Гибридизация in situ: Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)| Блог UNIM

FISH – исследование для дифференциальной диагностики

Современный метод цитогенетического анализа, позволяющий определять качественные и количественные изменения хромосом (в том числе транслокации и микроделеции) и используемый для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний крови и солидных опухолей.

Синонимы русские

Флуоресцентная гибридизация in situ

FISH-тест

FISH-анализ

Синонимы английские 

Fluorescence in-situ hybridization

FISH test

Метод исследования

Флуоресцентная гибридизация in situ.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH, от англ. fluorescence in—situ hybridization) – это один из самых современных методов диагностики хромосомных аномалий. Он основан на использовании ДНК-проб, меченных флуоресцентной меткой. ДНК-пробы представляют собой специально синтезированные фрагменты ДНК, последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. Таким образом, ДНК-пробы различаются по составу: для определения разных хромосомных аномалий используются разные, специфические ДНК-пробы. ДНК-пробы также различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие – к конкретному локусу.

В ходе процесса гибридизации при наличии в исследуемом образце аберрантных хромосом происходит их связывание с ДНК-пробой, которое при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как флуоресцентный сигнал (положительный результат FISH-теста). При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-пробы в ходе реакции «отмываются», что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет оценить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию. Таким образом, FISH-тест – это не только качественный, но и количественный метод.

FISH-тест обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами цитогенетики. В первую очередь, исследование FISH может быть применено как к метафазным, так и к интерфазным ядрам, то есть к неделящимся клеткам. Это основное преимущество FISH по сравнению с классическими способами кариотипирования (например, окрашиванием хромосом по Романовскому-Гимзе), которые применяются только к метафазным ядрам. Благодаря этому исследование FISH является более точным методом для определения хромосомных аномалий в тканях с низкой пролиферативной активностью, в том числе в солидных опухолях.

Так как в FISH-тесте используется стабильная ДНК интерфазных ядер, для исследования могут быть использованы самые различные биоматериалы – аспираты тонкоугольной аспирационной биопсии, мазки, аспираты костного мозга, биоптаты и, что немаловажно, сохраненные фрагменты ткани, например гистологические блоки. Так, например, FISH-тест может быть с успехом выполнен на повторных препаратах, полученных из гистологического блока биоптата молочной железы при подтверждении диагноза «аденокарцинома молочной железы» и необходимости определения HER2/neu-статуса опухоли. Следует особо подчеркнуть, что в данный момент исследование FISH рекомендовано в качестве подтверждающего теста при получении неопределенного результата иммуногистохимического исследования опухоли на онкомаркер HER2/neu(ИГХ 2+).

Другим преимуществом FISH является его способность определять микроделеции, которые не выявляются с помощью классического кариотипирования или ПЦР. Это имеет особое значение при подозрении на синдром Ди Джорджи и велокардиофациальный синдром.

FISH-тест широко используется в дифференциальной диагностике злокачественных заболеваний, в первую очередь в онкогематологии. Хромосомные аномалии в сочетании с клинической картиной и данными иммуногистохимического исследования являются основой классификации, определения тактики лечения и прогноза лимфо- и миелопролиферативнх заболеваний. Классическими примерами являются хронический миелолейкоз – t (9;22), острый промиелоцитарный лейкоз – t (15;17), хронический лимфолейкоз – трисомия 12 и другие. Что касается солидных опухолей, наиболее часто FISH-исследование применяется при диагностике рака молочной железы, мочевого пузыря, толстой кишки, нейробластомы, ретинобластомы и других.

Исследование FISH также может быть использовано в пренатальной и преимплантационной диагностике.

FISH-тест часто проводят в сочетании с другими методами молекулярной и цитогенетической диагностики. Результат этого исследования оценивают в комплексе с результатами дополнительных лабораторных и инструментальных данных.

Для чего используется исследование?

• Для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний (крови и солидных органов).

Когда назначается исследование?

• При подозрении на наличие злокачественного заболевания крови или солидных опухолей, тактика лечения и прогноз которых зависит от хромосомного состава опухолевого клона.

Что означают результаты?

Положительный результат:

• Наличие в исследуемом образце аберрантных хромосом.

Отрицательный результат:

• Отсутствие в исследуемом образце аберрантных хромосом.

Что может влиять на результат?

• Количество аберрантных хромосом.

Флуоресцентная гибридизация — Микросистемы

Программное и техническое обеспечение для исследовательской лаборатории

Возможности гибридизации in situ могут быть значительно повышены за счет одновременного использования нескольких флуоресцентных цветов. Многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) в своем простейшем варианте может быть использована для маркировки (окрашивания) многих характеристик, поскольку в гибридизации применяются различные флуорофоры. При использовании не одних цветов, а их комбинаций, с помощью микроскопов с цифровой обработкой изображений в отдельных клетках можно одновременно обнаруживать гораздо больше выделенных красителями характеристик.

 

Рис. 1. Многоцветная FISH

Для подробного ознакомления с флуоресцентными микроскопами основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам. 

На рисунке 1 представлен типичный образец многоцветной флуоресцентной гибридизации — FISH. Нормальные мужские лимфоциты были гибридизированы с FITC-биотином, окрашенным Chr2l и ChrY зондами, и CY3-дигоксигенином, окрашенным Chrl3 и ChrY зондами. Вверху слева — снимок ядер ДНК, окрашенных ДАПИ, полученный с помощью ДАПИ фильтра. Вверху справа — снимок Chr2l и ChrY, окрашенных FITC, полученный с помощью FITC-фильтра. Внизу слева — снимок Chrl3 и ChrY, окрашенныхCY3, полученный с помощью CY3 фильтра. Нижний правый снимок является комбинированным изображением, на котором в цвете представлены все хромосомы-мишени. Этот образец был предоставлен доктором Тимом Хоузилом, Интегрейтид генетикс, Фраминхэм, Массачусетс.

Техника многоцветной FISH, объединенная с методами цифровой обработки изображений, на сегодня предлагает не имеющие себе равных возможности неизотопного обнаружения множественных последовательностей нуклеиновых кислот для анализа компонентов клеток, хромосом и генов.

Флуоресценция — явление, при котором химическое соединение возбуждается на одной длине световой волны, а излучает на другой, обычно большей — применяется во всех биологических науках для изучения разнообразных структур и внутриклеточных процессов. Технологические успехи в разработке красителей и микроскопов привели за последнее десятилетие к быстрому развитию флуоресцентных методов.

В этой обзорной статье будут изложены основы FISH-метода, ограничения, с которыми столкнулись исследователи за годы применения FISH, последние разработки аппаратного и программного обеспечения, красителей и реагентов, повлиявшие на развитие этого метода, и текущие направления в этой области. Новейшие достижения этого метода, приведшие к его применению не только в исследовательских лабораториях, но в клинической диагностике, будут также рассмотрены в этой статье.

Обзор метода FISH

Применение FISH стремительно растет в геномике, цитогенетике, пренатальных исследованиях, биологии новообразований, радиоактивном маркировании, генном картировании, амплификации генов и основных биомедицинских исследованиях. В принципе, этот метод достаточно прост.

Гибридизацией идентифицируются, или помечаются, геномные последовательности-мишени, таким образом, что можно наблюдать их местоположение и размер. Последовательности ДНК или РНК из подходящих, в зависимости от хромосомы, зондов сначала помечаются репортерными группами, которые позже идентифицируются с помощью флуоресцентной микроскопии. Помеченный ДНК или РНК зонд потом гибридизируется с метафазными хромосомами или покоящимися ядрами на предметном стекле. После промывания и усиления сигнала образец исследуется по репортерным группам с помощью флуоресцентной микроскопии.

FISH позволяет достигать очень высокого пространственного разрешения морфологических и геномных структур. Этот метод довольно быстрый, простой в осуществлении и характеризуется высокой стабильностью красителей. В зависимости от используемого зонда можно определить геном отдельной особи, целые хромосомы, участки хромосом и последовательности уникальных копий.

Прежние ограничения

До недавнего времени FISH была ограничена аппаратным и программным обеспечением, реагентами, технологией получения красителей и высокой стоимостью исполнения. Серийно выпускаемые аппаратные средства для микроскопов, оптимизированные для многоцветной FISH, были недоступны до середины 1990-х годов. До этого микроскопы приходилось специально настраивать для приложений FISH. Большинство микроскопической оптики не было предназначено для обнаружения световых сигналов низкого уровня, характерных для FISH. Поскольку при использовании этого метода существенно улучшилось разрешение геномов, возросли и требования к микроскопической оптике. Представляли проблему и хроматические аберрации на многих длинах волн. Для многоцветного анализа в особенности, все линзы, включая собирающую линзу, должны были иметь коррекцию хроматических аберраций. К тому же, очень трудно было настраивать эпифлуоресцентные источники света для получения равномерного освещения.

Анализ снимков многоцветной FISH требует разделения различных сигналов либо (а) отдельными фильтр-кубами, либо (b) использованием насадки светофильтров возбуждения с широкополосными дихроичными и пороговыми фильтрами. Развитие технологии фильтров исправило некоторые прежние проблемы, вызванные оптической несоосностью и разъюстировкой, вызываемых механическим переключением между отдельными фильтр-кубами. Сменные фильтры света возбуждения, применяемые с многополосными дихроичными и пороговыми фильтрами, могут эффективно работать с тремя цветами при использовании отдельных фильтров возбуждения для каждого цвета без регистрации сдвига. Но при работе более чем с тремя цветами все же надо использовать однополосные фильтры.

Для сбора данных использовались высокочувствительная цветная пленка или ПЗС (прибор с зарядовой связью), и в обоих случаях были проблемы с точностью цветопередачи. В дополнение, были проблемы с наложением изображений разных цветов, снятых с одного образца с применением различных красителей-зондов.

Программное обеспечение для количественного анализа образцов, приготовленных с помощью флуоресцентных реагентов, также оставляло желать лучшего, поскольку существующие системы анализа изображений не были оптимизированы для работы с флуоресцентными образцами выборки. Визуальный анализ является трудоемкой и часто субъективной процедурой, поэтому без использования передовых достижений флуоресцентной визуализации анализ флуоресцентных выборок был труден и допускал двоякое толкование. Исследователям обычно приходилось иметь в штате собственных программистов для разработки собственных программ для анализа изображений.

