sands J.M. Osmolarity-stimulated urea transport in rat terminal IMCD: role of intracellular calcium // American Journal of Physiology-Renal Physiology.1993; 265 (2): F272–F277.

76. Green R.B. et al. Hyperosmolality inhibits sodium absorption and chloride secretion in mIMCD-K2 cells // American Journal of Physiology-Renal Physiology. 1996; 271 (6): F1248–F1254.

77. Nakahari T. et al. Osmotic flow transients during acetylcholine stimulation in the perfused rat submandibular gland // Experimental physiology. 1997; 82 (1): 55–70.

78. Gao Y. and Vanhoutte P.M. Hypotonic solutions induce epithelium-dependent relaxation of isolated canine bronchi // Lung. 1992; 170 (6): p. 339–347.

79. Lang F. et al. Ion channels and cell volume in regulation of cell proliferation and apoptotic cell death, in Mechanisms and Significance of Cell Volume Regulation. Karger Publishers, 2006: 142–160.

80. Needham D. Possible role of cell cycle-dependent morphology, geometry, and mechanical properties in tumor cell metastasis // Cell Biochemistry and Biophysics. 1991; 18 (2): 99–121. H.

81. Takahashi A., Yamaguchi H. and Miyamoto. Change in K+ current of HeLa cells with progression of the cell cycle studied by patch-clamp technique // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1993; 265 (2): 328–336.

82. Ritter M. and Wöll Е. Modification of cellular ion transport by the Ha-ras oncogene: Steps towards malignant transformation // Cellular Physiology and Biochemistry. 1996; 6 (5): 245–270.

83. Bianchini L. and Grinstein S. Regulation of volume-modulating ion transport systems by growth promoters, in Advances in comparative and environmental physiology. Springer, 1993: 249–277.

84. Palfrey H.C. and O’Donnell M.E. Characteristics and regulation of the Na/K/2CI cotransporter // Cellular Physiology and Biochemistry. 1992; 2 (6): 293307.

85. Dubois J.-M. and Rouzaire-Dubois B. The influence of cell volume changes on tumour cell proliferation // European Biophysics Journal. 2004; 33 (3): 227–232.

86. Rouzaire‐Dubois B., O’regan S. and Dubois J.M. Cell size‐dependent and independent proliferation of rodent neuroblastoma x glioma cells // Journal of cellular physiology. 2005; 203 (1): 243–250.

87. Burg M.B. Response of renal inner medullary epithelial cells to osmotic stress // Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 2002; 133 (3): 661–666.

88. Lang F. et al. Cell volume in the regulation of cell proliferation and apoptotic cell death // Cellular Physiology and Biochemistry. 2000; 10 (5-6): 417–428.

89. Michea L. et al. Cell cycle delay and apoptosis are induced by high salt and urea in renal medullary cells // American Journal of Physiology-Renal Physiology. 2000; 278 (2): F209–F218.

90. Klausen T.K. et al. Monovalent ions control proliferation of Ehrlich Lettre ascites cells // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2010; 299 (3): C714–C725.

91. Schreiber R. Ca2+ signaling, intracellular pH and cell volume in cell proliferation // The Journal of membrane biology. 2005; 205 (3): 129.

92. Wöll E. et al. The role of calcium in cell shrinkage and intracellular alkalinization by bradykinin in Ha‐ras oncogene expressing cells // FEBS letters. 1993; 322 (3): 261–265.

93. Wang Z. Roles of K+ channels in regulating tumour cell proliferation and apoptosis // Pflügers Archiv. 2004; 448 (3): 274–286.

94. Wang S. et al. Evidence for an early G1 ionic event necessary for cell cycle progression and survival in the MCF‐7 human breast carcinoma cell line // Journal of cellular physiology. 1998; 176 (3): 456–464.

95. Felipe A. et al. Potassium channels: new targets in cancer therapy // Cancer detection and prevention. 2006; 30 (4): 375–385.

96. Patel A.J. and Lazdunski M. The 2P-domain K+ channels: role in apoptosis and tumorigenesis // Pflügers Archiv. 2004; 448 (3): 261–273.

97. Voloshyna I. et al. TREK-1 is a novel molecular target in prostate cancer // Cancer research. 2008; 68 (4): 1197–1203.

98. Pardo L.A. et al. Approaches targeting Kv10. 1 open a novel window for cancer diagnosis and therapy // Current medicinal chemistry. 2012; 19 (5): 675–682.

99. Gómez-Varela D. et al. Monoclonal antibody blockade of the human Eag1 potassium channel function exerts antitumor activity // Cancer Research. 2007; 67 (15): 7343–7349.

100. Jäger H. et al. Blockage of intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channels inhibit human pancreatic cancer cell growth in vitro // Molecular pharmacology. 2004; 65 (3): 630–638.

101. Chen L. et al. Roles of volume‐activated Cl− currents and regulatory volume decrease in the cell cycle and proliferation in nasopharyngeal carcinoma cells // Cell proliferation. 2007; 40 (2): 253–267.

102. Varela D. et al. NAD (P) H oxidase-derived h3O2 signals chloride channel activation in cell volume regulation and cell proliferation // Journal of Biological Chemistry. 2004; 279 (14): 13301–13304.

103. Wang L., Chen L. and Jacob T. ClC-3 expression in the cell cycle of nasopharyngeal carcinoma cells // Sheng li xue bao: [Acta physiologica Sinica]. 2004; 56 (2): 230–236.

104. Liu W. et al. Inhibition of Ca2+-activated Cl− channel ANO1/TMEM16A expression suppresses tumor growth and invasiveness in human prostate carcinoma // Cancer letters. 2012; 326 (1): 41–51.

105. Duvvuri U. et al. TMEM16A induces MAPK and contributes directly to tumorigenesis and cancer progression // Cancer research. 2012; 72 (13): 3270–3281.

106. Britschgi A. et al. Calcium-activated chloride channel ANO1 promotes breast cancer progression by activating EGFR and CAMK signaling // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013; 110 (11): E1026–E1034.

107. Kunzelmann K. Ion channels in regulated cell death // Cellular and Molecular Life Sciences. 2016; 73 (11- 12): 2387–2403.

108. Blikslager A.T. et al. Restoration of barrier function in injured intestinal mucosa // Physiological reviews. 2007; 87 (2): 545–564.

109. Dignass A.U. Mechanisms and modulation of intestinal epithelial repair // Inflammatory bowel diseases. 2001; 7 (1): 68–77.

110. Lohela M. and Werb Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors // Current opinion in genetics & development. 2010; 20 (1): 72–78.

111. Schwab A. and Stock C. Ion channels and transporters in tumour cell migration and invasion // Phil. Trans. R. Soc. B. 2014; 369 (1638): 20130102.

112. Schwab A. et al. Role of ion channels and transporters in cell migration // Physiological reviews. 2012; 92 (4): 1865–1913.

113. Cooper J.A. The role of actin polymerization in cell motility // Annual Review of Physiology. 1991; 53 (1): 585–605.

114. Stossel T.P. On the crawling of animal cells // Science — New York then Washington. 1993; 260: 1086–1086.

115. Jakab M. and Ritter M. Cell volume regulatory ion transport in the regulation of cell migration, in Mechanisms and Significance of Cell Volume Regulation // Karger Publishers. 2006; 161–180.

116. Schwab A. et al. Migration of transformed renal epithelial cells is regulated by K+ channel modulation of actin cytoskeleton and cell volume // Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 1999; 438 (3): 330–337.

117. Ridley A.J. et al. Cell migration: integrating signals from front to back // Science. 2003; 302 (5651): 1704– 1709.

118. Chiang Y. et al. EGF upregulates Na+/H+ exchanger NHE1 by post‐translational regulation that is important for cervical cancer cell invasiveness // Journal of cellular physiology. 2008; 214 (3): 810–819.

119. Lauritzen G. et al. The Na+/H+ exchanger NHE1, but not the Na+, cotransporter NBCn1, regulates motility of MCF7 breast cancer cells expressing constitutively active ErbB2 // Cancer letters. 2012; 317 (2): 172–183.

120. Lagana A. et al. Regulation of the formation of tumor cell pseudopodia by the Na (+)/H (+) exchanger NHE1 // Journal of cell science. 2000; 113 (20): 3649–3662.

121. Stock C. et al. pH nanoenvironment at the surface of single melanoma cells // Cellular Physiology and Biochemistry. 2007; 20 (5): 679–686.

122. Ritter M. et al. Effect of inhibitors of Na+/H+‐exchange and gastric H+/K+ ATPase on cell volume, intracellular pH and migration of human polymorphonuclear leucocytes // British journal of pharmacology. 1998; 124 (4): 627–638.

123. Haas B.R. and Sontheimer H. Inhibition of the sodium-potassium-chloride cotransporter isoform-1 reduces glioma invasion // Cancer research. 2010; 70 (13): 5597–5606.

124. Schwab A. et al. Oscillating activity of a Ca (2+)-sensitive K+ channel. A prerequisite for migration of transformed Madin-Darby canine kidney focus cells // Journal of Clinical Investigation. 1994; 93 (4): 1631.

125. Ransom C.B., O’Neal J.T. and Sontheimer H. Volume-activated chloride currents contribute to the resting conductance and invasive migration of human glioma cells // Journal of Neuroscience. 2001; 21 (19): 7674–7683.

126. Soroceanu L., Manning T.J. and Sontheimer H. Modulation of glioma cell migration and invasion using Cl− and K+ ion channel blockers // Journal of Neuroscience. 1999; 19 (14): 5942–5954.

127. Mao J. et al. Blockage of volume-activated chloride channels inhibits migration of nasopharyngeal carcinoma cells // Cellular Physiology and Biochemistry. 2007; 19 (5-6): 249–258.

128. Chen Y.-F. et al. Motor Protein–Dependent Membrane Trafficking of KCl Cotransporter-4 Is Important for Cancer Cell Invasion // Cancer research. 2009; 69 (22): 8585–8593.

129. Rao J.N. et al. Activation of K+ channels and increased migration of differentiated intestinal epithelial cells after wounding // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2002; 282 (4): C885–C898.

130. Shin V.Y. et al. Nicotine suppresses gastric wound repair via the inhibition of polyamine and K+ channel expression // European journal of pharmacology. 2002; 444 (1): 115–121.

131. Trinh N.T.N. et al. EGF and K+ channel activity control normal and cystic fibrosis bronchial epithelia repair // American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 2008; 295 (5): L866–L880.

132. Potier M. et al. Altered SK3/KCa2. 3-mediated migration in adenomatous polyposis coli (Apc) mutated mouse colon epithelial cells // Biochemical and biophysical research communications. 2010; 397 (1): 42–47.

133. Yang H. et al. Epidermal growth factor receptor transactivation by the cannabinoid receptor (CB1) and transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) induces differential responses in corneal epithelial cells // Experimental eye research. 2010; 91 (3): 462–471.

134. Waning J. et al. A novel function of capsaicin-sensitive TRPV1 channels: involvement in cell migration // Cell calcium. 2007; 42 (1): 17–25.

135. Hu J. and Verkman A. Increased migration and metastatic potential of tumor cells expressing aquaporin water channels // The FASEB Journal. 2006; 20 (11): 1892–1894.

136. Loitto V.M., Karlsson T. and Magnusson K.E. Water flux in cell motility: expanding the mechanisms of membrane protrusion // Cell motility and the cytoskeleton. 2009; 66 (5): 237–247.

137. Verkman A.S. Aquaporins at a glance // J. Cell. Sci. 2011; 124 (13): 2107–2112.

138. Hara-Chikuma M. and Verkman A. Aquaporin-1 facilitates epithelial cell migration in kidney proximal tubule // Journal of the American Society of Nephrology. 2006; 17 (1): 39–45.

139. Levin M.H. and Verkman A. Aquaporin-3-dependent cell migration and proliferation during corneal re-epithelialization // Investigative ophthalmology & visual science. 2006; 47 (10): 4365–4372.

140. Hayashi S. et al. Involvement of aquaporin-1 in gastric epithelial cell migration during wound repair // Biochemical and biophysical research communications. 2009; 386 (3): 483–487.

141. Ruiz-Ederra J. and Verkman A. Aquaporin-1-facilitated keratocyte migration in cell culture and in vivo corneal wound healing models // Experimental eye research. 2009; 89 (2): 159–165.

142. Chen Z. et al. Impaired migration and cell volume regulation in aquaporin 5-deficient SPC-A1 cells // Respiratory physiology & neurobiology. 2011; 176 (3): 10–117.

143. Saadoun S. et al. Involvement of aquaporin-4 in astroglial cell migration and glial scar formationь // Journal of cell science. 2005; 118 (24): 5691–5698.

144. Chemaly A. et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification // Journal of Experimental Medicine. 2010; 207 (1): 129–139.

145. Lang F. and Hoffmann E.K. Role of ion transport in control of apoptotic cell death // Comprehensive Physiology. 2012;

146. Pasantes-Morales H. Channels and volume changes in the life and death of the cell // Molecular pharmacology. 2016; 90 (3): 358–370.

147. Trump B. and Berezesky I. Calcium-mediated cell injury and cell death // The FASEB Journal. 1995; 9 (2): p. 219–228.

148. Lehen’kyi V.Y. et al. Ion channnels and transporters in cancer. 5. Ion channels in control of cancer and cell apoptosis // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2011; 301 (6): C1281–C1289.

149. Poulsen K.A. et al. Deregulation of apoptotic volume decrease and ionic movements in multidrug-resistant tumor cells: role of chloride channels // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2010; 298 (1): C14–C25.

150. Porcelli A. et al. Apoptosis induced by staurosporine in ECV304 cells requires cell shrinkage and upregulation of Cl− conductance // Cell Death & Differentiation. 2004; 11 (6): 655–662.

151. Ise T. et al. Roles of volume-sensitive Cl− channel in cisplatin-induced apoptosis in human epidermoid cancer cells // The Journal of membrane biology. 2005; 205 (3): 139–145.

152. Bortner C.D. and Cidlowski J.A. Ion channels and apoptosis in cancer // Phil. Trans. R. Soc. B. 2014; 369 (1638): 20130104.

153. Okada Y. et al. Receptor‐mediated control of regulatory volume decrease (RVD) and apoptotic volume decrease (AVD) // The Journal of physiology. 2001; 532 (1): 3–16.

154. Okada Y. and Maeno E. Apoptosis, cell volume regulation and volume-regulatory chloride channels // Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 2001; 130 (3): 377–383.

155. Edwards Y.S. et al. Osmotic stress induces both secretion and apoptosis in rat alveolar type II cells // American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 1998; 275 (4): L670–L678.

156. Maeno E. et al. Normotonic cell shrinkage because of disordered volume regulation is an early prerequisite to apoptosis // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2000; 97 (17): 9487–9492.

157. Terada Y. et al. Hyperosmolality activates Akt and regulates apoptosis in renal tubular cells // Kidney international. 2001; 60 (2): 553–567.

158. Pedersen S.F. et al. The Na+/H+ exchanger, NHE1, differentially regulates mitogen-activated protein kinase subfamilies after osmotic shrinkage in Ehrlich Lettre Ascites cells // Cellular Physiology and Biochemistry. 2007; 20 (6): 735–750.

159. Reinehr R., Schliess F. and Häussinger D. Hyperosmolarity and CD95L trigger CD95/EGF receptor association and tyrosine phosphorylation of CD95 as prerequisites for CD95 membrane trafficking and DISC formation // The FASEB Journal. 2003; 17 (6): 731–733.

160. Friis M.B. et al. Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts // The Journal of physiology. 2005; 567 (2): 427–443.

161. Nielsen M.-B., Christensen S.T. and Hoffmann E.K. Effects of osmotic stress on the activity of MAPKs and PDGFR-β-mediated signal transduction in NIH-3T3 fibroblasts // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2008; 294 (4): C1046–C1055.

162. Bortner C.D. and Cidlowski J.A. Uncoupling cell shrinkage from apoptosis reveals that Na+ influx is required for volume loss during programmed cell death // Journal of Biological Chemistry. 2003; 278 (40): 39176–39184.

163. Franco R., Bortner C. and Cidlowski J. Potential roles of electrogenic ion transport and plasma membrane depolarization in apoptosis // The Journal of membrane biology. 2006; 209 (1): 43–58.

164. Orlov S. et al. Apoptosis in serum-deprived vascular smooth muscle cells: evidence for cell volume-independent mechanism // Apoptosis. 2004; 9 (1): 55–66.

165. Bortner C.D. and Cidlowski J.A. Absence of volume regulatory mechanisms contributes to the rapid activation of apoptosis in thymocytes // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1996; 271 (3): C950– C961.

166. Platonova A. et al. Swelling rather than shrinkage precedes apoptosis in serum-deprived vascular smooth muscle cells // Apoptosis. 2012; 17 (5): 429–438.

167. Platonova A. et al. The death of ouabain-treated renal epithelial C11-MDCK cells is not mediated by swelling-induced plasma membrane rupture // J. Membr Biol. 2011; 241 (3): 145–154.

168. Siegel R., Naishadham D. and Jemal A. Cancer statistics, 2013 // CA: a cancer journal for clinicians. 2013; 63 (1): 11–30.

169. Prevarskaya N., Skryma R. and Shuba Y. Ion channels and the hallmarks of cancer // Trends in molecular medicine. 2010; 16 (3): 107–121.

170. Foroni C. et al. Epithelial–mesenchymal transition and breast cancer: Role, molecular mechanisms and clinical impact // Cancer treatment reviews. 2012; 38 (6): 689–697.

171. Rhim A.D. et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation // Cell. 2012; 148 (1): 349– 361.

172. Krishna R. and Mayer L.D. Multidrug resistance (MDR) in cancer: mechanisms, reversal using modulators of MDR and the role of MDR modulators in influencing the pharmacokinetics of anticancer drugs // European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2000; 11 (4): 265–283.

173. Maeno E., Takahashi N. and Okada Y. Dysfunction of regulatory volume increase is a key component of apoptosis // FEBS letters. 2006; 580 (27): 6513– 6517.

174. Numata T. et al. Hypertonicity-induced cation channels rescue cells from staurosporine-elicited apoptosis // Apoptosis. 2008; 13 (7): 895.

175. Rotin D. and Grinstein S. Impaired cell volume regulation in Na (+)-H+ exchange-deficient mutants // American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1989; 257 (6): C1158–C1165.

176. Bonnet S. et al. A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth // Cancer cell. 2007; 11 (1): 37–51.

177. Hoffmann E.K. and Lambert I.H. Ion channels and transporters in the development of drug resistance in cancer cells // Phil. Trans. R. Soc. B. 2014; 369 (1638): 20130109.

178. Han Y. et al. Detection of potassium currents and regulation of multidrug resistance by potassium channels in human gastric cancer cells // Cell biology international. 2007; 31 (7): 741–747.

179. Morikage T. et al. Modulation of cisplatin sensitivity and accumulation by amphotericin B in cisplatin-resistant human lung cancer cell lines // Cancer research. 1993; (14): 3302–3307.

180. Beketic-Oreskovic L. and Osmak M. Modulation of resistance to cisplatin by amphotericin B and aphidicolin in human larynx carcinoma cells // Cancer chemotherapy and pharmacology. 1995; 35 (4): 327– 333.

181. Min X.-j. et al. Dysfunction of volume-sensitive chloride channels contributes to cisplatin resistance in human lung adenocarcinoma cells // Experimental Biology and Medicine. 2011; 236 (4): 483–491.

182. Lee E.L. et al. Impaired activity of volume‐sensitive Cl− channel is involved in cisplatin resistance of cancer cells // Journal of cellular physiology. 2007; 211 (2): 513–521.

