Какая реакция может быть на манту в 1 год: Реакция Манту | 1ДМЦ

¹ Кафедра гигиены и эпидемиологии, Медицинская школа Университета Янины, университетский городок, 45110, Янина, Греция

Поступило 3 июня 2008 г .; Принято 20 августа 2008 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе. при условии правильного цитирования оригинала.

Реферат

Предпосылки

Туберкулез остается серьезным заболеванием во всем мире.Участники противотуберкулезной кампании много раз сталкиваются с отрицательными туберкулиновыми кожными пробами после вакцинации бациллой Кальметта Герена. Решением может быть увеличение количества туберкулиновых единиц. Однако является ли реакция кожи линейной функцией дозы туберкулина? Есть ли побочные эффекты при приеме более высоких доз туберкулина?

Описание клинического случая

Шесть одновременных кожных туберкулиновых проб Манту с использованием 1, 2, 5, 10, 20 и 50 туберкулиновых единиц (всего 88) очищенного производного белка RT23 на 0.1 мл был применен к здоровому мужчине-греку 35 лет с известной естественной первичной инфекцией Mycobacterium tuberculosis за последние пять лет. Через 72 часа уплотнения на коже составили 15, 22, 23, 19, 23 и 27 мм соответственно.

Заключение

Не наблюдается линейной зависимости между дозой туберкулина и кожной реакцией; кожная реакция усиливалась по мере увеличения дозы туберкулина, но с уменьшающейся скоростью, особенно после 2 ТЕ, что кажется правильно определенным для выявления естественной инфекции.Побочных эффектов не было.

Предпосылки

В восьмидесятые годы первый автор (ID), ответственный за противотуберкулезную кампанию в префектуре Иоаннина, Греция, много раз сталкивался с отрицательными результатами туберкулиновых кожных тестов (TST) после вакцинации Bacille Calmette-Guérin (БЦЖ), и ему приходилось отвечать Почему. Была ли вакцина БЦЖ недостаточной? Была ли техника прививки недостаточной? Была ли обычная доза туберкулина в тестах TST, рекомендованная для выявления естественной инфекции, достаточной для выявления искусственной БЦЖ-инфекции?

БЦЖ содержит слабые бациллы; ТКП после БЦЖ может потребовать увеличения дозы туберкулина.Он увеличил туберкулиновые единицы (ТЕ) [1], предположив, что чем больше единиц, тем больше реакция. Однако об этом ничего не известно. Кроме того, есть ли побочные эффекты при приеме более высоких доз туберкулина?

ID экспериментировал на себе, используя одновременно шесть различных разведений: 1, 2, 5, 10, 20 и 50 TU на 0,1 мл (всего 88 TU). Ни одна из трех соответствующих статей [2-4], полученных (22 мая 2008 г.) из Medline с использованием алгоритма (Манту ИЛИ Имотест ИЛИ Тин ИЛИ «туберкулиновая кожная проба *» ИЛИ «туберкулиновая проба *») И (одновременное * ИЛИ множественное ИЛИ «тот же человек» ИЛИ «тот же человек» ИЛИ «тот же пациент») И (доза ИЛИ дозировка ИЛИ единица * ИЛИ «ЕД»), одновременно применяли более 15 ЕД для одного и того же человека, по сравнению с 88 ЕД в нашем случае.

Туберкулез остается серьезным заболеванием, убивающим миллионы людей во всем мире [5-7], особенно после пандемии вируса иммунодефицита человека и появления во всем мире штаммов с множественной лекарственной устойчивостью [6]; более того, он вернулся даже там, где, как мы думали, он был устранен [8]. Этот эксперимент над собой ничего не потерял в своей ценности; наоборот, он снова стал вечнозеленым. Его результаты могут заинтересовать фтизиатров, практикующих врачей и исследователей иммунитета.

Описание клинического случая

Методы

У здорового греческого врача-мужчины, 35 лет, рост 173 см, вес 72 кг, никогда не куривший, выпивающий не более одного или двух напитков в неделю, с известной естественной инфекцией с пяти лет 12 ноября 1985 г. было применено шесть TST (рисунок).Руки принадлежат первому автору, специализирующемуся на пульмонологии в Афинской больнице болезней грудной клетки в 1976–1980 годах. В течение этого периода он неоднократно получал отрицательные результаты тестов Манту / Сокаля; последний отрицательный результат 10 апреля 1980 г. Первый положительный результат у Манту произошел 20 июня 1980 г. С 11 февраля 1980 г. по 11 апреля 1980 г. он вообще не контактировал; таким образом, наиболее вероятный период заражения пришелся на период с 11 по 20 апреля 1980 г., первую неделю его службы в армии, когда имел место контакт с очень вероятным больным туберкулезом. Он получал химиопрофилактику (300 мг изониазида и 25 мг пиридоксина каждое утро) с июля 1980 года по май 1981 года.

Шесть одновременных туберкулиновых кожных проб у одного и того же человека (незначительная ретушь в 1 ЕД) . Руки принадлежат здоровому мужчине-греку 35 лет, с известным естественным заражением Mycobacterium tuberculosis с 5 лет (первый автор). Шесть точек в середине эритемы обозначают точки внутрикожной инъекции (метод Манту). Цифры между точками указывают расстояние между точками впрыска (в мм). Цифры под заголовком «TU» означают количество туберкулиновых единиц PPD-RT23 на инъекцию (доза туберкулина).Цифры под заголовком «мм» обозначают диаметр уплотнения в мм. Маленькие вертикальные линии | … | показаны границы уплотнения, а стрелки к этим линиям, поперек оси бревна предплечья, указывают на следы шариковой ручки, сделанные для определения границ методом Сокаля.

Все флаконы с 1, 2, 5, 10, 20, 50 TU на 0,1 мл очищенного производного белка (PPD) RT23 были предоставлены Институтом Пастера Греции в тот же день, сохранены в идентичных условиях и введены в течение нескольких дней. после изготовления, задолго до истечения срока годности.

Тестировщиком была медсестра по месту жительства противотуберкулезной кампании Янины с более чем двадцатилетним опытом работы. Во все шесть тестов вводили lege-artis (одна одноразовая игла 25 G с острым скосом и пластиковый туберкулиновый шприц на тест; внутрикожная инъекция ровно одной десятой миллилитра туберкулина PPD; белый блистер 4 мм). Индурация была определена через 72 часа по методике Сокала (рисунок).

Результаты

Результаты представлены на рисунке.Кожная реакция не была линейной функцией дозы туберкулина; уплотнение увеличивалось с уменьшающейся скоростью по мере увеличения дозы туберкулина (рисунок), в то время как неожиданное снижение произошло в дозе 10 ТЕ. Эритема (покраснение) не измерялась, но она была параллельна уплотнению (рисунок). Побочных эффектов не было.

Индурация туберкулиновой кожной пробы в зависимости от дозы туберкулина . Шесть одновременных тестов Манту с использованием 1, 2, 5, 10, 20 и 50 единиц PPD-RT23 на 0,1 мл (см. Рисунок 1).

Обсуждение

Снижение роста также обнаружило Tzimakas et al (1980; четыре TST на человека, 1, 2, 5 и 10 TU на 0,1 мл, у греческих здоровых мужчин и больных туберкулезом; у последних была более выраженная реакция) [9], Tzimakas et al (1984; 30 здоровых греческих молодых женщин, из которых десять были протестированы Манту с 2, десять с 5 и десять с 10 TUs PPD-RT23 на 0,1 мл) [10], Dimoliatis (1987; либо 1 или 2 или 10 ТЕ PPD-RT23 на 0,1 мл Манту на группу у 279 греческих школьников, вакцинированных жидкой или лиофилизированной БЦЖ; 6 групп) [1], Alcaide et al (1992; две единицы Манту, 2 и 5 ТЕ PPD-RT23 , у 2575 испанцев) [2], Стюарт и др. (2000; два TST на человека, 5 и 10 TUs PPD на 0.1 мл у 128 австралийских медицинских работников) [3] и Jentoft et al (2001; уплотнение ≥ 15 мм в 32% и 41% тестов Манту с 2 и 5 ТЕ PPD-RT23 соответственно в Норвегии) ​​[4 ]. Tzimakas et al (1980) [9] и Stuart et al (2000) [3] не уточняют, какой штамм использовался PPD; возможно, PPD-RT23 и PPD-S соответственно, поскольку PPD-RT23 используется в Греции и, вероятно, PPD-S в Австралии.

Парадокс более низкого уплотнения при 10 ТЕ по сравнению с 5 ТЕ (рисунок) может быть вызван случайностью, техническими ошибками, недостаточной концентрацией в данном конкретном флаконе или неизвестным фактором (факторами).Мы не считаем, что произошли технические ошибки (один и тот же опытный тестировщик, одно и то же время, точно 0,1 мл / тест, идентичный блистер на тест, идентичные условия хранения флаконов). Вероятность крайне маловероятна, потому что это явление снова наблюдалось несколько дней спустя (ноябрь 1985 г.), когда 431 ребенок, ранее вакцинированный лиофилизированной БЦЖ (апрель 1985 г.), был протестирован Манту с использованием тех же пузырьков и обнаружил ту же картину, в частности среднее диаметр в мм 5,8 (стандартное отклонение 4,8) у 74 детей, испытанных с 1 ТЕ, 9.3 (4,4) в 15 с 2 ТЕ, 10,9 (5,7) в 88 с 5 ТЕ, 10,0 (5,4) в 94 с 10 ТЕ, 11,4 (5,8) в 78 с 20 ТЕ и 14,5 (4,9) в 82 с 50 ТЕ [11]. Таким образом, наиболее вероятным объяснением является то, что что-то было не так с этой конкретной партией из 10 TU. Tzimakas et al [9] и Stuart et al [3] не предоставили подробностей о размерах реакций и используемом штамме PPD соответственно; таким образом, невозможно проверить, существует ли наше уменьшение на 10 единиц TU также в их данных.

Основная мысль исследователя, когда он осмелился ввозить в свой организм такое количество ТЕ (в 44 раза больше обычной дозы TST и в 5-6 раз больше, чем указано в библиографии), заключалась в том, что гораздо больше количества (неочищенного) Производные mtb должны находиться в теле туберкулеза и, кроме того, в легких, а не просто внутрикожно.Отсутствие каких-либо побочных эффектов подтвердило эту гипотезу. Он также основывался на уже использовавшемся более плотных разведениях [1], где он пришел к выводу, что реакция TST не является линейной функцией дозы туберкулина, а скорее возрастающей зависимостью, совместимой с известной в иммунологии кривой антиген-антитело [ 6]. Эта гипотеза также была подтверждена этим экспериментом на самом себе: кожная реакция является возрастающей функцией дозы туберкулина, но с уменьшающейся скоростью, особенно после 2 ТЕ.Стоит отметить, что из-за этой скорости уменьшения рекомендуемая доза для рутинного выявления естественной инфекции была правильно определена как 2 TU PPD-RT23 на 0,1 мл: хотя увеличение в мм уплотнения велико до этой дозы, оно составляет незначительно сверх этого.

Это история болезни. Однако эти результаты были повторены в шести группах детей, испытанных с шестью флаконами, показанными на рисунке [11], и соответствуют другим исследованиям [1-4,9,10].

Заключение

После шести одновременных кожных проб с туберкулином Манту с 1, 2, 5, 10, 20 и 50 ТЕ у здорового мужчины 35, т.е.е. после одновременной инъекции одному и тому же человеку в 44 раза больше TU, чем обычная доза TST, состоящая из 2 TU PPD-RT23, (i) побочных эффектов не наблюдалось; (ii) не наблюдается линейной зависимости между дозой туберкулина и кожной реакцией; последняя увеличивалась по мере увеличения дозы туберкулина, но с уменьшающейся скоростью, особенно после 2 ТЕ, что (iii) кажется правильно определенным для выявления естественной инфекции.

Сокращения

БЦЖ: Бацилла Кальметта Герена; мл: миллилитр; mtb: Mycobacterium tuberculosis ; PPD: очищенное производное белка; RT23: название использованного туберкулина; ТКП: туберкулиновая кожная проба; ТУ: Туберкулиновое отделение.

Согласие

«Письменное информированное согласие было получено от пациента для публикации этого описания случая и сопутствующих изображений. Копия письменного согласия доступна для просмотра главным редактором этого журнала».

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Вклад авторов

ID задумал идею и провел эксперимент. CL выполнил поиск в медлайн и написал первый черновик.Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись. ID является гарантом бумаги.

Ссылки

• Dimoliatis JD. Величина кожной реакции на туберкулин в зависимости от дозы туберкулина. Ятрики. 1987. 52: 538–542. (на греческом языке с аннотацией на английском языке). [Google Scholar]
• Алькаид Дж., Альтет Миннесота, Баталла Дж., Планы П., Табернер Дж. Л., Саллерас Л., Ромеро Массачусетс. Сравнительное исследование кожной чувствительности человека к 2 и 5 международным единицам туберкулина PPD RT 23 с твином 80.Med Clin (Barc) 1992; 99: 525–528. (на испанском языке с аннотацией на английском языке). [PubMed] [Google Scholar]
• Стюарт Р.Л., Беннетт Н., Форбс А., Грейсон М.Л. Парное сравнение результатов туберкулиновой кожной пробы у медицинских работников, принимавших туберкулин 5 и 10 ТЕ. Грудная клетка. 2000. 55: 693–695. DOI: 10.1136 / thorax.55.8.693. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Jentoft HF, Omenaas E, Eide GE, Gulsvik A. Сравнение теста на адреналин-Пирке с международными туберкулиновыми тестами PPD.Respir Med. 2001; 95: 205–211. DOI: 10.1053 / средн.2000.1023. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Murray CJL, Lopez AD. Глобальное бремя болезней. Всемирная организация здравоохранения, Гарвардская школа общественного здравоохранения и Всемирный банк; 1996. стр. 361. [Google Scholar]
• Иван Ройтт. Основная иммунология Ройтта. 9. Blackwell Science, Оксфорд; 1997. 336 269 300. [Google Scholar]
• Lao LY, De Guia TS. Туберкулиновая кожная проба: детерминанты и реакция. Респирология. 1999; 4: 311–317.DOI: 10.1046 / j.1440-1843.1999.00198.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Всемирная организация здравоохранения, Европейское региональное бюро. Здоровье 21 — основы политики достижения здоровья для всех в Европейском регионе ВОЗ. Копенгаген; 1999. стр. 47. [PubMed] [Google Scholar]
• Цимакас К., Зарогулидис К., Анастасиаду Б., Димитриадис Г. Наблюдения за эффективностью туберкулиновых кожных проб с различными туберкулиновыми единицами. Материалы 8-го Медицинского конгресса вооруженных сил Греции. 1980 г.п. 71. (резюме 113; на греческом языке).
• Tzimakas C, Kalafati-Tzimaka H, ​​Kakavelas H, Kapaltzoglou A. Помехи одновременной туберкулиновой кожной пробы. Гален. 1984; 26: 83–88. (на греческом языке с аннотацией на английском языке). [Google Scholar]
• Димолиатис I. Труды Третьего Греческого медицинского конгресса по заболеваниям грудной клетки. Салоники, Греция; 1986. Программа вакцинации лиофилизированной БЦЖ у 1690 детей в возрасте от 3 до 18 лет; до и после вакцинации туберкулиновая кожная проба; п. 119. (аннотация 103; на греческом языке).[Google Scholar]

Туберкулез подвздошной кости с двухкомпонентным абсцессом

Описание

39-летний мужчина поступил с коварными болями в спине и паху в течение 2 недель и хромал в течение 7 дней в амбулаторное ортопедическое отделение. У него была анорексия в течение последних двух недель, и он заметил потерю веса примерно на 7 кг, хотя у него оставалась лихорадка. При осмотре обнаружена ложная деформация правого бедра и болезненность в правой подвздошной ямке. Рентген таза показал нечеткое литическое поражение в передней половине правой подвздошной лопатки с минимальными периостальными реакциями (рис. 1).Его лабораторное исследование показало высокий гемоглобин 12 г / дл, скорость оседания эритроцитов на 64 мм, падение в конце первого часа, повышенное общее количество лимфоцитов 13 × 10 ⁹ / л с лимфоцитозом 40%. Его параметры почек, печени и питания были в пределах нормы (альбумин> 3500 мг / дл, абсолютное количество лимфоцитов> 1500 / мм ³ ). На рентгенограмме дорсолюмбо-крестцовой области и грудной клетки без особенностей. Была сделана МРТ, которая показала повышенную интенсивность на T2 и изображениях подвздошной кости с подавлением жира с эрозиями в коре, а также гиперинтенсивное скопление T2 в прилегающей подвздошной мышце и ягодичных мышцах, указывающих на абсцесс (рис. 2).УЗИ того же самого показало гипоэхогенное скопление переднемедиальнее правой подвздошной кости (рис. 3). Около 30 мл аспирата, который выглядел гнойным и густым, было удалено под контролем и отправлено на окрашивание по Граму, Цейлу Нильсену (ZN) и эксперту по генам (тест на амплификацию нуклеиновых кислот на основе катриджа (CBNAAT)). Окрашивание по Граму показало более 100 лейкоцитов на поле с низким увеличением, но окрашивание ZN (показывающее несколько кислотоустойчивых бактерий) и окрашивание по генам (CBNAAT) были положительными, подтверждая наличие Mycobacterium и чувствительность к рифампицину.Пациенту был начат курс из четырех препаратов противотуберкулезной терапии в соответствии с пересмотренной национальной программой борьбы с туберкулезом (категория 1: изониазид, рифампицин, пирозинамид и этанбутол (HRZE) в течение 2 месяцев, затем изониазид, рифампицин (HR) в течение 4 месяцев. ). Примерно через 2 месяца наблюдения у него было значительное клиническое улучшение с чувством общего благополучия, восстановился аппетит и увеличился вес примерно на 4 кг.