Самих реагентов и красителей было недостаточно для всех приложений. Например, эффективность определения места гибридизации падала с уменьшением размера зонда, что накладывало серьезные ограничения на те образцы, которые, можно наблюдать флуоресцентной микроскопией. Число различных флуоресцентных красителей было ограничено; к тому же они обладали невысокой фотостабильностью. Но развитие технологии флуоресцентных красителей и сопутствующих технологий в рамках федерально финансируемого Проекта «Геном человека» сейчас приносят свои плоды. Уже существуют зонды для всех хромосом человека, а также растет число доступных зондов генов. Наборы для гибридизации in situ и флуоресцентно-отмеченные зонды сегодня серийно выпускаются несколькими компаниями.

Цена была еще одним серьезным препятствием. Поскольку на рынке не было серийно выпускаемых FISH систем, исследователям приходилось собирать системы, получаемые под заказ, включая реагенты, зонды, микроскоп, аппаратное и программное обеспечение по обработке изображений, анализу данных и разработке отчетов. Проведение многоцветной FISH с комплексным анализом изображения могло стоить исследователю более $200 000 — сумма труднодоступная для большинства клинических исследователей. В результате, многие исследователи, желающие использовать FISH в своих лабораториях, не имели такой возможности.

FISH стала широко доступной

Многие производители аппаратного и программного обеспечения разработали доступные серийно выпускаемые системы, как альтернативу системам под заказ. Атмосфера сотрудничества, возникшая среди многих фирм и лабораторий, занимающихся FISH, привела к новым прорывам в этой области. И свои достижения авторы публикуемых работ рассматривают именно в рамках такого сотрудничества.

 

Рис. 2. Рабочий экран программы MultiFluor

Система, работающая в Соединенных Штатах и обеспечивающая средние цены для серийно выпускаемых для исследований FISH систем, объединяет компоненты многих производителей и полагается на последние достижения в программной обработке изображений, аппаратном обеспечении микроскопов и других аксессуаров. Для клинических исследовательских лабораторий эта система оказывается полезной во многих приложениях. Будучи интегрированной и автоматизированной, она позволяет проводить клинические испытания в полном объеме.

Система программного обеспечения, представленная здесь — MultiFluor ™ -многопараметрическая система визуализации (Системы исследования биологических структур), разработанная на базе Microsoft® Windows (корпорация Майкрософт, Беллевуе, Вашингтон) и предназначенная для обнаружения, анализа и представления структурных и молекулярных характеристик, полученных по выборкам многоцветной FISH. Время анализа и точность результатов улучшены благодаря соотнесению многих характеристик на различных длинах волн в каждой выборке. Эта система облегчает получение изображения, его хранение, управление базой данных, автоматическое управление микроскопом и полнофункциональный графический анализ данных.

На рисунке 2 изображен экран с обзорным представлением данных программы MultiFluor. Пользователи могут просмотреть снимки и соответствующие им данные, сопоставить многопараметрические данные, полученные в разных цветах (на разных длинах волн) с помощью различных инструментов графического построения, включая гистограммы, диаграммы рассеяния и т. д. Здесь различные графики показаны вместе с набором многоцветных снимков клетки (изображающих ДАПИ-ядра, FITC-ChrX, CY3-ChrY и CY5-Chr2l), наряду с исходными данными, представленными в таблице.

Исследователи FISH имеют возможность автоматически получать снимки на разных длинах волн в разных фокальных плоскостях, визуализировать зонды многоцветной FISH, снабжать снимки примечаниями и распечатывать их, хранить и извлекать большие объемы данных наборов многоцветных изображений. Метафазные хромосомы многоцветной FISH могут быть проанализированы генным картированием, с помощью сравнительной геномной гибридизации (СГГ), а также генерацией кариотипов. Выбранные пользователем области образца могут быть просканированы и проанализированы. Программа автоматически фокусирует систему, получает снимки на многих длинах волн, запоминает положение клеток на предметном стекле, измеряет различные характеристики, включая подсчет зонда, интенсивность флуоресценции и морфометрию клетки. Различные характеристики на различных длинах волн могут быть соотнесены друг с другом.

Дополнительной характеристикой системы является возможность ее работы с персональными компьютерами (ПК), объединенными в сеть. В типичной конфигурации один компьютер является онлайновой станцией, соединенной с аппаратным обеспечением камеры и микроскопа. Этот компьютер управляет получением снимков и производит мгновенный анализ. Другие ПК являются вторичными станциями анализа информации, где обрабатываются данные, поступившие с первого ПК, или где автономно выполняется какой-либо специальный анализ.

Программа позволяет представить все компоненты в ярких псевдоцветах для одновременной многоцветной визуализации. Например, одновременные снимки четырехцветного эксперимента (с использованием ДАПИ (синий), FITC (зеленый), CY3 (красный), и комбинации FITC- CY3 (желтый)) могут быть представлены отдельно или быть объединены в одно изображение (как показано на рисунке 1). Каждый снимок может быть интерактивно усилен для выделения интересующих характеристик. С помощью программы легко создавать гистограммы, диаграммы рассеяния, таблицы, линейные графики и другие формы представления и оценки данных (рисунок 2). К тому же данные хранятся в легко доступных и популярных форматах, таких как TIFF, JPEG, GIF и других.

Онкологические, пренатальные и биологические исследования

Описываемые FISH системы разработаны для обеспечения большей доступности исследователям, чем прежние, изготавливаемые под заказ. Они все больше применяются в онкологии, изучении патологий, цитогенетике и биологии развития. Среди их приложений такие, как анализ интерфазных клеток по количеству пятен при наблюдении с многоцветными красителями, иммунофенотипирование, морфометрия клетки и состав ДНК.

С помощью этих систем проводится анализ отклонений в числе копий хромосом, соотнесенных с общим составом ДНК, которые связаны с образованием опухолей мочевого пузыря. В пренатальных исследованиях эти системы могут использоваться для обнаружения анеуплоидий в покоящихся ядрах, связанных с пренатальными дефектами, включая синдром Дауна, синдром Тернера, синдром Клайнфельтера и другими. В клеточной биологии и биологии развития эта система может использоваться для картирования маркеров поверхности клетки и их относительного распределения, таких как рецепторы, маркеров цитоплазмы, включая белки цитоскелета, информационные РНК и специфические гены.

Диагностический потенциал

За последние полтора десятилетия стало понятно, что FISH метод имеет чрезвычайно большой потенциал не только как инструмент в исследовательской работе, но и в клинической диагностике в таких областях, как пренатальная диагностика, цитогенетика и развитие опухолей. Отсутствие высококачественных, доступных по цене систем, не только тормозило распространение FISH среди исследователей, но делало этот метод недостижимым для диагностических центров многих медицинских учреждений

Результаты, которые раньше могли быть получены лишь с помощью дорогостоящего, изготовленного под заказ оборудования, сейчас могут быть получены с помощью этой системы — и это является одним из наиболее важных ее достоинств. Мечта применить FISH не только для более широкого круга биомедицинских исследований, но и прямо поставить ее на службу пациентам, возможно, станет реальностью в не столь отдаленном будущем.

Флуоресцентная стереомикроскопия

Эпифлуоресцентное освещение

До недавнего времени, флуоресцентное освещение было доступно лишь на исследовательских микроскопах, оборудованных специальными светосильными объективами. Необходимость стереомикроскопии в этой методике усилилась с появлением генетически кодированных и биологически специфичных флуоресцентных белков, таких как GFP (зеленый флуоресцентный белок).

 

Рис. 1. Стереомикроскоп с эпифлуоресцентным осветителем

Применение стереомикроскопов для наблюдения GFP настолько распространено, что стерео флуоресцентные осветители чаще называются GFP-осветителями, несмотря на то, что они могут использоваться во многих других приложениях, как в биологических науках, так и в электронной промышленности. Большие образцы, такие как личинки, нематоды, полосатый данио, ооциты и зрелые насекомые легко наблюдать (и ими легко манипулировать), если они окрашены GFP и освещаются светом флуоресценции. Флуоресцентное освещение выявляет, какие организмы производят флуоресцентный белок, а стереоскопический способ наблюдения, в сочетании с большим полем зрения и большим рабочим расстоянием, позволяет наблюдателю пользоваться во время эксперимента пинцетом, пипетками или микроманипуляторами. Другие, более типичные образцы, также легко исследовать с помощью стереомикроскопов с флуоресцентным освещением.

Осветитель для эпифлуоресценции на стереомикроскопе функционирует подобно тем, которые установлены на более сложных микроскопах. Обычно, флуоресцентный осветитель представляет собой ксеноновую или ртутную дуговую лампу, помещенную во внешний блок осветителя, который соединяется микроскопом через промежуточный тубус (или вертикальный осветитель, см. рисунок 1 и 2), расположенный между трансфокатором микроскопа и окулярными тубусами. На сегодняшний день этот тип освещения ограничен приложениями, в которых применяются стереомикроскопы с общим главным объективом (CMO), поскольку для настройки стереомикроскопа Грену или другого стереомикроскопа, основанного на схеме сведения лучей, под свет флуоресценции невозможно использование серийно выпускаемых деталей.

Свет, излучаемый дуговой лампой, направляется через настраиваемую собирающую линзу-коллектор на возбуждающий фильтр, находящийся в комбинированном блоке светофильтров (как показано на рисунках 2 и 3). Этот фильтр пропускает свет лишь в определенном волновом диапазоне (полосе пропускания). Свет, прошедший через фильтр, отклоняется затем по оптическому пути микроскопа в его нижнюю часть (модуль трансфокатора и объектив в стереомикроскопе) и направляется на образец дихроичным зеркалом, которое, в зависимости от настройки, отражает, селективно-фильтрует и/или пропускает свет определенных длин волн/областей спектра. Термин дихроичное (или дихроматическое) отображает свойство фильтра или зеркала «различать» цвета падающего света, отражая свет того цвета, который оказывается ниже заданного предела длин волн, и, пропуская цвета выше этого предела.