183. Mongin A.A. and Orlov S.N. MECHANISMS OF CELL VOLUME REGULATION // Physiology and Maintenance-Volume I: General Physiology. 2009; 1: 130.

Анализ мазка в Оренбурге | МЦКТ «НьюЛайф»

Для выявления заболеваний мочеполовой сферы в урологической, гинекологической и венерологической практике проводится анализ мазка. Данный анализ очень популярен среди врачей, потому что он позволяет быстро определить причины дискомфорта пациента.

 

Сдать мазок Вам назначит врач-гинеколог или врач-уролог  из-за таких признаков как:

 

• непонятные выделения из влагалища;
• проверка микрофлоры;
• боль в нижней части живота;
• боль и дискомфорт при мочеиспускании;
• зуд в интимной зоне;
• подозрение на венерические заболевания;
• планирование зачатия;
• бесплодие и другие.

 

Как сдать мазок: подготовка к анализу

 

Помните что, от Вашей подготовки к процедуре зависит точность результатов!

 

Женщине нужно учитывать цикл менструаций, обычно можно сдать мазок на пятый день. Нельзя пользоваться свечами или мазями перед процедурой, не проводить спринцевание, в течении двух дней воздержаться от интимной близости, на сдачу анализа нужно приходить на полный мочевой пузырь.

 

Мужчинам же нельзя принимать алкоголь в течении двух дней и стоит воздержаться от интимной близости в течение 12 часов до процедуры. На сдачу анализа нужно приходить на полный мочевой пузырь.

 

Как расшифровать анализ мазка

 

В этом анализе исследуют: лейкоциты, микрофлору, эпителий, инфекции (трихомониаз, гонорея, кандидоз), ключевые клетки и слизь. Теперь нужно разобраться с нормой анализа.

 

На вашем листке с результатами будет таблица с символами: «U» (уретра), «V» (влагалище), «С» (цервикальный канал).

 

• Нормой в «U» будут являться показатели:

лейкоциты — 0-5 в п/з, эпителий — умеренный или 5-10 в п/з, слизь — умеренно/отсутствует, остальные показатели должны показывать — не выявлено/отсутствуют.

• Нормой в «V» будут являться показатели:

лейкоциты — 0-10 в п/з, эпителий — умеренный или 5-10 в п/з, микрофлора — палочковая в большом количестве/лактобациллярная, слизь — умеренно, остальные показатели должны показывать — не выявлено/отсутствуют.

• Норма в «С» будут являться показатели:

лейкоциты — 0-15-30 в п/з, эпителий — умеренный или 5-10 в п/з, слизь — умеренно, остальные показатели должны показывать — не выявлено/отсутствуют.

 

Небольшое отклонение может являться Вашей индивидуальной нормой. Большое отклонение указывает на заболевание или воспаление.

 

КАК СДАВАТЬ МАЗОК

 

Для женщин процедура проходит безболезненно и не сопровождается неприятными ощущениями. Вводится зеркало, и шпателем по стенкам влагалища собирается материал.

 

У мужчин процедура проходит иначе, в уретру вводится специальный зонд и несколько раз проворачивается, чтобы собрать материал со стенок. Процедура безболезненна, но неприятна! Если же Вы чувствуете боль, значит у Вас острое заболевание или инфекция.

 

Отзывы клиентов о сдаче анализа мазка в клинике МЦКТ «Нью Лайф»

 

В нашем Медицинском Центре Клеточных Технологий «Нью Лайф» теперь каждый клиент может оставить отзыв о своем лечащем враче! Если Вы уже сдавали анализы в нашей лаборатории, оставляйте свой отзыв на сайте! Это очень важно для нас!

Эктопия — псевдоэрозия шейки матки

Немного анатомии: между телом матки и влагалищем располагается шейка – канал, который соединяет эти два органа. Изнутри шейка матки выстлана цилиндрическим эпителием, клетки которого расположены в один слой. Наружная часть шейки матки покрыта многослойным плоским эпителием.

Эрозия шейки матки – дефект слизистой оболочки. Истинная эрозия – это ярко красное пятно, которое появляется на бледно-розовой поверхности слизистой шейки матки. Возникает она из-за дефекта покровной ткани, при котором происходит отторжение эпителиальных клеток. При этом повреждаются кровеносные сосуды, и женщина может жаловаться на кровянистые выделения после половых контактов.

Истинная эрозия встречается редко. Ее появлению способствуют нарушение гормонального фона – низкий уровень женских половых гормонов, механические воздействия (например, грубые половые контакты), некоторые инфекционные заболевания.

Чаще всего, когда на приеме у гинеколога женщине ставят диагноз «эрозия шейки матки», имеется в виду псевдоэрозия шейки матки или эктопия шейки матки. При псевдоэрозии обычный нормальный плоский эпителий наружной части шейки матки замещается цилиндрическим эпителием из цервикального канала. Отметим, что при эктопии шейки матки дефекта эпителия не возникает.

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Международной федерации по кольпоскопии и патологии шейки матки псевдоэрозия шейки матки или эктопия шейки матки относится к нормальному состоянию шейки матки и не переходит в онкологическое заболевание. Лечение эрозии шейки матки не требуется.

На сегодняшний день для оценки состояния шейки матки во всем мире женщинам старше 25 лет рекомендуют ежегодно проводить цитологическое исследование — соскоб из шейки матки (PAP-тест). Это единственное в мире исследование, которое помогает предотвратить появление рака шейки матки.

Соскоб на цитологию на практике.

Это исследование может быть выполнено в любой день менструального цикла кроме периода самой менструации; оно выполняется гинекологом сразу после установки гинекологического зеркала путём соприкосновения специальной щеточки с шейкой матки. Процедура абсолютно безболезненная.

Материал, взятый на цитологию, отправляется в специализированную лабораторию. Врачи-гинекологи ЕМС имеют возможность выполнять данное исследование двумя способами — классический тест (при помощи предметного стекла) и в жидкой среде. Второй способ позволяет выполнить исследование на Вирус Папилломы Человека (HPV) молекулярно-биологическим методом.

Результат мазка может быть в пределах нормы (напомним, что к нормальному состоянию относится и эктопия шейки матки), в этом случае его нужно будет повторить через год, либо выявить изменения. На сегодняшний день предпочтение отдается международной классификации патологии шейки матки Bethesda.

Другими словами, если исследование проводится ежегодно и результат подтверждает наличие предраковых (фоновых) аномалий, это совсем не значит, что обнаружится рак. При выявлении фоновых заболеваний проводится профилактическое лечение эрозии шейки матки методом конизации. В среднем проходит от 10 до 15 лет между появлением начальных изменений по результатам мазка на цитологию и появлением рака шейки матки.

Врачи-гинекологи ЕМС приглашают женщин старше 25 лет пройти ежегодное гинекологическое обследование, включающее в себя обязательное проведение соскоба на цитологию, и напоминают, что отсутствие исследования мазка на цитологию – самая главная причина появления рака шейки матки.

CFTR-зависимая регуляция ионных каналов в эпителии дыхательных путей (норма и CF) Карта путей — PrimePCR | Науки о жизни

CFTR-зависимая регуляция ионных каналов в эпителии дыхательных путей (CF и норма)

Трансмембранный регулятор муковисцидоза ( CFTR ) и Эпителиальный натриевый канал ( ENaC ) является основным шаги, ограничивающие скорость секреции Cl ^— и абсорбции Na ⁺ мерцательный эпителий дыхательных путей.Эти противоположные процессы являются основными детерминантами глубину перицилиарного слоя, которая должна поддерживаться в пределах, позволяющих одновременный мукоцилиарный клиренс и беспрепятственное поступление газов в просвет дыхательных путей. В важность CFTR — ENaC ингибирование задокументировано у пациентов с муковисцидозом (CF), страдающих дыхательными путями. обструкция и хроническая инфекция, возникающая в результате снижения мукоцилиарного клиренса вторичный к отсутствующему CFTR и ускоренный ENaC activity [1].

Регулирование ENaC интенсивно изучается. и проблема специфичности этих регуляторных путей на уровне органов хорошо известна. В то время как активность ENaC в почках или толстой кишке регулируется частично за счет системных уровней минералокортикоидов и их последующих эффекторов, Регламент ENaC в нормальных дыхательных путях в значительной степени невосприимчив к эти «глобальные» сигналы. Скорее, в дыхательных путях появляется ENaC . регулироваться локальными сигналами (основной способ — торможение CFTR ), которые отражают состояние жидкости на поверхности дыхательных путей. (ASL) отсек, в котором омываются поверхности дыхательных путей [2].

Однако остается неясным, как CFTR подавляет нормальный ENaC активность. Был предложен ряд механизмов ранжирования от измененного сотового трафика ENaC до прямого белок / белковые взаимодействия остаются предметом исследований [3], [4], [5]. Например, согласованное регулирование CFTR и ENaC могут включать большой динамический сигнальный комплекс в составе EBP50 , ДА-ассоциированный белок-65 ( YAP65 ) и нерецепторный тирозин киназа ДА .Возможно, этот комплекс опосредует ENaC ингибирование WWP2 через адаптерный белок WBP1 или NEDD4 Убиквитиновые протеинлигазы Е3 [6], [7], [8].

DeltaF508 CFTR потенциально сохраняет транспортер функциональность, но не может быть сохранена в исходной форме и, следовательно, является выбран для деградации, связанной с эндоплазматическим ретикулумом (ER) (ERAD) молекулярным шапероны и ассоциированные белки. В результате он не может подавлять ENaC [9].

Один локальный сигнал, на который нормальный эпителий дыхательных путей реагирует изменением Активность ENaC , — концентрация пуриновых нуклеотидов в отсек ASL. Внеклеточный АТФ связывается с P2Y2 рецепторов, которые соединяются через G-белок alpha q / 11 для активации PLC-beta и стимуляции быстрый гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфоната ( PtdIns (4,5) P2 ) в диаглицерин ( DAG ) и инозитол-1,4,5-трифосфат ( IP3 ).Поскольку PtdIns (4,5) P2 является необходим для нормального открытия канала, его истощение на апикальной мембране ингибирует ENaC [10], [11], [12]. [13].

P2Y2 активация является перспективной терапевтической мишенью в CF. P2Y2 запрещает ENaC и активирует Ca ²⁺ -зависимые хлоридные каналы (эти каналы кажутся также регулируется CFTR ). PLC-beta- сгенерировано IP3 активирует Ca ²⁺ -зависимый хлоридный канал (например,г., хлоридный канал кальция активировано 2 ( CLCA2 ) [14]). P2Y2 также активирует Ca ²⁺ -зависимый калий канал SK4 / IK1 на базолатеральной мембране, тем самым способствуя гиперполяризация мембраны и генерация петлевого тока, ответственного за CFTR — опосредованная секреция анионов [10], [11], [14].

Другой сигнал ASL, используемый нормальным эпителием дыхательных путей, — это локальный концентрация / активность специфических «протеаз, активирующих каналы».Было показано, что внеклеточная сериновая протеаза Простазин активирует ENaC путем преобразования «тихого» канала в апикальной мембране в канал, который активно переключается между открытым и закрытым состояниями. Уровень эндогенные антипротеиназы (например, ингибиторы активатора фактора роста гепатоцитов 1 и 2, HAI-1 и HAI-2 ) также важен для регуляции активности ENaC [15], [16], [17], [18], [19].

Неактивен в канале 3, чувствительного к амилориду катионов с нейтральным pH ( ASIC3 ) экспрессируется в легочном эпителии и может быть сильно активируется в кислотном эпителии CF из-за CFTR дисфункция ( CFTR и ASIC3 подавляют друг друга). Это может объяснить повышенную реабсорбцию Na ⁺ при МВ. в случае кислого pH в просвете, как ожидается, ингибирует ENaC [20].

Ссылки:

1. Smith JJ, Karp PH, Welsh MJ
   Нарушение транспорта жидкости эпителием дыхательных путей при муковисцидозе.Журнал клинических исследований, мар 1994; 93 (3): 1307-11
2. Хуанг П., Гилмор Е., Култген П., Барнс П., Милграм С., Штуттс М.Дж.
   Местная регуляция трансмембранного регулятора муковисцидоза и эпителиального натриевого канала в эпителии дыхательных путей. Труды Американского торакального общества 2004; 1 (1): 33-7
3. Kunzelmann K, Schreiber R, Nitschke R, Mall M
   Контроль эпителиальной Na + проводимости с помощью регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе.Pflugers Archiv: Европейский журнал физиологии, июнь 2000; 440 (2): 193-201
4. Бердиев Б.К., Кормет-Бояка Е., Туссон А., Кадри Ю.Дж., Остервельд-Хат Х.М., Хонг Дж.С., Гонсалес П.А., Фуллер С.М., Соршер Е.Дж., Лукач Г.Л., Бенос Д.Дж.
   Молекулярная близость регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе и эпителиального натриевого канала оценивается с помощью резонансной передачи энергии флуоресценции. Журнал биологической химии, 14 декабря 2007; 282 (50): 36481-8
5. Donaldson SH, Boucher RC
   Натриевые каналы и муковисцидоз.Сундук 2007 ноя; 132 (5): 1631-6
6. Снайдер П.М., Олсон Д.Р., Макдональд Ф.Дж., Бухер ДБ
   Множественные WW-домены, но не C2-домен, необходимы для ингибирования эпителиального Na + канала с помощью человеческого Nedd4. Журнал биологической химии, 27 июля 2001; 276 (30): 28321-6
7. McDonald FJ, Western AH, McNeil JD, Thomas BC, Olson DR, Snyder PM
   Убиквитин-протеинлигаза WWP2 связывается с эпителиальным Na (+) каналом и подавляет его.Американский журнал физиологии. Физиология почек 2002 Сентябрь; 283 (3): F431-6
8. Guggino WB, Stanton BA
   Новое понимание муковисцидоза: молекулярные переключатели, регулирующие CFTR. Обзоры природы. Молекулярная клеточная биология, июнь 2006; 7 (6): 426-36
9. Gelman MS, Kannegaard ES, Kopito RR
   Принципиальная роль протеасомы в деградации, связанной с эндоплазматическим ретикулумом, неправильно свернутого регулятора трансмембранной проводимости внутриклеточного муковисцидоза.Журнал биологической химии 2002 5 апреля; 277 (14): 11709-14
10. Devor DC, Pilewski JM
    UTP ингибирует абсорбцию Na + в бронхиальном эпителии человека, экспрессирующем CFTR дикого типа и DeltaF508. Американский журнал физиологии, апрель 1999 г .; 276 (4 Pt 1): C827-37.
11. Mall M, Wissner A, Gonska T, Calenborn D, Kuehr J, Brandis M, Kunzelmann K
    Ингибирование абсорбции Na (+) чувствительного к амилориду эпителиального Na (+) внеклеточными нуклеотидами в нормальных дыхательных путях человека и при муковисцидозе.Американский журнал респираторных клеток и молекулярной биологии 2000 Dec; 23 (6): 755-61
12. Починюк О., Тонг Q, Старушенко А, Stockand JD
    Связывание и прямая активация эпителиального Na + канала (ENaC) фосфатидилинозитидами. Журнал физиологии, 15 апреля 2007; 580 (Pt. 2): 365-72
13. Ма HP, Chou CF, Wei SP, Eaton DC
    Регуляция эпителиального натриевого канала фосфатидилинозитидами: эксперименты, значения и предположения.Pflugers Archiv: Европейский журнал физиологии, октябрь 2007 г .; 455 (1): 169-80
14. Mall M, Gonska T, Thomas J, Schreiber R, Seydewitz HH, Kuehr J, Brandis M, Kunzelmann K
    Модуляция Ca2 + -активированной секреции Cl- базолатеральными K + каналами в нормальном эпителии дыхательных путей человека и при муковисцидозе. Педиатрические исследования 2003 Апрель; 53 (4): 608-18
15. Bridges RJ, Newton BB, Pilewski JM, Devor DC, Poll CT, Hall RL
    Транспорт Na + в нормальных эпителиальных клетках и эпителиальных клетках бронхов человека ингибируется BAY 39-9437.Американский журнал физиологии. Клеточная и молекулярная физиология легких 2001 Июль; 281 (1): L16-23
16. Donaldson SH, Hirsh A, Li DC, Holloway G, Chao J, Boucher RC, Gabriel SE
    Регулирование эпителиального натриевого канала сериновыми протеазами в дыхательных путях человека. Журнал биологической химии 2002 8 марта; 277 (10): 8338-45
17. Caldwell RA, Boucher RC, Stutts MJ
    Активация сериновой протеазой почти безмолвных эпителиальных Na + -каналов.Американский журнал физиологии. Клеточная физиология 2004 Январь; 286 (1): C190-4
18. Tong Z, Illek B, Bhagwandin VJ, Verghese GM, Caughey GH
    Простазин, заякоренная в мембране серинпептидаза, регулирует натриевые токи в клетках JME / CF15, эпителиальных клетках дыхательных путей при муковисцидозе. Американский журнал физиологии. Клеточная и молекулярная физиология легких 2004 Ноябрь; 287 (5): L928-35
19. Tarran R, Trout L, Donaldson SH, Boucher RC
    Растворимые медиаторы, а не реснички, определяют объем жидкости на поверхности дыхательных путей при нормальном и муковисцидозном поверхностном эпителии дыхательных путей.Журнал общей физиологии 2006 Май; 127 (5): 591-604
20. Su X, Li Q, Shrestha K, Cormet-Boyaka E, Chen L, Smith PR, Sorscher EJ, Benos DJ, Matalon S, Ji HL
    Взаимодействие протон-управляемого Na (+) канала 3 и регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе. Журнал биологической химии, 1 декабря 2006 г.; 281 (48): 36960-8

Классификация рака | SEER Training

Рак классифицируется двумя способами: по типу ткани, в которой возникает рак (гистологический тип) и по первичной локализации, или по месту в организме, где впервые развился рак.В этом разделе представлен первый метод: классификация рака на основе гистологического типа. Международным стандартом классификации и номенклатуры гистологий является Международная классификация онкологических заболеваний, третье издание (МКБ-О-3).

С гистологической точки зрения существуют сотни различных видов рака, которые сгруппированы в шесть основных категорий:

Карцинома

Карцинома относится к злокачественному новообразованию эпителиального происхождения или раку внутренней или внешней оболочки тела.Карциномы, злокачественные новообразования эпителиальной ткани, составляют от 80 до 90 процентов всех случаев рака.

Эпителиальная ткань находится по всему телу. Он присутствует в коже, а также в покрытии и слизистой оболочке органов и внутренних проходов, таких как желудочно-кишечный тракт.

Карциномы делятся на два основных подтипа: аденокарцинома, которая развивается в органе или железе, и плоскоклеточная карцинома, которая возникает в плоском эпителии.

Аденокарциномы обычно встречаются на слизистых оболочках и сначала проявляются как утолщенная белая слизистая оболочка, похожая на бляшку.Они часто легко распространяются через мягкие ткани в том месте, где они возникают. Плоскоклеточный рак встречается во многих частях тела.

Большинство карцином поражает органы или железы, способные к секреции, такие как груди, которые производят молоко, или легкие, которые выделяют слизь, или толстую кишку, или простату, или мочевой пузырь.

Саркома

Саркома относится к раку, который возникает в поддерживающих и соединительных тканях, таких как кости, сухожилия, хрящи, мышцы и жир.Как правило, саркома встречается у молодых людей и развивается в виде болезненного образования на кости. Опухоли саркомы обычно напоминают ткань, в которой они растут.