Рентгенограмма таза с обоих бедер, показывающая нечеткое литическое поражение (стрелка) с вовлечением правой подвздошной кости с минимальной надкостничной реакцией.

Корональная (A) и аксиальная (B) МРТ с подавлением жира показывает повышенную интенсивность сигнала в правой подвздошной кости, небольшую область разжижения и прилегающую корковую эрозию. Наряду с поражением кости наблюдается гиперинтенсивный сбор медиально, смещая подвздошную мышцу и латерально в ягодичных мышцах. На аксиальном T1WI (C) скопление кажется гипоинтенсивным. T1WI, T1 взвешенное изображение.

Ультразвуковое изображение правой / левой поясничной области по длинной оси в серой шкале показывает большое гипоэхогенное поражение (толстая черная стрелка) в поясничной мышце, видимое перед корой поясничного отдела позвоночника (тонкая черная стрелка) с небольшими безэхогенными участками ( тонкая белая стрелка) внутри него (что указывает на некроз и, следовательно, образование абсцесса).

Туберкулез — серьезное бремя для здоровья, особенно в странах с низким и средним доходом. На внелегочный туберкулез приходится 10–15% заболеваний, из которых около 10% связаны со скелетом, главным образом с поражением позвоночника с последующим поражением костно-суставного аппарата. Изолированное поражение костей встречается редко, но сообщается о ребрах, длинных костях, пястных костях, лицевых костях и тазе.1 Диагностика в таких случаях может быть затруднена из-за атипичности и часто не учитывается. Визуализация играет важную роль в таком сценарии.Обычный рентгеновский снимок может показать деструкцию кости, но на компьютерной томографии его лучше определить. Абсцесс таза можно подтвердить с помощью УЗИ, а также выявить дефект подвздошной кости. Мы выделяем здесь результаты МРТ, по которым можно очень хорошо оценить двухкомпонентный абсцесс вместе с поражением подвздошной кости. Подвздошно-поясничный (ИП) абсцесс в странах с низким и средним доходом в основном является первичным, а во вторую очередь может быть вызван соседним спондилодисцитом2. В нашем стандартном учении абсцесс ИП должен быть туберкулезным, если не доказано иное.Следовательно, мы могли оперативно поставить диагноз с помощью окрашивания ZN и эксперта по генам.

Особые находки в нашем случае:

1. Изолированное поражение тазовой кости при туберкулезе встречается редко.

2. Вторичный абсцесс IP возникает из-за патологии желудочно-кишечного тракта или мочеполовой системы, но в нашем случае он в основном гнойный, но туберкулезный.

3. Вторичный туберкулезный абсцесс IP распространяется от соседних позвонков (спондилодисцит), чего не было.

CBNAAT — эффективный и быстрый тест с высокой чувствительностью (95.7%) и специфичности (99,3%), что является очень полезным инструментом для ранней диагностики даже в случаях, когда окрашивание отрицательное. Пациенту потребуется повторное наблюдение, поскольку рецидивы не редкость. Визуализация играет очень важную роль в диагностике туберкулеза скелета. Дифференциальный диагноз, который необходимо иметь в виду, включает гнойный абсцесс, другие гранулематозные состояния, гематомы, увеличенную сумку IP и псевдоаневризму.4

Мы намерены выделить классические результаты МРТ, дополненные другими диагностическими изображениями в этой ситуации.

Очки обучения

• Туберкулез может проявляться как изолированный остеомиелит.

• Абсцесс подвздошной кишки при туберкулезе может возникать без поражения позвоночника.

• Кортикальная эрозия и перфорация подвздошной кости могут затрагивать обе стороны, что приводит к двухкомпартментному абсцессу.

• Ультразвуковой дренаж помогает в диагностике и лечении с помощью противотуберкулезных препаратов.

Границы | Профилактика и лечение инфекционных осложнений ретроградной интраренальной хирургии

Введение

Почечнокаменная болезнь (KSD) — часто встречающееся заболевание в урологической практике, с оценочной частотой и распространенностью в США 0.9 и 8,8% соответственно (1, 2). Распространенность KSD в последние годы имеет тенденцию к росту как в популяционных, так и в крупномасштабных исследованиях (1, 3). Хотя рост заболеваемости KSD можно отчасти объяснить улучшением технологий визуализации и обнаружения, рост ожирения в США является еще одним вероятным фактором, способствующим этому (1, 3).

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) обычно связаны с KSD как по этиологии, так и по осложнению. Камни в почках, которые образуются вторично по отношению к инфекции, вызванной бактериями, продуцирующими уреазу, часто называют инфекционными камнями, а распространенные возбудители включают виды Proteus, Klebsiella и Staphylococcus (4).Однако одно недавнее исследование Parkhomenko et al. оценили посев мочи и камней в когорте 1191 пациентов и обнаружили, что бактериология струвитных камней сместилась в сторону нетрадиционных микроорганизмов, расщепляющих мочевину, таких как Enterococcus видов (5). Инфекционные камни часто состоят из фосфата магния-аммония (струвита) или карбонат-апатита (6). Эти камни образуются в результате расщепления мочевины на аммиак и диоксид углерода (CO ₂ ) под действием уреазы (6). Повышенная концентрация аммиака (а затем и аммония) создает локально щелочную среду, которая способствует образованию камней (6).Повышенная концентрация CO ₂ приводит к превращению CO ₂ в карбонат, что, в свою очередь, приводит к образованию карбонат-апатита (6). Примечательно, что инфекционные камни могут быть полимикробными, включая бактерии, не продуцирующие уреазу (4). Инфекционные камни чаще встречаются у пациентов с постоянными катетерами, нейрогенным мочевым пузырем или другими сопутствующими заболеваниями, которые могут привести к микробной колонизации мочевыводящих путей (6).

Отлично от инфекционных камней (IN-камни) — это инфицированных камней (ID-камни) (6).Камни ID представляют собой колонизированные камни в почках, образование и рост которых не обусловлены выработкой уреазы (6). Например, камень в почках может образовываться в результате других метаболических процессов (например, гиперкальциурии) и впоследствии колонизироваться бактериями мочевыводящих путей (6). Другой предполагаемый механизм возникновения ID-камней заключается в том, что бактерии мочевыводящих путей сами по себе служат очагом образования камней, а метаболические аномалии хозяина впоследствии вызывают рост камней (6). Камни ID с большей вероятностью, чем камни IN, демонстрируют несоответствие между каменными культурами и культурами мочи (6).Напротив, учитывая, что камни IN часто являются следствием предшествующей ИМП, посевы камней и посевы мочи часто совпадают (6). Важно отметить, что IN-камни представляют собой клиническую проблему, потому что антибиотики не могут проникнуть в матрицу камня, что делает решающее значение полного хирургического удаления (6). Если возможно, фрагменты камней следует собирать в стерильных условиях для отправки на культивирование камней (7). Каменные культуры являются не только лучшим предиктором серьезных послеоперационных инфекционных осложнений, но также могут предоставить важную информацию для руководства антимикробным лечением, если у пациента разовьется сепсис (7).

Лечение KSD является мультимодальным, с ретроградной внутрипочечной хирургией (RIRS) в качестве основного варианта хирургического лечения (8). Согласно текущим рекомендациям Американской урологической ассоциации (AUA), пациентам с камнями <20 мм (или <10 мм для камней нижнего полюса) может быть предложена RIRS в качестве хирургического лечения первой линии с отличными показателями отсутствия камней (9). Другие варианты хирургического лечения нефролитиаза включают ударно-волновую литотрипсию (SWL) и чрескожную нефролитотомию (PCNL) (8).Однако благодаря усовершенствованиям в технологии уретероскопов, таким как уменьшение размера эндоскопа и повышение эффективности лазера, RIRS стал наиболее часто используемым инструментом хирургического лечения KSD (8, 10).

Хотя в целом безопасные, важные и потенциально опасные осложнения RIRS включают инфекции мочевыводящих путей и уросепсис. Инфекционные осложнения могут возникнуть при лечении всех типов камней в почках, включая инфицированные, инфекционные и метаболические камни. Несколько больших совместных групп изучали инфекционные осложнения, связанные с RIRS.Отдел клинических исследований Общества эндоурологов (CROES) оценил 11 885 пациентов, перенесших уретероскопию, и обнаружил, что послеоперационная лихорадка возникла у 1,8% пациентов, у 1,0% пациентов развилась ИМП, а у 0,3% пациентов развился сепсис (10). Совместная группа «Уменьшение оперативных осложнений от камней в почках» (ROCKS) сообщила, что в ходе 1817 процедур уретероскопии 2,4% пациентов были госпитализированы вторично по поводу инфекционного осложнения (11). Помимо потенциальной заболеваемости пациентов, послеоперационный сепсис представляет собой серьезное финансовое бремя для системы здравоохранения.Хотя расчеты стоимости могут сильно отличаться, Arefian et al. сообщили, что лечение пациента с сепсисом влечет за собой средние общие расходы на больницу более 30 000 долларов на пациента (12). Сведение к минимуму послеоперационных инфекционных осложнений после RIRS — важный потенциальный путь для столь необходимой экономии затрат, поскольку общий расчетный экономический эффект от нефролитиаза составил 4,5 миллиарда долларов для занятого населения США в 2000 году (13). Учитывая медицинское и экономическое бремя, вызываемое инфекционными осложнениями RIRS, цель этого обзора — обобщить литературу по инфекционным осложнениям RIRS и предоставить современные клинические стратегии смягчения последствий, включая дооперационные, интраоперационные и постоперационные оперативная помощь.

Подготовка к операции

Предоперационное обследование пациента, перенесшего RIRS по поводу KSD, должно включать в себя тщательный сбор анамнеза и физический осмотр, базовые предоперационные анализы крови, включая базовую метаболическую панель (BMP) и полный анализ крови (CBC), а для большинства пациентов предоперационную оценку общего медицинского доктор. Кроме того, рекомендации AUA рекомендуют проводить анализ мочи у всех пациентов и посев мочи у пациентов, у которых есть клинические или лабораторные признаки инфекции (14).Европейская ассоциация урологов (EAU) рекомендует проводить предоперационный посев мочи у всех пациентов, перенесших процедуру удаления камней (15). В то время как положительные нитриты в анализе мочи специфичны для присутствия бактерий, многие уропатогены не продуцируют нитраты, например, Enterococcus (14, 16). Кроме того, у многих пациентов с нефролитиазом наблюдается стерильная пиурия из-за местного воспаления и травмы от камня. Учитывая эти прагматические проблемы, связанные с использованием только анализа мочи, в клинической практике получение посева мочи перед эндоурологическим вмешательством у всех пациентов не вызывает сомнений (17).

Предоперационный посев мочи является важным показателем инфекционных осложнений после RIRS (18–20). Blackmur et al. сообщили о значительной взаимосвязи между предоперационным положительным результатом в среднем образце мочи (MSSU) и частотой уросепсиса, даже несмотря на профилактику антибиотиками (21). Недавний метаанализ, проведенный Sun et al. которые включали 14 исследований с участием 9532 пациентов, оценивающих потенциальные факторы риска инфекционных осложнений после уретероскопии, показали, что положительный предоперационный посев мочи является наиболее значимым предрасполагающим фактором для инфекционных осложнений (19). Сборник доказательств делает использование обычных предоперационных посевов мочи у всех пациентов настоятельно рекомендуется (7, 22). Рутинный предоперационный посев мочи у всех пациентов, по-видимому, уже широко распространен, и его значение в прогнозировании исходов при инфекционных осложнениях поддерживает его дальнейшую практику.

Результаты посева мочи можно разделить на три основные категории: отрицательные, положительные и загрязненные. Пациентам с отрицательными результатами посева мочи предоперационная антибиотикопрофилактика сверх стандартной периоперационной дозы антибиотиков в день операции обычно не показана.Действительно, в текущем заявлении о передовой практике AUA говорится: «Нет доказательств высокого уровня, подтверждающих использование многократных доз противомикробных препаратов при отсутствии дооперационной симптоматической инфекции» (14). Пациентам с положительным посевом мочи следует начать лечение антибиотиками, специфичными для посева, и получить последующий посев мочи. В литературе предполагается, что RIRS следует проводить только при наличии отрицательного последующего посева для пациентов с положительным предоперационным посевом (20, 22–24).Для пациентов с устойчивыми положительными культурами практикующие врачи должны рассмотреть возможность получения консультации по инфекционному заболеванию. У пациентов с зараженными культурами мочи следует получить повторный образец. О зараженных культурах может сообщать микроскопическая лаборатория как таковая, но также можно предположить наличие эпителиальных клеток при микроскопии мочи (25). Действительно, в заявлении о передовой практике AUA рекомендуется брать дополнительные образцы у пациента в виде среднего образца или через катеризацию для повторных исследований мочи (14).

Escherichia coli , грамотрицательная палочка, является одним из наиболее часто встречающихся инфекционных организмов в мочеполовой системе (7, 26, 27). Senocak et al. в своем ретроспективном обзоре обнаружили, что E.coli не только отвечает за большинство положительных в целом положительных культур, но и за самую высокую долю культур с множественной лекарственной устойчивостью (28). Другие часто встречающиеся грамотрицательные микроорганизмы включают Proteus mirabilis, Klebsiella и Pseudomonas aeruginosa (4, 7, 26).E.coli , Proteus и Pseudomonas также являются известными грамотрицательными биопленкообразователями (26). Грамположительные организмы, как правило, состоят из видов Enterococcus и Staphylococcus aureus (7, 26), видов Enterococcus и Staphylococcus aureus также были выделены из биопленок, обнаруженных на катетерах мочевыводящих путей (26). Грамположительные бактерии могут составлять до 40% случаев ИМП, встречающихся в стационарных условиях, при этом Enterococcus составляют большинство этих образцов (29).E.coli и Proetus представляют особый интерес, поскольку они, как правило, вызывают инфекцию как следствие чрезмерного роста эндогенной флоры, а не как чужеродные захватчики (4). Proteus обычно обнаруживается как часть кишечной флоры, иногда переходящей в уретру, но обычно не вызывает ИМП у пациентов с беспрепятственными мочевыводящими путями (4). Наличие постоянного катетера позволяет микроорганизмам подниматься в верхние мочевыводящие пути за счет уникальной «роящейся» подвижности (4).Proteus также является модельным организмом, продуцирующим уреазу, и обычно ассоциируется со струвитными и оленьими камнями (4).

Рост числа бактерий с множественной лекарственной устойчивостью вызывает серьезную озабоченность и может увеличить заболеваемость и смертность от RIRS. Senocak et al. сообщили о распространенности 32,3% бактерий МЛУ в предоперационных посевах мочи у пациентов, перенесших RIRS по поводу KSD (28). Кроме того, они обнаружили, что при многофакторном анализе присутствие микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью является сильным предиктором инфекционных осложнений с отношением шансов 4.75 после учета других факторов пациента (28). И это несмотря на использование соответствующей предоперационной антибактериальной терапии (28). Патель и др. сообщили об аналогичных результатах для ПКНЛ (30). Это подчеркивает важность рационального использования антибиотиков и ограниченного использования эмпирической терапии и предпочтительного использования прямой целевой окончательной терапии перед лицом известной инфекции.

Еще одна важная вещь, о которой практикующий уролог должен знать перед RIRS, — это фунгурия. Чаще всего грибок возникает из-за видов Candida и известен как кандидурия (31).Хотя другие виды грибов, такие как Cryptococcus или Aspergillus , могут инфицировать почки, они обычно делают это только в случае распространенной инфекции и редко вызывают изолированные симптомы со стороны мочевыводящих путей (31). При анализе мочи грибок часто проявляется стерильной пиурией. Посев мочи обычно используется для диагностики грибковых инфекций с такой же эффективностью, как и бактериальные инфекции (31). Как и в случае с бактериальными инфекциями, следует определять восприимчивость к противогрибковым препаратам и назначать лечение, если эти услуги доступны.Другие стандартные лабораторные тесты менее полезны при лечении грибковой инфекции (31). Пациенты с бессимптомной кандидурией обычно не получают лечения, если пациенту не назначена урологическая процедура (31). Пациентов с кандидурией следует лечить пероральным флуконазолом или внутривенным введением амфотерицина В в течение нескольких дней до и после RIRS (14). Более длительный курс противогрибкового лечения рекомендуется пациентам с нейтропенией, которые поступают с обструктивной уропатией и подвергаются хирургическим вмешательствам на мочеполовых путях, таким как RIRS (14).Кроме того, пациенты с диабетом более склонны к кандидурии, поэтому при лечении диабетиков следует использовать более высокую степень клинической подозрительности (31). Кроме того, необходимо получить подробную историю недавнего использования антибиотиков, поскольку потеря сапрофитной флоры при длительном применении обычных антибиотиков, таких как фторхинолоны, цефалоспорины третьего поколения и клиндамицин, связана с повышенным риском грибковых инфекций (32). Хотя редко, грибковые инфекции после RIRS были зарегистрированы у пациентов, получающих длительную антибактериальную терапию (33).