 

Рис. 2. Ход лучей во флуоресцентном стереомикроскопе

Сфокусированный пучок света возбуждения проходит через трансфокатор и объектив, где образует перевернутый световой конус, облучающий образец, вызывающий возбуждение всех флуорофоров в образце, полоса поглощения которых соответствует полосе пропускания облучающего света. Вторичное флуоресцентное свечение (с длиной волны обычно большей возбуждающего света), испускаемое из образца, захватывается общим главным объективом стереомикроскопа и направляется обратно через трансфокатор к пороговому фильтру, который блокирует свет на длине волны возбуждения и пропускает лишь свет с длиной волны испускания. Тубус микроскопа на рисунках 1 и 2 сконструирован таким образом, что более длинные волны флуоресцентного испускания, проходя обратно, через левый и правый оптические каналы трансфокатора, фокусируются независимо перед тем, как они достигнут эпифлуоресцентного осветителя. Свет из левого канала проходит прямо к пороговому фильтру, после которого направляется в окулярные тубусы или в фотопорт. Напротив, свет в правом канале сначала направляется обратно через дихроичное зеркало, а потом к пороговому фильтру и окулярам. Этот свет не имеет выхода в порт камеры и может быть использован только для наблюдения образца.

Детали конструкции флуоресцентного комбинированного блока фильтров представлены на рисунках 2 и 3. Каждый блок содержит однополосный фильтр света возбуждения, два пороговых фильтра и дихроичное зеркало. Свет ртутной дуговой лампы попадает в блок светофильтров через возбуждающий фильтр, и отражается от поверхности дихроичного зеркала, как говорилось выше, и как показано на рисунке 3. Вторичное флуоресцентное излучение проходит через пороговые фильтры. Возбуждающий фильтр, дихроичное зеркало и пороговый фильтр левого канала вклеены в систему, а пороговый фильтр правого канала закреплен в небольшой рамке, которая может быть удалена из блока, если ослабить ее крепежные винты. Сняв пороговый фильтр, можно получить доступ к дихроичному зеркалу, расположенному внутри блока фильтров. При установке сменных фильтров, следите за тем, чтобы клей не попал на поверхность фильтров, и перед тем, как брать фильтры и дихроичное зеркало, обязательно надевайте перчатки, чтобы не испачкать поверхность отпечатками пальцев.

Флуоресцентный вертикальный осветитель может вместить три блока светофильтров и пустой блок диа-фильтров (без фильтров) для обычного наблюдения по методу светлого поля. Блоки фильтров крепятся на направляющих и устанавливаются в оптический путь с помощью рукоятки, используемой для контроля положения направляющих. К каждому блоку прилагается соответствующая идентификационная табличка-пластина. Таблички вставляются в щелевое отверстие в корпусе осветителя в последовательном порядке, чтобы оператор мог легко выбрать нужный блок фильтров для флуоресцентного наблюдения.

 

Рис. 3. Комбинации фильтров флуоресценции в стереомикроскопе

Набор комбинаций фильтров, представленный в таблице 1. Эти фильтры охватывают широкий диапазон флуоресцентного возбуждения и испускания и должны быть полезны во многих биологических исследованиях, где применяются обычные флуоресцентные красители. Эти комбинации фильтров также подходят для промышленного использования, как например, для анализа полупроводниковых пластин с ИС на загрязнение флуоресцентными полимерами фоторезистов. С помощью подбора соответствующей комбинации фильтров возбуждения/испускания, могут использоваться флуоресцентные зонды с длинами волн возбуждения в диапазоне от 380 до 510 нанометров (см. таблицу 1). Эти комбинации фильтров также весьма полезны в исследованиях с различными мутантами зеленых флуоресцентных белков, включая их голубую и синюю разновидность.

В культурах живых клеток с флуоресцентными метками белков, интенсивность сигнала может быть значительно повышена, если комбинации фильтров точно соответствуют профилю возбуждения и испускания флуорофоров. Например, в случае DS-красных сигналов, визуальное наблюдение и регистрация изображения красной флуоресценции фотоприемниками могут быть значительно улучшены за счет смещения красного сигнала в сторону эмиссии более оранжевого света. В дополнение, комбинации фильтров, подобранные для исследований образцов растений, с интенсивной фоновой автофлуоресценцией хлорофилла, часто бывают более эффективны при точном подборе соответствующих спецификаций фильтра и эмиссионного сигнала. Многие из этих критериев учитываются инженерами-разработчиками микроскопов для оптимизации полосы пропускания различных комбинаций фильтров стереомикроскопов.

Табл. 1. Комбинации флуоресцентных фильтров стереомикроскопов

Комплект фильтров	Диапазон длин волн возбуждения	Дихроичное зеркало	Диапазон длин волн испускания
Синий GFP/DAPI	379-401 нм	420 нм (DCLP)	435-485 нм
Голубой (EGFP) GFP	426-446 нм	455 (DCLP)	460-500 нм
Полоса пропускания GFP	HQ 450-490 нм	Q 495 (LP)	500-550 нм
Расширенная полоса пропускания GFP	HQ 450-490 нм	Q 495 (LP)	500 нм (LP)
TRITC (Ds-красный)	HQ 530-560 нм	Q 570 (LP)	590-650 нм
Полоса пропускания желтого GFP	HQ 490-510 нм	Q 515 (LP)	520-550 нм

Как и все чувствительные интерференционные фильтры, фильтры комбинированного блока со временем выходят из строя из-за интенсивного светового и ультрафиолетового облучения. Такие характеристики, как полоса пропускания и коэффициент пропускания, также меняются при использовании и хранении фильтров в среде с повышенной влажностью. Для увеличения срока службы такие фильтры следует хранить в сушильном шкафу или герметично закрытом контейнере с влагопоглотителем. Если наблюдения не проводятся, затвор осветителя следует держать закрытым, чтобы уменьшить количество света, проходящее через фильтры. Чистку фильтра можно производить только сухим воздухом из баллончика, мягкой щеткой из верблюжьей шерсти или безмасляным газом из газового баллона. Во избежание царапин и потертостей, никогда не протирайте фильтры с мягким интерференционным покрытием фильтров, тканью для протирки линз.

Фокусировка и юстировка дуговых ламп

Приобретите практический опыт юстировки и фокусировки дуговых ламп с помощью данного обучающего интерактивного приложения Mercury or Xenon Burner, в котором смоделированы все процессы юстировки лампы во флуоресцентном микроскопе.

С помощью стереомикроскопов можно наблюдать различные образцы в свете флуоресценции. Благодаря увеличению объектива от 0,5х до 1,6х и диапазону трансфокации до 15х, эти стереомикроскопы могут обеспечить общее увеличение системы от 4х до 540х, что сравнимо с диапазоном наблюдения классических сложных микроскопов. Широкий диапазон увеличения позволяет микроскопистам наблюдать как большие живые образцы, так и мелкие детали в тонких срезах, окрашенных флуорохромами, помещенных на предметном стекле. Пример наблюдения в свете флуоресценции с высоким коэффициентом увеличения приведен на рисунке 4. На нем представлен окрашенный тремя метками толстый образец почки мыши. Образец был окрашен ДАПИ, Alexa Fluor 488 WGA и Alexa Fluor 568 (использовались зонды Alexa Fluor и образец компании Molecular Probes и наблюдался с использованием трех комбинаций фильтров из таблицы 1: Blue GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, TRITC DsRed. Это изображение отчетливо демонстрирует возможности флуоресцентной стереомикроскопии на больших увеличениях при наблюдении образцов, приготовленных для сложных микроскопов.

 

Рис. 4. Срез почки мыши в свете флуоресценции

Другие производители стереомикроскопов предлагают альтернативные способы освещения для флуоресцентного возбуждения и наблюдения. В наиболее популярной конфигурации, представленной на рисунке 5, для флуоресцентного возбуждения используется внешняя схема, не использующая оптическую систему микроскопа для визуализации изображений. Свет из блока осветителя, сначала проходит через возбуждающий фильтр, и затем направляя через тубус, расположенный сзади корпуса микроскопа. В нижней части тубуса расположена система линз, направляющих свет возбуждения на образец. В такой конфигурации свет направляется прямо на образец при любом увеличении трансфокатора, обеспечивая тем самым одинаковую интенсивность флуоресцентного освещения и равномерный темный фон при любом значении увеличения.

Вторичное флуоресцентное излучение, испускаемое окрашенным образцом, захватывается общим главным объективом (рисунок 5) и проходит по каналам блока трансфокатора к пороговым фильтрам в верхней части микроскопа. После этого свет направляется либо к окулярам для прямого наблюдения, либо в тубус камеры для получения цифрового изображения или микрофотографирования. В этой конфигурации не нужны дихроичные зеркала, и это ее главное преимущество, другое преимущество — независимость от предварительно собранных блоков фильтров, что дает исследователю большую свободу выбора фильтров. Тем не менее, эта конфигурация может привести к ошибкам в работе неопытных операторов, вызванным неверным подбором комбинации фильтров.

 

Рис. 5. Микроскоп с отдельным ходом лучей света возбуждения

Интенсивное ультрафиолетовое излучение ртутной дуговой лампы, используемой в качестве источника света возбуждения во флуоресцентной микроскопии, может нанести серьезные повреждения сетчатки глаза. Во избежание этого, на корпусе микроскопов многих производителей есть защитные устройства, которые отфильтровывают ультрафиолетовый свет, облучающий образец на предметном столике. Другие меры предосторожности включают ультрафиолетовые пороговые фильтры на пути наблюдения и защиту от рассеянного света вокруг блока осветителя. В направляющие и поворотные рамки флуоресцентных интерференционных фильтров, если они не используются, часто вставляются специальные заглушки в форме фильтров.

Флуоресцентные стереомикроскопы часто оборудованы специальной диафрагмой, расположенной где-нибудь между блоком ртутного осветителя и вертикальным осветителем, для блокировки опасного ультрафиолетового излучения, исходящего от лампы, в то время, когда образец не наблюдается. Когда наблюдения не проводятся, эту диафрагму необходимо устанавливать на пути прохождения света.

При наблюдении образцов светосильными апохроматическими объективами (от 1.6x до 2.0x) во флуоресцентной стереомикроскопии, в нижних участках поля зрения могут возникать отблески, или горячие пятна. Этот артефакт обычно проявляется только при низких коэффициентах трансфокации, и исчезает с на больших увеличениях. В большинстве случаев отражения не возникают, если увеличение объектива мало (от 0,5х до 1,0х), независимо от оптической коррекции, и этот эффект обычно отсутствует у объективов с высокой числовой апертурой и низкой коррекцией (ахроматы или планахроматы).

Как показано в таблице 2, во флуоресцентной микроскопии существует много приложений, где применяются стереомикроскопы. Количество образцов, которые удобно наблюдать именно в этом режиме, весьма велико, и относятся они к широкому кругу дисциплин от биологии до промышленных производств.