Примеры сарком:

• Остеосаркома или остеогенная саркома (кость)
• Хондросаркома (хрящ)
• Лейомиосаркома (гладкая мускулатура)
• Рабдомиосаркома (скелетная мышца)
• Мезотелиальная саркома или мезотелиома (мембранная выстилка полостей тела)
• Фибросаркома (фиброзная ткань)
• Ангиосаркома или гемангиоэндотелиома (кровеносные сосуды)
• Липосаркома (жировая ткань)
• Глиома или астроцитома (нейрогенная соединительная ткань, обнаруженная в головном мозге)
• Миксосаркома (примитивная эмбриональная соединительная ткань)
• Мезенхимозная или смешанная мезодермальная опухоль (смешанные типы соединительной ткани)

Миелома

Миелома — это рак, который возникает в плазматических клетках костного мозга.Плазматические клетки производят некоторые белки, содержащиеся в крови.

Лейкемия

Лейкемии («жидкие раковые образования» или «раковые заболевания крови») — это раковые образования костного мозга (места образования клеток крови). Слово лейкемия по-гречески означает «белая кровь». Заболевание часто связано с перепроизводством незрелых лейкоцитов. Эти незрелые лейкоциты не работают так хорошо, как должны, поэтому пациент часто подвержен инфекциям. Лейкемия также влияет на красные кровяные тельца и может вызвать плохую свертываемость крови и утомляемость из-за анемии.Примеры лейкемии:

• Миелогенный или гранулоцитарный лейкоз (злокачественное новообразование миелоидных и гранулоцитарных лейкоцитов)
• Лимфатический, лимфоцитарный или лимфобластный лейкоз (злокачественное новообразование лимфоидных и лимфоцитарных клеток крови)
• Истинная полицитемия или эритремия (злокачественное новообразование, вызванное продуктами различных клеток крови, но с преобладанием эритроцитов)

Лимфома

Лимфомы развиваются в железах или узлах лимфатической системы, сети сосудов, узлов и органов (особенно селезенки, миндалин и тимуса), которые очищают жидкости организма и производят белые кровяные тельца или лимфоциты, борющиеся с инфекциями.В отличие от лейкозов, которые иногда называют «жидким раком», лимфомы являются «твердым раком». Лимфомы также могут возникать в определенных органах, таких как желудок, грудь или мозг. Эти лимфомы называются экстранодальными лимфомами. Лимфомы подразделяются на две категории: лимфома Ходжкина и неходжкинская лимфома. Присутствие клеток Рида-Штернберга в лимфоме Ходжкина диагностически отличает лимфому Ходжкина от неходжкинской лимфомы.

Смешанные типы

Типовые компоненты могут относиться к одной категории или к разным категориям.Вот несколько примеров:

• Аденосквамозная карцинома
• смешанная мезодермальная опухоль
• карциносаркома
• тератокарцинома

В следующем разделе вам будет предоставлен полный список типов тканей и опухолей, которые из них возникают.

Эпителиально-мезенхимальные взаимопревращения в нормальном поверхностном эпителии яичников и карциномах яичников: исключение из нормы — Ахмед — 2007 — Журнал клеточной физиологии

В ходе неопластической прогрессии простой эпителиальный слой OSE, лежащий над стромой, претерпевает изменения в дифференцировке, в результате в потере стромальных компонентов с приобретением характеристик дифференцировки эпителия, происходящего из мюллерова протока, например, яйцевода, эндометрия и шейки матки.OSE и эпителий мюллерова протоков имеют общее происхождение, и OSE часто подвергается дифференцировке по мюллеровскому типу, характерной для метаплазии во взрослой жизни. Это изменение в структуре дифференцировки важно для нашего понимания происхождения подтипов рака яичников и формирует основу для классификации этих видов рака на серозный (подобный фаллопиевым трубам), муцинозный (подобный эндоцервикальному), эндометриоидный (подобный эндометрию). и реже светлоклеточная карцинома (напоминающая светлоклетки).Около 80% всех эпителиальных карцином яичников имеют серозный прототип, чаще всего наблюдаемый в кистах включения, которые претерпели мюллерову метаплазию (Scully, 1995). На клеточном уровне дифференцировка Мюллера сопровождается экспрессией антигенов эпителиальной мембраны, таких как E-кадгерин, CA 125 и муцины (MUC1, MUC2, MUC3 и MUC4; Van Niekerk et al., 1993; Sundfeldt et al., 1997) . Высокая частота дифференцировки Мюллера может потребоваться для обеспечения сигналов выживания и роста при трансформации OSE (Karlan et al., 1995) и могут стать основой для инициации рака яичников.

Распространение рака яичников

Рак яичников распространяется на местные органы малого таза и брюшной полости. Опухоли, разрушающие капсулу яичника, способны распространять злокачественные клетки в брюшную полость, которые могут переноситься нормальной перитонеальной жидкостью. Злокачественные клетки брюшины часто агрегируют и образуют сфероидные структуры, которые впоследствии имплантируются на стенки брюшной полости с различной степенью перитонеальной инвазии.Во многих случаях метастазы в лимфатические узлы и перитонеальное распространение сосуществуют. Было показано, что серозные и недифференцированные карциномы чаще всего метастазируют в другие органы через лимфатические узлы (Sakai et al., 1997). При отдаленном распространении карциномы яичников может поражаться любой орган, включая мозг (Cormio et al., 1995). В наибольшей степени поражается печень, за которой следует легкое (Munkarah et al., 1997). Считается, что наличие асцита является комбинированным результатом лимфатической обструкции и повышенной продукции перитонеальной жидкости клетками, выстилающими брюшную полость (Feldman et al., 1972). Наличие большого объема асцита коррелирует с плохим прогнозом (Dembo et al., 1990).

EMT при раке яичников — клеточная перспектива

Начальным процессом, который регулирует EMT, является нарушение опосредованного E-cadherin межклеточного взаимодействия, которое поддерживает эпителиоидную сеть. Сообщалось, что первичные карциномы яичников экспрессируют E-кадгерин, и его экспрессия снижена во многих запущенных опухолях (Sundfeldt, 2003).Сообщалось о более высоких уровнях растворимого E-кадгерина в жидкости кисты злокачественных опухолей яичников, чем в доброкачественной кисте (Sundfeldt et al., 2001), что указывает на протеолитические механизмы, приводящие к расщеплению связанного с поверхностью E-кадгерина. Это подтверждает, что предпосылка EMT, которая тесно связана с потерей экспрессии E-cadherin и приобретением инвазивного фенотипа, существует при раке яичников. С другой стороны, недавнее исследование продемонстрировало, что экспрессия E-кадгерина была значительно увеличена при метастатических поражениях яичников по сравнению с соответствующими первичными опухолями (Davidson, 2001), предполагая, что экспрессия E-кадгерина происходит периодически во время прогрессирования карциномы яичников. , и необходим для роста как первичных, так и вторичных опухолей.Сообщалось также о клетках, экспрессирующих E-кадгерин, при асците у женщин с раком яичников, а о повышении экспрессии E-кадгерина в клетках карциномы асцита по сравнению с первичными карциномами (Davidson, 2001). Повышенная регуляция E-кадгерина в перитонеальных и метастатических поражениях карцином яичников может быть отмечена как события прогрессирования рака, возможно, опосредующие сигналы выживания для опухолевых клеток на этих участках посредством ингибирования аноикиса и апоптоза, или это может указывать на облегчение МЕТ, как показано при других формах рака (Christiansen and Rajasekaran, 2006).Интересная параллель может быть проведена с реэпителизацией метастазов рака толстой кишки по сравнению с мезенхимальными атрибутами инвазивных клеток и наблюдением эпителиальных атрибутов в карциноме мочевого пузыря, выбранной для колонизации вторичных участков у мышей (Chaffer et al., 2006).

Потеря E-кадгерина при запущенном первичном раке яичников согласуется со склонностью EMT к фактическому метастатическому распространению. Подавление E-кадгерина в некоторых случаях сопровождается повышенной экспрессией N-кадгерина, который способствует передаче мезенхимальных сигналов через взаимодействие со стромальными клетками.Экспрессия N-кадгерина при карциноме яичников плохо документирована. В недавнем исследовании 54 тканей (включая нормальные = 8, доброкачественные = 9, пограничные = 9, степень 1 = 8, степень 2 = 9 и степень 3 = 11), проведенное в нашей лаборатории, экспрессия E и N-кадгерина была наблюдается как в доброкачественных, так и в злокачественных опухолях (рис. 1). Экспрессия E-кадгерина отсутствовала в нормальных тканях яичников (n = 8), а слабая экспрессия N-кадгерина наблюдалась в плоских клетках, подвергающихся дифференцировке только в двух из восьми нормальных опухолей яичников (рис.2). Сообщалось об усилении экспрессии P-cadherin в опухолевых массах яичников с прогрессированием на более поздние стадии (Patel et al., 2003). Эти исследования показывают, что множественные подтипы кадгерина экспрессируются в опухолях яичников и их функциональная роль в поддержании межклеточного и межклеточного взаимодействия все еще не изучена. Учитывая известную роль N-кадгерина в содействии злокачественной трансформации, неизвестно, способствует ли экспрессия N-кадгерина при нормальном OSE злокачественным изменениям.

Иммуногистохимический анализ экспрессии E- и N-кадгерина в эндометриоидных опухолях яичников 1 и 3 степени.Были проанализированы одинаковые опухоли 1 и 3 степени. A , B : экспрессия E-кадгерина при опухолях яичников 1 и 3 степени; ( C , D ) экспрессия N-кадгерина в опухолях яичников 1 и 3 степени. Стрелки указывают на окрашивание мембран E- и N-кадгерином. Увеличение 400 ×.

Иммуногистохимический анализ экспрессии N-кадгерина в нормальных тканях яичников. A : Не наблюдалось экспрессии N-кадгерина в шести из восьми нормальных яичников. B : Экспрессия N-кадгерина в плоских клетках эпителия яичников, наблюдаемая в двух из восьми нормальных тканей яичников. Стрелки указывают на окрашивание мембраны N-кадгерином. Увеличение 400 ×.

Потеря экспрессии гена E-кадгерина, которая является отличительной чертой EMT, в основном связана с активацией Snail, Slug, TWIST, SIP-1 и других факторов транскрипции, подавляющих экспрессию E-кадгерина (Elloul et al., 2006). Эктопическая экспрессия Snail или Slug приводит к увеличению подвижности, инвазивности и онкогенности, связанных с EMT, в линии клеток рака яичников SKOV3 (Kurrey et al., 2005). Snail подавляет экспрессию компонентов адгезивного соединения (E-cadherin и β catenin) и компонентов плотного соединения (occludin и ZO-1), тогда как Slug подавляет экспрессию обоих компонентов, а также компонентов десмосомного соединения (Dsg2). Дальнейшая активация этих транскрипционных факторов гипоксией выявила немедленную активацию экспрессии Slug в раковых клетках яичников с последующим подавлением экспрессии Snail и E-кадгерина (Kurrey et al., 2005). Более того, индуцированная гипоксией повышающая регуляция экспрессии Snail приводит к усилению индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF-1α), подавлению E-кадгерина и инвазивности клеток рака яичников (Imai et al., 2003). Эти наблюдения предполагают, что микросреда опухоли, связанная с гипоксией, может способствовать ЭМП и превращению опухолей яичников в метастатический фенотип. Дальнейшие доказательства ЭМП при раке яичников подтверждаются недавним исследованием, которое продемонстрировало, что 17β-эстрадиол увеличивает экспрессию Snail с последующим увеличением экспрессии MMP-2 и снижением экспрессии E-кадгерина в клеточных линиях рака яичников с положительным и отрицательным рецептором эстрогена. (Динг и др., 2006). Эти исследования предполагают, что системы Slug-Snail-cadherin могут быть возможными кандидатами для молекулярного нацеливания в будущем лечении рака яичников.

Семейство пептидов эндотелина, которые составляют ЕТ-1, -2, -3, являются мощными митогенами для нескольких опухолей человека (Rosano et al., 2003). По сравнению с нормальными яичниками, ЕТ-1 и его рецептор (ЕТ _А R) сверхэкспрессируются в первичных и метастатических карциномах яичников, и высокие уровни ЕТ-1 выявляются у пациентов с асцитом (Bagnato et al., 1999). ЕТ-1 индуцирует ЕМП в клетках рака яичников (Rosano et al., 2005) и косвенно модулирует взаимодействие опухоль-хозяин, модулируя пролиферацию, миграцию, инвазию, секрецию протеазы, образование трубок эндотелиальных клеток и стимулируя неоваскуляризацию in vivo за счет усиления регуляции Экспрессия VEGF и HIF-1α (Salani et al., 2000). ЕТ-1-индуцированная ЭМП в раковых клетках яичников включает изменения фибробластоподобной морфологии, потерю E-кадгерина и β-катенина и усиление экспрессии N-кадгерина, виментина и Snail (Rosano et al., 2005). Активация ET _A R с помощью ET-1 запускает сигнальный путь, опосредованный интегрин-связанной киназой (ILK), ведущий к ингибированию киназы гликогенсинтазы 3 β (GSK3β) (Rosano et al., 2005). Этот путь имеет решающее значение для эффектов, вызывающих ЕМТ при других карциномах (D’Amico et al., 2000) и почечного интерстициального фиброгенеза (Li et al., 2003). Недавно мы продемонстрировали, что EGF-индуцированная EMT при OSE также зависит от этого пути (Ahmed et al., 2006). Также было продемонстрировано, что стимуляция ЕТ-1 раковых клеток яичников придает устойчивость к таксол-индуцированному апоптозу (Del Bufalo et al., 2002). В соответствии с таксолом, который является специфическим для эпителия химиотерапевтическим агентом (Markman, 2007), стимулированные ЕТ-1 мезенхимальные раковые клетки яичников являются химиорезистентными к таксолу. Кроме того, активация ET _A R в клетках рака яичников приводит к трансактивации рецептора EGF, другого известного индуктора ЕМТ в клетках рака яичника (Vacca et al., 2000). Недавние исследования в нашей лаборатории показали, что EGF-индуцированная EMT в эпителиальных раковых клетках яичников приводит к подавлению экспрессии липокалина, активированного желатиназой нейтрофилов (NGAL), установленного индуктора эпителиальных фенотипов (Lim et al., 2007). В совокупности эти данные предполагают, что существует сосуществование ET-1 и EGF-индуцированной передачи сигналов ЕМТ в карциномах яичников, представляющих потенциальные мишени для противоопухолевой терапии.

Костные морфогенетические белки (BMP) экспрессируются во многих тканях взрослых, включая яичники (Theriault et al., 2007). У крыс BMP4 активируется в OSE рядом с местом овуляции (Fathalla, 1971), что указывает на роль BMP4 в репарации OSE за счет стимулирования пролиферации и миграции клеток.Недавно было сообщено, что существует внутренняя разница в передаче сигналов BMP4 в нормальных OSE и раковых клетках яичников (Theriault et al., 2007). Обработанные BMP4 клеточные линии рака яичников претерпевают связанные с EMT изменения, такие как повышенные уровни экспрессии Snail и Slug, подавление экспрессии E-кадгерина с повышенной клеточной подвижностью, инвазивность, ремоделирование ECM с реорганизацией актинового цитоскелета и активация Rho GTPases ( Theriault et al., 2007). С другой стороны, клетки OSE не реагируют на BMP4 изменением подвижности клеток, а подвергаются перестройке цитоскелета, как это показано на раковых клетках.Это говорит о том, что OSE и раковые клетки яичников обладают различными регуляторными механизмами для ответа на экзогенные стимулы. Было показано, что помимо цитокинов, описанных выше, VEGF и лизофосфатидная кислота, которые в большом количестве присутствуют в асците и сыворотке больных раком яичников, вызывают инвазивность в культивируемых клеточных линиях рака яичников (Ren et al., 2006; Wang et al. ., 2006). В недавнем исследовании мы показали, что асцит у пациентов с раком яичников вызывает определенные изменения, связанные с инвазивностью раковых клеток яичников (Ahmed et al., 2005). Недавнее исследование продемонстрировало, что гонадотропины, такие как фолликулостимулирующий гормон и лютеинизирующий гормон, активируют протеолиз и инвазивность клеток рака яичников (Choi et al., 2006), что согласуется с эпидемиологическими исследованиями, демонстрирующими повышенную частоту рака яичников у женщин, подвергшихся воздействию избытку гонадотропинов во время менопаузы или лечения бесплодия (Shoham, 1994; Shushan et al., 1996). Однако до сих пор не известно, является ли это облегчение инвазивности гормонами и факторами роста ЭМП-зависимостью.

Исследования, описанные выше, предоставляют убедительные доказательства того, что EMT играет важную роль в модулировании подвижности и инвазивности клеток рака яичников, растущих в двумерной ситуации. Однако данных о статусе EMT раковых клеток яичников, попавших в брюшину, нет. Несколько недавних исследований продемонстрировали, что клетки карциномы, плавающие в асците, обладают способностью прилипать и вторгаться в мезотелиальную выстилку (Burleson et al., 2006). Повышение экспрессии MMP-2 с сопутствующим подавлением экспрессии TIMP-2 было продемонстрировано в злокачественных клетках при перитонеальном асците по сравнению с первичными опухолями (Davidson, 2001).Недавно экспрессия Smad взаимодействующего белка 1 (Sip1), который регулирует экспрессию E-cadherin и MMP-2, была продемонстрирована в клетках карциномы асцита пациентов с карциномой яичников (Elloul et al., 2005). Более того, агрегаты или сфероиды карциномы брюшных яичников защищены от апоптоза, вызванного радиацией и терапевтическими препаратами, такими как таксол (Makhija et al., 1999). Эти исследования предполагают, что отколовшиеся опухолевые клетки яичников, которые выживают как свободно плавающие клеточные агрегаты в асците, являются инвазивными и способны подвергаться ЭМП.Кроме того, асцит содержит множество факторов роста и цитокинов, которые могут индуцировать ЭМП в плавающих клеточных агрегатах опухоли. Поскольку злокачественные клеточные агрегаты при асците трудно отделить, мы адаптировали модель культуры ткани клеточных агрегатов или сфероида рака яичника, используя технику наложения жидкости (Santini and Rainaldi, 1999). Используя этот метод, мы недавно продемонстрировали, что линии клеток рака яичников, выращенные в виде клеточных агрегатов, могут поддерживать рост в течение 10 дней, в то время как нормальная линия клеток яичников не может расти дольше 2 дней (Shield et al., 2007а). Агрегаты раковых клеток экспрессировали повышенные уровни мезенхимальных маркеров, таких как интегрин α2β1 (Valles et al., 1996), N-кадгерин, виментин и секретируемый про-MMP2 / MMP9, а также активированный MMP2 / MMP9, при этом такой активации MMP не наблюдалось. в монослойных клетках (Shield et al., 2006, 2007b). В недавнем исследовании сообщалось об инвазивных характеристиках сфероидов асцита, выделенных у пациентов с раком яичников, и эта инвазивность коррелировала с сокращением выживаемости пациентов на 16-17 месяцев (Burleson et al., 2006). В том же исследовании сообщалось о ретракции мезотелиального слоя в месте прикрепления сфероида. Этот эффект, однако, исчез к 7 дню после полного рассеивания сфероидных клеток, указывая на то, что опухолевые сфероиды асцита обладают способностью разрушать мезотелиальный монослой, но после дезагрегирования теряют способность делать это. На основании этих предварительных наблюдений можно предположить, что карцинома яичников в «сфероидальном режиме» в брюшине способствует ЭМП, наделяя клетки свойствами, способствующими метастазированию.Однако метастатическое прогрессирование в сальник может в конечном итоге потребовать обратного, MET, представляющего метастазы, чтобы они очень напоминали соответствующие им первичные опухоли. Основываясь на этих наблюдениях, мы предлагаем рабочую модель прогрессирования рака яичников, которая обеспечивает основу для развития EMT / MET как механистического процесса локализованного распространения рака яичников (рис. 3).