В урологической практике обычно используются постоянные дренажи мочевыводящих путей. К ним относятся катетеры мочевого пузыря, мочеточниковые стенты и чрескожные нефростомические трубки. Было обнаружено, что наличие дренажей во время RIRS связано с послеоперационными инфекционными осложнениями (7, 34). Присутствие инородного тела в мочеполовой системе по существу создает основу для колонизации микроорганизмов и образования биопленки, выступающей в качестве очага инфекции (22). Короче говоря, биопленка представляет собой матрицу внеклеточного материала, выделяемого микроорганизмами, обычно бактериями, которые образуют пленку или покрытие на поверхности инородного тела и обеспечивают адгезию и дальнейшую колонизацию (22, 35).Это особенно актуально для уролога, поскольку многие распространенные уропатогены способствуют образованию биопленок (26). Манипуляции инородным телом с биопленкой во время RIRS могут посеять бактерии по мочеполовому пути (22).

Постоянные катетеры мочевого пузыря (также известные как катетеры Фолея) часто встречаются в урологической практике и часто приводят к внутрибольничным инфекциям, называемым катетер-ассоциированными инфекциями мочевыводящих путей (CAUTI) (26). CAUTI — это наиболее часто встречающаяся в клинической практике внутрибольничная инфекция (26).Неудивительно, что постоянные катетеры мочевого пузыря были связаны с повышенным риском инфицирования после RIRS (36, 37). Кроме того, было обнаружено, что постоянные катетеры мочевого пузыря тесно связаны с предоперационной грибкурией и развитием ССВО после RIRS (38). Мочевые катетеры быстро колонизируются бактериями после введения, и подъем в мочевой пузырь занимает всего 1-3 дня (39). Продолжительность катетеризации — самый большой фактор риска инфицирования (39). Практически все пациенты с постоянным катетером дольше 1 месяца будут иметь бактериурию (40).Имея это в виду, в идеале катетеры следует менять как можно ближе к процедуре. Пациенты с постоянными катетерами с бессимптомной бактериурией должны пройти лечение до процедуры (39). Кроме того, получение посева мочи из «недавно замененного» катетера может помочь лучше адаптировать противомикробную профилактику во время RIRS. Биопленки, образующиеся на катетерах, имеют тенденцию быть полимикробными, если они находятся на месте более нескольких дней (40). «Свежий» обмененный образец может избежать заражения и может дать более релевантные клинические данные.

Несколько исследований установили связь между наличием предоперационных стентов и инфекцией после RIRS (19, 34, 36). Недавний метаанализ Sun et al. обнаружили, что дооперационные мочеточниковые стенты в значительной степени связаны с развитием инфекционных осложнений после RIRS с отношением шансов 1,53 (19). Подобно постоянным катетерам мочевого пузыря, мочеточниковые стенты быстро колонизируются и могут образовывать биопленку вскоре после установки (23). Важно отметить, что инфекция, связанная со стентом, может происходить в отсутствие образования биопленки, что указывает на то, что другие механизмы также опосредуют взаимосвязь между дооперационными мочеточниковыми стентами и развитием сепсиса после RIRS (22).Посев мочи часто не согласуется с посевом из стента, что затрудняет выбор антибиотика (23). Нево и др. обнаружили, что у 11% пациентов были положительные культуры стентов, несмотря на стерильную культуру мочи, а у 26,4% пациентов с положительными культурами мочи и стентов были несовместимые культуры (23). Это же исследование также продемонстрировало связь между положительными культурами стентов и сепсисом после процедуры (23). Нево и др. обнаружили значимую взаимосвязь между продолжительным временем пребывания стента и послеоперационным сепсисом у пациентов, перенесших уретероскопию после установки стента (35).Действительно, Нево и др. сообщили о пятикратном увеличении риска уросепсиса у пациентов с постоянным сроком стента более 30 дней по сравнению с пациентами со временем постоянного стента менее 30 дней (35). Увеличение частоты сепсиса также наблюдалось через 2, 3 и> 3 месяцев пребывания стента (35). Хотя эти результаты предполагают, что замену стента перед RIRS следует рассматривать для пациентов с более длительным временем установки стента, в настоящее время нет проспективных рандомизированных контролируемых исследований, на которых можно было бы основывать окончательные рекомендации.Эти исследования показывают, что у пациентов с постоянными стентами следует поддерживать более высокую степень подозрения на инфекционные осложнения, несмотря на стерильные предоперационные посевы мочи и возможность отправки посевов стентов во время операции. С практической точки зрения, в отличие от катетеров Фолея, стенты нельзя регулярно менять до RIRS, учитывая, что замена стентов обычно выполняется в операционной. «Офисное» стентирование было адаптировано некоторыми урологами, и если бы офисное стентирование получило широкую адаптацию, рутинная замена стента до RIRS может стать потенциальным средством минимизации осложнений, вызванных RIRS в будущем (41).Стенты с лекарственным покрытием и с антимикробным покрытием были изучены как средство решения проблем, связанных с инфекцией, но в настоящее время нет широко адаптированных мочеточниковых стентов с лекарственным покрытием или покрытием (22, 26). Это еще одно важное направление для будущих исследований.

Пациентам может быть проведена чрескожная нефростомическая трубка перед RIRS по разным причинам. Чаще всего это пациенты с острым заболеванием, которые слишком нестабильны для ретроградной установки мочеточникового стента, или пациенты, у которых невозможно установить ретроградный почечный доступ (42).Ранее существовавшие PCN представляют собой известный риск инфекционных осложнений после RIRS (36). Однако, учитывая, что пациенты, которым выполняется установка PCN вместо стентирования по поводу острой непроходимости, часто болеют, неясно, связаны ли более высокие показатели сепсиса во время RIRS с фактическим PCN или с тяжестью заболевания во время начальной декомпрессии. (42). Как и в случае мочеточниковых стентов, в большинстве практик невозможно прагматично обменять PCN до RIRS. В одном систематическом обзоре сделан вывод о том, что посев мочи на ПХЯ может помочь в выборе антибиотиков при выборе антибиотиков для лечения сепсиса в контексте обструкции верхних мочевых путей (43).В идеале эти культуры следует брать во время декомпрессии, и, как правило, культуры следует брать из дренажа, а не из мешка для сбора. Это относится и к катетерам Фолея. Следует отметить, что хотя посевы PCN могут помочь в выборе антибиотиков, они мало пригодны для лечения бесплодия, так как не было различий в исходах инфекционных осложнений у пациентов, которые ожидали стерилизации мочи от PCN перед операцией по удалению камня в верхних отделах тракта (43). Для пациентов с сепсисом и перенесших экстренную декомпрессию с использованием стента или PCN не существует четко установленных, основанных на фактических данных рекомендаций относительно того, сколько времени должно пройти до прохождения окончательной RIRS.Однако разумно и интуитивно разрешить завершить курс лечения антибиотиками сложной инфекции мочевыводящих путей, который составляет не менее 7 дней (44).

Факторы риска развития инфекционных осложнений после RIRS были тщательно изучены, и было выявлено несколько групп риска. Помимо положительного предоперационного посева мочи и наличия дренажей мочевыводящих путей, эти факторы риска включают женский пол, диабет, почечные аномалии, ишемическую болезнь сердца, пожилой возраст, рецидив ИМП в анамнезе, предыдущее неполное удаление камней, отведение мочи, параплегию и более высокий индекс коморбидности Чарльстона (11, 18, 19, 22, 34, 45, 46).Иммуносупрессия, недавняя химиотерапия или лечение стероидами, плохое питание и длительный курс госпитализации — это другие факторы, которые в целом повышают риск послеоперационных инфекционных осложнений (47). Некоторые из этих популяций требуют особого внимания при подготовке к RIRS.

Женский пол является общепризнанным фактором риска инфекционных осложнений после RIRS (19, 37, 48). Более короткая уретра подвергает женские мочевыводящие пути более высокому риску колонизации промежностными и ректальными бактериями, которые могут вызвать инфекцию (19, 39, 47).Клиницисты должны поддерживать более высокий индекс подозрения на инфекционные и инфицированные камни у пациентов женского пола. В отношении беременных пациенток клиницисты должны с осторожностью избегать применения потенциально тератогенных антибиотиков, таких как фторхинолоны и аминогликозиды (49). Хотя уретероскопия считается безопасной, беременные пациентки считаются группой высокого риска AUA (50, 51). В одном метаанализе сообщалось, что не было повышенных показателей осложнений после RIRS у беременных пациенток, а осложнения, как правило, были незначительными при их возникновении (50).Во втором ретроспективном обзоре также не было отмечено различий в частоте осложнений у беременных и небеременных пациенток (52). У беременных пациенток может быть отложена диагностика KSD в пользу других медицинских или акушерских причин (50). Стентирование после RIRS у беременных может быть проблематичным, поскольку более высокие концентрации кальция и уратов в моче увеличивают риск инкрустации стента (53). Стенты также более склонны к миграции у беременных (53). Если беременность считается высоким риском или есть особые акушерские проблемы, рассмотрите возможность консультации акушера-гинеколога перед операцией и / или мониторинга сердца плода с акушером-гинекологом во время операции.

Sun et al. сообщили, что сахарный диабет был одним из наиболее клинически значимых предоперационных факторов риска инфекционных осложнений после прохождения уретероскопии (19). Ли и др. также обнаружили, что сахарный диабет является независимым предиктором инфекции после RIRS (45). Пациенты с сахарным диабетом более восприимчивы к инфекции по нескольким причинам (19). Повышенное содержание глюкозы в моче может способствовать выживанию и размножению бактерий в мочеполовой системе, хотя данные, подтверждающие прямую связь, отсутствуют (54).Кроме того, нарушение иммунной функции, вторичное по отношению к неполному фагоцитозу, и снижение функции гранулоцитов у пациентов с диабетом могут сделать их более предрасположенными к инфекциям (54). Кроме того, пациенты с диабетом склонны к развитию диабетической цистопатии, которая может приводить к рецидивам ИМП, вторичным по отношению к неполному опорожнению мочевого пузыря (55). Пациенты с сахарным диабетом также имеют более высокую вероятность развития ИМП по сравнению с общей популяцией вне контекста послеоперационных осложнений (54).

Перед операцией известные пациенты с диабетом должны быть обследованы на предмет определения HbA1c, поскольку пациенты с более высоким уровнем HbA1c могут подвергаться более высокому риску осложнений и более длительному пребыванию в больнице (51). Если до операции уровень глюкозы в крови превышает 400 мг / дл, можно отложить плановый RIRS (51). Пациентов следует проконсультировать о том, как следует изменить режим приема лекарств от диабета в день операции (51). В целом, следует сохранять более высокую степень подозрения в отношении инфекционных осложнений в послеоперационном периоде у пациентов с диабетом.Если уровень глюкозы в крови остается неконтролируемым или у пациента сложный режим приема лекарств, рассмотрите возможность консультации эндокринолога.

Пациентам с искусственными суставами, установленными в течение 2 лет после процедуры, следует рассмотреть возможность проведения антибиотикопрофилактики процедур, которые могут вызвать бактериемию, таких как RIRS, однако AUA не считает их отдельно высоким риском инфекционных осложнений (14). Другие сопутствующие заболевания, такие как пожилой возраст, ишемическая болезнь сердца и более высокий индекс сопутствующей патологии Чарльстона, были связаны с более высоким риском послеоперационных инфекционных осложнений после РИОС (11, 18, 22, 34).Для пожилых пациентов следует рассмотреть возможность предоперационного осмотра гериатром, а для пациентов с патологическими сердечными заболеваниями — предоперационного осмотра кардиологом. Как правило, следует использовать мультидисциплинарный подход с консультацией специалиста для предоперационной оптимизации пациентов с множественными сопутствующими заболеваниями. Предоперационные рекомендации приведены в таблице 1.

Таблица 1 . Краткое изложение предоперационных соображений.

Внутриоперационные соображения

Текущие рекомендации AUA рекомендуют антибиотикопрофилактику в отношении грамотрицательных палочек и энтерококков видов у пациентов, которым выполняются эндоскопические процедуры верхних мочевыводящих путей (14). Согласно AUA, периоперационными противомикробными препаратами выбора для RIRS являются триметоприм-сульфаметоксазол (TMP-SMX) или цефалоспорин 1-го / 2-го поколения. Альтернативными схемами антибиотиков являются аминогликозид +/– ампициллин, азтреонам +/– ампициллин или амоксициллин / клавуланат (14).Руководства EAU схожи в рекомендациях TMP-SMX, аминопенициллина плюс ингибитор бета-лактамазы или цефалоспоринов 2-го / 3-го поколения (56). Следует избегать назначения TMP-SMX беременным, а азтреонам следует назначать пациентам с почечной недостаточностью и аллергией на пенициллин (14, 49). Парентеральную антибиотикопрофилактику следует проводить в течение 1 часа после процедуры или 2 часа, если используется ванкомицин (14). Вопреки этим рекомендациям Deng et al. не обнаружили различий в частоте послеоперационных лихорадочных ИМП с или без антибиотикопрофилактики у пациентов с отрицательными культурами мочи, перенесших уретероскопическую литотрипсию, в своем метаанализе 4591 пациента в 11 различных исследованиях (57).Однако риск развития послеоперационной пиурии и бактериурии был значительно ниже у пациентов, получавших однократную дозу антибиотиков перед процедурой, без разницы между пероральными или внутривенными препаратами (57). Подобно этому более позднему открытию, Knopf et al. Обнаружили, что однократная доза левофлоксацина снижает риск послеоперационной бактериурии с 12,5 до 1,8% (58).

Это противоречие не ново, и хотя рекомендации AUA поддерживают профилактику антибиотиками, Европейская ассоциация урологов не занимает жесткой позиции в отношении их использования для всех пациентов (57).Контроль над антибиотиками имеет решающее значение, поскольку мы уже начали наблюдать рост числа распространенных уропатогенов, таких как E.coli , с паттернами устойчивости к фторхинолонам и TMP-SMX (28). Это все больше доказательств в пользу ограничения использования эмпирических методов лечения антибиотиками как с целью ограничить распространение резистентности, так и с потенциально снижением частоты сепсиса (27). Зисман и др. в своем ретроспективном исследовании обнаружили, что значительная часть пациентов с положительным посевом мочи до RIRS содержала патогены, устойчивые к ципрофлоксацину (27).Они стремились адаптировать антибиотикопрофилактику с помощью двух агентов на основе местных паттернов резистентности в их больнице и обнаружили снижение риска септических событий по сравнению с типичной профилактикой (27). Кроме того, Schnabel et al. пришли к аналогичному выводу во время обзора литературы по профилактике мочекаменной болезни антибиотиками с умеренным преимуществом профилактики однократной дозой у пациентов, перенесших RIRS (59). Это предполагает назначение антибиотиков в периоперационном периоде в зависимости от местной чувствительности, если она известна.Наконец, в отношении грибковой профилактики в заявлении AUA говорится: «Однократная противогрибковая профилактика рекомендуется пациентам с бессимптомной фунгурией, которым проводится эндоскопическая, роботизированная или открытая операция на мочевыводящих путях». (14). В противном случае нет никаких рекомендаций, предлагающих пациентам с конкретными факторами риска получать периоперационную противогрибковую профилактику.

Поддержание низкого давления ирригации во время RIRS — ключ к снижению инфекционных осложнений. Повышение давления в собирающей системе может нарушить почечную фильтрацию и даже привести к ретроградному потоку из собирающей системы, известному как «пиеловенозный обратный ток», при котором происходит сообщение мочи и почечной венозной крови (60).Теоретически это могло бы обеспечить передачу бактериальных продуктов и медиаторов воспаления из мочевыводящих путей в системный кровоток (45). Это мнение подтверждается тем фактом, что высокое внутрипочечное давление во время RIRS, как было установлено, связано с послеоперационной лихорадкой (60). Кроме того, одно исследование ex-vivo моделированной уретероскопии обнаружило связь между высоким внутрипочечным давлением и гистологическими изменениями, а также экстравазацией жидкости на модели свиней (60).Нормальное внутритазовое давление составляет примерно 5 мм рт. Ст., А порог пиеловенозного рефлюкса составляет примерно 35 мм рт. Ст. (61). Во время операции давление может достигать 328 мм рт. Ст. Во время принудительной ирригации, что почти в 10 раз превышает порог рефлюкса (61).

Часто используемый метод для поддержания низкого внутритазового давления и снижения риска инфекционных осложнений — это использование интродьюсера для доступа к мочеточнику (UAS) (61). UAS — это инструмент, изначально задуманный как «направляющая трубка», используемая во время уретероскопии для повторного входа в мочеточник и почечную собирающую систему при поддержании более низкого давления при орошении (61).БПЛА способствует низкому давлению при орошении, потому что он создает канал из системы сбора за пределы тела. Этот канал обеспечивает отток ирригации и уравновешивание с атмосферным давлением. Примечательно, что эти эффекты наиболее выражены, когда используется интродьюсер большого диаметра и инструменты не закрывают просвет (61). Было показано, что БАС снижает внутритазовое давление до 75%, а интродьюсеры большого диаметра могут поддерживать давление ниже порога рефлюкса во время процедуры (61).При использовании UAS во время RIRS внутритазовое давление обратно пропорционально UAS и напрямую связано с размером уретероскопа (61).