Табл. 2. Приложения флуоресцентной стереомикроскопии

Область	Приложения — Анализ
Биология	Экспрессия генов, сортировка клеток, диссекция, процессы развития, исследования глаз и мускулов
Ботаника	Клетки растений, автофлуоресценция тканей, пробы грунта, паразиты
Фармакология	Капиллярный поток, лекарства, природоохранные наблюдения
Гидрология	Качество воды, клеточные структуры и анализ мембран фильтров
Агрономия	Изучение семян, экспрессия генов и трансгенетика
Электроника	Паяльная паста, анализ эпоксидных смол, проверка покрытий, отбор полимеров для интегральных микросхем
Полупроводники	Загрязнение фоторезистами, наличие инородных частиц, производственный контроль
Полимеры	Наличие инородных частиц , пустот, гранул, неполимеризированных областей
Металлообработка	Трещины, поверхностные дефекты, загрязнения, сварка, анализ разрушений
Материалы	Трещины, сварка, карбоновые соединения, исследование ориентаций
Бумажное производство	Волокна, покрытия и включения
Судебная экспертиза	Текстильные волокна, жидкости организма, отпечатки пальцев, банкноты, подделки

Флуоресцентная стереомикроскопия обладает уникальным, в сравнении с классическим сложным микроскопом, свойством трехмерного наблюдения. В дополнение к этому, стереомикроскопы обладают большими рабочими расстояниями и глубиной поля, что обеспечивает более широкое панорамное поле зрения и более интенсивную флуоресценцию. Эти характеристики имеют огромное значение для исследователей, которым приходится работать с большими биологическими образцами и материалами, и для специалистов, ведущих подготовительную работу, как например, монтаж компонентов, производственный контроль электроники или резка. Поскольку для специальных приложений становятся доступными все более точные комбинации фильтров, применение флуоресценции в стереомикроскопии продолжает расти.

Флюоресцентная in situ гибридизация для определения амплификации гена HER2 при цитологическом исследовании у больных раком молочной железы

Применение таргетной терапии в лечении онкологических больных обусловило необходимость в повседневной клинической практике определения молекулярных мишеней лекарственных препаратов. Одним из таких препаратов является герцептин (транстузанаб), представляющий рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, связывающееся с рецепторами 2-го типа человеческого эпидермального фактора роста HER2 на поверхности опухолевых клеток. Высокая эффективность герцептина обусловлена как прямой цитотоксичностью, так и непосредственным блокированием пролиферации, стимуляцией апоптоза, антиангиогенной активностью. Онкоген HER2 расположен в хромосоме 17 (17q21). Гиперэкспрессия онкопротеина HER2/neu, связанная с амплификацией гена HER2, встречается в 10—30% инвазивных раков молочной железы с плохим прогнозом, но, с другой стороны, эти опухоли поддаются лечению герцептином [1, 2, 4]. Экспрессия онкопротеина HER2/neu может определяться иммуноцитохимически. При неопределенном (2+) иммуноцитохимическом герцепт-статусе для определения наличия либо отсутствия амплификации гена HER2 необходимо применять метод гибридизации in situ.

Гибридизация in situ — это метод прямого выявления нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в клеточных структурах. Метод позволяет определить специфические нуклеотидные последовательности непосредственно в клетках, так как зонд наносят прямо на клеточный образец, содержащий генетический материал, при этом морфология изучаемых клеток не меняется [3, 5].

Целью настоящего исследования явилась разработка метода FISH (флюоресцентной in situ гибридизации) для определения амплификации гена HER2 при предоперационном цитологическом исследовании тонкоигольных аспирационных биоптатов у больных инвазивным протоковым раком молочной железы (РМЖ).

Исследовали аспирационные тонкоигольные биоптаты у 110 больных инвазивным протоковым РМЖ, проходивших лечение в МНИОИ им. П.А. Герцена. Клеточный материал (после пункции) помещали в специальную питательную среду накопления, в микропробирку, содержащую 800 мкл среды. Взвесь клеток распределяли по 50—100 мкл в контейнеры центрифуги системы Сytospin-3 («Shandon», Великобритания) и центрифугировали в режиме 1000 об./мин в течение 5 мин. Полученные препараты использовали для иммуноцитохимических (ИЦХ) реакций с антителами к онкопротеину с-erbB-2 (HER2/neu) («Dako») и метода FISH с использованием коммерческого набора HER2 FISH («Dako»). Предварительно проводили контроль качества полученных монослойных мазков, для чего два цитопрепарата окрашивали рутинным методом по Лейшману для цитологического анализа. При наличии в мазках достаточного количества исследуемого клеточного материала (не менее 300 клеток), проводили иммунохимическую реакцию и FISH-реакцию на оставшихся неокрашенных цитопрепаратах.

Интенсивность ИЦХ-экспрессии антител с-erbB-2(HER2/neu) оценивали полуколичественно. После проведения иммуноцитохимической реакции с антителами к онкопротеину с-erbB-2 (HER2/neu) изучали мембранное окрашивание. Отрицательной ИЦХ-реакцией (0) считали отсутствие мембранного окрашивания или выявление его менее чем в 10% клеток (рис. 1,). Окрашивание слабой интенсивности мембран более чем 10% клеток опухоли оценивали как 1+ (рис. 2,). Неопределенной ИЦХ-реакцией (2+), требующей проведения FISH-исследования, являлось умеренное мембранное окрашивание более 10% клеток опухоли или сильное мембранное окрашивание менее 30% опухолевых клеток (рис. 3,). Положительной ИЦХ-реакцией (3+) считали сильное полное мембранное окрашивание более 30% опухолевых клеток (рис. 4,). Никогда не принимали во внимание окрашивание цитоплазмы.

Рис. 1. Инвазивный протоковый РМЖ. Иммуноцитохимия. Отсутствие экспрессии онкопротеина (0). ×200.

Рис. 1. Экспрессия белка пролиферативной активности Ki-67 в клетках РМЖ. ×100.

Рис. 2. Инвазивный протоковый РМЖ. Иммуноцитохимия. Слабая экспрессия онкопротеина (1+). ×200.

Рис. 2. Экспрессия онкопротеина с-erbB-2 в клетках РМЖ (+2). ×200.

Для определения амплификации гена HER2 проводили флюоресцентную гибридизацию in situ. Для исследования использовались флюоресцентные зонды HER2 FISH («Dako»). Цитологический материал, прочно зафиксированный на высокоадгезивных предметных стеклах, обрабатывали пепсином, чтобы облегчить проникновение зонда к ядерной ДНК. Благодаря нагреванию происходила денатурация ДНК и последующая гибридизация одноцепочечной ДНК, комплементарной к внесенному зонду. Несвязавшиеся зонды затем отмывали и проводили анализ FISH-реакции с помощью флюоресцентного микроскопа Axio Imager A1 («Zeiss»).

Оценку наличия амплификации гена HER2 проводили путем подсчета количества сигналов, которыми помечен ген HER2 (красный сигнал) и сигналов, метящих центромерный участок 17-й хромосомы (зеленый сигнал). Сигналы визуализировали с помощью флюоресцентного микроскопа. Определяли среднее значение количества копий гена HER2 на ядро. Подсчитывали соотношение красных и зеленых меток в 20 ядрах.

1. Если среднее значение количества копий гена HER2 более 6 на ядро или соотношение красных меток к зеленым 2,2 и более, то констатировали наличие амплификации.

2. Если среднее значение количества копий гена HER2 менее 4 на ядро или соотношение красных меток к зеленым менее 1,8, то констатировали отсутствие амплификации.

3. Если среднее значение количества копий гена HER2 4—6 на ядро или соотношение красных меток к зеленым 1,8—2,2, констатировали наличие неопределенного HER2-статуса, что требовало дополнительного исследования не менее 40 опухолевых ядер или повторения FISH-реакции.

В результате проведенного исследования в 22 случаях РМЖ ИЦХ-реакцию оценили как 3+, в 11 — 2+, что требует проведения FISH-реакции, в 66 — ИЦХ-реакция была слабой интенсивности (+) и в 11 — экспрессия отсутствовала (0).

При проведении FISH-реакции во всех 22 случаях РМЖ с ИЦХ-реакцией 3+ обнаружили амплификацию гена HER2 (рис. 5,), в 77 случаях с отрицательной и слабо положительной ИЦХ-реакцией амплификация не выявлена (рис. 6,). В группе 2+ амплификация гена HER2 была обнаружена у 7 больных и в 4 случаях она отсутствовала (таблица).

Рис. 3. Инвазивный протоковый РМЖ. Иммуноцитохимия. Умеренная экспрессия онкопротеина (2+). ×200.

Рис. 3. Экспрессия Р.Э. в клетках РМЖ: 8 баллов. ×200.

Сравнение гормонального и HER2-статуса при раке молочной железы показало следующие данные. У 23 (79%) из 29 больных инвазивным протоковым РМЖ с наличием амплификации гена HER2 экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона отсутствовала. У 71 (87,5%) из 81 больной инвазивным РМЖ неспецифического типа с отсутствием амплификации гена HER2 наблюдалась экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона.

Таким образом, проведенное исследование показало возможность FISH-метода для определения амплификации гена HER2 на цитологических препаратах до начала какого-либо лечения и необходимость ее подтверждения при умеренно выраженной (2+) иммуноцитохимической экспрессии HER2/neu.