Рабочая модель прогрессирования рака яичников.Во время прогрессирования рака яичника клетки эпителиального рака яичника, растущие на поверхности яичника, подвергаются EMT для достижения подвижных функций, необходимых для метастазирования рака. Разрыв опухоли яичников приводит к распространению опухолевых клеток в брюшину, где они выживают в виде клеточных агрегатов / сфероидов. Эти сфероиды претерпевают изменения в инвазивном мезенхимальном фенотипе для поддержания выживания и подвижности. Раковые сфероиды и окружающие их мезотелиальные и инфильтрирующие клетки крови секретируют цитокины и факторы роста (например,g., VEGF, TNF-α, IL-6, IL-8, bFGF, лизофосфатидная кислота и др.) в виде асцита в брюшине. Секретируемые факторы образуют аутокринную / паракринную петлю, которая инициирует и поддерживает EMT, чтобы способствовать инвазивности сфероидов карциномы, пока они не найдут вторичный сайт прикрепления. Однако рост сальника требует МЕТ для поддержания роста рака.

органоидных культур из нормальных и склонных к раку тканей молочной железы человека сохраняют сложные эпителиальные клоны

Размножение нормальных органоидов молочной железы человека

Мы успешно установили 79 культур органоидов из нормальных тканей молочной железы человека, полученных либо в результате редукционной маммопластики (выполняемой для уменьшения размера груди), либо от профилактических мастэктомий (выполняемых для предотвращения РМЖ) с использованием условий культивирования, описанных ранее ⁴ .Во всех случаях нормальная гистология исходной ткани была подтверждена при осмотре патологом груди (D.D.). Скорость создания органоидных культур была высокой, с эффективностью 95%. Как и в случае с другими органоидными системами ¹⁵ , культуры можно размножать в течение длительного времени, при этом самая длинная органоидная культура может быть перенесена в течение> 16 месяцев. Органоиды обычно диссоциировали и пассировали каждые 2–4 недели.

Было обнаружено, что органоиды нескольких типов тканей демонстрируют единую определяющую морфологию, которая напоминает гистологию ткани происхождения, такой как кишечная крипта ¹⁶ .Напротив, мы обнаружили, что эпителиальные клетки молочных желез самоорганизуются в множество различных структурных типов в культуре органоидов (Fig. 1a, b). Большинство структур были ацинарного типа и имели просвет, который был либо изолирован, либо ассоциирован с зарождающимся органоидом. Также присутствовали твердые сферы в дополнение к разветвленным трубчатым структурам. Ветвящиеся или почкующиеся структуры присутствовали в 1 из 102 органоидов ( n = 3 культуры, дополнительная таблица 1). Последние были отмечены во время ранних пассажей, но стали менее частыми с повторной диссоциацией и продолжительным ростом.Органоиды окрашивали на люминальный маркер цитокератин 8 (CK8) и базальный маркер цитокератин 14 (CK14), и было обнаружено, что они состоят из люминальных клеток, базальных клеток или смеси обоих типов клеток (рис. 1c – e). это указывает на то, что в этих культурах сохраняются как базальные, так и просветные клетки.

Рис. 1. Эпителий молочной железы человека можно размножать без иммортализации в виде органоидных культур.

a Ткань молочной железы человека переваривали и культивировали в органоидной среде BC, как описано ранее. ⁴ .Культуру, демонстрирующую несколько типов органоидной структуры (обозначенных красными стрелками, представляющими n = 79), визуализировали с помощью фазово-контрастной микроскопии, масштабная линейка = 100 мкм. b , c Органоиды окрашивали, как указано для актина (красный) и расщепленной каспазы 3 (зеленый), чтобы продемонстрировать клиренс просвета, или окрашивали на CK8 (зеленый), CK14 (красный) и актин (белый), и контрастно окрашен DAPI (синий), n = 4, масштабная линейка = 100 мкм. Органоиды были визуализированы с помощью конфокальной микроскопии. d Показаны конфокальные изображения с малым увеличением для репрезентативной культуры, n = 4, масштабная линейка = 100 мкм. e Количественное определение органоидов, положительных по CK8 и / или CK14 в каждой из четырех нормальных культур молочной железы. f Органоиды окрашивали на ERα (зеленый), актин (красный) и DAPI (синий) и отображали с помощью конфокальной микроскопии (левая панель, масштабная линейка = 100 мкм). Органоиды обрабатывали 0,5 нг / мл эстрадиола в течение 7 дней, и жизнеспособность органоидов анализировали с помощью Cell-Titer-Glo (правая панель).Показаны среднее и стандартное отклонение (ORG9, n = 3). г Три репрезентативные культуры органоидов (ORG45, ORG9 и ORG24) окрашивали EpCAM и CD49f, и эти маркеры, а также включение EDU измеряли с помощью проточной цитометрии.

Этот метод культивирования особенно отличался эффективным размножением просветных клеток. Это было очевидно на основе экспрессии цитокератина в просвете с помощью иммунофлуоресценции, идентификации клеток с высоким содержанием EpCAM с помощью проточной цитометрии и создания органоидных структур просвета ацинарного типа.Подмножество органоидов молочной железы сохраняло экспрессию рецептора эстрогена альфа (ERα) в культуре и росло в ответ на лечение эстрадиолом (рис. 1f и дополнительный рис. 1а). В среднем 34% органоидов в культуре содержали по крайней мере одну клетку, положительную по ER ( n = 5 культур). При подсчете на клетку, а не на органоид, в среднем 10% всех клеток в культуре были положительными по ER ( n = 5 культур) (дополнительная таблица 2).

Анализ проточной цитометрии культур органоидов с использованием маркеров EpCAM и CD49f показал, что зрелый просвет (EpCAM ⁺ CD49f ^—), предшественник просвета (EpCAM ⁺ CD49f ⁺ ) и базальный / стволовый (EpCAM ^{) —} CD49f ⁺ ) все клетки поддерживали в культуре (см. Три репрезентативных примера на рис.1г).

Молочные линии образуют различные морфологии органоидов

Морфологическая оценка отдельных органоидов в культуре показала, что они демонстрируют различные типы структур; при последующем анализе каждая морфология могла быть сопоставлена ​​с отдельным клоном клеток молочной железы (Fig. 2a, b). Клетки из органоидов были отсортированы с помощью FACS с использованием EpCAM и CD49f на зрелые просветные клетки (EpCAM ⁺ CD49f ^—), предшественники просвета (EpCAM ⁺ CD49f ⁺ ) и базальные / стволовые клетки (EpCAM ^— CD49f ^{). +} ) подтипы ^6,10,17,18 , а затем повторно культивировали в органоидных условиях.Отсортированные клетки экспрессировали базальные и люминальные маркеры, как и ожидалось (рис. 2c). Зрелые просветные клетки образовывали ацинусы с просветом, тогда как просветные клетки-предшественники образовывали меньшие сферы с меньшим просветом, и последний тип органоидов экспрессировал известные маркеры LP-клеток (рис. 2b, c и дополнительный рис. 1b, c). Базальные / стволовые клетки формируют большие дезорганизованные сферы, которые могут демонстрировать почкование просвета или ветвящиеся выросты (Fig. 2b, c).

Рис. 2. Типы эпителиальных клеток молочной железы образуют отдельные структуры в культуре органоидов.

a Изображение под микроскопом в светлом поле репрезентативной культуры органоидов, демонстрирующее несколько типов структур, выделенных красными стрелками. b Репрезентативные примеры морфологии органоидов для каждой из указанных линий клеток молочной железы. c Клетки из органоидной культуры (представитель n = 9 культур) окрашивали на EpCAM и CD49f и сортировали с помощью FACS на зрелый просвет (ML, красный), предшественник просвета (LP, оранжевый) и базальный / стволовый клеточные (BS, зеленые) популяции.Клетки рекультивировали как органоиды, а затем оценивали с помощью светлопольной микроскопии ( n = 9) или конфокальной микроскопии после окрашивания на указанные маркеры (столбец 1, столбцы 2-3 и столбцы 4-6 взяты из отдельных изображений, n = 3). Масштабные линейки = 100 мкм. d , e Клетки указанных типов были повторно культивированы после сортировки в течение> 6 недель, затем отображены с помощью микроскопии в светлом поле d , (представитель n = 9, масштабная линейка = 100 мкм) или проанализированы для экспрессии EpCAM и CD49f с помощью проточной цитометрии в и .Культуры с клетками-предшественниками просвета, которые дифференцировались с образованием других типов клеток молочной железы, были ORG7, ORG43, ORG46, ORG48, ORG49 и ORG51. ORG41, ORG42 и ORG50 имели клетки-предшественники просвета, которые не дифференцировались с образованием других типов клеток молочных желез. f Клетки-предшественники просвета (EpCAM ⁺ CD49f ⁺ ), отсортированные из двух разных культур органоидов, повторно культивировали как органоиды, окрашивали на CK8 (зеленый) или EpCAM (зеленый), CK14 (красный) и DAPI (синий) , и изображение получено с помощью конфокальной микроскопии (репрезентативно для n = 6, масштабная линейка = 100 мкм). г Клетки дважды сортировали на EpCAM и CD49f, затем повторно выращивали и анализировали, как в и .

Эти типы структур аналогичны тем, которые генерируются другими методами трехмерного культивирования молочной железы, что отражает присущую нормальным клеткам молочной железы способность самоорганизовываться в протоковые или долькообразные структуры при воздействии экстракта базальной мембраны ^{19,20, 21,22} . Однако созданные нами органоиды были примечательны тем, что несколько структур и типов клеток сосуществовали в одной культуре, и разнообразие можно было воспроизвести даже после повторной диссоциации и пассирования органоидов.Все типы клеток могут образовывать органоиды. Хотя базальные / стволовые клетки образовывали более крупные органоиды, их общая эффективность образования органоидов была ниже, чем у других типов клеток. Эффективность образования органоидов была рассчитана как 1 из 16 зрелых клеток просвета, 1 из 10 клеток-предшественников просвета и 1 из 117 базальных / стволовых клеток ( n ≥ 3 культур, оцененных для каждой) (дополнительная таблица 3).

Чтобы оценить их рост и дифференцировку в культуре, клетки, отсортированные по EpCAM и CD49f, впоследствии отслеживали в культуре органоидов в течение не менее 6 недель.В то время как зрелые клетки просвета EpCAM ⁺ CD49f ^— генерировали преимущественно ацинарные структуры, которые оставались EpCAM ⁺ , базальные / стволовые клетки EpCAM ^— CD49f ⁺ генерировали более разнообразные типы структур, включая базальные, просветные клетки-предшественники и зрелые просветные клетки. типы (рис. 2г, д). Интересно, что отсортированные клетки-предшественники просвета EpCAM ⁺ CD49f ⁺ были способны генерировать как зрелые просветные, так и базальные клетки (рис. 2d, e, шесть из девяти протестированных культур).Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило экспрессию базальных и люминальных маркеров в органоидах, полученных из одиночных просветных клеток-предшественников (рис. 2f). Эти результаты можно было обобщить после двойной сортировки клеток для повышения чистоты (рис. 2g). Ранее сообщалось о способности предшественников просвета генерировать как просветные, так и базальные клетки in vitro и in vivo (в экспериментах по восстановлению молочных желез) ^23,24 .

В трех из девяти случаев отсортированные клетки-предшественники просвета не дифференцировались в культуре ни на просветные, ни на базальные клоны (процент клеток, которые были предшественниками просвета после сортировки и повторного культивирования, составлял 95.2, 97,4 и 99,6%). В двух из этих случаев родительские несортированные культуры преимущественно состояли из органоидов типа предшественников просвета на основании морфологии (процент клеток, являющихся предшественниками просвета, составлял 96,6%, 30,6% и 87,4% соответственно). Возможно, что зрелые люминальные и базальные типы клеток не присутствуют в некоторых культурах, потому что люминальные клетки-предшественники неспособны дифференцироваться в другие типы клеток.

Органоиды сохраняют сложные клоны эпителия молочной железы

Чтобы получить более высокое разрешение изображения сложных типов клеток молочной железы в культуре органоидов, мы использовали массовую цитометрию, или CyTOF.Этот метод позволил нам измерить уровни 38 белков на уровне одной клетки, по сравнению с проточной цитометрией, где обычно измеряются только 2–4 белка. ^25,26 . Мы создали уникальную панель из 38 меченных металлами антител, распознающих белки, связанные с функцией клеток молочной железы, происхождением и онкогенезом (дополнительный рис. 2), чтобы очертить паттерны экспрессии специфичных для молочных желез белков на отдельных клетках в культурах органоидов.

Массовая цитометрия была выполнена на панели из 12 культур органоидов, полученных из нормальных тканей молочной железы пациентов разного возраста (19–58 лет), паритета (G0 – G4) и статуса наследственной мутации (нет, BRCA1 , BRCA2 , TP53 , ATM и PALB2 ).Как уже упоминалось, все ткани были гистологически нормальными. У большинства пациентов ранее не было РМЖ; у двух пациентов с наследственными мутациями в генах предрасположенности к раку и анамнезом предшествующей РМЖ мы также подтвердили, что клетки в культуре органоидов были диплоидными (дополнительный рис. 3). Чтобы свести к минимуму контаминацию стромы, культуры анализировали после пассажа 4. Стромальные клетки могут сохраняться в культуре во время ранних пассажей, но к пассажу 4 стромальные клетки не оставались в 11 из 12 культур (описанных ниже), и оставалось лишь небольшое количество остаточных. фибробласты присутствуют в одной культуре.

Результаты CyTOF были проанализированы с использованием алгоритма кластеризации с X-сдвигом для поиска групп или кластеров похожих клеток на основе уровней экспрессии 38 маркеров молочной железы. Затем кластеры отображались с помощью силовой схемы (рис. 3а). Как описано в другом месте ²⁷ , здесь каждая точка представляет одну клетку, а близость клеток, как показано на графике, соответствует сходству их паттернов экспрессии белка. Анализ X-сдвига определил 29 кластеров эпителиальных клеток в культурах органоидов, представляющих разные типы клеток, а также различия в экспрессии белков внутри клеточных линий и между пациентами (рис.3а). Оценка базальных и просветных маркеров снова подтвердила, что основные подтипы эпителия сохранялись в культуре (рис. 3b – d и дополнительный рис. 4) с минимальным загрязнением стромы в одной культуре (121 клетка, рис. 3c). Важно отметить, что мы подтвердили, что уровни BRCA1 и p53 не влияли на определение основных кластеров, даже несмотря на то, что некоторые из этих пациентов имели унаследованные мутации в этих генах; повторный запуск алгоритма X-сдвига без BRCA1 и p53 воспроизвел почти идентичный шаблон кластеризации с первым анализом (дополнительный рис.5).

Рис. 3. Массовая цитометрическая оценка подтипов клеток молочной железы в нормальных органоидах молочной железы.

Форс-направленная схема, изображающая CyTOF-анализ 12 нормальных культур органоидов молочной железы. Каждая точка представляет одну ячейку и окрашена кластером, заданным с помощью X-сдвига. b Показаны уровни экспрессии маркеров, используемых для определения основных популяций молочной железы (более теплые цвета = более высокие уровни экспрессии). c Выделение основных клонов молочных желез на направленном по силе макете, как определено по экспрессии маркера в b . d Тепловая карта, показывающая уровни экспрессии указанных маркеров в клетках из репрезентативной культуры органоидов (красный = высокая экспрессия, синий = низкая экспрессия). 38 маркеров на панели CyTOF показаны на оси x , а отдельные ячейки на оси y упорядочены на основе кластеризации X-сдвига.

При анализе CyTOF этого большого набора образцов органоидной культуры было обнаружено несколько примечательных результатов, как показано на кластерной тепловой карте на рис.3d и дополнительный рис. 4 с дополнительными примерами, показанными в виде направленной по силе компоновки на дополнительном рис. 6. Зрелые клетки просвета в органоидах поддерживали экспрессию белков, которые характерны для их аналогов в первичных тканях, например, CK8, MUC1, EPCAM, CD24, HER2 и вариабельная экспрессия ERα ^11,28 . Уровни экспрессии PR в органоидах также были вариабельными, но в целом низкими. Кроме того, ранее сообщалось, что BRCA1 экспрессируется на самом высоком уровне в зрелых клетках просвета, с промежуточной экспрессией в клетках-предшественниках просвета и на самом низком уровне экспрессии в базальных / стволовых клетках, и этот паттерн хорошо сохраняется в органоидах ^28,29 .Предшественники просвета отличались более высокой экспрессией CD133 ¹¹ , а базальные клетки экспрессировали CD49f и по-разному экспрессировали SMA, EGFR, CD90 и CD10 ³⁰ . Кроме того, небольшая (<1%) популяция клеток, экспрессирующих EPCR (также известных как PROCR), может быть идентифицирована в основной популяции. Было показано, что PROCR маркирует редкую популяцию базальных мультипотентных стволовых клеток в молочной железе мыши ³¹ , и было показано, что он связан с экспрессией связанных со стволовостью факторов транскрипции и более высокой способностью к формированию атмосферы в клетках молочной железы человека ³² .

Для более прямого сравнения экспрессии белка в культурах органоидов с тканями, из которых они были получены, четыре ткани молочной железы были использованы для создания свежедиссоциированных единичных клеток, которые немедленно фиксировались параформальдегидом и замораживались для CyTOF, а также культуры органоидов, которые поддерживали в течение четырех пассажей, а затем диссоциировали на отдельные клетки и готовили для CyTOF. Ткани и соответствующие культуры органоидов были проанализированы CyTOF в одной партии с использованием нашей панели антител, специфичных для молочной железы.Для сравнения, одну ткань культивировали как HMEC в каноническом двумерном формате культуры, и снова соответствующие HMEC запускали в той же партии, что и клетки, выделенные непосредственно из исходной ткани.

X-сдвиг определяет 70 кластеров в четырех парах совпадающих тканей и органоидов; 44 из них были эпителиальными скоплениями (рис. 4а). Используя стандартные маркеры для определения стромальных клеток, а также люминальных и базальных эпителиальных клеток, мы подтвердили, что основные типы эпителиальных клеток молочной железы сохраняются в культуре (рис.4б – г). Культуры органоидов сохранили значительную степень сходства с тканями, из которых они были получены, что отражено в близости в пространстве на направленном по силе макете, а также в кластеризации, определяемой с помощью X-сдвига, и отображении экспрессии белков на тепловой карте (рис. 4d, левая панель и дополнительный рис. 7а). В отличие от органоидов, HMECs, выращенные только для двух пассажей в стандартной двумерной культуре с использованием среды Lonza MEGM, значительно отличались от первичных тканей, теряли большую часть просветных клеток и демонстрировали паттерн экспрессии белка со смешанными базальными и просветными характеристиками, которые не походили на любые клетки первичной ткани (рис.4d, правые панели и дополнительный рис. 7b).

Рис. 4. Сложные паттерны экспрессии белка, специфичного для молочной железы, из исходной ткани сохраняются в культуре.