UAS может также снизить риск заражения за счет минимизации времени операции. Kim et al. при многофакторном анализе выяснили, что время операции является независимым фактором риска развития фебрильной инфекции мочевыводящих путей после РИРБ (62). Это может быть связано с несколькими факторами, а именно с каменной массой, давлением ирригации и объемом ирригации (45, 62). Разумно, увеличенное время работы требует использования большего объема ирригации по сравнению с более короткими процедурами.Более высокое количество камней также потребует больше времени на операцию и обеспечит больше очагов инфекции (45, 62). Продолжительное попадание инородной жидкости в мочеполовую систему в сочетании с многократным обнажением внутреннего матрикса камня может открыть путь для инфекции (45). Если бы это было сделано под высоким давлением, вероятность того, что пациент столкнется с перемещением инфекционного материала в другие системы через пиеловенозный рефлюкс, также увеличится (45). Один метод, который, как было показано, сокращает рабочее время, — это использование вторичного БПЛА для сокращения времени на повторный вход в систему сбора (61).Однако использование БАС сопряжено с определенными рисками, поскольку их использование может вызвать независимое повреждение мочеточников, начиная от поверхностных повреждений слизистой оболочки и заканчивая периферическими перфорациями (61).

Другой метод поддержания низкого давления при орошении — это использование самотечного орошения. Ретроспективное исследование Farag et al. предположили, что использование стационарного орошения под давлением из мешка самотеком было связано с меньшим количеством инфекционных осложнений по сравнению с использованием ручного орошения шприцом во время RIRS (63).Самотечное орошение — это «естественное орошение, основанное на высоте от кончика уретероскопа до поверхности физиологического раствора» (64). При самотечном орошении расход физиологического раствора зависит от высоты, на которой подвешен ирригационный мешок, высоты стола в операционной и размера инструмента, который занимает рабочий канал (64). Меньший диаметр рабочего канала и меньшая высота, как правило, приводят к снижению расхода полива (64). Одна из проблем, связанных с использованием самотечного орошения, заключается в том, что невозможно поддерживать постоянный расход, поскольку давление снижается по мере опорожнения мешка и заполнения системы сбора.

Существуют различные испытанные методы, позволяющие обеспечить адекватную скорость потока при поддержании низкого давления в сборной системе. К ним относятся автоматические насосы, шприцы с ручным управлением и устройства с педальным управлением, которые стремятся обеспечить постоянную скорость потока при более низком давлении (64). Иноуэ и др. попытался изучить этот вопрос дальше и сравнил два новых автоматических ирригационных насоса с самотечным орошением с точки зрения скорости потока при аналогичном давлении (64). В исследовании ex vivo они обнаружили, что с использованием инструментов и без них скорость потока была значительно ниже по сравнению с одним из двух автоматических насосов (64).Hendlin et al. в своем исследовании ex-vivo обнаружили, что гравитационное орошение оказывает меньшее усилие, чем ручные и ножные насосные устройства (65). В конечном итоге, при выборе методики полива следует стремиться использовать минимальное давление, обеспечивающее адекватную визуализацию.

Интраоперационные каменные посевы — еще один инструмент, используемый при лечении инфекционных осложнений. Извлечение камня для культивирования во время RIRS в стерильных условиях может предоставить важную информацию для будущих инфекционных осложнений (7).Бактерии могут располагаться в матриксе камня и, следовательно, не могут быть взяты в предоперационном посеве мочи и не могут быть нацелены на антибиотикопрофилактику (6, 7). Имеются данные, свидетельствующие о том, что положительные посевы камней являются важными предикторами инфекционных осложнений (7). Если у пациента развиваются послеоперационные инфекционные осложнения, результаты посева камней могут помочь в выборе целевой антимикробной терапии. По этой причине мы рекомендуем посылать посевы камней во время операции, если есть подозрения, что камень может быть инфекционным или инфицированным.Следует знать, что между дооперационными культурами и каменными культурами часто существует несоответствие (66). Корец и др. цель — определить соответствие между предоперационными культурами из мочевого пузыря и интраоперационными культурами камней и лоханки почек, а также инфекционными осложнениями (66). Это проспективное исследование показало, что у пациентов с положительным предоперационным посевом из мочевого пузыря и положительным посевом из почечной лоханки конкордантность составила 64,3% (66). Каменные культуры соответствовали предоперационным культурам мочевого пузыря у 70 пациентов.6% пациентов с положительным результатом для обоих (66). У пациентов с положительным посевом камней и посевом из почечной лоханки конкордантность составила 75% (66).

Принудительный диурез — это еще один метод, который может снизить риск инфекционных осложнений после RIRS (7). Основная концепция заключается в том, что внутривенное введение мочегонного средства, такого как фуросемид, в операционной может помочь предотвратить пиеловенозный рефлюкс за счет увеличения выработки мочи и улучшения оттока во время процедуры, хотя доказательства, подтверждающие эту практику, относительно слабы (7).И последнее замечание по интраоперационному ведению: при выполнении RIRS важно поддерживать открытые линии связи с бригадой анестезиологов. Часто анестезиологи первыми видят физиологические признаки надвигающегося сепсиса, которые могут потребовать немедленного прекращения процедуры. Это относилось ко всем типам хирургии, а не только к RIRS, поскольку было показано, что командный подход улучшает результаты всех хирургических процедур (67). Если во время операции есть подозрение, что может развиваться инфекционное осложнение или что пациент находится в группе высокого риска, для максимальной декомпрессии мочевыводящих путей следует настоятельно рассмотреть возможность установки катетера Фолея и мочеточникового стента.В заключение отметим, что при выполнении RIRS при почечнокаменной болезни две распространенные стратегии разрушения камней — это пыль и дробление камней. В настоящее время не существует высококачественных проспективных рандомизированных исследований, сравнивающих пыление камнями и фрагментацию камней в отношении инфекционных осложнений (большинство таких сравнительных исследований оценивают процент отсутствия камней как первичный результат), и это представляет собой важное направление для будущих исследований. Интраоперационные рекомендации приведены в Таблице 2.

Таблица 2 .Краткое изложение интраоперационных соображений.

Послеоперационные вопросы

Даже при оптимальных предоперационных и интраоперационных стратегиях развитие инфекционных осложнений после RIRS у некоторых пациентов неизбежно, и раннее выявление и лечение имеют решающее значение для минимизации заболеваемости (7). Пациенты должны находиться под наблюдением в палате выздоровления, а пациентам с известными факторами риска инфекционных осложнений может потребоваться длительное пребывание в палате выздоровления с возможным госпитализацией для наблюдения за послеоперационным сепсисом (11).Сепсис определяется Третьим международным консенсусным определением сепсиса и септического шока (Sepsis-3) как «опасная для жизни дисфункция органа, возникающая в результате нерегулируемой реакции хозяина на инфекцию» (68). Уросепсис — это сепсис, исходящий из мочевыводящих путей (69). Клинические критерии диагностики сепсиса количественно оцениваются с помощью системы балльной оценки последовательной оценки органной недостаточности (SOFA) (70). Эта система присваивает оценку от 0 до 4 каждой из шести основных систем органов, включая дыхательную, коагуляционную, печеночную, сердечно-сосудистую, центральную нервную и почечную системы, причем более высокий балл указывает на худшую функцию (70).Сепсис выявляется у пациентов с резким изменением показателя SOFA на 2 или выше при наличии инфекции, как правило, в условиях интенсивной терапии (70). Вне отделений интенсивной терапии быстрый SOFA (qSOFA) используется для стратификации риска для пациентов с риском сепсиса (70). Этот инструмент состоит из трех критериев: изменение психического статуса (шкала комы Глазго), систолическое артериальное давление <100 мм рт.ст. и частота дыхания ≥22 вдохов в минуту (70). Пациенты относятся к группе высокого риска, если соблюдаются два или более критериев (70).В контексте каменной болезни воспалительная реакция может развиться из-за выброса эндотоксина, вторичного по отношению к фрагментации камня, или из-за выброса бактерий. Бактерии и их поверхностные молекулы действуют как патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), которые связывают рецепторы на поверхности врожденной иммунной системы (69, 71). Это стимулирует местную иммунную реакцию, а также индукцию транскрипции различных медиаторов воспаления (71). В мочеполовой системе и в других местах это может привести к начальному подавляющему каскаду воспаления, поскольку задействовано больше иммунных клеток, повреждаются местные ткани, а такие медиаторы, как закись азота, вызывают локальный отек (71).

При подозрении на надвигающийся уросепсис необходимо провести посев мочи и крови и незамедлительно начать прием антибиотиков. Лечение, направленное на культивирование, является идеальным вариантом, но не следует откладывать прием антибиотиков для получения результатов посева. Отсроченное лечение антибиотиками связано с повышенной смертностью у пациентов с тяжелым сепсисом, поэтому эмпирическую терапию антибиотиками широкого спектра действия следует начинать как можно скорее (66). Хотя большинство уропатогенов являются грамотрицательными, грамположительные бактерии становятся все более важным источником урологических инфекций (29).Эмпирические антибиотики должны охватывать как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии, и варианты включают различные комбинации следующего: ампициллин, гентамицин, пиперациллин / тазобактам, карбапенемы, цефепим и ванкомицин. Однако при выборе антибиотиков особое внимание следует уделять бактериям, продуцирующим бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС). Одно рандомизированное клиническое исследование, проведенное Harris et al. обнаружили более высокий 30-дневный уровень смертности у пациентов с бактериемией БЛРС, получавших пиперациллин-тазобактам, по сравнению с пациентами, получавшими меропенем (12.3 против 3,7%) (72). Варианты лечения БЛРС включают карбапенемы по отдельности или в комбинации с фосфомицином или тигециклином (69).

Другой важной этиологией послеоперационного сепсиса является грибковая инфекция. Критерии для начала лечения грибка расплывчаты и, как правило, заключаются в начале лечения тяжелобольных пациентов с известными факторами риска и отсутствием других причин лихорадки (73). В литературе предлагалось использовать произвольное ограничение риска инфицирования более 10% для начала противогрибковой терапии (73).Однако, как правило, с учетом заболеваемости и смертности, связанных с грибковым сепсисом, при раннем клиническом подозрении следует серьезно рассмотреть вопрос о начале противогрибковой терапии (73). Эхинокандины могут рассматриваться для эмпирической терапии из-за резистентных к азолам микроорганизмов у пациентов, недавно подвергшихся воздействию азола или подозреваемых на инфекцию Candida glabrata (73). Флуконазол можно назначать пациентам, не находящимся в критическом состоянии (73). В конечном итоге, когда у пациента возникает подозрение на послеоперационный уросепсис из-за RIRS, необходимо получить раннюю консультацию специалиста по инфекционным заболеваниям для определения оптимального эмпирического режима на основе местных паттернов резистентности.Переключение антибиотикотерапии с эмпирической чувствительности на терапию, основанную на чувствительности, должно быть выполнено, как только информация станет доступной (22). В дополнение к быстрому началу антимикробной терапии и консультации по инфекционному заболеванию, диагностика уросепсиса после RIRS должна побудить к раннему переходу на лечение в отделение интенсивной терапии (74). Пациенты должны получать надлежащую гемодинамическую и респираторную поддержку, если этого требует их клиническое состояние (69). По возможности следует устранить любые очаги инфекции (69).Кроме того, пациентам, у которых нет катетера Фолея, необходимо установить катетер для максимальной декомпрессии мочевыводящих путей.

Уросепсис, вторичный по отношению к KSD, сопряжен с высоким риском заболеваемости и смертности (12, 22, 69, 71), и, соответственно, регулярное использование послеоперационных антибиотиков для минимизации инфекционных осложнений было активной областью обсуждения. В текущих рекомендациях указано, что нет доказательств того, что можно продолжать антибактериальную терапию через 24 часа при отсутствии других факторов (14).Однако в некоторых центрах антибиотикотерапия продолжается от 3 до 5 дней после операции даже у пациентов с отрицательными результатами посева (74). Учитывая рост числа бактерий МЛУ, использование послеоперационных антибиотиков у пациентов без факторов риска или признаков послеоперационной инфекции должно быть ограничено. Послеоперационные рекомендации приведены в Таблице 3.

Таблица 3 . Краткое изложение послеоперационных соображений.

Заключение

KSD остается распространенным заболеванием, которое урологи эффективно лечат с помощью RIRS.Хотя побочные эффекты случаются редко, инфекционные осложнения могут привести к серьезным последствиям. Для клиницистов жизненно важно понимать, какие пациенты подвержены риску инфекционных осложнений, и шаги, которые можно предпринять для минимизации таких осложнений. Кроме того, понимание и распознавание предупреждающих признаков серьезной инфекции в послеоперационном периоде в сочетании со знанием текущих руководств и наиболее эффективных методов лечения имеет решающее значение для устранения этих осложнений, когда они возникают.

Авторские взносы

JK: концепция и дизайн, анализ и интерпретация данных, составление рукописи и авторский надзор.JH: сбор данных, анализ и интерпретация данных и составление рукописи. AS: концепция и дизайн, анализ и интерпретация данных, а также критический пересмотр рукописи на предмет важного интеллектуального содержания. WA и MG: концепция и дизайн, анализ и интерпретация данных, критический пересмотр рукописи на предмет важного интеллектуального содержания и контроль. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Конфликт интересов

MG получает компенсацию за обучение в Cook Urological Inc., Boston Scientific Inc., Olympus Inc., Lumenis Inc. и Retrophin Inc.

Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все утверждения, выраженные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают интересы их дочерних организаций или издателей, редакторов и рецензентов.Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не подлежат гарантии или одобрению со стороны издателя.

Список литературы

1. Весы CD, Smith AC, Hanley JM, Saigal CS. Распространенность камней в почках в США. Eur Urol. (2012) 62: 160–5. DOI: 10.1016 / j.eururo.2012.03.052

CrossRef Полный текст | Google Scholar

2. Tundo G, Vollstedt A, Meeks W. Pais V. CO. (2021) 03766: 1–6.DOI: 10.1097 / JU.0000000000001629

CrossRef Полный текст

3. Киттанамонгколчай В., Воган Л. Е., Эндерс Ф. Т., Дхондуп Т., Мехта Р. А., Крамбек А. Е. и др. Изменение частоты и формы мочевых камней за 3 десятилетия. Mayo Clin Proc . (2019) 93: 291–9. DOI: 10.1016 / j.mayocp.2017.11.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Пархоменко Э., Де Фацио А., Тран Т., Тай Дж., Блюм К., Гупта М. Многопрофильное исследование струвитных камней: закономерности инфицирования и колонизации. Дж Эндоурол . (2017) 31: 533–7. DOI: 10.1089 / конец.2016.0885

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Мариен Т., Миллер Н.Л. Лечение инфицированного камня. Urol Clin North Am. (2015) 42: 459–72. DOI: 10.1016 / j.ucl.2015.05.009

CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Воллин Д.А., Джойс А.Д., Гупта М., Вонг MYC, Лагуна П., Гравас С. и др. Использование антибиотиков, профилактика и лечение инфекционных осложнений при мочекаменной болезни. World J Urol. (2017) 35: 1369–79. DOI: 10.1007 / s00345-017-2005-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Родригес-Монсальве Эрреро М., Дойзи С., Келлер Э.С., Де Конинк В., Траксер О. Ретроградная внутрипочечная хирургия: возрастающая роль в лечении мочекаменной болезни. Asian J Urol. (2018) 5: 264–73. DOI: 10.1016 / j.ajur.2018.06.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Ассимос Д., Крамбек А., Миллер Н. Л., Монга М., Мурад М. Х., Нельсон С. П. и др.Хирургическое лечение камней: Рекомендации Американской урологической ассоциации / эндоурологического общества, ЧАСТЬ II. Дж Урол . (2016) 196: 1161–9. DOI: 10.1016 / j.juro.2016.05.091

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Де ла Розетт Дж., Денштедт Дж., Джеавлет П., Кили Ф., Мацуда Т., Перл М. и др. Офис клинических исследований эндоурологического общества: глобальное уретероскопическое исследование: Показания, осложнения и исходы у 11 885 пациентов. Дж Эндоурол .(2014) 28: 131–9. DOI: 10.1089 / конец.2013.0436

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Коул А., Теланг Дж., Ким Т.К., Сварна К., Ци Дж., Дау С. и др. Госпитализация в связи с инфекцией после уретероскопического лечения камня: результат совместной хирургической операции. BMC Urol. (2020) 20: 1–7. DOI: 10.1186 / s12894-020-00720-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Арефиан Х., Хойблин С., Шераг А., Бранкхорст Ф.М., Юнис М.З., Мерер О. и др.Стоимость сепсиса, связанная с больницей: систематический обзор. J Заражение. (2017) 74: 107–17. DOI: 10.1016 / j.jinf.2016.11.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Сайгал С.С., Джойс Г., Тимилсина А.Р. Прямые и косвенные издержки нефролитиаза у занятого населения: возможности лечения? Kidney Int. (2005) 68: 1808–14. DOI: 10.1111 / j.1523-1755.2005.00599.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

14.Lightner DJ, Wymer K, Sanchez J, Kavoussi L. Урологические процедуры и антимикробная профилактика (2019). Ам Урол Асс . (2019): 1-29.