FISH-диагностика | Клиника «Надия»

Предимплантационная диагностика

Предимплантационная генетическая диагностика, сравнительная геномная гибридизация, 24 хромосомы, количество эмбрионов не больше 8-ми

57 300,00

Предимплантационная генетическая диагностика, сравнительная геномная гибридизация, 24 хромосомы, количество эмбрионов не больше 8-ми, без биопсии бластоцисты/бластомера

54 400,00

Предимплантационная генетическая диагностика: сравнительная геномная гибридизация, 24 хромосомы, за каждый дополнительный эмбрион свыше 8-ми

8 000,00

Предимплантационная генетическая диагностика методом ПЦР (I ст. сложности)

11 200,00

Предимплантационная генетическая диагностика методом ПЦР (ІI ст. сложности)

22 400,00

Предимплантационная генетическая диагностика методом ПЦР (ІII ст. сложности)

33 600,00

Предимплантационный генетический скрининг по 5 хромосомам (13, 18, 21, X, Y): биопсия бластомера, PGD

19 410,00

Предимплантационный генетический скрининг по 5 хромосомам (13, 18, 21, X, Y), без биопсии бластоцисты/бластомера, до 5 образцов включительно

6 900,00

Предимплантационный генетический скрининг по 5 хромосомам (13, 18, 21, X, Y), без биопсии бластоцисты/бластомера, до 10 образцов включительно

13 800,00

Предимплантационный генетический скрининг по 9 хромосомам (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X, Y), без биопсии бластоцисты/бластомера, до 5 образцов включительно

9 700,00

Предимплантационный генетический скрининг по 9 хромосомам (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X, Y), без биопсии бластоцисты/бластомера, до 10 образцов включительно

19 400,00

Предимплантационный генетический скрининг по 8 хромосомам (13, 15, 16, 18, 21, 22, X, Y), без биопсии бластоцисты/бластомера, до 10 образцов включительно

19 000,00

Предимплантационный генетический скрининг по 8 хромосомам (13, 15, 16, 18, 21, 22, X, Y), без биопсии бластоцисты/бластомера, до 5 образцов включительно

9 500,00

Преимплантационный генетический скрининг частых анеуплоидий (ПГС) методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)

Рекомендуемые статьи

13 июля 2019

С одной стороны, с мужчиной все проще. Его фертильность очень легко оценить по анализу спермы, сдал спермограмму, посмотрели под микроскопом, увидели ситуацию и все стало ясно. Напомню, сегодняшняя норма — 15 миллионов сперматозоидов в 1 миллилитре с подвижностью А+Б (прямолинейное движение) больше 39% и жизнеспособность 58%, морфологическая норма может быть даже 4%. По сути, красивыми внешне могут быть всего 4 процента сперматозоидов (раньше было 14%). Все это говорит о том, что сперма нормальная.

13 июля 2019

Итак, из физиологии и биологии мы уже понимаем, что не каждый секс приводит к зачатию. Что же тогда считать бесплодием? Во всем мире принято определение этого состояния, которое сформулировано так: проблему можно рассматривать как бесплодие, если пара 12 месяцев ведет регулярную половую жизнь, но беременность не наступает. Почему именно 12 месяцев?

12 июля 2019

Отдельно можем выделить еще один фактор бесплодия — ВОЗРАСТНОЕ. В европейских странах сложилась опасная демографическая тенденция. Множественные методы контроля рождаемости, контрацептивы, урбанизация плюс наша социальная активность приводят к тому, что замуж сейчас выходят позже, детей думают рожать позже. Сначала образование, карьера, а потом уже дети. И все это заставляет женщину медлить с зачатием ребенка.

06 августа 2010

Несмотря на значительные достижения в лечении бесплодия за последние 30 лет, эффективность самого лучшего сегодня метода лечения бесплодия — ЭКО остается, относительно ожиданий пациентов, невысокой — 30-40%. Вопрос: почему хорошие эмбрионы не хотят приживаться в матке — все еще остается открытым.

26 июня 2009

Рекомендации по образу жизни и питанию после ЭКО

ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ (FISH) В ДИАГНОСТИКЕ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ И ЕГО РЕЦИДИВОВ | Матвеев

1. Halling K.C., Kipp B.R. Fluorescence in situ hybridization in diagnostic cytology. Hum Pathol 2007;38:1137–44.

2. Halling K.C., Kipp B.R. Adv Bladder Cancer Detection Using FISH (UroVysion Assay). Anat Pathol 2008;15:279−86.

3. Kipp B.R., Tanasescu M., Else T.A. et al. Quantitative fluorescence in situ hybridization and its ability to predict bladder cancer recurrence and progression to muscle-invasive bladder cancer. J Mol Diagn 2009;11(2):148−54.

4. Richter J., Jiang F., Gorog J.P. et al. Marked genetic differences between stage pTa and stage pT1 papillary bladder cancer detected by comparative genomic hybridization. Cancer Res 1997;57: 2860–4.

5. Fadl-Elmula I., Gorunova L., Mandahl N. et al. Karyotypic characterization of urinary bladder transitional cell carcinomas. Genes Chromosomes Cancer 2000;29:256–65.

6. Sarosdy M.F., Schellhammer P., Bokinsky G. et al. Clinical evaluation of a multi-target fluorescent in situ hybridization assay for detection of bladder cancer. J Urol 2002;168:1950–4.

7. Клиническая онкоурология. Под ред. Б.П. Матвеева. М.: Вердана, 2003. 717 с.

8. Wang M.R., Perissel B., Taillandier J. et al. Nonrandom changes of chromosome 10 in bladder cancer. Detection by FISH to interphase nuclei. Cancer Genet Cytogenet 1994;73(1):8−10.

9. Cajulis R.S., Haines G.K . 3rd, Frias-Hidvegi D. et al. Cytology, flow cytometry, image analysis, and interphase cytogenetics by fluorescence in situ hybridization in the diagnosis of transitional cell carcinoma in bladder washes: a comparative study. Diagn Cytopathol 1995;13(3):214−24.

10. Pycha A., Mian C., Haitel A. et al. Fluorescence in situ hybridization identifies more aggressive types of primarily noninvasive (stage pTa) bladder cancer. J Urol 1997;157:2116–9.

11. Zhang F.F., Arber D.A., Wilson T.G. et al. Toward the validation of aneusomy detection by fluorescence in situ hybridization in bladder cancer: comparative analysis with cytology, cytogenetics, and clinical features predicts recurrence and defines clinical testing limitations. Clin Cancer Res 1997;3:2317–28.

12. Reeder J.E., O’Connell M.J., Yang Z. et al. DNA cytometry and chromosome 9 aberrations by fluorescence in situ hybridization of irrigation specimens from bladder cancer patients. Urology 1998;51(5A Suppl):58−61.

13. Marano A., Pan Y., Li C. et al. Chromosomal numerical aberrations detected by fluorescence in situ hybridization on bladder washings from patients with bladder cancer. Eur Urol 2000;37(3):358−65.

14. Stamouli M.I., Panani A.D., Ferti A.D. et al. Detection of genetic alterations in primary bladder carcinoma with dual-color and multiplex fluorescence in situ hybridization. Cancer Genet Cytogenet 2004;149(2):107−13.

15. Kiemeney L.A., Schoenberg M. Familial transitional cell carcinoma. J Urol 1996;156(3):867−72.

16. Sandberg A.A., Berger C.S. Review of chromosome studies in urological tumors. II. Cytogenetics and molecular genetics of bladder cancer. J Urol 199;151(3):545−60.

17. Pycha A., Mian C., Posch B. et al. Numerical chromosomal aberrations in muscle invasive squamous cell and transitional cell cancer of the urinary bladder: an alternative to classic prognostic indicators? Urology 1999;53(5):1005−10.

18. Sokolova I.A., Halling K.C., Jenkins R.B. et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn 2000; 2:116–23.

19. Cajulis R.S., Haines G.K. III, Frias-Hidvegi D. et al. Interphase cytogenetics as an adjunct in the cytodiagnosis of urinary bladder carcinoma. A comparative study of cytology, flow cytometry and interphase cytogenetics in bladder washes. Anal Quant Cytol Histol 1994;16:1–10.

20. Bubendorf L., Grilli B. UroVysion multiprobe FISH in urinary cytology. Methods Mol Med 2004;97:117–31.

21. http://www.nikon-microscope.ru/fish_dna.htm

22. Halling K.C. Vysis UroVysion for the detection of urothelial carcinoma. Expert Rev Mol Diagn 2003;3:507–19.

23. Bubendorf L., Grilli B., Sauter G. et al. Multiprobe FISH for enhanced detection of bladder cancer in voided urine specimens and bladder washings. Am J Clin Pathol 2001;116:79–86.

24. Halling K.C., King W., Sokolova I.A. et al. A comparison of BTA stat, hemoglobin dipstick, telomerase and Vysis UroVysion assays for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Urol 2002;167:2001–6.

25. Halling K.C., King W., Sokolova I.A. et al. A comparison of cytology and fluorescence in situ hybridization for the detection of urothelial carcinoma. J Urol 2000;164(5):1768−75.

26. Halling K.C., Kipp B.R. Fluorescence in situ hybridisation for the detection of bladder cancer. Eur Ren Genitourinary Dis 2006; 2:51–4.

27. Laudadio J., Keane T.E., Reeves H.M. et al. Fluorescence in situ hybridization for detecting transitional cell carcinoma: Implications for clinical practice. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations 2006;24(3):270−1.

28. Gudjуnsson S., Isfoss B.L., Hansson K. et al. The value of the UroVysion assay for surveillance of non-muscle-invasive bladder cancer. Eur Urol 2008;54(2):402−8.

29. Башкатов С.В. Прогностическое значение молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических нарушений в клетках поверхностной уротелиальной карциномы. Автореф. дис. … канд. мед. наук, 2008, 20 с.

30. Van Rhijn B.W., van der Poel H.G., van der Kwast T.H. Urine markers for bladder cancer surveillance: a systematic review. Eur Urol 2005;47(6):736−48.

31. May M., Hakenberg O.W., Gunia S. et al. Comparative diagnostic value of urine cytology, UBC-ELISA, and fluorescence in situ hybridization for detection of transitional cell carcinoma of urinary bladder in routine clinical practice. Urology 2007; 70(3) 449−53.

32. Skacel M., Fahmy M., Brainard J.A. et al. Multitarget fluorescence in situ hybridization assay detects transitional cell carcinoma in the majority of patients with bladder cancer and atypical or negative urine cytology. J Urol 2003; 169:2101–5.

33. Yoder B.J., Skacel M., Hedgepeth R. et al. Reflex UroVysion testing of bladder cancer surveillance patients with equivocal or negative urine cytology: a prospective study with focus on the natural history of anticipatory positive findings. Am J Clin Pathol 2007;127:295–301.

34. Kipp B.R., Karnes R.J., Brankley S.M. et al. Monitoring intravesical therapy for superficial bladder cancer using fluorescence in situ hybridization. J Urol 2005;173:401–4.

35. Mengual L., Marin-Aguilera M., Ribal M.J. et al. Clinical utility of fluorescent in situ hybridization for the surveillance of bladder cancer patients treated with bacillus Calmette-Guerin therapy. Eur Urol 2007; 52:752–9.

36. Pycha A., Mian C., Hofbauer J. et al. Does topical instillation therapy influence chromosomal aberrations in superficial bladder cancer? J Urol 1998; 159(1):265−9.

гибридизация in situ — это… Что такое гибридизация in situ?