Четыре нормальные ткани молочной железы были расщеплены до единичных клеток и зафиксированы параформальдегидом. Параллельно с этим из каждой ткани генерировали культуры органоидов, пассировали четыре раза, расщепляли до отдельных клеток и фиксировали. Уровни экспрессии белков 38 маркеров, связанных с онкогенезом и развитием молочной железы, анализировали на уровне отдельных клеток в культурах органоидов и соответствующих тканях происхождения с использованием цитометрии по времени пролета (CyTOF). a Силовое расположение органоидных культур и совпадающих исходных тканей, где каждая точка представляет одну клетку, а близость в пространстве связана с их сходством с точки зрения паттернов экспрессии белков. Ячейки окрашены кластерами, заданными с помощью X-сдвига. b Выделение основных популяций молочной железы по силовому расположению на основе экспрессии стандартных белковых маркеров для этих типов клеток. c Примеры клон-специфических маркеров, используемых для определения популяций молочных желез, показанных в b , включая просвет (CK8 и EpCAM), зрелый просвет (GATA3) и базальный / стержневой (CK14, SMA и CD49f), а также в качестве стромальных маркеров (CD31, CD45 и CD140b) (более теплые цвета = более высокие уровни экспрессии). d Для сравнения нормальную ткань молочной железы переваривали до отдельных клеток и фиксировали, и параллельно получали и дважды пассировали двумерную культуру эпителиальных клеток молочной железы человека (HMEC, культивируемые в Lonza MEGM). HMEC и соответствующие ткани происхождения также были проанализированы с использованием CyTOF, как в и . Экспериментальная схема, разграничение типов клеток на направленном под действием силе макете и клетки из ткани или клетки из культуры выделены на разных панелях как для органоидов (левый столбец), так и для HMEC (правый столбец). e Корреляция между профилями экспрессии белка каждой HMEC или органоидной клетки и сигнатурами экспрессии, полученными из основных эпителиальных кластеров в соответствующей первичной ткани. Прямоугольные диаграммы (центральная линия, медиана; границы прямоугольника, верхний и нижний квартили; усы, 1,5 × межквартильный размах) показывают максимальное значение — каждой клетки для основных эпителиальных кластеров, стратифицированных по образцам. Статистическая значимость оценивалась с помощью двустороннего критерия Манна – Уитни (*** p <2.2e − 16).

Мы провели статистическое сравнение профилей экспрессии белков каждой клетки в культурах HMEC и органоидов с сигнатурами, полученными из основных типов эпителия в соответствующей первичной ткани. Клетки из культур органоидов продемонстрировали значительно более сильную корреляцию с первичными тканевыми эпителиальными сигнатурами экспрессии, чем клетки из культуры HMEC (рис. 4e).

Чтобы гарантировать, что различия между HMEC и тканями не связаны с вариациями от пациента к пациенту, мы создали культуру органоидов и HMEC, происходящие из одного и того же образца ткани молочной железы.Множественные клоны эпителия молочных желез могут быть обнаружены в культуре органоидов, но не в HMECs (Fig. 5a). HMECs снова значительно отклонились от первичных тканей (рис. 5b). Аналогичное сравнение десяти культур органоидов с набором из четырех несопоставимых первичных тканей молочной железы продемонстрировало, что паттерны экспрессии белка отдельных клеток коррелировали между культурой и несоответствующей тканью со средним значением r Пирсона в диапазоне от 0,54 до 0,76 (в среднем 0,67, рис. 5c). . CyTOF-анализ трех иммортализованных линий HMEC аналогичным образом показал значительные различия в экспрессии маркеров клонов ³³ , как и клетки MCF10A, выращенные в трехмерной культуре, которые часто используются для моделирования нормального эпителия молочной железы человека (дополнительный рис.8).

Рис. 5: Анализ подобранной органоидной культуры, HMEC и первичной ткани с помощью CyTOF.

Ткань молочной железы была диссоциирована и использована для создания культуры органоидов (ORG24), а также стандартной двумерной культуры HMEC (HMEC24). Клетки из ткани также напрямую фиксировали и замораживали для будущего анализа. Клетки из культур вместе с клетками из ткани анализировали CyTOF. На тепловых картах и показаны отдельные клетки из культур или сопоставленных тканей, как указано, с цветной полосой слева, указывающей на различные кластеры, определенные с помощью X-сдвига.b Корреляция между профилями экспрессии белка HMEC или органоидной клетки и сигнатурами экспрессии, полученными из основных эпителиальных кластеров в согласованной первичной ткани. Прямоугольные диаграммы (центральная линия, медиана; границы прямоугольника, верхний и нижний квартили; усы, 1,5 × межквартильный размах) показывают максимальное значение — каждой клетки для основных эпителиальных кластеров, стратифицированных по образцам. Статистическая значимость оценивалась с помощью двустороннего критерия Манна – Уитни (*** p <2.2e − 16). c Корреляционный анализ, как в b , проведенный для указанных десяти культур органоидов по сравнению с набором из четырех несовпадающих первичных тканей молочной железы.

В этих анализах также наблюдались заметные различия между культурами органоидов и первичными тканями. В некоторых культурах органоидов экспрессия CD10 была потеряна (дополнительный рис. 7a). Это может означать потерю взаимодействующих стромальных клеток или врожденной тканевой архитектуры, и то и другое не может быть полностью воспроизведено in vitro.В тех случаях, когда экспрессия CD10 сохранялась, эти клетки представляли собой субпопуляцию базовой популяции CD90 ⁺ (дополнительная фигура 6). Кроме того, органоиды проявляли высокие уровни экспрессии CD44 по сравнению с первичными тканями молочной железы (дополнительные рисунки 6 и 7a). Ранее сообщалось об увеличении CD44 в культивируемых клетках молочной железы, что объяснялось их повышенной скоростью пролиферации в культуре ³⁴ . Кроме того, CD44 является геном-мишенью Wnt и может индуцироваться R-спондином 1 в культуральной среде органоидов ³⁵ .Наконец, как отмечалось выше, экспрессия PR в культурах органоидов в целом была низкой (дополнительный рис. 7a). Однако эти изменения не были столь разительными, как различия между первичными тканями и культурами HMEC, где наблюдалась значительная потеря разнообразия клонов и нормальных различий между тремя основными популяциями молочных желез.

Многие из изменений, наблюдаемых в HMEC и MCF10A, были ранее описаны на основе небольшого количества маркеров (например, CK14, CK8, виментин и ERα), указывающих на клетки со смешанным базальным и просветным фенотипом ^3,36,37 ; однако анализ CyTOF с большей панелью маркеров обеспечил анализ этих клеток с более высоким разрешением.

Неоднородность органоидов с и без мутаций

BRCA1

Предыдущие анализы тканей молочной железы человека показали высокую степень вариабельности клеточного состава от пациента к пациенту ^38,39,40 . Чтобы оценить, присутствуют ли аналогичные результаты в культурах органоидов, мы извлекли уровни экспрессии EpCAM и CD49f из анализов CyTOF 12 культур органоидов, а также из трех дополнительных культур, запущенных в более раннем пилотном проекте, чтобы определить долю клеток, присутствующих в каждой. из трех основных линий молочной железы.Мы обнаружили, что хотя линии молочных желез сохраняются в культуре органоидов, относительная доля каждой линии действительно варьируется от культуры к культуре (Рис. 6a). Это также заметно в кластерах, определяемых X-сдвигом, и в компоновке, направленной по силе (Рис. 6b и Дополнительный Рис. 9). Чтобы оценить, отражает ли эта вариабельность врожденную вариабельность от пациента к пациенту, мы сравнили распределение по клонам пяти культур органоидов из рис. 4 и 5 к соответствующим тканям и обнаружил, что распределение клонов было сходным в трех случаях, но разительно различающимся в двух (рис.6в). Различия в распределении клонов могут быть связаны с артефактом отбора проб, поскольку только относительно небольшая часть груди используется для создания органоидной культуры. Кроме того, различия в клинических переменных, таких как возраст, половая принадлежность и статус наследственной мутации, могут способствовать изменчивости и могут привести к обогащению определенных популяций клеток в культуре.

Рис. 6: Гетерогенность присутствует в распределении клонов молочных желез в культурах органоидов.

a Долю клеток в базальных, предшественниках просвета и зрелых клонах просвета определяли с использованием уровней EpCAM и CD49f, измеренных с помощью CyTOF для каждой из указанных 15 культур органоидов молочной железы.Образцы без известной мутации в гене предрасположенности к раку груди отмечены звездочкой. По гистологическим данным все случаи были нормальными. b Схема с принудительной ориентацией, в которой каждая точка представляет одну ячейку, окрашенную идентификатором культуры (см. Дополнительный рис. 9). c Процент эпителиальных клеток в каждой из указанных основных клонов молочной железы показан для указанных культур органоидов и соответствующих первичных тканей.

Ранее сообщалось, что ткани груди женщин с наследственной мутацией в BRCA1 имеют более высокую долю просветных клеток-предшественников, которые могут быть обнаружены до любого явного туморогенеза ¹¹ .Мы предположили, что часть очевидных вариаций от пациента к пациенту в клеточных клонах в культурах органоидов может быть связана с аналогичным увеличением доли просветных клеток-предшественников в культурах с мутацией в BRCA1 . Анализ 12 культур органоидов, полученных из восстановительных маммопластов, по сравнению с 12 культурами органоидов, полученных от носителей мутации BRCA1 , действительно показал, что BRCA1 -мутированные культуры органоидов имеют более высокую долю просветных предшественников (рис.7а, б). Важно отметить, что для этого анализа пациенты были сопоставлены в отношении потенциальных смешивающих переменных возраста и половой принадлежности (дополнительный рисунок 10). Интересно, что это различие не было результатом увеличения пролиферации предшественников просвета от носителей мутации BRCA1 на основе включения EDU (рис. 7c), предполагая, что увеличение числа предшественников просвета не было результатом преимущественного распространения во время культивирования. процесс, но вместо этого может отражать другие присущие свойства или высокую долю предшественников просвета в нативных тканях, как сообщалось ранее ¹¹ .

Рис. 7: BRCA1 -гетерозиготные органоиды молочной железы имеют повышенную долю предшественников просвета.

a Репрезентативные культуры органоидов без (дикого типа) и с известной наследственной мутацией в BRCA1 расщепляли до единичных клеток, фиксировали и окрашивали на EpCAM и CD49f. Показаны графики проточной цитометрии. b Количественная оценка популяций зрелых люминальных (ML), просветных предшественников (LP) и базальных / стволовых (базальных) популяций, определяемых с помощью проточной цитометрии оценки уровней EpCAM и CD49f, показаны для 12 культур органоидов дикого типа (WT) в сравнении с 12 культурами, полученными из тканей груди пациентов с наследственной мутацией BRCA1 (B1 mut). c Пролиферацию клеток молочной железы измеряли во всех 24 культурах путем инкубации с EDU в течение 16 часов и измерения включения EDU. В b показано среднее и c с 95% доверительным интервалом. * p = 0,037, по критерию Стьюдента t , двусторонний.

В дополнение к культурам с расширенными популяциями просветных предшественников были идентифицированы две культуры со значительно большей долей зрелых просветных популяций. Удивительно, но эти культуры «преимущественно зрелых люминальных клеток» можно было пассировать в течение> 8 месяцев in vitro, несмотря на то, что они почти полностью состоят из более дифференцированных клеток (дополнительный рис.11а). Культуры состояли из полых ацинарных структур; со временем развились более крупные структуры с многопросветной морфологией. Они также иногда наблюдались в других культурах с меньшей частотой, были ранее описаны ⁴¹ и напоминают доброкачественную обычную гиперплазию протоков (дополнительный рис. 11b, c). Интересно, что пролиферирующие зрелые клетки просвета экспрессировали более высокие уровни субъединицы γ2 ламинина 332 (ранее называвшегося ламинином 5 (V)), белка базальной мембраны, который обычно продуцируется базальными миоэпителиальными клетками (дополнительный рис.11г). В органоидах это может быть следствием близости клеток просвета к экстракту базальной мембраны, в котором они выращиваются.

Таким образом, большинство тканей молочной железы при культивировании в виде органоидов давало зрелые просветные, просветные предшественники, а также базальные / стволовые эпителиальные клетки. Однако существует значительная неоднородность между пациентами. В некоторых тканях, предрасположенных к раку, это отражало повышенную долю клеток-предшественников просвета, тогда как в других тканях это было связано с разными уровнями других подтипов эпителия молочных желез.

Компоненты органоидной среды влияют на пропорцию клонов

Чтобы определить вклад отдельных факторов роста и ингибиторов в репрезентацию различных типов эпителиальных клеток молочной железы в культуре органоидов, мы создали набор из десяти органоидных сред, в которых один фактор отсутствует в каждая из восьми композиций (EGF, добавка B27, ингибитор TGFβ A83-01, R-спондин 1, FGF7 и FGF10, ингибитор p38 MAPK SB202190, херегулин β1 и Noggin) и с двумя контролями (с разными источниками R- спондин 1).Используя каждую из этих десяти сред, мы культивировали ткани молочной железы четырех разных женщин. Культуры пассировали по крайней мере дважды для получения достаточного количества клеток и анализировали с помощью CyTOF.

Анализ клонов молочных желез, присутствующих в наборе из десяти культур органоидов, показал, что удаление отдельных факторов из среды влияло на долю клеток в каждой из клонов молочных желез в большинстве случаев (рис. 8а и дополнительный рис. 12а). . Это также было очевидно по направленной силе компоновки, когда клетки, выращенные в каждом из десяти условий, не перекрывались и демонстрировали различия в кластеризации как между, так и внутри основных клонов молочных желез (рис.8б).

Рис. 8: Распределение клонов эпителия молочной железы после удаления факторов из органоидной среды.

Четыре ткани молочной железы человека были диссоциированы, и был получен набор из десяти совпадающих культур органоидов с использованием составов сред, каждая из которых имела удаление указанного компонента среды. a Фракция зрелых просветных (ML), просветных клеток-предшественников (LP) и базальных клеток в культурах органоидов, выращенных в среде без указанного фактора, как нормализовано к контролю (полная среда).Показано среднее значение со стандартной ошибкой среднего ( n = четыре культуры). b Показаны схемы с направленным усилием для четырех наборов органоидных культур, где каждая точка, представляющая отдельную клетку, окрашена в зависимости от конкретного состава используемой среды. c Уровни экспрессии EGFR в зрелых просветных, просветных клетках-предшественниках и базальных / стволовых клетках показаны на гистограмме, измеренной с помощью CyTOF, в согласованных культурах органоидов, выращенных в присутствии или отсутствии EGF, как указано.

Наиболее заметные изменения произошли в результате удаления EGF, что привело к увеличению относительной доли зрелых люминальных клеток с одновременным уменьшением базальных клеток (рис.8а). Анализ уровней EGFR в отдельных клетках из популяций молочных желез показал, что в отсутствие EGF доля базальных клеток EGFR + была снижена во всех четырех испытанных случаях, но EGFR + клетки-предшественники просвета были уменьшены только в двух из четырех случаев (рис. . 8c). Все линии молочных желез демонстрировали последовательные изменения в экспрессии белка в условиях отсутствия EGF. Зрелые клетки просвета показали пониженную экспрессию маркеров MUC1 и галектина-1, клетки-предшественники просвета продемонстрировали пониженную экспрессию ANPEP (CD13), а базальные клетки продемонстрировали повышенную экспрессию CD90 во всех четырех случаях (дополнительный рис.12б).

В отличие от EGF, удаление либо херегулина β 1, ингибитора p38 MAPK, либо FGF7 и FGF10 приводило к относительному уменьшению зрелых клеток просвета с одновременным увеличением в одной из других клонов молочных желез (Рис. 8a). Удаление ингибитора TGFβ и в различной степени удаление Noggin из среды привело к относительному увеличению количества клеток-предшественников просвета, тогда как удаление R-спондина 1 привело к относительному уменьшению фракции предшественников просвета (рис.8а). Интересно, что удаление добавки B27 не повлияло на распределение клонов молочных желез в культуре. Однако удаление B27 или EGF действительно повлияло на культуру органоидов в целом, о чем свидетельствует уменьшение слияния и размера органоидов во всех четырех случаях (дополнительный рис. 12c). Также наблюдалось снижение процента базальных клеток, которые являются CD73 ⁺ CD90 ^—, в трех из четырех случаев после удаления B27 и во всех четырех случаях после удаления EGF (дополнительный рис.13). Отдельный тип клеток CD73 ⁺ CD90 ^— был описан как минорная популяция эпителиальных клеток молочных желез с бипотентной активностью предшественников ⁴² .

Эти находки демонстрируют, что состав органоидной среды может быть изменен, чтобы влиять на относительную долю клонов молочных желез, присутствующих в культуре органоидов, и имеет значение для дальнейших исследований дифференцировки эпителиальных клеток молочных желез и автономной, а также не клеточной автономной передачи сигналов.

Фибробласты, ассоциированные с карциномой, направляют опухолевую прогрессию инициированного эпителия предстательной железы человека

ВВЕДЕНИЕ

Большинство раковых заболеваний человека — это карциномы, которые, по определению, возникают из эпителиальных клеток, выстилающих железы, протоки и поверхности органов. (1) . Следовательно, до настоящего времени в центре внимания исследований находились эпителиальные клетки или, более конкретно, генетические изменения, которые происходят в эпителиальных клетках по мере их перехода от нормальных к злокачественным.Для этого преобразования необходимы множественные генетические изменения. (2) . Однако несколько направлений исследований предполагают, что сопутствующие изменения также происходят в клетках, окружающих эпителиальное злокачественное новообразование. (3) . Эти клетки образуют строму или поддерживающую основу эпителиального слоя и состоят из фибробластических, гладкомышечных, воспалительных, эндотелиальных и нервных клеток. Постулируется, что изменения в этих стромальных клетках усиливают несколько туморогенных фенотипов эпителиальных клеток. (4, 5, 6, 7) .

Концептуальная основа, указывающая на роль стромальных клеток в онкогенезе, пришла из исследования эмбриологического развития, где инструктивные и разрешающие взаимодействия (в дополнение к генетическим детерминантам) необходимы для программирования и поддержания эпителиальной структуры и функции. Эмбриональные эпителиальные и инструктивные стромальные (мезенхимальные) клетки обмениваются взаимным молекулярным диалогом, который обеспечивает правильное развитие и функционирование органов. (8, 9, 10) . Считается, что разрешающие взрослые аналоги этих эпителиальных и стромальных взаимодействий обеспечивают регуляторные сигналы, которые поддерживают гомеостаз.Злокачественная трансформация взрослых эпителиальных клеток нарушает такую ​​гомеостатическую регуляцию, включая контроль структуры ткани, адгезии, гибели клеток и пролиферации. Если реципрокный молекулярный обмен между эпителиальными и стромальными клетками изменяется во время трансформации, это может привести к образованию стромальных клеток, которые получают и передают измененные молекулярные сигналы.

Исследования фибробластов вблизи злокачественного поражения также подтверждают роль стромальных клеток в онкогенезе. (11, 12, 13) .Фибробласт является основным типом клеток стромального компартмента и, как таковой, принимает непосредственное участие в оркестровке стромальной половины диалога в тканевом гомеостазе. Модификация фибробластов в строме, непосредственно прилегающих к трансформированным эпителиальным клеткам, была зарегистрирована в нескольких опухолевых системах. (14, 15, 16, 17, 18) . Паттерны фенотипической и генотипической экспрессии этих CAF 4 находятся под интенсивным расследованием. Например, Ronnov-Jessen et al. (3 , 19) продемонстрировали, что гистология и характеристики роста CAF молочной железы отличаются от таковых фибробластов, связанных с нормальными эпителиальными клетками молочной железы.Они описали присутствие «активированных» или аномальных миофибробластов, связанных с клетками инвазивной карциномы молочной железы. Другие фенотипические изменения, приписываемые CAF, включают аномальное миграционное поведение in vitro (20) и измененная экспрессия факторов роста, таких как фактор роста тромбоцитов, инсулиноподобные факторы роста I и II, трансформирующий фактор роста-β1, фактор роста гепатоцитов / фактор эпителиального рассеяния и фактор роста кератиноцитов (18 , 21, 22, 23, 24, 25) .Хотя эти фенотипические изменения были задокументированы в CAF, их последствия или вклад в рост и развитие опухоли еще не исследованы.