16. HOLLOWAY J, JOSHI N, O’BRYAN T. Положительный тест на нитриты мочи: точный предиктор отсутствия чистой энтерококковой бактериурии. South Med J (Бирмингем, Алабама). (2000) 93: 681–2. DOI: 10.1097 / 00007611-200007000-00008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Мотамединия П., Корец Р., Бадалато Г., Гупта М.Периоперационные посевы и роль антибиотиков при хирургии камней. Перевод Андрол Урол. (2014) 3: 297–301. DOI: 10.3978 / j.issn.2223-4683.2014.07.01

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Bhojani N, Miller LE, Bhattacharyya S, Cutone B, Chew BH. Факторы риска уросепсиса после уретероскопии по поводу каменной болезни: систематический обзор с метаанализом. Дж Эндоурол . (2021) 1–10. DOI: 10.1089 / конец.2020.1133

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19.Sun J. Le, Xu JN, Ouyang J. Факторы риска инфекционных осложнений после уретероскопии: систематический обзор и метаанализ. Urol Int. (2020) 104: 113–24. DOI: 10.1159 / 000504326

CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Бай Т., Ю X, Цинь Ц., Сюй Т., Шэнь Х., Ван Л. и др. Выявление факторов, связанных с послеоперационным уросепсисом после уретероскопии с помощью лазерной литотрипсии с гольмием: иттрием-алюминием-гранатом. Urol Int. (2019) 103: 311–7.DOI: 10.1159 / 000502159

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Blackmur JP, Maitra NU, Marri RR, Housami F, Malki M, McIlhenny C. Анализ связи факторов с риском послеоперационного уросепсиса у пациентов, подвергающихся уретероскопии для лечения каменной болезни. J Endourol. (2016) 30: 963–9. DOI: 10.1089 / конец.2016.0300

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Нево А., Мано Р., Шретер Э., Лифшиц Д.А.Клинические последствия культивирования стентов у пациентов с постоянными мочеточниковыми стентами до уретероскопии. J Urol. (2017) 198: 116–21. DOI: 10.1016 / j.juro.2017.01.064

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Гош А., Оливер Р., Путь С, Уайт Л., Сомани Б.К. Результаты дневной уретерореноскопии (DC-URS) по поводу каменной болезни: предполагаемые результаты через 4,5 года. World J Urol. (2017) 35: 1757–64. DOI: 10.1007 / s00345-017-2061-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25.Lightner DJ, Wymer K, Sanchez J, Kavoussi L. Заявление о передовой практике урологических процедур и антимикробной профилактики. J Urol. (2020) 203: 351–6. DOI: 10.1097 / JU.0000000000000509

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Lo J, Lange D, Chew BH. Мочеточниковые стенты и инфекции мочевыводящих путей, связанные с катетерами Фолея: роль покрытий и материалов в профилактике инфекций. Антибиотики. (2014) 3: 87–97. DOI: 10.3390 / antibiotics3010087

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27.Зисман А., Бадаан С., Кастин А., Кравцов А., Амиэль Г. Е., Мюллерад М. Настройка антибиотикопрофилактики для уретероскопических процедур на основе профилей местной резистентности может привести к снижению частоты инфекций и уросепсиса. Urol Int. (2020) 104: 106–12. DOI: 10.1159 / 000503905

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Сеночак С., Озджан С., Сахин Т., Йилмаз Г., Озювали Е., Сарикая С. и др. Факторы риска инфекционных осложнений после гибкой уретерореноскопии с лазерной литотрипсией. Урол Дж. (2018) 15: 19–24. DOI: 10.22037 / uj.v0i0.3967

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Дасгупта Р., Салливан Р., Френч Дж., О’Брайен Т. Доказательное назначение антибиотиков в урологии: 5-летний обзор микробиологии. BJU Int. (2009) 104: 760–4. DOI: 10.1111 / j.1464-410X.2009.08779.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Патель Н., Ши В., Лисс М., Рахим О., Венцлер Д., Шаллхорн С. и др.Бактериурия с множественной лекарственной устойчивостью перед чрескожной нефролитотомией позволяет прогнозировать послеоперационные инфекционные осложнения. J Endourol. (2015) 29: 531–6. DOI: 10.1089 / конец.2014.0776

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Pricop C, Dorobăt C, Puia D, Orsolya M. Антибиотикопрофилактика при ретроградной уретероскопии: какую стратегию мы должны принять? Микробы (Bucureşti). (2013) 3: 115–21. DOI: 10.11599 / germs.2013.1045

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33.Гросс М., Винклер Х., Питлик С., Вайнбергер М. Неожиданная кандидемия, осложняющая уретероскопию и стентирование мочи. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. (1998) 17: 583–6. DOI: 10.1007 / BF01708625

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Мицузука К., Накано О., Такахаши Н., Сато М. Идентификация факторов, связанных с послеоперационной фебрильной инфекцией мочевыводящих путей после уретероскопии мочевых камней. Мочекаменная болезнь. (2016) 44: 257–62.DOI: 10.1007 / s00240-015-0816-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Сон Д.В., Ким С.В., Хонг К.Г., Юн Би Иль, Ха Ю-С, Чо И-Х. Факторы риска инфекционного осложнения после уретероскопических процедур верхних мочевыводящих путей. J Infect Chemother. (2013) 19: 1102–8. DOI: 10.1007 / s10156-013-0632-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Chugh S, Pietropaolo A, Montanari E, Sarica K, Somani BK.Предикторы мочевых инфекций и уросепсиса после уретероскопии по поводу каменной болезни: систематический обзор из раздела EAU по мочекаменной болезни (EULIS). Curr Urol Rep . (2020) 2:16. DOI: 10.1007 / s11934-020-0969-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Chenoweth CE, Gould C.V, Saint S. Диагностика, лечение и профилактика катетер-ассоциированных инфекций мочевыводящих путей. Infect Dis Clin North Am. (2014) 28: 105–19. DOI: 10.1016 / j.idc.2013.09.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Doersch KM, Thai KH, Machen GL, Bird ET, Reilly TP, El Tayeb MM, et al. Сравнение клинических результатов стентирования мочеточника в операционной и в офисе с использованием нового седативного средства закисью азота. Урология. (2019) 132: 37–42. DOI: 10.1016 / j.urology.2019.07.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Сюй Л., Ли Х, Пучерил Д., Хансен М., Литтлтон Р., Пибоди Дж. И др.Использование чрескожной нефростомии и стентирования мочеточника при лечении обструкции мочеточника. Мир J Nephrol. (2016) 5: 172. DOI: 10.5527 / wjn.v5.i2.172

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. van Nieuwkoop C., van der Starre WE, Stalenhoef JE, van Aartrijk AM, van der Reijden TJK, Vollaard AM, et al. Продолжительность лечения фебрильной инфекции мочевыводящих путей: прагматичное рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование не меньшей эффективности у мужчин и женщин. BMC Med. (2017) 15:70. DOI: 10.1186 / s12916-017-0835-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Ли Т., Сунь XZ, Лай Д.Х. Ли X, Хэ YZ. Лихорадка и синдром системной воспалительной реакции после ретроградной внутрипочечной операции: факторы риска и прогностическая модель. Kaohsiung J Med Sci. (2018) 34: 400–8. DOI: 10.1016 / j.kjms.2018.01.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Озгор Ф, Сахан М., Кубук А., Ортач М., Айранчи А., Сарилар О.Факторы, влияющие на инфекционные осложнения после гибкой уретерореноскопии. Мочекаменная болезнь. (2019) 47: 481–6. DOI: 10.1007 / s00240-018-1098-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Grabe M, Botto H, Cek M, Tenke P, Wagenlehner FME, Naber KG, et al. Предоперационная оценка пациента и факторов риска инфекционных осложнений и предварительная классификация загрязнения операционного поля урологических процедур. World J Urol. (2012) 30: 39–50. DOI: 10.1007 / s00345-011-0722-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Бабуджан М., Гондран-Теллье Б., Абдалла Р., Сичез П.С., Акики А., Гайлет С. и др. Прогнозируемые факторы риска инфекции мочевыводящих путей после гибкой уретероскопии, несмотря на предоперационные меры предосторожности во избежание инфекционных осложнений. World J Urol. (2020) 38: 1253–9. DOI: 10.1007 / s00345-019-02891-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49.Bookstaver PB, Bland CM, Griffin B, Stover KR, Eiland LS, McLaughlin M. Обзор использования антибиотиков во время беременности. Pharmacother J Hum Pharmacol Drug Ther. (2015) 35: 1052–62. DOI: 10.1002 / phar.1649

CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Бозкурт Ю., Сойлемез Х., Атар М., Санджактутар А.А., Пенбегул Н., Хатипоглу Н.К. и др. Эффективность и безопасность уретероскопии у беременных: сравнительное исследование. Мочекаменная болезнь . (2013) 41: 37–42. DOI: 10.1007 / s00240-012-0523-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53.Laing KA, Lam TBL, Mcclinton S, Cohen NP, Traxer O, Somani BK. Результаты уретероскопии при мочекаменной болезни у беременных: результаты систематического обзора литературы. Urol Int. (2012) 89: 380–6. DOI: 10.1159 / 000343732

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Чен С.Л., Джексон С.Л., Бойко Э.Дж. Сахарный диабет и инфекция мочевыводящих путей: эпидемиология, патогенез и предлагаемые исследования на животных моделях. Дж Урол . (2009) 182: S51–6.DOI: 10.1016 / j.juro.2009.07.090

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Nitzan O, Elias M, Chazan B, Saliba W. Инфекции мочевыводящих путей у пациентов с сахарным диабетом 2 типа: обзор распространенности, диагностики и лечения. Диабет, метаболический синдром, ожирение, цели Ther. (2015) 8: 129–36. DOI: 10.2147 / DMSO.S51792

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56. Бонкат Г., Бартолетти Р., Брюьер Ф., Кай Т., Герлингс С.Е., Кёвес Б. и др.Руководство по урологическим инфекциям. In: , представленный на Ежегодном конгрессе EAU в Милане, Италия, 2021 г., . Арнем: Офис рекомендаций ЕАУ (2021 г.).

Google Scholar

57. Дэн Т., Лю Б., Дуань Х, Цай С., Чжао З., Чжу В. и др. Антибиотикопрофилактика при уретероскопической литотрипсии: систематический обзор и метаанализ сравнительных исследований. BJU Int. (2018) 122: 29–39. DOI: 10.1111 / bju.14101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

61.Де Конинк В., Келлер Э.С., Родригес-Монсальве М., Аудуин М., Дойзи С., Траксер О. Систематический обзор оболочек доступа к мочеточнику: факты и мифы. BJU Int. (2018) 122: 959–69. DOI: 10.1111 / bju.14389

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62. Kim JW, Lee YJ, Chung JW, Ha YS, Lee JN, Yoo ES, et al. Клиническая характеристика послеоперационных фебрильных инфекций мочевыводящих путей после уретероскопической литотрипсии. Исследование Clin Urol. (2018) 59: 335–41.DOI: 10.4111 / icu.2018.59.5.335

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Фараг М., Тимм Б., Дэвис Н., Вонг Л.М., Болтон Д.М., Джек Г.С. Орошение мешком под давлением и ручные ирригационные насосы во время уретероскопической лазерной литотрипсии: сравнение инфекционных осложнений. J Endourol. (2020) 34: 914–8. DOI: 10.1089 / конец.2020.0148

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Иноуэ Т., Ямамичи Ф., Окада С., Хамамото С., Фудзисава М.Изменение ирригационного потока через гибкий уретероскоп с различными устройствами в рабочем канале: сравнение между автоматическим ирригационным насосом и самотечным орошением. Int J Urol. (2020) 27: 333–8. DOI: 10.1111 / iju.14197

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Корец Р., Граверсен Дж.А., Кейтс М., Муес А.С., Гупта М. Системный воспалительный ответ после чрескожной нефролитотомии: проспективный анализ предоперационной мочи, почечно-лоханочной мочи и посевов камней. Дж Урол . (2011) 186: 1899–903. DOI: 10.1016 / j.juro.2011.06.064

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68. Сеймур К.В., Лю В.Х., Ивашина Т.Дж., Бранкхорст Ф.М., Ри Т.Д., Шераг А. и др. Оценка клинических критериев сепсиса для третьего международного консенсуса определений сепсиса и септического шока (сепсис-3). JAMA — J Am Med Assoc. (2016) 315: 762–74. DOI: 10.1001 / jama.2016.0288

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

69.Дрегер Н.М., Дегенер С., Ахмад-Нежад П., Вёбкер Г., Рот С. Уросепсис — Урсаке, диагностика и терапия. Dtsch Arztebl Int. (2015) 112: 837–47. DOI: 10.3238 / arztebl.2015.0837

CrossRef Полный текст | Google Scholar

70. Cecconi M, Evans L, Levy M, Rhodes A. Сепсис и септический шок. Lancet (Британское издание (2018) 392: 75–87. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (18) 30696-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

71. Wagenlehner FM, Lichtenstern C, Rolfes C, Mayer K, Uhle F, Weidner W, et al.Диагностика и лечение уросепсиса. Int J Urol. (2013) 20: 963–70. DOI: 10.1111 / iju.12200

CrossRef Полный текст | Google Scholar

72. Harris PNA, Tambyah PA, Lye DC, Mo Y, Lee TH, Yilmaz M, et al. Влияние пиперациллин-тазобактама по сравнению с меропенемом на 30-дневную смертность пациентов с инфекцией кровотока, вызванной кишечной палочкой или Klebsiella pneumoniae, и устойчивостью к цефтриаксону. JAMA — J Am Med Assoc. (2018) 320: 984–94. DOI: 10.1001 / jama.2018.12163

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

74.Саблер И.М., Катафигиотис И., Дувдевани М. Послеоперационный уход за пациентом после уретероскопии. В: Ф. Шварц Б., Д. Денштедт Дж., Редакторы. Уретероскопия: полное современное руководство [Интернет]. Cham: Springer International Publishing (2020). п. 141–50. DOI: 10.1007 / 978-3-030-26649-3_11

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аминоацилирование тРНКИ и роль воды в качестве редактора

Abstract

Вычитка / редактирование в синтезе белка имеет важное значение для точного перевода информации из генетического кода.В этой статье мы представляем теоретическое исследование эффективности кинетического механизма проверки, который использует гидролиз неправильного субстрата в качестве дискриминационного шага в ферментативных каталитических реакциях. Мы рассматриваем аминоацилирование тРНК ^Ile , которое является важным этапом в синтезе белка и для которого теперь доступны экспериментальные результаты. Мы представляем расширенную кинетическую схему, а затем применяем методы алгоритма стохастического моделирования для получения зависящих от времени концентраций различных веществ, участвующих в реакции, и скорости их образования.Мы получаем скорости образования продукта и гидролиза АТФ как для правильных, так и для неправильных субстратов (изолейцина и валина в нашем случае, соответственно), в одномолекулярном ферменте, а также в кинетике ансамбля ферментов. Настоящая теоретическая схема правильно воспроизводит (i) амплитуду фактора дискриминации в общих скоростях между изолейцином и валином, которая получается как (1,8 × 10 ² ). (4,33 × 10 ² ) = 7,8 × 10 ⁴ , (ii) скорости гидролиза АТФ как для Ile, так и для Val при различных концентрациях субстрата при аминоацилировании тРНК ^Ile .Настоящее исследование показывает зависимость скорости реакции немихайлового типа от концентрации тРНК ^Ile в случае валина. Обнаружено, что общее редактирование в устойчивом состоянии не зависит от концентрации аминокислот. Интересно, что вычисленная скорость гидролиза АТФ для валина при высокой концентрации субстрата такая же, как и скорость образования Ile-тРНК ^Ile , тогда как при промежуточной концентрации субстрата скорость гидролиза АТФ относительно низкая. Мы обнаружили, что присутствие дополнительного редактирующего домена в редактирующем ферменте класса I делает кинетическую корректуру более эффективной за счет усиленного гидролиза неправильного продукта в редактирующем CP1-домене.

Образец цитирования: Santra M, Bagchi B (2013) Кинетическая корректура на одномолекулярном уровне: аминоацилирование тРНК ^Ile и роль воды как редактора. PLoS ONE 8 (6): e66112. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066112

Редактор: Анил Кумар Тьяги, Университет Дели, Индия

Поступила: 16 марта 2013 г .; Принята к печати: 2 мая 2013 г .; Опубликовано: 20 июня 2013 г.

Авторские права: © 2013 Santra, Bagchi.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Работа частично поддержана грантами DST и CSIR (Индия). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Кинетическая корректура — это теория, предложенная для объяснения известного отсутствия ошибок в биологическом синтезе. В биохимических реакциях ферменты не только увеличивают скорость реакции, но и выборочно выбирают правильный субстрат, ведущий к желаемому продукту. Многие биологические процессы, такие как синтез белка или репликация ДНК, проявляют высокую специфичность в отношении выбора правильных субстратов в присутствии многих других структурно или химически аналогичных субстратов [1].Ожидается, что из-за сходной энергии связывания как правильных, так и неправильных субстратов и аналога размера / формы фермента частота ошибок (отношение скорости образования неправильного продукта к скорости образования желаемого продукта) будет высокой. Напротив, частота ошибок крайне низка при выборе аминокислоты при синтезе белка (10 ⁻⁴ ) [2] и репликации ДНК (10 ⁻⁹ ) [3] — [5]. Молекулярная причина такой высокой селективности до сих пор не совсем понятна с точки зрения количественной теории.Эта важная проблема оставалась предметом дискуссий в течение нескольких десятилетий, при этом первоначальная формулировка повторной активации Хопфилда была признана неадекватной в нескольких биосинтезах [6]. Недавние экспериментальные исследования нескольких ферментативных каталитических реакций показывают, что разложение промежуточных продуктов происходит посредством реакции гидролиза [7], [8]. Было предложено несколько альтернативных механизмов редактирования, которые были признаны удовлетворительными в разных случаях, подчеркивая тот факт, что может работать более одного механизма [9].Один из этих механизмов, впервые предложенный Ферштом, использует гидролиз неправильного субстрата в качестве основного дискриминационного шага.