гибридизация in situ

гибридизация in situ.

(Источник: «Англо-русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд-во ВНИРО, 1995 г.)

.

• cytological hybridization
• цитологическая гибридизация

Смотреть что такое «гибридизация in situ» в других словарях:

• гибридизация in situ — цитологическая гибридизация Метод выявления (картирования) определенных участков молекулы ДНК препараты хромосом после денатурации ДНК и удаления РНК и белков гибридизуют с мечеными фрагментами ДНК (или РНК), комплементарными искомому участку, а… …   Справочник технического переводчика

• гибридизация in situ — hibridizacija in situ statusas T sritis augalininkystė apibrėžtis Specifinių DNR sekų atpažinimo metodas sveikose chromosomose su radioaktyviu papildomuoju (komplementariuoju) zondu. atitikmenys: angl. in situ hybridization rus. гибридизация in… …   Žemės ūkio augalų selekcijos ir sėklininkystės terminų žodynas

• Флюоресцентная гибридизация in situ — Метафазная пластинка с филадельфийской хромосомой. Хромосомы окрашены в синий цвет, локус ABL1 красный цвет, локус BCR зелёный цвет. Вверху слева хромосома с перестройкой, отмечена красно зеленой точкой. Флюоресцентная гибридизация in situ, или… …   Википедия

• флуоресцентная (нерадиоактивная) гибридизация in situ — Метод гибридизации in situ, основанный на использовании нерадиоактивных зондов (например, биотинилированной ДНК), идентифицируемый затем с помощью флуоресцентных меток. [Арефьев В.А., Лисовенко Л.А. Англо русский толковый словарь генетических… …   Справочник технического переводчика

• флуоресцентная гибридизация in situ — флуоресцентная гибридизация in situ. См. нерадиоактивная гибридизация in situ. (Источник: «Англо русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд во ВНИРО, 1995 г.) …   Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

• нерадиоактивная гибридизация in situ — fluorescence (nonradioactive, non isotopic) in situ hybridization, FISH флуоресцентная (нерадиоактивная) гибридизация in situ. Метод гибридизации in situ <in situ hybridization>, основанный на использовании нерадиоактивных зондов (например …   Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

• ПЦР-гибридизация in situ — * ПЛР гібрыдызацыя in situ * PCR in situ hybridization or PCR PRINS вариант ПЦР, т. е. полимеразной цепной реакции (см.), когда ДНК амплифицируется и выявляется на морфологически интактных клетках или тканях. Для этого клетки или ткань… …   Генетика. Энциклопедический словарь

• Флуоресцентная (нерадиоактивная) гибридизация in situ метод FISH — Флуоресцентная (нерадиоактивная) гибридизация in situ, метод FISH * флуарэсцэнтная (нерадыеактыўная) гібрыдызацыя in situ, метад FISH * fluorescent (nonradioactive, non isotopic) in situ hybridization or FISH метод гибридизации in situ (cм.),… …   Генетика. Энциклопедический словарь

• флуоресцентная гибридизация in situ — fluorescencinė hibridizacija in situ statusas T sritis augalininkystė apibrėžtis Chromosomų analizės metodas, kurį taikant naudojami švytintys fluorochromų žymekliai kaip alternatyva radioaktyviems žymekliams. atitikmenys: angl. FISH;… …   Žemės ūkio augalų selekcijos ir sėklininkystės terminų žodynas

• геномная гибридизация in situ — genominė hibridizacija in situ statusas T sritis augalininkystė apibrėžtis Vienos rūšies genomo fragmentų įjungimo į kitos rūšies genomą analizės metodas, pagrįstas neradioaktyvių zondų naudojimu, kurie po to identifikuojami fluorescenciniais… …   Žemės ūkio augalų selekcijos ir sėklininkystės terminų žodynas

Гибридизация на месте (ISH)

Введение

Гибридизация на месте (ISH)

— это метод, который позволяет точно локализовать определенный сегмент нуклеиновой кислоты в гистологическом срезе. В основе ISH лежит то, что нуклеиновые кислоты, если они адекватно сохраняются в гистологическом образце, могут быть обнаружены путем нанесения комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, к которой прикреплена репортерная молекула.

Визуализация репортерной молекулы позволяет локализовать последовательности ДНК или РНК в гетерогенных популяциях клеток, включая образцы тканей и образцы окружающей среды. Рибозонды также позволяют локализовать и оценить степень экспрессии генов. Этот метод особенно полезен в неврологии.

Зонды для гибридизации in situ

• Зонды двухцепочечной ДНК (дцДНК)
• Зонды одноцепочечной ДНК (оцДНК)
• РНК-зонды (рибозонды)
• Синтетические олигонуклеотиды (PNA, LNA)

Методы маркировки

• Радиоактивные изотопы
• Нерадиоактивные метки
  • биотин
  • дигоксигенин
  • флуоресцентный краситель (FISH)

Применение гибридизации на месте

• Микробиология (классическая мишень — 16S рРНК) — морфология и популяционная структура микроорганизмов
• Патология (профилирование патогенов, аномальная экспрессия генов)
• Биология развития (определение профиля экспрессии генов в эмбриональных тканях)
• Кариотипирование и филогенетический анализ (уникальные паттерны FISH на отдельных хромосомах, хромосомные аберрации)
• Физическое картирование (картирование клонов на хромосомах и прямое отнесение картированных клонов к хромосомным областям, связанным с гетерохроматином или эухроматином)

Производство рибозондов

Список литературы

»« Гибридизация на месте »[Майр]

Примечание. [MAJR] — это тег медицинского предметного заголовка (MeSH) для основного заголовка.Тег используется для ограничения поиска статьями, основные темы которых представлены терминами, включенными в базу данных NLM MeSH.

»Браун С. Гибридизация in situ с рибозондами: обзор для ветеринарных патологов. Vet Pathol. 1998 Май; 35 (3): 159-67. PMID: 9598579

Заявление об ограничении ответственности

Упоминание конкретных продуктов или поставщиков на этом веб-сайте не означает одобрения со стороны правительства США.

Справка

Приложения

Технологии

Проектов

Дистрибьюторы

Гибридизация in situ — обзор

Гибридизация in situ

Гибридизация in situ (ISH) является одним из основных методов биологии развития и обеспечивает преимущество визуализации и даже количественной оценки клинически значимых молекул в морфологическом контексте.Это один из наиболее важных методов визуализации экспрессии генов на клеточном уровне в тканях. Идентификация паттернов экспрессии генов в тканях может предоставить важную пространственную и временную информацию и является первым шагом в понимании функции генов.

После первоначального описания ISH (Gall et al. ., 1969; John et al. ., 1969) радиоактивное мечение стало нормой, позволяя чувствительное полуколичественное определение нуклеотидных последовательностей. Если чувствительность является наивысшим приоритетом, предпочтительным выбором остается ISH с использованием зондов с радиоактивной меткой.Если необходима радиоактивная маркировка, [ ³⁵ S] -уридинтрифосфатаза (UTP) оказалась наиболее чувствительной и надежной меткой для обнаружения мРНК, поскольку она обеспечивает наибольший компромисс между временем и разрешением сигнала. Тем не менее, ³⁵ S-меченные зонды испускают электроны с промежуточной энергией и диапазоном, который позволяет менее точную клеточную локализацию транскрипта с помощью авторадиографического протокола, чем полученная с нерадиоактивными зондами. Использование таких этикеток ( ³ H, ³² P, ³⁵ S, ¹²⁵ I) опасно, дорого и требует много времени.Кроме того, у этих этикеток ограниченный срок хранения.

Для рутинного использования ISH при патологии нерадиоактивные зонды считаются лучше, чем радиоактивные, потому что использование последних утомительно. Неизотопные методы для усиления флуоресцентного или колориметрического обнаружения имеют сопоставимую чувствительность с чувствительностью, получаемой при радиоактивном мечении при обнаружении относительно большого количества генов в одной клетке (Breininger and Baskin, 2000). Если для обнаружения отдельных копий специфических мРНК требуется еще большая чувствительность, ее можно получить, используя сверхчувствительный ISH в сочетании со стрептавидин-нанозолотом-серебром (Hacker et al ., 1997). В любом случае чувствительность зависит в первую очередь от используемой системы обнаружения.

Методы ISH информационной РНК (мРНК) стали чрезвычайно мощным инструментом для анализа паттернов экспрессии генов. Возможности обнаружения in situ последовательностей мРНК с помощью заключаются в том, что клетки, которые синтезируют и накапливают интересующие последовательности, могут быть идентифицированы и помещены в надлежащий морфологический контекст. Таким образом, изменения в экспрессии генов, измеренные в гомогенатах, могут быть скорректированы для правильной тканевой основы и могут быть оценены потенциальные клеточные взаимодействия.Другими словами, преимущество локализации мРНК с помощью ISH состоит в том, что мРНК присутствует в клетке, экспрессирующей ген, тогда как сайт синтеза пептида не всегда находится в той же клетке, что и зрелый белок (антиген), идентифицированный с помощью IHC.

Существуют различные методы повышения чувствительности обычного ISH. Недавно Hrabovszky и Petersen (2002) продемонстрировали, что усиленная скорректированная плотность сигнала (общая плотность площади сигнала минус фоновая плотность) может быть получена при использовании концентраций зонда и / или сульфата декстрана, в несколько раз превышающих те, которые используются обычно.Они использовали концентрации зонда и сульфата декстрана> 4 × 10 ⁴ имп / мин / мкл и> 10%, соответственно. Продолжительная реакция гибридизации (> 16 часов) также увеличивала плотность сигнала. Неспецифическое связывание зонда было значительно снижено, а скорректированная плотность сигнала была увеличена за счет включения 750–1000 мМ дитиотреитола в буфер для гибридизации. Это исследование проводилось на ткани головного мозга крысы. Ожидается, что его преимущества в других типах тканей.

Игрок и др. . (2001) разработали метод ISH разветвленной дезоксирибонуклеиновой кислоты (бДНК) для обнаружения ДНК и мРНК в целых клетках.Этот метод представляет собой систему амплификации сигнала, в которой последовательности нуклеиновых кислот-мишеней гибридизуются с серией синтетических олигонуклеотидных зондов и визуализируются посредством генерации хромогенных или флуоресцентных сигналов в реакции, катализируемой щелочной фосфатазой (AP).