Мы предположили, что CAF могут влиять на прогрессирование опухоли в неопухолевых эпителиальных клетках. Чтобы проверить эту гипотезу, мы разработали серию экспериментов, которые концептуально эквивалентны изучению генетических детерминант туморогенеза. Общий тест на онкогенность — введение мутировавшего гена в уже измененную (инициированную / бессмертную), но неопухолевую клеточную линию.Если опухоль образуется, мутация способствовала прогрессированию опухоли. Более строгий тест на онкогенность исследует влияние мутировавшего гена на нормальную клетку. Если в этом случае образуется опухоль, мутация завершила как инициирование, так и прогрессирование опухоли. Чтобы определить, может ли CAF влиять на прогрессирование и / или инициирование эпителиальных клеток предстательной железы, мы выращивали CAF либо с инициированными (TAg-HPE), либо с NHPE клетками, in vivo и in vitro , и измеряли изменения в онкогенезе и канцерогенезе. индикаторы (морфология, гибель клеток и пролиферация) соответственно.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Условия культивирования

клеток NHPF и NHPE, иммортализованных Т-антигеном большого размера SV40 (TAg-HPE; Ref. 26 ) выращивали в полной среде DMEM (Life Technologies, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк), содержащей 10% FCS (Life Technologies), при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO ₂ . Среда не содержала антибиотиков, за исключением случаев, когда это указано. Клетки NHPE выращивали в специальной среде, которая содержала смесь DME h26 50% / Ham’s F12 50% (Life Technologies), 2.5% термоинактивированный декстран, покрытый / очищенный от угля FCS, эпидермальный фактор роста (10 нг / мл; Life Technologies), экстракт бычьего гипофиза (10 мг / мл; Clonetics, Walkersville, MD), инсулин (1 мг / мл; Clonetics), трансферрин (5 мг / мл; Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури), фосфоэтаноламин (0,1 мм; Sigma), холерный токсин (0,2 мг / мл; Sigma), пенициллин (100 единиц / мл; Life Technologies ) и стрептомицин (100 мг / мл; Life Technologies). Культуры регулярно проверялись на загрязнение Mycoplasma , и было обнаружено, что они не заражены.

Животные

Были получены

гомозиготных бестимусных голых мышей CD1 (Simonsen, Gilroy, CA; Taconic Farms, Germantown, NY; Charles River, Hollister, CA; Harlan, Indianapolis, IN) и гомозиготных бестимусных самцов голых крыс RNU (Harlan), которые использовали для определения онкогенности. анализы.

Подготовка клеток

Выделение нормальных клеток предстательной железы.

Ткань предстательной железы человека была получена от пациентов, перенесших операцию в Калифорнийском университете в Сан-Франциско.Клетки NHPE были получены от взрослых пациентов с доброкачественной гиперплазией простаты, у которых не было доказательств рака простаты. Ткань была получена от этих пациентов во время трансуретральной резекции простаты. Такой эпителий может отличаться от эпителия более молодых пациентов до развития доброкачественной гиперплазии предстательной железы. Однако нет никаких доказательств того, что доброкачественная гиперплазия предстательной железы является предраковым состоянием. Поэтому из-за нехватки ткани предстательной железы у молодых мужчин мы включили эпителиальные клетки, полученные в результате доброкачественной гиперплазии, в нашу нормальную популяцию.NHPF были получены от взрослого пациента, перенесшего цистопростатэктомию по поводу инвазивной переходно-клеточной карциномы мочевого пузыря, у которого не было гистопатологических свидетельств карциномы простаты.

Образцы ткани были разрезаны на мелкие кусочки (1 × 1 × 1 мм), и органоиды эпителия предстательной железы были отделены от окружающих стромальных клеток методами, описанными ранее. (27) . Вкратце, ткань ферментативно переваривали коллагеназой типа I (225 единиц / мл; Sigma) и гиалуронидазой (125 единиц / мл; Sigma) в RPMI 1640 (с 25 мм HEPES и 10% FCS; Life Technologies) при 37 ° C в течение ночи. .Препарат центрифугировали с получением осадка, содержащего эпителиальные органоиды (ацинарные и протоковые фрагменты, сохраняющие in vivo архитектурную организацию ) и непереваренные фрагменты ткани и супернатант, содержащий стромальные клетки. Эпителиальные органоиды выделяли с помощью центрифугирования, фильтрации, повторного осаждения единичной гравитацией и промывки, как описано ранее. (28) . Эпителиальные органоиды замораживали в ДМСО до дальнейшего использования. (29) . Фибробласты и специфичные для гладких мышц маркеры (виментин, коллаген IV типа, фибронектин и α-актин гладких мышц) не были обнаружены вокруг интактных органоидов, что указывает на то, что пищеварение было полным и что стромальное загрязнение протоковых органоидов было минимальным. (30) .

Супернатант, содержащий стромальные клетки, центрифугировали при 250 × g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали и высевали в шестилуночные чашки в RPMI 1640 с 1 нМ тестостерона, средой, которая способствует преимущественному росту фибробластов. После того, как клетки разрослись до слияния, их ненадолго обрабатывали трипсином для высвобождения фибробластов, которые затем удаляли и размножали в RPMI 1640 с 5% FCS. Микроскопию и иммуноцитохимию использовали для определения чистоты фибробластической фракции.Образцы были проверены методом иммунофлуоресценции с использованием антицитокератиновых антител широкого спектра (DAKO Corp., Carpinteria, CA), чтобы подтвердить отсутствие контаминирующих эпителиальных клеток (рис. 1). ⇓ и использование антител против виментина (Sigma) и α-актина гладких мышц (Sigma) для подтверждения их фибробластической природы. При необходимости повторяли обогащение фибробластов дифференциальной трипсинизацией. На втором или третьем пассаже использовали фибробласты.

Рис.1.

Характеристика популяций эпителия и фибробластов человека.Представлены фазово-контрастные и флуоресцентные микрофотографии NHPE, NHPF, TAg-HPE и CAF. NHPE представляет собой эпителиальный органоид в культуре до клеточного разрастания. Эпителиальные клетки (NHPE и TAg-HPE) были сильно реактивными с антицитокератиновым антителом ( B и H ), тогда как они были слабо реактивными или нереактивными с антивиментиновым антителом ( C и I ). Цитокератины специфичны для эпителиальных клеток, тогда как виментин обычно экспрессируется в фибробластах, а не в эпителии.Напротив, фибробласты были сильно реактивными по отношению к антителу к антивииментину ( F и L ) и не реагировали с антителом к ​​антицитокератину ( E и K ). Пруток , 50 мкм.

TAg-HPE Линия эпителиальных клеток простаты.

TAg-HPE был использован для обозначения линии эпителиальных клеток предстательной железы человека BPH-1. (26) . Эта клонально производная линия была получена путем иммортализации SV40-T клеток, полученных из хирургического образца ткани предстательной железы с доброкачественной гиперплазией.При гистопатологическом исследовании злокачественных новообразований не выявлено. Эти родительские эпителиальные клетки выделяли с использованием методик, описанных выше. Эта клеточная линия не является опухолевой, как было продемонстрировано, в том смысле, что опухоли не развиваются после периодов роста до 1 года у бестимусных грызунов, хотя жизнеспособные клетки могут быть обнаружены в месте трансплантата. Обозначение TAg-HPE используется здесь, чтобы подчеркнуть, что это генетически инициированные (SV40-T) эпителиальные клетки простаты человека.

Изоляция предстательной железы CAF.

Первичные CAF простаты были получены из опухолей простаты у трех пациентов. Во время радикальной простатэктомии опухоли простаты были идентифицированы с помощью гистопатологического анализа окрашенных замороженных срезов. Фрагмент свежей ткани, непосредственно прилегающий к явной карциноме, использовали для получения CAF для роста в культуре. Образцы разрезали на мелкие фрагменты, и фибробласты отделяли от загрязняющих эпителиальных клеток ферментативным расщеплением, как описано выше.Эти CAF были неотличимы от нормальных фибробластов простаты морфологически, иммуноцитохимически и по характеристикам роста, на что указывает время удвоения популяции (рис. ⇓ и таблица 1 ⇓ ).

Таблица 1

Характеристика фибробластов и эпителиальных клеток

Протокол

В этом исследовании эксперименты были организованы в две параллельные серии. В первой серии были исследованы взаимодействия фибробластов / эпителия in vivo с использованием тканевых рекомбинантов.Во второй серии те же взаимодействия были исследованы на морфологию, жизнеспособность и пролиферацию с использованием системы кокультивирования in vitro . Для измерения прогрессирования опухоли CAF объединяли с инициированными клетками TAg-HPE. Для измерения инициации опухоли CAF объединяли с клетками NHPE.

Получение

in vivo Тканевые рекомбинанты

В этой модельной системе фибробласты (NHPF или CAF) смешивали с эпителиальными (NHPE или TAg-HPE) клетками и заливали в коллагеновый гель, который затем прививали животному-хозяину.Тканевый рекомбинант был извлечен через обозначенный период времени и проанализирован.

Тканевые рекомбинанты получали смешиванием пяти органоидов эпителия предстательной железы человека или 1 × 10 ⁵ клеток TAg-HPE с 2,5 × 10 ⁵ фибробластов предстательной железы человека в 50 мкл коллагена крысиного хвоста I типа. (31) . Полученные гели инкубировали в течение ночи в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° C в полной RPMI 1640 с 1 нМ тестостерона и затем помещали под почечную капсулу самцов бестимусных грызунов.Контрольные образцы ткани состояли из 3,5 × 10 ⁵ клеток каждого типа фибробластов (CAF или NHPF), 3,5 × 10 ⁵ клеток TAg-HPE или 50 органоидов NHPE только в коллагеновом геле. Образцы тканей выращивали в течение 20–85 дней. Влажный вес каждого тканевого рекомбинанта регистрировали при сборе урожая. Ткани фиксировали формалином, заливали парафином и анализировали гистологически.

Получение

in vitro Кокультуры

В этой модельной системе фибробласты (NHPF или CAF) выращивали до слияния, а затем сверху наслоили различные эпителиальные клетки (NHPE или TAg-HPE).Зеленый флуоресцентный краситель CMFDA (Molecular Probes, Юджин, штат Орегон) использовали для окрашивания популяции фибробластов перед добавлением неокрашенной популяции эпителия. Флуоресцентная микроскопия, а также проточная цитометрия легко отличают окрашенные CMFDA клетки от неокрашенных (рис. 2). ⇓ и позволил отдельные измерения каждой популяции. Дифференциальное окрашивание сохранялось минимум 4 дня без отрицательного воздействия на пролиферацию и эффективность посева. (32) .

Фиг.2.

Проточная цитометрия отличает неокрашенные эпителиальные клетки от зеленых флуоресцентных фибробластов, окрашенных CMFDA.

Для приготовления сокультуры 1 × 10 ⁵ первичных фибробластов простаты выращивали до слияния в шестилуночных чашках в полной среде DMEM в течение 3-дневного периода. Окрашивание осуществляли инкубацией в бессывороточной среде DMEM, содержащей 5 мкМ CMFDA (10 мм исходный раствор в ДМСО; Sigma), 100 единиц / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина в течение 45 минут при 37 ° C.Затем среду аспирировали, фибробласты дважды промывали HBSS и дополнительно инкубировали с полной DMEM в течение 1 часа. Эпителиальные клетки, растущие в логарифмической фазе, высвобождали из планшета для культивирования ткани трипсинизацией, и 2,5 × 10 ⁵ клеток высевали на конфлюэнтные окрашенные CMFDA фибробласты простаты. Сокультуры инкубировали с минимальной сывороточной средой (DMEM + 0,5% FCS + пенициллин 100 единиц / мл и стрептомицин 100 мг / мл) в течение 1–4-дневных периодов. Морфологию, жизнеспособность и пролиферацию каждого типа клеток независимо или совместно с их партнером оценивали, как описано ниже.

Измерение онкогенных показателей

Морфологический анализ.

Для in vivo тканевых рекомбинантов морфологию тканевых рекомбинантов оценивали путем окрашивания H&E залитых парафином тканей и иммуногистохимии. Обработка H&E производилась стандартным образом. Тканевые рекомбинанты были исследованы на экспрессию цитокератина и антигена SV40-T с использованием иммуногистохимического метода извлечения эпитопа. (33) .После депарафинизации и регидратации тканевых срезов извлечение эпитопа было выполнено для всех образцов с использованием микроволнового нагрева в течение 10 минут в 0,01 м трис-основном буфере при pH 9–10. После инкубации в течение ночи в соответствующей блокирующей сыворотке срезы тканей инкубировали либо с антицитокератиновым антителом широкого спектра действия в разведении 1: 100 (DAKO Corp.), либо с антителом Pab101 к антигену SV40-T в разведении 1:40 (щедрый подарок. от доктора Джона Лемана, Медицинский колледж Олбани, Олбани, штат Нью-Йорк). После промывания срезы тканей инкубировали с биотинилированным вторичным антителом (Amersham Life Science, Inc., Арлингтон, Иллинойс). Систему авидин-биотин-пероксидаза (Vector Laboratories; Burlingame, CA) использовали для определения реакционной способности с использованием 3,3′-диаминобензидина (Sigma) в качестве хромагена и гематоксилина в качестве контрастного красителя. Экспрессию простатоспецифического антигена определяли в тканевых рекомбинантах NHPF / NHPE с использованием кроличьих поликлональных антител (DAKO Corp.) в соответствии со спецификациями производителя. Для этого антитела извлечение антигена не требовалось. Для сокультив in vitro использовали световую микроскопию и окрашивание CMDFA для изучения взаимосвязи эпителиальных клеток с фибробластами.

Жизнеспособность.

Для in vivo тканевых рекомбинантов были идентифицированы клетки апоптотической карциномы с использованием набора Oncor ApopTag (Oncor, Gaithersburg, MD). Вкратце, срезы депарафинизировали, регидратировали и инкубировали в протеиновом ферменте Oncor (20 мкг / мл) в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали в ферментном буфере TdT рабочей силы в течение 1 ч при 37 ° C, промывали и метили апоптотические тельца с использованием анти-дигоксигенин-флуоресцеина.Срезы подвергали контрастному окрашиванию и закрепляли с помощью Oncor Propidium Iodide / Antifade (Oncor). Индекс апоптоза определяли с помощью флуоресцентной микроскопии как процент апоптотических клеток в шести микроскопических полях при × 400. Для совместных культур in vitro и гибель эпителиальных клеток определяли путем измерения относительного поглощения PI с использованием проточной цитометрии. Этот метод полезен, потому что жизнеспособные клетки способны исключать ИП, в то время как апоптотические и некротические клетки — нет. (34, 35, 36) . Эксперименты по совместному культивированию проводили серийно для 1-, 2-, 3- и 4-дневной инкубации.Максимальный эффект CAF простаты на пролиферацию и гибель клеток TAg-HPE наблюдался на 3-й день (данные не показаны). Совместно культивируемые клетки и соответствующие контроли высвобождали из планшетов трипсинизацией и центрифугировали. Клетки ресуспендировали в 1 мл минимальной сывороточной среды и образцы инкубировали с PI (25 мкг / мл; Sigma) и красителем Hoechst 33342 (5 мкг / мл; Molecular Probes) в течение 6 мин. Эксперименты проводили в трех экземплярах и анализировали на проточном цитометре FACStar Plus с двумя лазерами (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния), оборудованном двумя аргоновыми лазерами.Возбуждение CMFDA и PI происходило при настройке первого лазера на 488 нм. Эмиссии CMFDA и PI собирали при 530/30 нм и 630/22 нм соответственно. Hoechst 33342 возбуждали многолинейным УФ-излучением на длине волны 354–363 нм от второго лазера, и его флуоресценция регистрировалась при 451/15 нм логарифмически после инкубации. Десять тысяч событий были получены и проанализированы на компьютере Macintosh с помощью программы Cell Quest (Becton Dickinson).

Распространение.

Для тканевых рекомбинантов in vivo измерения пролиферации в залитых парафином образцах опухолевых эксплантатов проводили с использованием Ki-67, маркера, специфичного для пролиферации. (37) , как описано ранее (38) . Для совместных культур in vitro определения проводили, как указано выше, за исключением 45-минутной инкубации в Hoechst 33342. Интенсивность флуоресценции отображалась в линейной шкале. Для культуры ткани время удвоения популяции и относительная эффективность посева для клеток, выращенных в монослое, определяли, как описано ранее. (39) .

Онкогенез

Для оценки роста тканевых рекомбинантов in vivo коллагеновые гели, содержащие указанные клетки, прививали под почечную капсулу бестимусной мыши или крысы-хозяина в возрасте 50–120 дней. Трансплантаты были удалены через 20–85 дней, как указано. Все протоколы для животных были одобрены Комитетом по исследованиям на животных Калифорнийского университета в Сан-Франциско.

Морфометрический анализ

Для морфометрического анализа были выбраны

репрезентативных срезов из тех тканевых рекомбинантов, которые состоят из клеток предстательной железы CAF / TAg-HPE, которые ранее были исследованы на экспрессию цитокератина с помощью иммуногистохимии.Оцифрованные изображения были получены из нескольких различных микроскопических полей. Случайные линии были нарисованы через несколько полей, и ядра клеток, пересекаемые этими линиями, были обозначены как эпителиальные или стромальные в зависимости от наличия или отсутствия окрашивания цитокератином. Таким образом подсчитывали не менее 1000 клеток на предметное стекло и три предметных стекла на образец для определения процента эпителиальных клеток и процента стромальных клеток.

Кариотипический анализ

Культуры клеток при 50–80% конфлюэнтности инкубировали в среде, содержащей колцемид (0.0625 мкг / мл) в течение 4 ч. Митотические клетки удаляли с планшетов, набухали в 0,075 м гипотоническом растворе KCl и фиксировали на предметных стеклах. Хромосомы были соединены G-полосой с 0,05% трипсином-0,02% EDTA и окрашены по Гимзе (Fisher Scientific).

Сравнительная геномная гибридизация

Вкратце, зонды были подготовлены переводом ников, как описано ранее. (40) . Двести нг меченой флуоресцеином тестируемой ДНК, 200 нг нормальной эталонной ДНК, меченной Texas Red, и 20 мкг немеченой ДНК, расщепленной Cot-1, смешивали, осаждали и ресуспендировали в 10 мкл гибридизационной смеси.Эту смесь зондов денатурировали и немедленно добавляли к слайду с метафазными спредами нормальных лимфоцитов, которые были денатурированы, обезвожены и высушены на воздухе. Смеси зондов давали возможность гибридизоваться с метафазными спредами в течение 72 часов. Затем предметные стекла промывали и контрастировали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом.

Статистический анализ

Индексы гибели и пролиферации клеток сравнивали с помощью теста t . Сырые массы различных тканевых рекомбинантов сравнивали с использованием теста Краскела-Уоллиса (непараметрический дисперсионный анализ ANOVA).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Нормальные и инициированные эпителиальные клетки предстательной железы вместе с нормальными и связанными с карциномой фибробластами предстательной железы составляют тканевые компоненты онкогенных модельных систем.

Мы исследовали стромальные / эпителиальные взаимодействия при онкогенезе предстательной железы путем объединения фибробластных и эпителиальных клеток in vivo, и in vitro, . Чтобы определить, способны ли CAF стимулировать прогрессирование опухоли, их выращивали с инициированными эпителиальными клетками.Чтобы дополнительно проверить, способны ли CAF стимулировать как инициирование, так и прогрессирование опухоли, их выращивали с нормальными эпителиальными клетками.