В предыдущем исследовании мы исследовали каталитический процесс аминоацилирования тРНК. Мы показали, что для синтетаз класса I стационарные и одиночные молекулярные события дают несколько разную кинетику [10]. Мы представили расширенную кинетическую схему, которая включала роль воды и использовала универсальную технику распределения времени первого прохождения для получения зависящей от времени скорости.Теория объясняет несоответствие между однократным оборотом и скоростью устойчивого состояния для ферментов как класса I, так и класса II [10].

В данной работе мы изучаем кинетическую корректуру фермента класса I. Мы изучили относительные достоинства двух схем, предложенных Хопфилдом и Ферштом, и выяснили скорость. Для количественной оценки кинетической корректуры мы исследовали с имеющимися данными степень правильного и неправильного формирования продукта.

В своем новаторском исследовании Фершт предположил, что наиболее важным отличительным этапом кинетической корректуры может быть гидролиз высокоэнергетического комплекса фермент-субстрат.Таким образом, решающую роль играет простая химическая реакция с водой. Однако подробный количественный анализ схемы Фершта, насколько нам известно, не проводился.

Здесь мы представляем такой анализ. Мы предлагаем схему, подобную Michealis-Menten, в которую мы включаем гидролиз в качестве побочной реакции, чтобы показать, что гидролиз может помочь ферменту различать два аналогичных субстрата, несмотря на схожую энергию связывания.

Элементарные стадии ферментативного катализа включают образование комплекса Михаэлиса-Ментен с последующим образованием продукта.В последние годы несколько экспериментальных исследований ферментативного катализа на одномолекулярном уровне выявили много интересных особенностей в краткосрочной динамике [11]. Он успешно воспроизводит ту же скорость стационарного состояния, которую дает кинетика Михаэлиса-Ментен. При катализе одиночными молекулярными ферментами в системе присутствует только один фермент, и устойчивый поток субстрата поддерживается, поскольку концентрация субстрата относительно высока по сравнению с концентрацией фермента. В экспериментальной установке in vitro концентрация фермента остается постоянной за счет рециркуляции свободных ферментов после высвобождения продукта, тогда как концентрация субстрата со временем уменьшается.Ситуация in vivo может быть иной, если концентрация фермента может быть аналогична концентрации субстрата. В настоящей работе мы рассматриваем как реакции одиночного молекулярного фермента, так и реакции ансамблевого ферментативного катализа.

В этой статье мы в основном концентрируемся на аминоацилировании тРНК ^Ile с использованием изолейцина в качестве правильного и валина в качестве неправильного субстрата в присутствии изолейцил-тРНК синтетазы (IleRS) в процессе синтеза белка. Эта система была тщательно изучена в нескольких экспериментах [9], [12], и есть много интересных открытий (в основном кинетических результатов), которые еще предстоит решить.Например, относительная скорость аминоацилирования валина и изолейцина сильно зависит от температуры. Проверка на ∼10 ⁴ не очевидна из-за разницы в скорости гидролиза только продуктов.

С другой стороны, хотя в литературе существует ограниченное количество теоретических исследований, они по большей части не могут объяснить существующие экспериментальные результаты без какого-либо противоречия. В последние годы в связи с развитием передовых методов молекулярной спектроскопии были предприняты огромные попытки проанализировать структуры различных промежуточных продуктов, образующихся в ходе реакции и фермента [13], [14].Хотя структура различных промежуточных продуктов, образующихся в ходе реакции, может раскрыть механизм, она не может дать нам количественную оценку дискриминации. Более того, часто бывает чрезвычайно сложно получить все промежуточные продукты, поскольку многие из них временные. Кинетические экспериментальные исследования имеют преимущество количественной оценки скорости отдельного шага, а также общей реакции. Следовательно, механизм реакции можно понять, построив схему реакции на основе кинетических экспериментальных данных, которая может объяснить все доступные кинетические результаты.Лучший способ понять реакцию как количественно, так и качественно — это предложить схему, основанную как на кинетических, так и на спектральных результатах, и подтвердить экспериментальные наблюдения с результатами, полученными из схемы.

Структурный анализ аминоацил-тРНК синтетаз показывает, что существует активный сайт, который активирует аминокислоту в присутствии АТФ, а затем активированная аминокислота переносится на тРНК. Уникальность изолейцил-тРНК синтетазы (IleRS) заключается в том, что кроме этого активного сайта у нее есть отдельный сайт редактирования, расположенный на ∼30 Å отдельно от сайта активации в домене, известном как домен CP1 ( рис.1 ) [13], [15] — [17]. Роль сайта редактирования заключается в гидролизе неправильного комплекса фермент-продукт, что снижает частоту ошибок. Наличие этого сайта редактирования заставляет IleRS различать валин более эффективно, чем это наблюдается у нередактирующих ферментов аминоацилирования тРНК [18].

Контроль скорости гидролиза АТФ важен, поскольку он напрямую связан со скоростью гидролиза промежуточных продуктов, образующихся во время реакции. Более высокая скорость гидролиза АТФ указывает на более высокую скорость гидролиза промежуточных соединений, которая служит побочной реакцией, приводящей к образованию меньшего количества продукта.Если гидролиз промежуточных продуктов не происходит, то количество гидролизованных молекул АТФ на молекулу образовавшегося продукта будет идентично 1. Величина отношения, наблюдаемая в случае изолейцина, составляет ~ 1,5, тогда как в случае валина ~ 270 [12]. Таким образом, гидролиз АТФ служит маркером точности предложенной кинетической схемы.

Сравнение апо Thermus thermophilus LeuRS с сокристаллической структурой комплекса аминоацилирования Pyrococcus horikoshii LeuRS с тРНК-Leu показывает, что домен CP1 поворачивается на ~ 20 ° относительно канонического ядра фермента, чтобы предотвратить конфликт со связанным 5 ‘Конец тРНК [15].После аминоацилирования 3’-конец тРНК перемещается на ~ 30 Å от синтетического активного сайта к сайту редактирования аминокислоты для проверки; требует, чтобы область редактирования повернулась на ~ 35 ° по сравнению с апо-состоянием T. thermophilus LeuRS.

Накопление многочисленных кристаллических структур LeuRS ясно показывает, что фермент претерпевает значительные конформационные изменения, чтобы приспособиться к комплексам аминоацилирования и редактирования. Это также сопровождается изменениями в тРНК, особенно на заряженном 3′-конце, и ее взаимодействиями с AARS.

Сокристалл S. aureus IleRS с тРНК ^Ile показал, что сайт редактирования внутри CP1 может быть доступен с 3′-конца связанной тРНК ^Ile . Было предложено конформационное изменение связанной тРНК для перемещения 3′-конца от активного сайта к сайту редактирования.

Элегантный анализ кинетической корректуры, объясняющий повышенную специфичность цикла фосфорилирования-дефосфорилирования (PdPC), был недавно проведен Qian [19]. PdPC демонстрирует сверхчувствительность нулевого порядка и, как известно, демонстрирует усиление чувствительности.PdPC также может распознавать неспецифические перекрестные помехи при передаче сигнала. Фактически, многие кинетические механизмы корректуры зависят от механизма обратной связи, который приводит к переключению, описывающему усиление чувствительности.

Предлагаемые кинетические схемы и их описание

В альтернативной схеме Фершта [9] повторная активация не требуется. Здесь критическим шагом является увеличение скорости гидролиза неправильного субстрата. Фершт описал два механизма, как показано на рис.2 и Рис.3 .

Рис. 2. Схематическое изображение одного из двух кинетических механизмов корректуры (механизм I), предложенных Ферштом.

Здесь образование Val-тРНК ^Ile является лимитирующей стадией (k = 1,2 с ^-1 ), за которой следует быстрый гидролиз комплекса.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066112.g002

Рисунок 3. Альтернативный механизм кинетической корректуры (механизм II), предложенный Ферштом.

В этом механизме изменение конформации фермента является самым медленным шагом. Общая кинетика включает гидролиз в два этапа.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066112.g003

Согласно механизму I ( рис. 2 ), в случае валина фермент переходит в сильно гидролизуемое состояние во время образования IleRS ^*. .Val-AMP.tRNA ^{Комплекс Иль} . После этапа определения скорости , то есть ., переноса валина на тРНК ^Ile комплекс быстро гидролизуется, приводя к свободному ферменту и исходным субстратам.Таким образом, гидролиз предлагается увеличить дискриминацию с 10 до ∼180. В альтернативном механизме, показанном на фиг.3 (механизм II), Фершт предположил, что существует возможность фермента претерпевать конформационные изменения и переходить в высокогидролизуемую конформацию еще до переноса валина на тРНК ^Ile (образуя IleRS ^{). *} .Val-AMP.tRNA ^Ile ), и это шаг ограничения скорости. После конформационной флуктуации комплекс Val-AMP.tRNA ^Ile быстро гидролизуется.Существует еще одна стадия гидролиза, связанная с продуктом (Val-тРНК ^Ile ), если он образован по ошибке. На основании экспериментальных результатов Фершт пришел к выводу, что оба этих механизма равновероятны.

Однако есть некоторые трудности с обоими механизмами. В обоих случаях предполагается, что фермент претерпевает изменение конформации до высокогидролизуемого состояния. Структурный анализ IleRS показывает, что он имеет сайт редактирования, расположенный в домене CP1, который находится на расстоянии ∼30 Å от активного сайта (см. рис.1 ), а валин перемещается в этот сайт после переноса на тРНК ^Ile и легко гидролизуется [13], [20] — [26]. Это говорит о том, что фермент не должен подвергаться каким-либо конформационным колебаниям. Скорее, внутри фермента есть сайт связывания, и субстрат переходит на этот сайт и гидролизуется. Поскольку эта транслокация происходит после образования связи Val-тРНК ^Ile , стадия гидролиза участвует после образования Val-тРНК ^Ile , как в механизме I.Это противоречит механизму II.

Теперь, согласно механизму I, при образовании комплекса Val-AMP.IleRS ^* .tRNA ^Ile фермент переходит в гидролизуемое состояние и гидролизуется после образования связи Val-tRNA ^Ile . Этап определения скорости считается этапом перед гидролизом , то есть ., этапом, который включает образование связи между аминокислотой и тРНК. Однако несколько экспериментальных данных подтверждают, что этап выпуска продукта является этапом ограничения скорости.

Таким образом, ни один из вышеперечисленных механизмов не обеспечивает должного гидролиза. Здесь мы конструируем механизм, основанный как на кинетических экспериментах, так и на структурных доказательствах, и проводим количественное исследование, чтобы понять вклад усиленного гидролиза в общую дискриминацию и гидролиз АТФ. Отметим, что такой количественный анализ не проводился даже для механизмов Фершта.

На основе экспериментальных результатов Фершта и Хопфилда мы построили новую теоретическую модель, которая имеет следующие особенности.

1. Гидролиз происходит только после образования продукта, связанного с ферментом, но до высвобождения продукта.
2. Этап образования фермент-субстратного комплекса (ES) включает небольшую дискриминацию (~ 1/10) [27], как в схеме Хоупфилда. Однако реакция этого комплекса с АТФ включает дальнейшее несоответствие, приводящее к общему различению 1/160 до образования комплекса фермент-субстрат-АМФ.
3. В случае неправильного переноса субстрата (валина) на тРНК ^Ile , аминокислота переходит в домен CP1 (гидролитически активная область) фермента.В результате он подвергается быстрой диссоциации за счет усиленного гидролиза.
4. Чрезвычайно низкая концентрация комплекса фермент-продукт в устойчивом состоянии, обнаруженная Ферштом в случае валина, предполагает, что он подвергается усиленному гидролизу.

После учета всех вышеперечисленных наблюдений, мы разработали новую схему, которая показана на Рис. 4 (для изолейцина).

Предлагаемая модифицированная схема реакции валина немного отличается и изображена на рис.5 .

На рис. 4 и Рис. 5 , IleRS обозначается как E , это аминокислота, это АТФ, это АМФ, это тРНК ^Ile , это продукт (или или), указывает, что продукт находится в домене CP1. Мы использовали две немного разные схемы для Ile и Val. Введение дополнительных стадий гидролиза в случае Val связано с экспериментальными доказательствами гидролиза Val на соответствующих стадиях. Обратите внимание, что основное различие между этими двумя схемами заключается в наличии транслокации Val-тРНК ^Ile в редактирующий домен CP1, приводящей к образованию высокогидролизуемого комплекса E ^* P в случае Val.

Теперь мы определяем зависящую от времени скорость катализа и концентрации гидролиза АТФ для обоих субстратов. Вышеупомянутые кинетические схемы могут быть представлены системой простых химических кинетических уравнений. Решение этих уравнений обеспечивает зависящую от времени концентрацию субстратов, различных промежуточных соединений и продуктов, из которых можно легко определить скорость катализа и гидролиза АТФ. Поскольку представленные схемы сложны, получить аналитическое решение слишком сложно.Хотя можно найти решение для заданного набора кинетических параметров с помощью метода численного интегрирования, решение, полученное этим методом, является детерминированным по своей природе. С другой стороны, реакции in vivo не являются детерминированными из-за небольшого размера биологической клетки. Существует альтернативный метод получения недетерминированного решения, следующий за методом распределения времени первого прохождения. Этот метод следует вероятностному подходу, который находит распределение времени первого прохождения образования продукта, из которого легко может быть получена скорость установившегося состояния.Два основных ограничения этого подхода заключаются в следующем. Для сложных реакций, включающих различные элементарные стадии, такие как настоящие кинетические схемы, это не удается. Другой и наиболее важный недостаток заключается в том, что он не обеспечивает зависимость концентраций субстратов, промежуточных соединений и продуктов от времени, поскольку он имеет дело с вероятностью времени первого прохождения, а не с вероятностями веществ.

Методы

Мы провели стохастический симуляционный анализ, предложенный Гиллеспи, и получили зависящие от времени концентрации всех субстратов, промежуточных соединений и продуктов [28].Это недетерминированный метод, который позволяет определять концентрации различных веществ с течением времени. В то время как для небольшой системы он показывает случайную концентрацию во времени, для большой системы получается детерминированная зависящая от времени концентрация. Более того, с помощью этого метода были изучены как одиночный молекулярный, так и ансамблевой ферментный катализ.

Обсуждение и результаты

Приведенные выше кинетические схемы переводятся в систему кинетических уравнений, знакомую из химической кинетики, особенно в области кинетики ферментов.Существует несколько методов решения такой связанной системы дифференциальных уравнений первого порядка. Один из подходов, который мы использовали ранее, — это метод распределения времени первого прохождения (f (t)) путем прямого вывода уравнения для f (t). Этот метод практичен, когда количество связанных уравнений невелико, например, шесть или меньше. Однако здесь мы имеем дело с большим количеством концентраций, более чем с десятью. Итак, мы использовали метод стохастического моделирования Гиллеспи для получения зависимых от времени концентраций [28].Этот метод и его различные варианты широко обсуждались в литературе.

Для проведения анализа нам необходимы числовые значения всех кинетических параметров. Мы рассмотрели следующий набор k для изолейцина, которые либо получены, либо взяты из литературы [9], [12], [27].

,,,,, ,,, и.

Аналогичным образом константы скорости для валина равны

,,,,,,,, ,,, и.

Во-первых, мы изучили одиночный молекулярный катализ для обоих субстратов.В этом исследовании рассматривается один фермент, а другие субстраты (аминокислоты, АТФ и тРНК ^Ile ) берутся в избыточном количестве, что аналогично методике экспериментов с одной молекулой. Рис. 6 и Рис. 7 показывают распределения времени ожидания для Ile и Val, соответственно. Рисунки ясно показывают, что временные масштабы образования продукта для изолюцина и валина сильно различаются. Скорость образования продукта идентична распределению времени первого прохождения.Распределение времени первого прохождения показывает, что скорость образования продукта для изолейцина очень быстро снижается и стремится к нулю в течение секунды. С другой стороны, соответствующая скорость для валина не сильно меняется даже до 10 секунд (показано на вставке рис. 7, ). Экспериментальные исследования также показывают подобное поведение [12]. Большая разница во времени для двух субстратов возникает из-за присутствия гидролиза перед переносом и после переноса в случае валина.

Рисунок 7.Вычисленное распределение времени первого прохождения для аминоацилирования тРНК ^Ile валином в одномолекулярной реакции.