Применение методов нуклеиновой кислоты-мишени и амплификации сигнала к ISH может позволить обнаруживать всего одну или две копии определенных молекул ДНК в клеточных препаратах. Для достижения этой цели можно использовать метод bDNA-ISH, поскольку он очень чувствителен и может обнаруживать одну или две копии ДНК на клетку.Он специфичен и обеспечивает точную локализацию, давая положительные сигналы, которые сохраняются в субклеточных компартментах, в которых расположена нуклеиновая кислота-мишень. Повреждение морфологии клеток, вызванное тепловым воздействием, сводится к минимуму, поскольку этот метод не требует повторных циклов при повышенных температурах. Фонового шума, вызванного эндогенным биотином, можно избежать, поскольку в процедуре не используется репортерная система авидин-биотин (Kenny et al ., 2002). Распространение сигнала не является проблемой, поскольку репортерные зонды физически связаны с пространственно фиксированными мишенями нуклеиновых кислот.Обе клеточные линии и ткани, включая клинические образцы, могут быть изучены с помощью метода bDNA-ISH.

Недавно Weisheit et al . (2002) объединили традиционный ISH срезов тканей с техникой полного ISH для обнаружения активности гена. Преимуществом этого метода является строгий контроль условий гибридизации за счет использования плотно закрытых реакционных сосудов. Такой подход исключает испарение жидкости и приводит к постоянным концентрациям соли и формамида даже при высоких температурах.Теоретически каждый срез можно анализировать с помощью другого зонда, что облегчает анализ нескольких генов в срезах одного образца. Миниатюрные предметные стекла для монтажа срезов вырезаются из обычных предметных стекол микроскопа и обрабатываются для ISH в лабораторных контейнерах объемом 2 мл.

О новом подходе к обнаружению небольших изменений в экспрессии генов, а также к оптимизации профилей экспрессии генов с низкой численностью сообщили Ky и Shughrue (2002). Чтобы повысить чувствительность изотопного ISH для обнаружения редких мРНК, они использовали секции криостата и пометили зонд как [ ³⁵ S] -UTP, так и [ ³⁵ S] -аденозинтрифосфат (ATP).Кроме того, срезы гибридизовали с зондом в течение двух ночей вместо одной ночи, что значительно увеличивает интенсивность сигнала, поскольку зонд имеет больше шансов гибридизоваться с комплементарной мРНК. Эти два метода усиления — независимо или в комбинации — продемонстрировали усиление сигнала. Однако этот протокол обычно сопровождается увеличением фонового шума.

Holm (2000) оценил чувствительность трех систем обнаружения: AP-антищелочная фосфатаза (APAAP), стрептавидин-флуоресцеинизотиоцианат (STAV-FITC) и амплификация тирамидного сигнала (TSA), используя меченый биотином вирус папилломы человека 16, и обнаружил что метод APAAP обеспечивает наилучшую чувствительность, поскольку единичные вирусные копии обнаруживаются в фиксированных формалином и залитых парафином образцах тканей.

Из-за биологической значимости чувствительного обнаружения мРНК in situ в сочетании с высоким пространственным разрешением Moorman et al . (2001) разработали нерадиоактивный протокол ISH для обнаружения последовательностей мРНК в срезах тканей. Процедура в основном основана на методе ISH с полным креплением, который подходит для ISH на секциях. Чувствительность этой процедуры повышается за счет повышения температуры гибридизации до 70 ° C. Более высокие температуры способствуют лучшему проникновению зонда в ткани.

Доступны новые методы обнаружения для улучшения обнаружения сигналов; один основан на опосредованном пероксидазой отложении гаптенизированного или фторхромированного тирамида, называемом каталитическим репортерным отложением (CARD), а другой — TSA (Bobrow et al ., 1992; Speel et al ., 1998). В системе TSA HRP ковалентно связана с Fab-фрагментами анти-дигоксигенина, что обеспечивает отложение биотинилированного тирамида, который впоследствии обнаруживается с помощью AP, конъюгированного со стрептавидином.Однако этот протокол может улучшить или не улучшить отношение сигнал / шум, в зависимости от типа исследования.

Протокол гибридизации in situ (ISH)

---

Хранение образцов

Сохранение РНК

Сохранение РНК затруднено из-за присутствия фермента РНКазы. Этот фермент обнаружен на стеклянной посуде, в реагентах, на операторах и их одежде. РНКаза быстро разрушает любую РНК в клетке или сам зонд РНК, поэтому пользователи должны убедиться, что они используют стерильные методы, перчатки и растворы для предотвращения загрязнения зонда или тканевой РНК РНКазой.

Общее хранение образцов при использовании замороженных срезов

Для достижения наилучших результатов на более старых предметных стеклах не храните предметные стекла в сухом виде при комнатной температуре. Вместо этого храните в 100% этаноле при -20 ° C или в пластиковой коробке, покрытой сарановой пленкой, при -20 ° C или -80 ° C. При таком хранении слайды сохраняются на несколько лет.

---

Выбор зонда

РНК-зонды

РНК-зонды должны иметь длину 250–1 500 оснований; пробы длиной около 800 оснований демонстрируют наивысшую чувствительность и специфичность.Матрицы транскрипции должны обеспечивать транскрипцию как зонда (антисмысловая цепь), так и РНК отрицательного контроля (смысловая цепь). Для этого клонируйте в вектор с противоположными промоторами. Круглые шаблоны необходимо линеаризовать перед изготовлением зонда, хотя можно также использовать шаблоны ПЦР.

ДНК-зонды

ДНК-зонды обеспечивают высокую чувствительность для гибридизации in situ. Они не так сильно гибридизуются с целевыми молекулами мРНК по сравнению с зондами РНК, поэтому формальдегид не следует использовать в промывках после гибридизации.

Специфичность зонда важна. Если точная нуклеотидная последовательность мРНК или ДНК в клетке известна, можно сконструировать точный комплементарный зонд. Если> 5% пар оснований не комплементарны, зонд будет только слабо гибридизоваться с целевой последовательностью. Это означает, что зонд с большей вероятностью будет вымыт во время этапов промывки и обнаружения и может быть некорректно обнаружен.

---

РНК-зонд, меченный дигоксигенином (DIG), протокол гибридизации in situ

В этом протоколе описывается использование DIG-меченых одноцепочечных РНК-зондов для обнаружения экспрессии интересующего гена в парафиновых срезах.

1) Депарафинизация

Для замороженных срезов начните с шага 2. Если используются парафиновые срезы, фиксированные формальдегидом, продолжайте с этого шага.

Перед тем, как продолжить, слайды необходимо депарафинизировать и регидратировать. Неполное удаление парафина может привести к плохому окрашиванию среза.

Поместите предметные стекла в штатив и выполните следующие промывки:

• Ксилол: 2×3 мин.
• Ксилол 1: 1 со 100% этанолом: 3 мин.
• 100% этанол: 2×3 мин.
• 95% этанол: 3 мин.
• 70% этанол: 3 мин.
• 50% этанол: 3 мин.
• Промыть холодной водопроводной водой

Держите предметные стекла в водопроводной воде до извлечения антигена.С этого момента слайды не могут высохнуть, так как это вызовет неспецифическое связывание антител и сильное фоновое окрашивание.

2) Получение антигена

Расщепление с 20 мкг / мл протеиназы К в предварительно нагретом 50 мМ Трис в течение 10–20 минут при 37 ° C. Время инкубации и концентрация протеиназы К могут потребовать оптимизации.

Мы рекомендуем попробовать титрование протеиназы К для определения оптимальных условий. Недостаточное переваривание снизит сигнал гибридизации, а чрезмерное переваривание приведет к плохой морфологии ткани, что очень затруднит локализацию сигнала гибридизации.Оптимальная концентрация протеиназы К будет варьироваться в зависимости от типа ткани, длины фиксации и размера ткани.

3) Промойте предметные стекла 5 раз в дистиллированной воде.

4) Погрузите предметные стекла в ледяную 20% (об. / Об.) Уксусную кислоту на 20 секунд. Это делает клетки проницаемыми, обеспечивая доступ к зонду и антителу.

5) Обезвоживайте предметные стекла, промывая в течение примерно 1 мин на каждую промывку в 70% этаноле, 95% этаноле и 100% этаноле, затем сушите на воздухе.

6) Добавьте 100 мкл раствора для гибридизации на каждое слайд.

9024 2505050.1%

Реагент	Конечная концентрация	Количество, необходимое для использования на 1 мл раствора
Формамид	50%	500 мкл
Соли	5x раствор	5x	50 мкл
Декстрансульфат	10%	100 мкл
Herapin	20 U / мкл	10 мкл
10 мкл
1 мкл

Солевой раствор (20x)

• 4 М NaCl
• 100 мМ ЭДТА
• 200 мМ Трис-HCl pH 7,5
• 100 мМ Nah3PO4.2h3O

  0 9156 900

  Раствор Денхардта (100x)
  • 10 г фиколла
  • 10 г ПВП (поливинилпирролидина)
  • 10 г бычьего сывороточного альбумина (БСА)
  • 500 мл стерильного dh3O

  7) 1 инкубируйте предметные стекла для в увлажненной камере гибридизации при желаемой температуре гибридизации.Типичные температуры гибридизации находятся в диапазоне 55–62 ° C.

  8) Разведите зонды в растворе для гибридизации в пробирках для ПЦР. Нагрейте при 95 ° C в течение 2 минут в блоке ПЦР, чтобы денатурировать РНК или ДНК-зонд. Немедленно охладите на льду, чтобы предотвратить повторный отжиг.

  9) Слить гибридизационный раствор. Добавьте 50–100 мкл разбавленного зонда на секцию, чтобы покрыть весь образец. Инкубируйте в увлажненной камере для гибридизации при 65 ° C в течение ночи. Накройте образец покровным стеклом, чтобы предотвратить испарение.

  На этом этапе РНК-зонд будет гибридизоваться с соответствующей мРНК, или ДНК-зонд будет гибридизоваться с соответствующей клеточной ДНК. Оптимизируйте температуру гибридизации в зависимости от последовательности используемого зонда, а также от типа клетки или ткани. Эту температуру следует оптимизировать для каждого анализируемого типа ткани.

  Оптимальная температура гибридизации для зондов зависит от процента оснований, присутствующих в целевой последовательности. Концентрация цитозина и гуанина в последовательности являются важными факторами.

  10) Стойкие промывки

  Параметры раствора, такие как температура, концентрация соли и детергента, можно изменять для устранения неспецифических взаимодействий.