клеток NHPE были выделены в виде органоидных фрагментов протоков предстательной железы и ацинусов из гистологически доброкачественной ткани предстательной железы. Органоиды содержали базальные клетки, которые экспрессировали цитокератины 5 и 14, и клетки просвета, которые экспрессировали цитокератины 8, 18, простатоспецифический антиген и кислую фосфатазу простаты. (30) . Это указывало на то, что эпителиальные клетки были хорошо дифференцированы.Типичная органоидная морфология клеток NHPE в культуре представлена ​​на рис. ⇓ . Эти клетки имеют ограниченную пролиферативную способность (таблица 1). ⇓ и представляют собой не инициированную эпителиальную популяцию.

Стромальные клетки нормальной предстательной железы человека были охарактеризованы с использованием антител к виментину, актину, миозину и цитокератину. Почти все клетки экспрессировали виментин, тогда как 10-20% также экспрессировали актин или миозин, что характерно для гладкомышечных клеток, обычно обнаруживаемых в строме простаты.Таким образом, эти клеточные популяции представляют собой комбинацию фибробластов и миофибробластных клеток, происходящих из стромы простаты. Для простоты эти ячейки называются NHPF. NHPF не экспрессируют цитокератины, специфичные для эпителиальных клеток (рис. 1). ⇓ . Время удвоения популяции, эффективность посева и кариотип были сопоставимы с другими первичными фибробластами человека (таблица 1). ⇓ . Эти клетки представляют собой нормальные фибробластные популяции.

Инициированная популяция эпителиальных клеток (TAg-HPE) представлена ​​линией клеток предстательной железы человека BPH-1. (26) .Как описано ранее, эти клетки экспрессировали эпителиально-специфические цитокератины по образцу, соответствующему люминальным эпителиальным клеткам in vivo , и продемонстрировали ядерную реактивность с антителом Pab 101, которое обнаруживает антиген SV40-T. Клетки TAg-HPE сохранили многие ферментные системы, экспрессируемые в предстательной железе. (26) . Морфология булыжника и характеристики роста этих клеток показаны на рис. ⇓ и таблица 1 ⇓ . Кариотипически эти клетки аномальны со средним числом хромосом 76.Хотя эти клетки приобрели некоторые маркеры трансформации, клетки TAg-HPE не являются опухолевыми при выращивании отдельно либо подкожно. или под почечной капсулой бестимусного хозяина на срок до 1 года (Таблица 2 ⇓ ; Ref. 26 ). 5 Обозначение TAg-HPE подчеркивает, что клетки инициируются (под действием антигена SV40-T) и происходят из эпителия предстательной железы человека.

Таблица 2

Рост опухолей тканевых рекомбинантов и контрольных трансплантатов у бестимусных хозяев

CAF были иммуноцитохимически неотличимы от NHPF, описанных выше.Рис. 1 ⇓ экспоненциально растущие NHPF и CAF имели идентичный морфологический вид, типичный для фибробластов (длинные и веретенообразные). Однако при длительном культивировании при слиянии CAFs образовывали очаги, в которых клетки росли друг над другом, фенотип, который напоминает трансформированные клетки и не наблюдается с NHPFs. CAF # 1, CAF # 2 и CAF # 3 продемонстрировали время удвоения популяции, которое варьировалось от 22 до 48 часов (таблица 1). ⇓ . Хромосомный набор всех CAF, проанализированный с помощью кариотипического анализа и сравнительной геномной гибридизации, был нормальным.

Были измерены исходные морфологии, жизнеспособность, индексы пролиферации и онкогенность для каждой клеточной популяции индивидуально, они описаны на рис. ⇓ и таблицы 1 ⇓ и 2 ⇓ , соответственно.

CAF вызывают резкое прогрессирование опухоли при трансплантации в виде тканевых рекомбинантов с инициированными эпителиальными клетками

in vivo .

Три основных признака прогрессирования опухоли — это ускоренный рост, морфология опухолевой ткани и способность к инвазии.Все три были оценены в нашей модельной системе.

Контрольные трансплантаты клеток NHPE, клеток TAg-HPE, NHPF и CAF, выращенных индивидуально в коллагеновых гелях в течение от 20 до 85 дней, демонстрировали минимальный рост со средней влажной массой 10 мг или менее (Таблица 2 ⇓ и рис.3 ⇓ ). При гистологическом исследовании клетки TAg-HPE образовали ороговевшие жемчужины. Эти данные согласуются с предыдущими сообщениями о том, что клетки TAg-HPE не являются опухолевыми. (26) при одиночном выращивании на бестимусных хозяевах (даже до 1 года).Контрольные трансплантаты каждого типа фибробластов по отдельности (NHPF и CAF) демонстрировали доброкачественную фибробластическую строму.

Рис.3.

A , общий вид тканевых рекомбинантов, собранных после 85 дней роста самца голой мыши-хозяина. Тканевый рекомбинант CAF / TAg-HPE весил 1250 мг, а тканевый рекомбинант NHPF / TAg-HPE весил 10 мг; штанга , 1 см. B , влажный вес прививок (логарифмическая шкала) после 19–85 дней роста у бестимусных хозяев.• трансплантаты, выращенные на самцах бестимусных мышей-хозяев; ▴ — трансплантаты, выращенные на самцах бестимусных крыс-хозяев; †, графты показаны в A .

Тканевые рекомбинанты, состоящие из клеток CAF / TAg-HPE, демонстрировали поразительный рост с максимальной влажной массой, приближающейся в 500 раз по сравнению с любыми другими тканевыми рекомбинантами. Средний влажный вес этих тканевых рекомбинантов составлял 97 мг через 20 дней роста, 198 мг через 42 дня роста и 180 мг через 85 дней роста. Оценка двух других онкогенных показателей, гибели клеток и пролиферации, продемонстрировала низкую фракцию гибели клеток (1.5 ± 0,9%) и высокой пролиферативной фракции (43,9 ± 5,3%), чего следует ожидать в опухоли. Напротив, рекомбинанты контрольной ткани, состоящие из нормальных фибробластов / инициированных эпителиальных клеток (NHPF / TAg-HPE), продемонстрировали минимальный рост через 20 дней со средней влажной массой, идентичной массе только клеток TAg-HPE (Таблица 2). ⇓ . Даже через 90 дней средний влажный вес этих тканевых рекомбинантов существенно не изменился. Небольшой вклад эпителия в эти тканевые рекомбинанты препятствовал надежной оценке гибели или пролиферации эпителиальных клеток in vivo .

Гистологический вид тканевых рекомбинантов CAF / TAg-HPE напоминал низкодифференцированные аденокарциномы с участками плоской дифференцировки (рис. 4, A – C ). ⇓ . Эта гистология была последовательной для всех этих тканевых рекомбинантов независимо от широкого диапазона влажных масс трансплантатов CAF / TAg-HPE. Опухоли содержали плохо дифференцированные, неправильные эпителиальные тяжи разного размера. Эпителий образовывал небольшие гнезда, напоминающие железы в некоторых областях опухоли, и представлял собой отдельные клетки, которые смешивались с фиброзной стромой в других областях.Эпителиальная природа этих клеток была подтверждена иммуноокрашиванием антицитокератиновыми антителами широкого спектра действия (рис. 4 B ). ⇓ . Кроме того, ядерная иммунореактивность с антителом к ​​антигену SV40-T подтвердила происхождение опухолей от привитых клеток TAg-HPE (фиг. 4 C ). ⇓ . К этим плохо дифференцированным эпителиальным клеткам примешивались участки плоского эпителия со случайным ороговением (рис. 4 A ). ⇓ . Многие эпителиальные клетки содержат крупные полиморфные ядра с крупными ядрышками.Стромальные клетки были перемешаны между островками эпителиальных клеток по всей опухоли.

Рис.4.

Гистологический вид тканевых рекомбинантов. A – C , серийные срезы рекомбинантной ткани, состоящей из CAF / TAg-HPE. Срез, окрашенный H & E ( A ), демонстрирует внешний вид, соответствующий плохо дифференцированной аденокарциноме. Обратите внимание на присутствие многих неплотно прилегающих, слабо дифференцированных эпителиальных клеток, а также участков плоской дифференцировки.Иммуноокрашивание антителом к ​​цитокератину ( B ) подтверждает эпителиальную природу этих малодифференцированных клеток, тогда как ядерное окрашивание антителом к ​​SV40-T ( C ) во многих эпителиальных клетках подтверждает происхождение опухолей от привитые клетки TAg-HPE. Штанга , A – C . D , тканевый рекомбинант, состоящий из NHPF / TAg-HPE. Этот срез окрашивали на экспрессию цитокератина. Обратите внимание, что эпителиальные клетки образуют дискретные шнуровидные структуры в доброкачественной строме. E , тканевый рекомбинант, состоящий из CAF / NHPE (окрашенный H&E). Обратите внимание на структуру эпителиального протока, выстланную аномальным многослойным плоским эпителием. F , тканевый рекомбинант, состоящий из NHPF / NHPE, окрашенный для демонстрации экспрессии простатоспецифического антигена. Обратите внимание на структуру эпителиальных протоков, выстланных высоким столбчатым эпителием, сильно экспрессирующим этот специфический для предстательной железы маркер человека. Штанга , D – F .

Морфометрический анализ тканевых рекомбинантов CAF / TAg-HPE проводили для оценки процентного содержания эпителиальных и стромальных клеток.Были выбраны восемь репрезентативных тканевых рекомбинантов, состоящих из CAF / TAg-HPE. Влажный вес этих тканевых рекомбинантов составлял от 97 до 5130 мг. Срезы окрашивали антицитокератиновым антителом широкого спектра действия для идентификации эпителиальных компонентов в тканевых рекомбинантах. Эти тканевые рекомбинанты состояли из эпителия на 80 ± 3% (± стандартное отклонение) и стромы на 20 ± 3%. Вклад эпителиальных клеток в массу опухоли был одинаковым для всех проанализированных временных точек.

Инвазивный потенциал часто оценивают по установлению роста опухоли на удаленных участках с течением времени ( i.е. , метастазы). Чтобы определить, обладают ли эти тканевые рекомбинанты метастатическим потенциалом, мы попытались вырастить трансплантаты в течение длительного периода времени (таблица 2). ⇓ . CAF # 4 и CAF # 5 имели эффективность посева, аналогичную другим популяциям CAF, описанным выше, и показали время удвоения популяции 30,9 и 26,5 часов, соответственно. Анализ был прекращен из-за истощения хозяина. Во время умерщвления (85 дней) тканевые рекомбинанты CAF / TAg-HPE полностью окружили обе почки хозяина, оставляя мало идентифицируемой нормальной почечной ткани (см.рис.3 A ⇓ ) и животное, которое было серьезно скомпрометировано. Метастазов не обнаружено. Следовательно, для остальных анализов был выбран период времени 42 дня. Метастазы в этих экспериментальных условиях не обнаружены.

В отличие от злокачественных гистологических проявлений рекомбинантов CAF / TAg-HPE, рекомбинанты NHPF / TAg-HPE оказались доброкачественными. Гистологически эпителиальные клетки в тканевых рекомбинантах NHPF / TAg-HPE образовывали небольшие твердые тяжи с несколькими одиночными клетками, как показано на рис.4 D ⇓ . Эпителиальные клетки были окружены доброкачественной фибробластной стромой, которая составляла большую часть рекомбинантной ткани.

Тканевые рекомбинанты, состоящие из CAF / TAg-HPE, были значительно больше, чем трансплантаты одного TAg-HPE и тканевые рекомбинанты NHPF / TAg-HPE после 20 дней роста ( P = 0,0015), 42 дня роста ( P = 0,0013) и 85 дней роста ( P = 0,0002).

CAF не могут вызывать опухолевидный генез, будучи привиты в виде рекомбинантов с нормальными эпителиальными клетками

in vivo .

Хотя CAF продемонстрировали драматическую способность влиять на прогрессирование опухоли в инициированных эпителиальных клетках, они не вызывали обширного туморогенеза в нормальных эпителиальных клетках в этих условиях. Тканевые рекомбинанты, состоящие из клеток CAF / NHPE, продемонстрировали минимальный рост через 42 дня со средней влажной массой 10,5 мг ( n = 6). Однако гистологический вид эпителиальных клеток отличался от такового при сочетании с нормальными фибробластами. Эпителиальные клетки в сочетании с CAF образуют протоковые структуры с многослойной плоской выстилкой (рис.4 E ) ⇓ . Такая дифференцировка ненормальна для эпителиальных клеток простаты. Опять же, эпителиальные структуры были окружены доброкачественной фибробластной стромой, которая составляла большинство небольших тканевых рекомбинантов. Трансплантаты тканевых рекомбинантов NHPF / NHPE также показали минимальный рост (4 мг; Таблица 2 ⇓ ). В отличие от тканевых рекомбинантов CAF / NHPE, эпителиальные клетки в тканевых рекомбинантах NHPF / NHPE образовывали протоковые структуры, выстланные высокими столбчатыми эпителиальными клетками, которые экспрессировали простатоспецифический антиген.Такой вид характерен для нормального эпителия предстательной железы (рис. 4 F ). ⇓ .

CAF вызывают изменение морфологии эпителия, снижение гибели клеток и увеличение пролиферации клеток при совместном культивировании с инициированными клетками TAg-HPE

in vitro.

Совместное культивирование клеток CAF / TAg-HPE привело к изменению морфологии эпителия, снижению гибели эпителия и увеличению пролиферации эпителия по сравнению с совместным культивированием NHPF / TAg-HPE (рис.5) ⇓ . Клетки TAg-HPE в сокультуре с CAFs имели устойчивый рост, который давал большое количество клеток (рис. 5). ⇓ . Флуоресцентно окрашенные CAF, совместно культивированные с неокрашенными клетками TAg-HPE, демонстрировали «сотовый» вид. Клетки TAg-HPE выросли через фибробластный монослой и достигли дна культуральной чашки. Произошло полное смещение CAF, о чем свидетельствуют островки неокрашенных клеток внутри окрашенного зеленой флуоресценцией фибробластного монослоя (рис. 5 A ). ⇓ . В контрольных сокультурах, состоящих из клеток NHPF / TAg-HPE, клетки TAg-HPE росли в виде монослоя поверх нормальных фибробластов.Вытеснения НПЗ не наблюдалось (рис. 5 A ). ⇓ . Второй канцерогенный индикатор, гибель клеток TAg-HPE, был ниже, когда эти инициированные эпителиальные клетки совместно культивировали с CAF по сравнению с сокультивированием с NHPF (рис. 5 B ). ⇓ . Точно так же в этой системе был изменен третий индикатор — клеточная пролиферация. Пролиферация клеток TAg-HPE увеличивалась при совместном культивировании с CAF по сравнению с совместным культивированием с NHPF (рис. 5 C ). ⇓ . Эти данные демонстрируют, что CAF вызывают туморогенные фенотипы в клетках TAg-HPE при выращивании в сокультуре.Повышенный рост эпителия в фибробластический слой (напоминающий инвазивные клетки), снижение гибели эпителиальных клеток и повышенная пролиферация эпителия — все это признаки онкогенной популяции.

Рис.5.

Морфология, гибель и пролиферация клеток TAg-HPE в сокультуре с CAF или NHPF. A , фазовые и флуоресцентные изображения сокультив TAg-HPE с различными популяциями фибробластов. Неокрашенные клетки TAg-HPE отличаются от окрашенных флуоресценцией CMFDA / зеленой фибробластов в сокультуре.В сокультурах CAF / TAg-HPE клетки TAg-HPE вытесняли CAF (зеленые флуоресцентные клетки), достигая дна планшета. Кокультуры выглядели как «соты». В совместных культурах NHPF / TAg-HPE клетки TAg-HPE росли поверх монослоя фибробластов (зеленая лужайка клеток) без смещения фибробластов. Пруток , 50 мкм. B , гибель клеток TAg-HPE в сокультуре. Значительно более низкий процент гибели клеток наблюдался в клетках TAg-HPE при совместном культивировании с CAF по сравнению с NHPF.Процент гибели клеток TAg-HPE при совместном культивировании с различными фибробластами составлял: CAF # 1,, 8,2%, n = 5, P = 0,0062; CAF # 2, □, 8,4%, n = 3, P = 0,05; и CAF № 3, , 8,7%, n = 3, P = 0,04 против NHPF ▪, 12,6%; непарный т тест сравнения. C , пролиферация клеток TAg-HPE в сокультуре. Значительно более высокий процент клеток TAg-HPE находился в S-фазе при совместном культивировании с CAF по сравнению с NHPF.Процент клеток TAg-HPE в S-фазе при совместном культивировании с разными фибробластами составлял: CAF # 1, , 17,2%, n = 5, P <0,0001; CAF # 2, □, 17,1%, n = 3, P <0,0001; и CAF № 3, , 21,8%, n = 3, P <0,0001 по сравнению с NHPF, 11,0%, n = 12. Bars , SE.

CAF не изменяют онкогенные индикаторы при совместном культивировании с нормальными эпителиальными клетками

in vitro .

Поскольку CAF усиливают фенотипы, связанные с прогрессированием опухоли при выращивании с иммортализованными клетками TAg-HPE, мы спросили, могут ли CAF усиливать фенотип инициации опухоли при выращивании с генетически нормальными эпителиальными клетками. Когда клетки NHPE накладывались на сливающиеся лужайки CAF, эпителиальная популяция клеток не увеличивалась. Влияние на морфологию, гибель клеток и пролиферацию было трудно измерить из-за малого количества эпителиальных клеток. Чтобы изучить эти параметры на клеточной основе, микроскопическое исследование колоний NHPE, растущих на CAF, выявило чрезвычайно низкую частоту митоза и отсутствие пикнотических ядер (по данным окрашивания Hoechst 33258, данные не показаны).Это подтверждает, что пролиферация и гибель клеток были низкими в клетках NHPE, совместно культивируемых с CAF. В контрольных сокультурах клеток NHPE, растущих на конфлюэнтном слое NHPF, популяция эпителиальных клеток демонстрировала минимальное размножение, росла как отдельные клетки и в конечном итоге формировала небольшие колонии.

Эти данные демонстрируют, что, хотя CAF могут иметь значительный эффект на онкогенные индикаторы инициированных эпителиальных клеток (TAg-HPE), их влияние на рост генетически нормальных эпителиальных клеток было незначительным.Кроме того, мы также наблюдали отсутствие эффекта NHPF ни на нормальные, ни на инициированные эпителиальные клетки предстательной железы, что было определено путем измерения показателей жизнеспособности и пролиферации.

Хотя абсолютные различия в пролиферации и гибели клеток, наблюдаемые в сокультурах CAF / TAg-HPE, были статистически значимыми, они не были значительными. Однако длительное воздействие этих тонких различий в снижении гибели клеток и увеличении пролиферации может привести к драматическому кумулятивному эффекту размера опухоли с течением времени, как показано в модели in vivo , описанной выше.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты настоящего исследования демонстрируют, что CAF стимулируют опухолевую прогрессию инициированных эпителиальных клеток как in vivo , так и in vitro . CAF простаты человека, выращенные с инициированными эпителиальными клетками предстательной железы, резко стимулировали рост и изменяли гистологию популяции TAg-HPE. Этот эффект не был обнаружен, когда нормальные фибробласты простаты выращивали с клетками TAg-HPE в тех же экспериментальных условиях.Напротив, CAF не стимулировали рост нормальных эпителиальных клеток в идентичных условиях. Из этих данных мы заключаем, что в этой модельной системе предстательной железы человека CAF могут стимулировать прогрессирование онкогенеза.