На вставке показана временная зависимость для короткого промежутка времени, когда распределение показывает сначала резкий подъем, а затем медленный спад.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066112.g007

Роль тРНК ^Ile в гидролизе АТФ для получения валина представлена ​​на Рис. 8 . Это показывает, что скорость гидролиза АТФ в стационарном состоянии увеличивается с увеличением концентрации тРНК ^Ile .При низкой концентрации тРНК ^Ile она быстро увеличивается, а затем насыщается при высокой концентрации. Аналогичное поведение наблюдается в случае изолейцина (данные не показаны). Стационарная скорость гидролиза АТФ как для валина (, фиг. 9 (A), ), так и для изолейцина ( фиг. 9 (B) ) показывает поведение типа Михаэлиса-Ментен. Интересно, что график обратной скорости по сравнению с обратной концентрацией тРНК ^Ile в случае валина (вставка , рис.9 (A) ) указывает на отклонение от поведения Михаэлиса-Ментен в отличие от изолейцина (вставка , рис.9 (В) ). Это отклонение объясняется корреляцией относительного вклада тРНК-независимого гидролиза в тРНК-зависимый гидролиз. Таким образом, наличие тРНК-независимого гидролиза усложняет зависимость общего гидролиза АТФ от тРНК ^Ile .

Рисунок 9. Концентрационная зависимость тРНК ^Ile стационарной скорости гидролиза АТФ для (A) валина и (B) изолейцина.

На вставках показано соответствующее поведение в обратных масштабах.Обратите внимание на отклонение от поведения Михаэлиса-Ментен для изолейцина.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066112.g009

Большинство недавних экспериментальных исследований кинетической корректуры аминоацилирования тРНК пытаются понять относительный вклад редактирования до и после переноса, а также тРНК-независимое и зависимое редактирование, поскольку механизм редактирования отражается на этих величинах. Незначительный вклад тРНК-независимого редактирования валина посредством гидролиза наблюдался неоднократно, на что указывает скорость гидролиза АТФ в отсутствие тРНК ^Ile .Однако экспериментально невозможно оценить относительный вклад тРНК-независимого редактирования в присутствии тРНК ^Ile . В нашем настоящем исследовании мы пометили молекулы AMP, которые образуются в результате гидролиза на стадии редактирования, не зависящей от тРНК. Как тРНК-зависимая, так и независимая скорость гидролиза АТФ представлена ​​в Fig. 10 . Как и ожидалось, скорость тРНК-зависимого гидролиза АТФ увеличивается с увеличением концентрации тРНК ^Ile . Интересно, что скорость тРНК-независимого гидролиза АТФ снижается с увеличением концентрации тРНК ^Ile и спадает до нуля при высокой концентрации.Следует отметить, что хотя тРНК-независимый гидролиз АТФ стремится к нулю, относительный вклад редактирования перед переносом уменьшается, а затем сходится к конечному значению (~ 9%) при высокой концентрации тРНК ^Ile .

Рисунок 10. тРНК ^Ile , зависящая от концентрации стационарная скорость гидролиза АТФ для Val в процессах до и после переноса.

Доля гидролиза перед переносом по отношению к общему гидролизу АТФ также показана синей пунктирной линией.Относительный вклад редактирования перед переносом сходится к конечному значению (~ 9%) при высокой концентрации тРНК ^Ile .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066112.g010

Уменьшение относительного вклада тРНК-независимого редактирования связано с тем, что популяция фермент-тРНК ^Ile увеличивается, а свободный фермент уменьшается с повышение концентрации тРНК ^Ile . При очень высокой концентрации тРНК ^Ile почти все ферменты остаются в виде комплекса фермент-тРНК ^Ile , тогда как тРНК-независимое редактирование происходит только тогда, когда фермент начинает каталитический цикл из свободной формы.На фиг. , фиг. 11, мы показываем фракцию свободного фермента и комплекса фермент-тРНК ^Ile при двух предельных концентрациях тРНК ^Ile . При низкой концентрации ферменты остаются в обеих формах. С другой стороны, при высокой концентрации он показывает значительное количество комплекса фермент-тРНК ^Ile по сравнению со свободным ферментом.

Рисунок 11. Зависимость от времени доли свободного фермента и комплекса фермент-тРНК ^Ile при двух различных концентрациях тРНК ^Ile ([тРНК ^Ile ] = 1 нМ и 100 нМ) в условиях многооборотного действия в присутствии валина. .

Пунктирная и сплошная линии соответствуют концентрациям тРНК ^Ile 1 нМ и 100 нМ соответственно. Черные и зеленые линии указывают на долю свободного фермента, тогда как красные и синие линии указывают на долю комплекса фермент-тРНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066112.g011

Стационарные скорости катализа изолейцина и валина и гидролиза АТФ для валина показаны на Рис. 12 . Зависимость скорости реакции от концентрации аминокислот для обоих субстратов отражает поведение, подобное Михаэлису-Ментену.Хотя скорость гидролиза АТФ для валина отличается от скорости реакции для изолейцина при малых и промежуточных концентрациях аминокислот, они почти равны при высоких концентрациях аминокислот и насыщаются до значения ~ 1,1 с ^-1 .

Рис. 12. Зависимость от концентрации аминокислот стационарной скорости ферментативного катализа для изолейцина (черная сплошная линия) и валина (синяя пунктирная линия).

Скорость гидролиза АТФ для Val показана красной пунктирной линией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066112.g012

Было обнаружено, что скорость аминоацилирования изолейцина выше, чем скорость гидролиза АТФ в случае валина при промежуточной концентрации (72 мкМ) субстрат [12]. При очень высокой концентрации субстрата другое экспериментальное исследование показывает, что эти две скорости абсолютно одинаковы при различных температурах и pH системы [9]. Важно отметить, что хотя скорость аминоацилирования изолейцина такая же, как и скорость гидролиза АТФ в случае валина при высокой концентрации субстрата, первая скорость всегда выше, чем вторая при концентрации аминокислот от низкой до промежуточной.Из зависимости скорости образования продукта в установившемся состоянии для изолейцина и валина от концентрации аминокислот мы находим, что константы Михаэлиса составляют ∼60 нМ и ∼26 мкМ, соответственно. В результате в диапазоне микромолярных концентраций установившаяся скорость образования продукта изолейцина становится насыщенной, но гидролиз АТФ для валина все еще остается ниже своего максимального значения. Разница в шкале констант Михаэлиса изолейцина и валина снижает скорость гидролиза АТФ валина по сравнению со скоростью образования продукта изолейцина в промежуточном диапазоне концентраций (до 500 мкМ).Скорость образования продукта валина остается низкой во всем диапазоне концентраций аминокислот ( фиг. 12, ).

Здесь необходимо упомянуть, что стационарная концентрация Val-тРНК ^Ile составляет менее 0,8% от комплекса IleRS или IleRS.Val-AMP. [9] Как высокое значение отношения АТФ к продукту, так и низкая концентрация Val-тРНК ^Ile предполагают, что скорость гидролиза во время реакции намного выше, чем нормальная скорость гидролиза Val-тРНК ^Ile .Это возможно, если аминокислота попадает в сильно гидролизующий домен CP1 IleRS после переноса на тРНК ^Ile . Включение такого усиленного гидролиза во время реакции объясняет как высокое значение соотношения, так и низкую концентрацию Val-тРНК ^Ile .

Общее различие, когда оба субстрата присутствуют в реакционной смеси в равном количестве, представляет собой отношение k _cat / K _m для неправильных и правильных субстратов. Таким образом, дискриминация.В настоящем исследовании мы получили ( k _cat ) _{Ile =} 1,057 s ⁻¹ и ( k _cat ) _{Val =} 5,76 × 10 ⁻³ s ⁻¹ . Таким образом, соотношение ( k _cat ) _Ile / ( k _cat ) _Val равно 1,8 × 10 ² . Мы также получили значения ( K _м ) _Ile и ( K _м ) _Val , и это 6.17 × 10 ⁻⁸ M и 2,68 × 10 ⁻⁵ M соответственно. Тогда отношение ( K _м ) _Ile / ( K _м ) _Val получается равным 4,33 × 10 ² . Здесь следует отметить, что экспериментально определенное значение ( K _м ) _Ile / ( K _м ) _Val составляет ∼1 / 10 ² [27]. Следовательно, общая дискриминация составляет (1,8 × 10 ² ).(4,3 × 10 ² ) = 7,8 × 10 ⁴ .

До сих пор мы представили кинетику изолейцина и валина и соответствующее редактирование, рассматривая субстраты (изолейцин и валин) отдельно. Чтобы получить полное редактирование напрямую, мы проводим анализ в присутствии обоих субстратов с равным количеством в условиях насыщения тРНК ^{, Ile} и АТФ. Зависящие от времени продукты высеваются на левой панели Рис. 13 . Рисунок и соответствующая вставка показывают, что общее редактирование составляет ∼10 ⁵ , что близко к вышеупомянутому значению D.Мы обнаружили, что редактирование в устойчивом состоянии не зависит от концентрации аминокислот, присутствующих в системе (правая панель , рис. 13, ).

Рисунок 13. Левая панель: зависимость продуктов от времени (Ile-тРНК ^Ile и Val-тРНК ^Ile ), когда и изолейцин, и валин присутствуют в системе в равных количествах.

Вставка показывает линейное увеличение Val-тРНК ^Ile во время устойчивого состояния. Правая панель: зависимость от концентрации аминокислот общего редактирования ( i.е. , соотношение скоростей образования Ile-тРНК ^Ile и Val-тРНК ^Ile в присутствии равных количеств Ile и Val).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066112.g013

Заключение

Учитывая множество процессов, участвующих в аминоацилировании тРНК, количественное понимание кинетической корректуры непросто. Наличие многих констант скорости также затрудняет точное экспериментальное объяснение механизма корректуры.Таким образом, цель состоит не только в том, чтобы различать схемы Хопфилда и Фершта, но и в рационализации констант скорости, наблюдаемых экспериментально.

Успехи спектроскопии одиночных молекул вселяют надежду, поскольку можно получить распределение времени ожидания, которое содержит больше информации, чем просто скорость в установившемся состоянии. Также есть возможность, что мы можем наблюдать отдельные процессы отдельно и индивидуально.

В этой статье мы представили модифицированную схему Фершта, чтобы количественно понять происхождение эффективной кинетической корректуры при аминоацилировании тРНК ^Ile , рассматривая конкретный случай различения изолейцина и валина.Схема Фершта предлагает гидролиз в качестве ключевого шага различения. С помощью предложенной нами схемы мы получили распределение времени первого прохождения, а также стационарную скорость реакции и гидролиза АТФ для Ile и Val. Настоящее теоретическое исследование успешно фиксирует экспериментальные наблюдения, так что разница в скорости общей реакции для Ile и Val. Мы показываем, что стационарная скорость гидролиза АТФ при высокой концентрации Val такая же, как и скорость образования продукта для Ile при его высокой концентрации, тогда как при низких и промежуточных концентрациях аминокислот скорость гидролиза АТФ для валина меньше, чем скорость Ile -тРНК ^{Образование Ile} .Общая скорость реакции в стационарном состоянии в случае валина показывает зависимость типа, отличного от michaelis, от концентрации тРНК ^Ile из-за взаимодействия между тРНК-независимым и тРНК-зависимым редактированием. Вклад тРНК-независимого редактирования в общее редактирование валина уменьшается с увеличением концентрации тРНК ^Ile и стремится к нулю при высокой концентрации. Мы обнаружили, что значительное количество фермента остается в виде комплекса фермент-тРНК ^Ile по сравнению со свободным ферментом, и это снижает относительный вклад независимого от тРНК редактирования.В настоящей работе количественно оценивается важность этапа гидролиза и делается вывод, что в разумной кинетической схеме этот этап может в общих чертах объяснить величину различения, связанного с кинетической корректурой.

Есть еще много важных этапов, связанных с синтезом белка, таких как кинетическая корректура, участвующая в выборе аминоацил-тРНК в рибосоме [29], [30] и выбор правильной пары оснований при репликации ДНК. Сложность формулировки правильной кинетической схемы для любой из этих задач заключается в отсутствии констант скорости для нескольких критических шагов.Таким образом, даже когда предложена правильная схема, ее справедливость не может быть легко подтверждена. Требуются дальнейшие экспериментальные исследования отдельных кинетических ступеней.

Молекулярный механизм редактирования еще предстоит понять на микроскопическом уровне. Ясно, что каталитические домены CP1 и Rossmann fold могут определять ход событий, следующих за образованием продукта. Возможно, что размер не того продукта позволяет ему перейти в домен CP1, в то время как правильный продукт будет выпущен без перехода в домен CP1.Недавний структурный анализ выявил доказательства конформационного движения домена CP1 с большой амплитудой вокруг глицина на β-цепи. Одномолекулярное спектроскопическое исследование, безусловно, может помочь в выяснении правильного механизма.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить профессора Умеша Варшнея за обсуждения и за указание ценных ссылок. Мы благодарим профессора Алана Фершта за полезные предложения. М.С. благодарит г-на Ракеша Шаран Сингха, Раджиба Бисваса и Сайката Банерджи за ценный вклад в подготовку рукописи.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: MS BB. Проведены эксперименты: ср. Проанализированы данные: MS BB. Написал статью: MS BB.

Ссылки

1. 1. Полинг Л. (1958) В: Festschrift Arthur Stoll, Birkhäuser Verlag, Базель, Швейцария, стр.597.
2. 2. Ленингер А.Л. (1970) Биохимия: молекулярные основы структуры и функции клетки. Нью-Йорк: Worth Publishers, 833 стр.
3. 3. Уотсон Дж. Д. (1970) Молекулярная биология гена.Нью-Йорк: В. А. Бенджамин, 662 с.
4. 4. Кимура М., Охта Т. (1973) Мутация и эволюция на молекулярном уровне. Genetics Suppl 73: 19–35.
5. 5. Фершт А.Р. (1981) Обзорная лекция: Механизмы редактирования ферментов и генетический код. Proc R Soc Lond B 212: 351–379.
6. 6. Хопфилд Дж. Дж. (1974) Кинетическая корректура: новый механизм уменьшения ошибок в биосинтетических процессах, требующий высокой специфичности. Proc Natl Acad Sci U S A 71: 4135–4139.
7. 7. Хуссейн Т., Камартхапу В., Крупарани С.П., Дешмук М.В., Санкаранараянан Р. (2010) Механистическое понимание распознавания родственных субстратов во время корректуры при переводе. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 22117–22121.
8. 8. Boniecki MT, Vu MT, Betha AK, Martinis SA (2008) CP1-зависимое разделение предварительного и посттрансферного редактирования в лейцил-тРНК-синтетазе. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 19223–19228.
9. 9. Фершт А.Р. (1977) Механизмы редактирования в синтезе белка.Отторжение валина изолейцил-тРНК синтетазой. Биохимия 16: 1025–1030.
10. 10. Santra M, Bagchi B (2012) Катализ аминоацилирования тРНК: единичный оборот к стационарной кинетике тРНК-синтетаз. J. Phys Chem B 116: 11809–11817.
11. 11. Лу HP, Xun L, Xie XS (1998) Одномолекулярная ферментативная динамика. Science 282: 1877–1882.
12. 12. Hopfield JJ, Yamane T, Yue V, Coutts SM (1976) Прямое экспериментальное доказательство кинетической корректуры при аминоацилировании тРНК ^Ile .Proc Natl Acad Sci U S A 73: 1164–1168.
13. 13. Фукаи С., Нуреки О, Секин С., Шимада А., Тао Дж. И др. (2000) Структурная основа для различения L-валина от L-изолейцина и L-треонина двойным ситом с помощью комплекса тРНК ^val и валил-тРНК синтетазы. Cell 103: 793–803.
14. 14. Mascarenhas AP, Martinis SA (2008) Функциональная сегрегация предсказанного «шарнирного» сайта в линкерах β-цепи лейцил-тРНК синтетазы Escherichia coli .Биохимия 47: 4808–4816.
15. 15. Zhu B, Yao P, Tan M, Eriani G, Wang E (2009) тРНК-независимое редактирование перед переносом лейцил-тРНК синтетазой класса I. J Biol Chem 284: 3418–3424.
16. 16. Silvian LF, Wang J, Steitz TA (1999) Взгляд на редактирование структуры Ile-тРНК-синтетазы с тРНК ^Ile и мупироцином. Science 285: 1074–1077.
17. 17. Кьюсак С., Яремчук А., Тукало М. (2000) Кристаллическая структура 2 Å лейцил-тРНК синтетазы и ее комплекса с аналогом лейциладенилата.EMBO J 19: 2351–2361.
18. 18. Gruic-Sovulj I, Uter N, Bullock T, Perona JJ (2005) тРНК-зависимый аминоацил-аденилатный гидролиз нередактирующей аминоацил-тРНК синтетазой класса I. J Biol Chem 280: 23978–23986.
19. 19. Qian H (2003) Термодинамический и кинетический анализ усиления чувствительности при передаче биологического сигнала. Biophy Chem 105: 585–593.
20. 20. Splan KE, Игнатов ME, Musier-Forsyth K (2008) Трансферная РНК модулирует механизм редактирования, используемый пролил-тРНК синтетазой класса II.J Biol Chem 283: 7128-7134.
21. 21. Апостол I, Левин Дж., Липпинкотт Дж., Лич Дж., Хесс Э. и др. (1997) Включение норвалина в позиции лейцина в рекомбинантном человеческом гемоглобине, экспрессируемом в Escherichia coli . J Biol Chem 272: 28980–28988.
22. 22. Чжао М., Чжу Б., Хао Р., Сюй М., Эриани Г. и др. (2005) Лейцил-тРНК-синтетаза из предковой бактерии Aquifex aeolicus содержит реликты эволюции синтетазы. EMBO J 24: 1430–1439.
23. 23. Фершт А.Р. (1985) Структура и механизм фермента. Нью-Йорк: W. H. Freeman, 475 p.
24. 24. Eriani G, Delarue M, Poch O, Gangloff J, Moras D (1990) Разделение тРНК-синтетаз на два класса на основе взаимоисключающих наборов мотивов последовательностей. Nature 347: 203–206.
25. 25. Номанбхой Т.К., Хендриксон Т.Л., Шиммель П. (1999) РНК-зависимая транслокация неправильно активированных аминокислот для предотвращения ошибок в синтезе белка.Mol Cell 4: 519–528.
26. 26. Nomanbhoy TK, Schimmel PR (2000) Неактивированные аминокислоты перемещаются с одинаковой скоростью по поверхности тРНК-синтетазы. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 5119–5122.
27. 27. Loftfield RB, Eigner EA (1966) Специфика ферментативных реакций. Аминоацилрастворимые РНК-лигазы. Biochim Biophys Acta 130: 426–448.
28. 28. Gillespie DT (1976) Общий метод численного моделирования стохастической временной эволюции связанных химических реакций.Журнал Comput Phys 22: 403–434.
29. 29. Blanchard SC, Gonzalez RL, Kim HD, Chu S, Puglisi JD (2004) Выбор тРНК и кинетическая корректура при переводе. Nat Struct Mol Biol 11: 1008–1014.
30. 30. Schmeing TM, Ramakrishnan V (2009) Что недавние структуры рибосом показали о механизме трансляции. Природа 461: 1234–1242.