Прогресс и начало.

Демонстрация прогрессирования опухоли требует увеличения роста эпителия (баланс между пролиферацией и апоптозом), морфологии опухолевой ткани и способности к инвазии. Действительно, стимуляция роста TAg-HPE с помощью CAF была наиболее ярким фенотипом, легко обнаруживаемым при наблюдении как in vitro , так и in vivo .Пролиферация эпителия генерировала большую часть опухоли in vivo . Морфология опухолевой ткани была очевидна в этих карциномах, созданных в трансплантатах CAF / TAg-HPE. Цитологический вид соответствовал злокачественному новообразованию, демонстрируя плейотропию, увеличенное ядерное: цитоплазматическое соотношение, выступающие ядрышки и отсутствие клеточной поляризации. Все эти особенности являются отличительными чертами опухолевых клеток. Архитектура ткани также была изменена в связи с отсутствием нормальных железистых структур, содержащих люминальные и базальные клетки.Рост злокачественных клеток был типичным для аденокарциномы, поскольку клетки образовывали гнезда, которые напоминали плохо дифференцированные железы с нарушенной тканевой архитектурой в некоторых областях, тогда как во многих областях клетки росли индивидуально и инфильтровали строму. Карциноматный вид не был очевиден, когда инициированные клетки TAg-HPE выращивали с нормальными фибробластами в тех же условиях in vivo . Наконец, появление сокультуры CAF / TAg-HPE in vitro и тканевых рекомбинантов in vivo соответствовало онкогенному фенотипу в том смысле, что эпителий в каждом случае нарушал фибробластный слой.

Демонстрация инициации опухоли требует дополнительных событий помимо увеличения роста, изменения морфологии и инвазии, необходимых для прогрессирования опухоли. Поскольку CAF могут стимулировать эти последние свойства в генетически измененных клетках TAg-HPE, они демаскировали бы инициирующее событие в NHPE, если бы такое событие произошло. Хотя рост клеток NHPE не стимулировался CAF, мы полагаем, что это не является ограничивающим событием. Эти же клетки NHPE можно стимулировать к росту и дифференцировке в сочетании с инструктивной мезенхимой урогенитального синуса. (30) .Хотя CAF не способствовали росту нормальных эпителиальных клеток, CAF действительно изменяли гистологию эпителия. Это говорит о том, что аномальная передача сигналов от CAF недостаточна для стимуляции образования опухоли. Эпителиальные клетки в тканевых рекомбинантах CAF / NHPE были доброкачественными по внешнему виду, с нормальным соотношением ядер: цитоплазма, морфологией протоков и отсутствием местной инвазии. Однако замена нормальных высоких столбчатых клеток на аномальный многослойный многослойный плоскоклеточный вид предполагает, что аномальные стромальные сигналы от CAF обнаруживаются клетками NHPE на некотором уровне.Взятые вместе, эти данные предполагают, что сигналы CAF могут влиять как на нормальные, так и на генетически измененные эпителиальные клетки, но что результат такой передачи сигналов диктуется генетическим составом эпителиальных клеток.

Фибробласты в развитии, заживлении ран и опухолеобразовании.

Хотя термин «фибробласт» часто используется в общем смысле, молекулярные, биохимические и морфологические различия между различными типами фибробластических клеток становятся очевидными.В этом отношении фибробласты, по-видимому, демонстрируют «пластичный» фенотип, который позволяет этим клеткам адаптироваться к нормальным и патологическим ситуациям. (41) . Это было элегантно продемонстрировано во время эмбрионального развития, когда фибробласты, по-видимому, управляют нормальным эпителиальным развитием в различных системах органов, включая простату, матку и кишечник. (9 , 42 , 43) . Этот поучительный фенотип характерен для эмбриональных фибробластов, потому что зрелые взрослые фибробласты редко способны повторять эту специализированную функцию.

Реакция ткани на повреждение (заживление ран), а также некоторые доброкачественные пролиферативные нарушения мягких тканей также представляют обстоятельства, при которых были описаны «реактивные» фибробласты с уникальными фенотипическими характеристиками. (44, 45, 46) . Эти поражения характеризовались появлением так называемых «миофибробластов», которые имеют общие структурные и биохимические свойства как с «нормальными» фибробластами, так и с гладкомышечными клетками. Миофибробласты начинают накапливаться на ранних стадиях заживления раны, наиболее многочисленны во время сокращения раны и постепенно исчезают (возможно, через механизмы апоптоза) на более поздних стадиях образования рубца. (41 , 46) .Напротив, миофибробласты, по-видимому, являются постоянным признаком различных фиброматозов. Исследования миофибробластов в этих патологических состояниях выявили дальнейшее разнообразие фенотипов фибробластов, поскольку эти клетки можно разделить на категории на основе их экспрессии белков, таких как виментин, актин, миозин и десмин. Существует мало убедительных доказательств клеточного происхождения этих миофибробластов или химических сигналов, запускающих их накопление. (45) . Однако вполне вероятно, что эти клетки возникают в соответствии с конкретными физиологическими потребностями в результате измененных сигналов из микросреды. (41) .

Наконец, неоплазия представляет собой третье обстоятельство, при котором фенотип «связанных с карциномой» фибробластов отличается от фенотипа фибробластов, обнаруженных в нормальной ткани. Предыдущая работа документально зафиксировала такие различия, включая аномальную экспрессию актина гладких мышц (аналогичную той, что наблюдается в миофибробластах, связанных с заживлением ран), несоответствующую секрецию протеолитических ферментов, включая металлопротеиназы (металлометионеин-2 и стромелизин-3; Ref. 14 ,, 47 ), а также производство белков внеклеточного матрикса, таких как тенасцин и гиалуронан. (15 , 48) .Эти различия могут усилить инвазивный потенциал злокачественных эпителиальных клеток. CAF также могут быть способны модулировать фенотип ближайших эпителиальных клеток. В частности, экспрессия рецептора эпителиальных стероидов (11) , а также экспрессия молекул клеточной адгезии (49) , может регулироваться CAF посредством паракринных сигнальных механизмов.

Хотя изменения CAFs были описаны ранее, это исследование показывает, что присутствие таких клеток вблизи инициированного эпителия имеет важные биологические последствия.Мы предполагаем, что эти CAF направляют прогрессирование эпителиальной опухоли. В описанной здесь модельной системе эти CAF стимулируют прогрессирование эпителиального туморогенеза. CAF последовательно не образуют опухоли, когда их прививают или инокулируют сами по себе. Они являются генетически нормальными, как определено сравнительной геномной гибридизацией и кариотипическим анализом, и демонстрируют ограниченную продолжительность жизни в культуре (таблица 1). ⇓ . Более того, по рассматриваемым здесь критериям эти фибробласты были морфологически и иммуноцитохимически неотличимы от нормальных фибробластов.

Предыдущие исследования.

Следует отметить, что другие исследователи ранее изучали взаимодействия фибробластов и эпителия в росте и развитии опухоли с использованием иммортализованных или канцерогенных фибробластных клеточных линий, а не смертных фибробластов, используемых в этом исследовании (Refs. 25 а также 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 год ; см. рис. 6 ⇓ ). Эти исследования продемонстрировали, что линии фибробластных клеток, а также инициированные фибробласты, которые были изменены вирусными или химическими канцерогенами, могут усиливать рост и рост опухоли при совместной инокуляции с клетками карциномы.Это происходит даже в условиях, когда клетки карциномы инокулируются ниже их онкогенной дозы. Эти инициированные и / или канцерогенные фибробластные клеточные линии отличаются от CAF, описанных здесь, поскольку описанные клеточные линии ранее образовывали опухоли (саркомы) при введении по отдельности, содержали генетические изменения, были бессмертными и / или отличались от нормальных фибробластов по множеству туморогенных фенотипов.

Рис.6.

Исследования, в которых изучали взаимодействие фибробластов и эпителия с использованием клеток на разных стадиях неопластической прогрессии.Перечислены это исследование и те, на которые есть ссылки.

Взаимодействия фибробластов и эпителия при росте и развитии опухоли также были изучены путем совместной инокуляции нормальных или CAF с опухолегенными эпителиальными клетками. Было показано, что такие фибробласты регулируют рост, дифференциацию и туморогенез клеток карциномы как положительным, так и отрицательным образом. (54 , 58, 59, 60, 61, 62, 63) . Следует признать, что эпителиальные клетки, использованные в этих предыдущих исследованиях, также отличались от тех, которые использовались в настоящем исследовании.Клетки TAg-HPE, хотя и были иммортализованы, по строгим критериям оказались неопухолевыми. Таким образом, хотя предыдущие исследования продемонстрировали, что фибробласты могут регулировать рост клеток карциномы, настоящее исследование является первым, демонстрирующим, что первичные, фенотипически нормальные фибробласты, связанные со злокачественным эпителием человека, могут стимулировать прогрессирование неопухолевых эпителиальных клеток (рис. 6). ⇓ .

Изменчивость фенотипа CAF.

Тканевые рекомбинанты CAF / TAg-HPE, представленные выше, продемонстрировали воспроизводимую вариабельность.Хотя клиническая стадия и степень Глисона всех образцов опухолей, использованных для выделения различных популяций CAF, были сходными, способность отдельных изолятов CAF способствовать онкогенезу различалась. Это не было неожиданностью, учитывая неоднородное клиническое поведение опухолей простаты, даже в пределах одинаковых клинических стадий и классов. Обнаруженная вариабельность онкогенеза не зависела от периода роста тканевых рекомбинантов, а была продиктована образцом CAF, использованным в конкретном тканевом рекомбинанте (таблица 1). ⇓ .Это подчеркивает неоднородность опухоли к опухоли. Следует также отметить, что разные субпопуляции CAF в одном образце привели к опухолям разной влажной массы. Это наблюдение, вероятно, отражает переменный вклад нормальных фибробластов, CAF и гладкомышечных клеток в строму, окружающую злокачественную опухоль предстательной железы. Внутриопухолевая вариабельность не зависела от экспериментальных условий, поскольку пересадка тканевых рекомбинантов, содержащих одну и ту же субпопуляцию CAF, в разные дни давала аналогичные результаты.

Дополнительность модельных систем.

Системы in vivo, и in vitro, , описанные в этом исследовании, дали дополнительные результаты. Все изменения измеренных онкогенных показателей обеих систем способствовали росту опухоли. CAF стимулировали гистологические изменения, замедляли гибель клеток и повышали пролиферацию инициированных эпителиальных клеток как in vivo, , так и in vitro . Тканевые рекомбинанты, состоящие из CAF / TAg-HPE, продемонстрировали влажную массу в 500 раз больше, чем тканевые рекомбинанты, состоящие из NHPF / TAg-HPE.Процент клеток TAg-HPE в S-фазе клеточного цикла удваивался при совместном культивировании с CAF. Это предсказуемо привело бы к существенной разнице в росте опухоли с течением времени. Аналогичным образом, замедление гибели клеток, которое наблюдалось при совместном культивировании клеток TAg-HPE с CAF, также могло оказывать значительное влияние на размер опухоли с течением времени. Ожидается, что это 2-кратное увеличение жизнеспособности клеток (снижение гибели клеток) в сочетании с 2-кратным увеличением пролиферации будет иметь драматический эффект in vivo .Действительно, это то, что мы наблюдали (рис. 3). ⇓ . Таким образом, результаты каждой системы подтверждали и обобщали результаты другой. Хотя в настоящих экспериментах анализировался вклад CAF в стимуляцию онкогенеза, участие других стромальных компонентов не исключалось. Эндотелиальные клетки, воспалительные клетки и другие, возможно, также внесли свой вклад в среду, которая усиливала онкогенез в системе in vivo .

Новые аспекты модельных систем.

У модельных систем, описанных в настоящем исследовании, есть несколько важных преимуществ: ( a ) человеческие клетки были использованы для исследования онкогенного процесса. Это важно, потому что эти клетки могут быть более репрезентативными для рака человека, чем модели на животных; ( b ) мы использовали отдельные, но взаимодополняющие модели in vitro и in vivo . Поскольку наша система in vitro была подтверждена с помощью нашего подхода in vivo , мы сможем использовать систему in vitro в будущем для изучения конкретных переменных, которые могут влиять на канцерогенный процесс; ( c ) наши модельные системы позволили нам индивидуально управлять генетическими и эпигенетическими компонентами.Генетические изменения имеют решающее значение для туморогенеза. Однако накопление мутаций в злокачественных клетках происходит на фоне взаимодействия с микроокружением опухоли. Хотя микросреда часто рассматривается как поддерживающая и отзывчивая, наши данные демонстрируют, что она играет более активную роль в канцерогенном процессе. В этом отношении многоступенчатая прогрессия, которая олицетворяет канцерогенез, включает генетические изменения в эпителии, а также эпигенетический вклад окружающей поддерживающей стромальной ткани.Наши данные подчеркивают необходимость обоих компонентов в этом процессе и демонстрируют, что ни один компонент сам по себе не является достаточным, чтобы вызвать прогрессирование опухоли. Описанные здесь модельные системы позволяют независимо изучать генетические и эпигенетические влияния. Наблюдения, изложенные в настоящем исследовании, имеют важное значение для диагностики и лечения злокачественных заболеваний.

«Активность эпителиального дефенсина HBD-3 против пародонтального патогена» Нормана Б.Штраф

Название степени

Магистр стоматологических наук (MDS)

Комитет

Прадип К. Адатроу, D.D.S., M.P.H., M.D.S. Анастасиос Каридис, D.D.S., Ph.D. Свати Ю. Равал, B.D.S., M.D.S. Сидни Х. Штейн, доктор философии, доктор философии.

Ключевые слова

Дефенсин, эпителий, липополисахарид

Аннотация

Дефенсины — катионные (положительно заряженные) пептиды с антибиотической активностью широкого спектра действия. У человека есть два типа дефенсинов: альфа (α) и бета (β).Нейтрофилы человека содержат четыре α-дефенсина, известные как пептид нейтрофилов человека (HNP) 1-4. Эпителиальные клетки продуцируют четыре β-дефенсина, известные как бета-дефенсин человека (HBD) 1-4. Грамотрицательные анаэробные бактерии, связанные с заболеваниями пародонта, устойчивы к человеческим α-дефенсинам, но убиваются β-дефенсинами.

HBD-3 — наиболее активный β-дефенсин. HBD-3 является более длинным пептидом, чем HNP 1-4. HBD-3 имеет дополнительные аминокислотные остатки с гидрофобными боковыми цепями около N-конца и остатки с катионными боковыми цепями на C-конце.

Цели: (1) Подтвердить, что пародонтальный патоген A.a. ( Aggregatibacter actinomycetemcomitans ) устойчив к HNP-1, но убивается HBD-3; (2) Определите, может ли N-концевая или C-концевая часть HBD-3 учитывать активность против A.a. ; (3) Определить, связывается ли HBD-3 с липополисахаридом (LPS), который покрывает поверхность грамотрицательных бактерий; (4) Определите, является ли связывание гидрофобного N-конца HBD-3 с гидрофобной частью липида A LPS за активность HBD-3 против A.а.

Методы: непатогенные Escherichia coli и патогенные A.a. Бактерии Y4 инкубировали с рекомбинантным HBD-3 или HNP-1, очищенным от нейтрофилов человека. Бактерии также инкубировали с синтетическими пептидами CHRG07 и CHRG01. Эти пептиды имеют последовательности, происходящие от N-конца и С-конца HBD-3 соответственно. Количество жизнеспособных бактерий определяли путем разведения, посева на твердую питательную среду и подсчета колоний.

Бактерии также инкубировали с HBD-3 и очищенным ЛПС из E.coli или A.a. , чтобы определить, абсорбирует ли очищенный LPS HBD-3 и блокирует ли убийство. В аналогичных экспериментах использовался очищенный липид А или деацилированный ЛПС, в котором отсутствуют гидрофобные жирные кислоты липидной части ЛПС.

Результаты: HBD-3 обладал сильной бактерицидной активностью против A.a. в обычных условиях анализа для α-дефенсинов (в разбавленной культуральной среде) и в обычных условиях анализа для β-дефенсинов (в буфере без питательных веществ). HBD-3 в концентрации 5 мкМ убивал 90-99% A.а. в течение 2-4 часов. Напротив, HNP-1 не проявлял активности против A.a. независимо от условий анализа, подтверждая, что A.a. устойчив к HNP-1, но убивается HBD-3.

И CHRG07, и CHRG01 убили A.a. , но гораздо активнее оказался CHRG07. Активность CHRG07 была равна активности HBD-3, что указывает на то, что смесь гидрофобных и катионных аминокислотных остатков на N-конце может составлять активность HBD-3 против A.a.

Очищенный ЛПС из E.coli или A.a. блокировал активность HBD-3 при соотношении LPS к HBD-3 1: 1, указывая на то, что одна молекула HBD-3 связывается с каждой молекулой LPS. Деацилированный ЛПС также блокировал HBD-3 в соотношении 1: 1, но очищенный липид А не блокировал. Хотя HBD-3 связывается с LPS, и гидрофобные остатки рядом с N-концом HBD-3, по-видимому, важны для уничтожения A.a. , часть гидрофобного липида A LPS не была сайтом связывания HBD-3. Связывание HBD-3 с другими гидрофобными веществами, такими как мембранные белки или фосфолипиды, может быть важным для активности HBD-3 против A.а.

Выводы: Сопротивление A.a. к α-дефенсинам лейкоцитов, вероятно, важен для способности A.a. , чтобы вызвать болезнь. С другой стороны, β-дефенсины эпителиальных клеток, вероятно, помогают защитить здоровых людей от заболеваний полости рта. Небольшие синтетические пептиды, такие как CHRG07, которые содержат часть HBD-3, активную против пародонтального патогена A.a. может быть полезен для профилактики или лечения гингивита и пародонтита.

Эпителиально-мезенхимальные взаимопревращения в нормальном поверхностном эпителии яичников и карциномах яичников: исключение из нормы

ПОКАЗЫВАЕТ 1-10 ИЗ 95 ССЫЛОК

СОРТИРОВАТЬ ПО РелевантностиНаибольшее влияние на статьи Новость

Поверхностный эпителий, патология яичников, биология яичников.

Целью данной статьи является обзор клеточных и молекулярных механизмов, которые лежат в основе контроля нормального и неопластического роста клеток OSE, дифференцировки и экспрессии индикаторов прогрессирования неопластики. Развернуть

• Просмотреть 11 выдержек, справочная информация

Экспрессия E-кадгерина при эпителиальном раке яичников человека и нормальном яичнике

Клеточно-специфическая экспрессия E-cad в кистах включения нормальных яичников и в эпителиальных слоях пограничных опухолей указывает на роль для E‐ cad в ранних событиях прогрессии до злокачественного фенотипа, который наблюдался в злокачественных опухолях всех стадий, несмотря на степень их дифференцировки.Развернуть

• Просмотреть 2 выдержки, справочная информация

Переключение кадгерина при прогрессировании рака яичников

Результаты показывают, что регулируемая экспрессия комплексов P-кадгерин / β-катенин в опухолевых клетках яичников может представлять собой ключевой этап в прогрессировании заболевания. Развернуть

• Просмотреть 1 отрывок, справочная информация

Эндотелин-1 способствует переходу эпителия в мезенхиму в клетках рака яичников человека.

Показано, что аутокринный путь ET-1 / ET (A) R управляет эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT) в опухолевых клетках яичников путем индукции фибробластоидного и инвазивного фенотипа, подавления E-кадгерина, повышения уровня бета-катенин, улитка и другие мезенхимические маркеры, а также подавление активности промотора E / E / R.