Один остаток может модулировать сборку наноклеток в солевозависимом ферритине

Клеткообразующие белки имеют множество потенциальных применений в биомедицине и биотехнологии, где ферритин, запасающий железо, является широко используемым примером.Однако контроль сборки / разборки ферритиновой клетки остается сложной задачей, обычно требующей экстремальных условий, несовместимых со многими желательными грузами, особенно для более хрупких биофармацевтических препаратов. Недавно было показано, что ферритин из гипертермофильной бактерии Thermotoga maritima (TmFtn) имеет обратимую сборку в мягких условиях, предлагая большую потенциальную биосовместимость с точки зрения доступа груза и инкапсуляции. Подобно ферритину Archeoglobus fulgidus (AfFtn), TmFtn образует 24-мерные клетки, опосредованные ионами металлов (Mg ²⁺ ).Мы решили кристаллическую структуру TmFtn дикого типа и нескольких мутантов, демонстрирующих различные свойства сборки / разборки. Эти данные в сочетании с другими биофизическими исследованиями позволяют нам предложить кандидатов на межфазные аминокислоты, критически важные для контроля сборки. Эта работа углубляет наше понимание того, как эти ферритиновые комплексы собираются, и является полезным шагом на пути к производству триггерных ферритинов, в которых эти свойства можно точно сконструировать и контролировать.

Эта статья в открытом доступе

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Тоба Тек Сингх — Слова без границ

Через два или три года после раздела правительства Пакистана и Индии решили обменивать сумасшедших так же, как они обменивали гражданских заключенных.Другими словами, сумасшедшие-мусульмане из индийских сумасшедших домов будут отправлены в Пакистан, а индуистские и сикхские сумасшедшие из пакистанских сумасшедших домов будут переданы Индии.

Я не могу сказать, имело ли это решение смысл или нет. В любом случае дата безумного обмена была назначена после совещаний на высшем уровне по обе стороны границы. Все детали были тщательно проработаны. С индийской стороны, мусульманским лунатикам с родственниками в Индии будет разрешено остаться. Остальные отправят на границу.Здесь, в Пакистане, почти все индусы и сикхи уехали, поэтому вопрос о сохранении немусульманских лунатиков не возникал. Все сумасшедшие индусы и сикхи будут отправлены на границу под стражей в полиции.

Я не знаю, что там произошло. Однако, когда новости о безумном обмене достигли сумасшедшего дома здесь, в Лахоре, это стало увлекательной темой для обсуждения среди сокамерников. Был один сумасшедший мусульманин, который двенадцать лет читал газету Zamindar ¹ каждый день.Один из его друзей спросил его: «Маулви Сахиб! Что такое Пакистан?» После тщательных размышлений он ответил: «Это место в Индии, где делают бритвы».

Услышав это, его друг был доволен.

Один сикхский сумасшедший спросил другого сикха: «Сардар джи, почему они отправляют нас в Индию? Мы даже не говорим на этом языке».

«Я понимаю индийский язык», — ответил другой, улыбаясь. «Индейцы — дьявольские люди, которые надменно расхаживают», — добавил он.

Во время купания сумасшедший мусульманин закричал: «Да здравствует Пакистан!» с такой силой, что он поскользнулся на полу и вырубился.

Были также некоторые сумасшедшие, которые на самом деле не были сумасшедшими. Большинство этих сокамерников были убийцами, чьи семьи подкупили чиновников сумасшедшего дома, чтобы те совершили их, чтобы спасти их от петли палача. Эти сокамерники кое-что понимали в том, почему Индия была разделена, и они слышали о Пакистане. Но они не были так хорошо информированы. Газеты им мало что рассказывали, да и неграмотные охранники, которые за ними ухаживали, тоже не сильно помогали. Все, что они знали, это то, что был человек по имени Мохаммед Али Джинна, которого люди называли Кайд-э-Азем.Он создал для мусульман отдельную страну под названием Пакистан. Они понятия не имели, где он находится и каковы его границы. Вот почему все сумасшедшие, не совсем потерявшие рассудок, недоумевали, в Пакистане они или в Индии. Если они были в Индии, то где был Пакистан? Если они были в Пакистане, то как получилось, что место, где они жили, до недавнего времени называлось Индией?

Один сумасшедший настолько увлекся этим вопросом Индии / Пакистана, что стал еще более безумным.Однажды он забрался на дерево и два часа просидел на одной из его ветвей, без перерыва читая лекции по сложным вопросам раздела. Когда охранники сказали ему спуститься, он поднялся выше. Когда его пытались запугать угрозами, он ответил: «Я не буду жить ни в Индии, ни в Пакистане. Я буду жить на этом дереве прямо здесь!» С большим трудом они в конце концов его уговорили. Когда он спустился на землю, он заплакал и обнял своих друзей-индуистов и сикхов, обезумев от мысли, что они оставят его и отправятся в Индию.

Один мужчина держал M.S. по специальности радиоинженер. Он держался отдельно от других сокамерников и проводил все свое время, бесшумно прогуливаясь по определенной тропинке в саду. Однако, услышав об обмене, он переоделся и побежал голым по территории.

Был один толстый сумасшедший мусульманин из Чиниота, который был активным активистом Мусульманской лиги. Он мылся пятнадцать или шестнадцать раз в день, но за ночь отказался от этой привычки.Его звали Мохаммед Али. Однажды он объявил, что он Кайд-э-Азем, Мохаммед Али Джинна. Увидев это, сикхский сумасшедший объявил себя мастером Тара Сингхом. Кровь текла бы, если бы оба не были классифицированы как опасные сумасшедшие и содержались в разных помещениях.

Был также молодой индусский юрист из Лахора, который сошел с ума из-за несчастной любовной связи. Он был огорчен, узнав, что Амритсар сейчас в Индии, потому что его возлюбленная была индуисткой из этого города.Хотя она отвергла его, он не забыл ее после того, как потерял рассудок. По этой причине он проклял мусульманских лидеров, которые разделили Индию на две части, так что его возлюбленная осталась индийской, а он стал пакистанцем.

Когда новости об обмене дошли до сумасшедшего дома, несколько сумасшедших попытались утешить адвоката, сказав ему, что его отправят в Индию, где живет его возлюбленная. Но он не хотел покидать Лахор, опасаясь, что его практика не будет процветать в Амритсаре.

В Европейском приходе было два англо-индийских сумасшедших.Они очень встревожились, узнав, что англичане уехали после предоставления Индии независимости. Приглушенным тоном они часами обсуждали, как это повлияет на их положение в сумасшедшем доме. Останется ли Европейский приход или исчезнет? Подают ли им английский завтрак? Что, заставят их есть ядовитые кровавые индийские чапати вместо хлеба?

Один сикх находился в заключении пятнадцать лет. Он говорил на своем собственном странном языке, постоянно повторяя эту бессмысленную фразу: «Упри гур гур ди аннексе ди бе-дхийан о мунг ди даал далалтин».» ² Он никогда не спал. По словам охранников, он не спал ни разу пятнадцать лет. Однако иногда он отдыхал, прислонившись к стене.

Его ступни и лодыжки опухли из-за того, что все время стояли, но, несмотря на эти физические проблемы, он отказывался лечь и отдыхать. Он внимательно слушал, когда обсуждали Индию, Пакистан и грядущий безумный обмен мнениями. Когда его спрашивали, что он думает, он отвечал очень серьезно: «Упри гур гур ди аннексе ди бе-дхияна ди мунг ди даал ди пакистанского города».» ³

Позже он заменил «пакистанского орнамента» на «ди Тоба Тек Сингха». Он также начал спрашивать других сокамерников, где находится Тоба Тек Сингх и к какой стране он принадлежит. Но никто не знал, в Пакистане это или в Индии. Когда они спорили по этому поводу, они только еще больше запутались. В конце концов, Сиалкот когда-то был в Индии, но теперь очевидно, что он находится в Пакистане. Кто знает, может ли Лахор, который сейчас находился в Пакистане, не отправиться завтра в Индию? Или вся Индия может стать Пакистаном? И была ли какая-то гарантия, что и Пакистан, и Индия однажды не исчезнут полностью?

Волосы этого сикхского сумасшедшего были растрепанными и тонкими.Из-за того, что он мылся так редко, его волосы и борода спутались, придавая ему устрашающий вид. Но он был безобидным парнем. За пятнадцать лет он ни с кем не дрался.

Прислуга знала только, что он владел землей в районе Тоба Тек Сингх. Будучи зажиточным помещиком, он внезапно потерял рассудок. Родственники связали его тяжелыми цепями и отправили в сумасшедший дом.

Семья навещала его раз в месяц. Убедившись, что он здоров, они снова уезжали.Эти семейные посещения продолжались много лет, но прекратились, когда начались проблемы Индии и Пакистана.

Звали этого сумасшедшего Башан Сингх, но все звали его Тоба Тек Сингх. Хотя у него было очень мало чувства времени, он, казалось, знал, когда его родственники приезжают в гости. Он скажет дежурному офицеру, что его визит приближается. В день он тщательно мыл тело, расчесывал и смазывал волосы маслом. Затем он одевался в лучшую одежду и отправлялся на встречу с родственниками.

Если ему задавали какой-либо вопрос, он либо молчал, либо говорил: «Упри гур гур ди аннексе ди бе-дхияна ди мунг ди даал ди лаалтейн».

У Башана Сингха была пятнадцатилетняя дочь, которая каждый месяц росла на высоту пальца. Он не узнал ее, когда она пришла к нему в гости. В детстве она плакала всякий раз, когда видела отца. Она продолжала плакать и теперь, когда стала старше.

Когда начались проблемы с перегородкой, Башан Сингх начал расспрашивать других сумасшедших о Тоба Тек Сингхе.Поскольку он так и не получил удовлетворительного ответа, его беспокойство усиливалось день ото дня.

Потом родственники перестали его навещать. Раньше он мог предсказать их прибытие, но теперь казалось, что голос внутри него заглушили. Он очень хотел видеть тех людей, которые сочувственно говорили с ним и приносили в подарок цветы, сладости и одежду. Конечно, они могли сказать ему, был ли Тоба Тек Сингх в Пакистане или Индии. В конце концов, у него создалось впечатление, что они пришли из Тоба Тек Сингха, где находилась его земля.

В том сумасшедшем доме был еще один сумасшедший, который думал, что он Бог. Однажды Башан Сингх спросил его, находится ли Тоба Тек Сингх в Пакистане или Индии. Хохоча, он ответил: «Ни то, ни другое, потому что я еще не решил, куда его поставить!»

Башан Сингх умолял этого «Бога» разрешить статус Тоба Тек Сингха и, таким образом, положить конец его недоумению. Но «Бог» был слишком занят, чтобы заниматься этим делом из-за всех остальных приказов, которые он должен был отдать. Однажды Башан Сингх вышел из себя и закричал: «Упри гур гур ди аннексе ди бе-дхияна ди мунг ди даал вахай Гуру джи ва Хальса и вахай Гуру джи ки фатах.Джо болай так нахал сел акал! »

Под этим он мог иметь в виду: «Ты — Бог мусульман. Если бы ты был сикхским богом, ты бы непременно помог мне».

За несколько дней до дня обмена один из мусульманских друзей Башана Сингха приехал в гости из Тоба Тек Сингха. Этот человек никогда раньше не посещал сумасшедший дом. Увидев его, Башан Сингх резко повернулся и пошел прочь. Но охранник остановил его.

«Он пришел навестить вас. Это ваш друг Фазлуддин», — сказал охранник.

Взглянув на Фазлуддина, Башан Сингх пробормотал немного. Фазлуддин подошел и схватил его за локоть. «Я давно собирался навестить вас, но до сих пор у меня не было времени», — сказал он. «Все ваши родственники благополучно перебрались в Индию. Я помогал им, чем мог. Ваша дочь Руп Кур…».

Башан Сингх, казалось, что-то вспомнил. «Дочь Руп Кур», — сказал он.

Фазлуддин заколебался, а затем ответил: «Да, она … она тоже в порядке. Она ушла с ними.«

Башан Сингх ничего не сказал. Фазлуддин продолжил: «Они попросили меня убедиться, что с вами все в порядке. Теперь я слышал, что вы собираетесь в Индию. Передайте мои молитвы брату Балбиру Сингху и брату Вадхаде Сингху. А также сестре Имрат Кур … Скажите брату Балбиру. Сингх, что у меня все хорошо. Одна из двух коричневых коров, которых он оставил, уже отела. Другая тоже отела, но умерла через шесть дней. И … и скажите, что если есть что-то еще, что я могу для них сделать, Я всегда готов И принесла тебе сладости.«

Башан Сингх передал пакет охраннику. «Где Тоба Тек Сингх?» он спросил.

Фазлуддин опешил. «Тоба Тек Сингх? Где это? Там, где было всегда», — ответил он.

«В Пакистане или в Индии?» Башан Сингх настаивал.

Фазлуддин растерялся. «Это в Индии. Нет, нет, Пакистан».

Башан Сингх ушел, бормоча: «Упарди гур гур ди аннексе ди дхияна ди мунг ди даал ди Пакистана и Индостана ди дар фатай мун!»

Наконец, все приготовления к обмену были завершены.Были окончательно составлены списки всех сумасшедших, подлежащих переводу, и назначена дата самого обмена.

Погода была очень холодной. Индуистов и сикхов сумасшедших из сумасшедшего дома Лахора погрузили в грузовики под надзором полиции. На пограничном посту Вага пакистанские и индийские официальные лица встретились друг с другом и выполнили необходимые формальности. Потом начался обмен. Это продолжалось всю ночь.

Выгрузить сумасшедших и отправить их через границу было непросто.Некоторые из них даже не хотели выходить из грузовиков. Тех, кто выбрался, было трудно контролировать, потому что они начали скитаться повсюду. Когда охранники попытались одеть тех сумасшедших, которые были обнажены, они сразу же сорвали одежду с их тел. Одни ругались, одни пели, другие дрались. Они плакали и разговаривали, но ничего нельзя было понять. Сумасшедшие сами подняли шум. И было достаточно холодно, чтобы у вас стучали зубами.

Большинство сумасшедших были против обмена.Они не понимали, почему их нужно вырвать с корнем и отправить в неизвестное место. Некоторые, полубезумные, начали кричать: «Да здравствует Пакистан!». Две или три драки вспыхнули между сикхами и мусульманскими сумасшедшими, которые пришли в ярость, услышав лозунги.

Когда подошла очередь Башана Сингха быть внесенным в реестр, он поговорил с ответственным должностным лицом. «Где Тоба Тек Сингх?» он спросил. «Это в Пакистане или Индии?»

Чиновник засмеялся. «Это в Пакистане», — ответил он.

Услышав это, Башан Сингх отпрыгнул и побежал туда, где его поджидали оставшиеся товарищи.Пакистанские охранники поймали его и попытались вернуть на контрольно-пропускной пункт, но он отказался идти.

«Тоба Тек Сингх здесь!» воскликнул он. Затем он начал бредить на высшем уровне: «Упор ди гур гур ди аннексе ди бе-дхияна манг ди даал Тоба Тек Сингха и Пакистана!»

Должностные лица пытались убедить его, что Тоба Тек Сингх сейчас находится в Индии. Они сказали, что если бы случайно это было не так, они бы отправили его туда напрямую. Но он не стал слушать.

Поскольку он был безобидным, охранники позволили ему стоять прямо там, где он был, пока они продолжали свою работу.Он молчал всю ночь, но перед восходом солнца закричал. Со всех сторон прибежали чиновники. После пятнадцати лет на ногах он лежал лицом вниз на земле. Индия была с одной стороны, за забором из колючей проволоки. Пакистан был на другой стороне, за другим забором. Тоба Тек Сингх лежал посередине, на клочке земли, у которого не было названия.

¹ «Помещик» ² Буквально: «Отсутствие созерцания и чечевицы пристройки из вышеперечисленного сахарного фонарика».» ³ » Gornament «: пенджабское произношение английского слова» правительство «.

Подробнее читайте в выпуске за сентябрь 2003 г.