  Для приготовления 1 л 20-кратного солевого раствора цитрата натрия (SSC)

  • 175,3 г NaCl (3 M)
  • 88,2 г цитрата натрия
  • 800 мл стерильного dh3O
  • Довести pH до 5 с помощью лимонной кислоты, заполнить до 1 л и автоклавировать

  
  Промыть 1

  • 50% формамид в 2x SSC
  • 3×5 мин, 37–45 ° C

  Смыть избыток зонда и гибридизационного буфера при более высоких температурах (до 65 ° C) в течение коротких периодов времени.Если оставить слишком долго, это может смыть слишком много гибридизированной РНК / ДНК зонда.

  Промывка 2

  • 0,1–2x SSC
  • 3×5 мин, 25–75 ° C

  
  На этом этапе удаляется неспецифическая и / или повторяющаяся гибридизация ДНК / РНК.

  Следуйте этим рекомендациям, чтобы оптимизировать температуру и концентрацию соли для стирки в строгих условиях:

  • Для очень коротких ДНК / РНК-зондов (0.5–3 т.п.н.) или очень сложных зондов, температура промывки должна быть ниже (до 45 ° C), а жесткость — ниже (1–2x SSC).
  • Для однолокусных или больших зондов температура должна быть около 65 ° C, а строгость должна быть высокой (ниже 0,5x SSC).
  • Температура и строгость должны быть самыми высокими для повторяющихся зондов (таких как повторения альфа-спутников).
    

  11) Дважды промыть MABT (буфер малеиновой кислоты, содержащий Твин 20) в течение 30 минут при комнатной температуре.MABT мягче, чем PBS, и больше подходит для обнаружения нуклеиновых кислот.

  Для приготовления 5x исходного раствора МАБТ

  • 58 г малеиновой кислоты
  • 43,5 г NaCl
  • 55 г Tween-20
  • 900 мл воды

  Довести pH до 7,5, добавив основание Tris. Потребуется около 100 г. Довести конечный объем до 1 л.

  12) Высушите предметные стекла.

  13) Перенесите в увлажненную камеру и добавьте 200 мкл блокирующего буфера в каждую секцию (MABT + 2% BSA, молоко или сыворотка).Блокировать на 1-2 часа при комнатной температуре.

  14) Слить блокирующий буфер. Добавьте антитело против метки в блокирующем буфере в необходимом разведении. Рекомендуемую концентрацию / разведение см. В таблице данных антител. Инкубируйте 1-2 часа при комнатной температуре.

  15) Промойте предметные стекла 5х10 мин при помощи МАБТ при комнатной температуре.

  16) Вымойте слайды 2×10 мин каждое при комнатной температуре буфером для предварительного окрашивания (100 мМ Tris pH 9,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2).

  17) Для обнаружения флуоресценции перейдите к шагу 18. Для других форм обнаружения верните слайды в увлажненную камеру и следуйте инструкциям производителя по проявлению цвета.

  18) Ополосните предметные стекла в дистиллированной воде.

  19) Высушите слайды на воздухе в течение 30 мин. Промыть в 100% этаноле и тщательно высушить на воздухе.

  20) Установите с помощью монтажного раствора DePeX.

  ---

  
  Другие полезные ресурсы

  Гибридизация на месте

  00:00:07.18 Меня зовут Джо Галл.
  00: 00: 09.18 Я нахожусь в Институте Карнеги в Балтиморе
  00: 00: 12.13 в Отделении эмбриологии,
  00: 00: 14.15, и я собираюсь сегодня поговорить с
  00: 00: 16.15 о in situ гибридизация.
  00: 00: 19.06 Гибридизация in situ — это метод
  00: 00: 22.16, с помощью которого меченая одноцепочечная молекула
  00: 00: 25.26 РНК или ДНК в растворе
  00: 00: 29.09 гибридизуется с иммобилизованным
  00 : 00: 32.12 Одноцепочечная РНК или ДНК в ткани
  00:00:35.18 или срез ткани.
  00: 00: 37.24 И, имея метку на молекуле в растворе,
  00: 00: 43.20 в конечном итоге гибрид становится видимым
  00: 00: 46.20 в срезе ткани
  00: 00: 48.11, если смотреть в микроскоп.
  00: 00: 50.14 Этот метод гибридизации in situ
  00: 00: 52.10 впервые был успешно осуществлен
  00: 00: 54.07 в моей лаборатории в 1968 году.
  00: 00: 57.07 Происхождение гибридизации in situ,
  00 : 00: 59.29 по крайней мере, как интеллектуальный феномен,
  00:01:03.28 происходит из экспериментов
  00: 01: 05.27, которые проводились намного раньше,
  00: 01: 09.06 в основном около 1950 года,
  00: 01: 11.19 двумя исследователями по имени Кунс и Каплан,
  00: 01: 14.24 и т. Д. Кунс и Каплан сделали
  00: 01: 17.20, чтобы разработать технику иммуноцитохимии,
  00: 01: 22.05 метод, с помощью которого
  00: 01: 25.01 флуоресцентное антитело
  00: 01: 28.16 заставляло связываться с антиген
  00: 01: 31.21, иммобилизованный в срезе ткани,
  00:01:34.07, чтобы можно было определить положение специфических белковых молекул
  00: 01: 37.28 в клетках
  00: 01: 41.16 по их флуоресценции.
  00: 01: 43.14 Здесь показано современное изображение.
  00: 01: 46.13 Это ядерное тело из ооцита саламандры.
  00: 01: 52.01 Здесь показано иммуноокрашивание
  00: 01: 54.27 с антителом против белка Coilin.
  00: 02: 00.01 Иммуноокрашивание антителом
  00: 02: 02.01 против белка Sm.
  00: 02: 04.13 Это слайд, который я сделал совсем недавно,
  00:02:07.21 с использованием техники Куна и Каплана.
  00: 02: 11.14 Дело, однако, в том, что
  00: 02: 14.15 они показали, что можно обнаружить
  00: 02: 16.28 специфические белковые молекулы в тканях,
  00: 02: 19.12, и это произошло мне кажется, что было бы замечательно
  00: 02: 21.15, если бы можно было обнаружить специфические нуклеиновые кислоты в тканях.
  00: 02: 26.16 На самом деле, я меньше думал о нуклеиновых кислотах
  00: 02: 29.09, поскольку думал о генах,
  00: 02: 31.19, потому что я изучал гигантские хромосомы
  00:02:33.28 саламандр, показанных здесь,
  00: 02: 36.14 или гигантские хромосомы дрозофилы,
  00: 02: 38.22, показанные здесь,
  00: 02: 40.11 и в этих хромосомах
  00: 02: 42.18 можно увидеть полосы
  00: 02: 45.10, которые в то время считались генами
  00: 02: 48.18 людьми, работавшими с ними.
  00: 02: 50.24 Теперь мы знаем, что это немного сложнее, чем это,
  00: 02: 53.11, но казалось, что у нас есть ткань
  00: 02: 58.11 — хромосома —
  00:03:00 .19 где специфические гены
  00: 03: 02.22 — специфические нуклеиновые кислоты …
  00: 03: 05.12 должно быть возможно сделать что-то сравнимое с методом иммунофлуоресцентного окрашивания
  00: 03: 08.15
  00: 03: 11.12 для обнаружения специфические гены в этих тканях.
  00: 03: 15.12 Итак, на самом деле,
  00: 03: 19.17 Я довольно долго держал это в голове,
  00: 03: 23.20, и стало возможным думать о таких вещах
  00:03 : 27.23 в начале 1960-х,
  00: 03: 29.29, когда следователи обнаружили, что
  00:03:33.14 можно было бы взять двухцепочечную ДНК,
  00: 03: 36.27 денатурировать ее до одинарных цепей,
  00: 03: 40.02 и иммобилизовать эти цепи
  00: 03: 42.24 на нитроцеллюлозном фильтре.
  00: 03: 46.21 Это было сделано парой исследователей
  00: 03: 50.03 по имени Гиллеспи и Шпигельман,
  00: 03: 52.07, и они показали, что
  00: 03: 54.11 с денатурированной ДНК на filter,
  00: 03: 57.11 затем можно было бы гибридизировать с ней радиоактивную РНК
  00: 04: 00.02
  00:04:02.18 и фактически определяют количественно
  00: 04: 05.17 количество конкретной генной последовательности на фильтре.
  00: 04: 09.07 Итак, я подумал,
  00: 04: 11.21 «Что ж, если они могут сделать это на фильтре
  00: 04: 13.13, вы должны иметь возможность делать это на слайде».
  00: 04: 15.17 Итак, я попытался денатурировать ДНК на предметном стекле,
  00: 04: 21.18, то есть в клетках — ядрах —
  00: 04: 25.07, которые были выдавлены на предметное стекло,
  00:04: 27.28, и я обнаружил, что могу достаточно адекватно денатурировать ДНК,
  00:04:31.13, не повреждая ткань,
  00: 04: 33.24, но затем, когда я попытался гибридизировать с ней радиоактивную РНК
  00: 04: 36.02,
  00: 04: 38.15 я не получил сигнала.
  00: 04: 40.16 В данном случае
  00: 04: 42.11 Я искал радиоактивность с помощью авторадиографии,
  00: 04: 45.28, то есть путем покрытия ткани
  00: 04: 48.11 тонким слоем фотоэмульсии.
  00: 04: 51.16 и поиск зерен серебра в эмульсии
  00: 04: 54.27, вызванных радиоактивностью зонда.
  00: 04: 58.24 Как я уже сказал, ничего не произошло,
  00: 05: 01.00, и я более или менее отказался от этой техники.
  00: 05: 04.29 Это было с начала до середины 1960-х годов.
  00: 05: 08.21 Совершенно случайно,
  00: 05: 14.06 произошел перерыв в исследованиях, которые я и другие
  00: 05: 16.14 проводили
  00: 05: 19.24 на ооцитах саламандры и ооцитах лягушки.
  00: 05: 22.17, и мы обнаружили, что
  00: 05: 27.03 в ядре гигантского ооцита,
  00: 05: 29.19, которое показано здесь,
  00:05:32.06, полученный из этого большого ооцита, здесь
  00: 05: 36.06 — ооцит — это яйцо лягушки —
  00: 05: 39.06 внутри этого гигантского ядра
  00: 05: 42.07, конечно же, хромосомы,
  00:05 : 44.08 но, кроме того, мы обнаружили, что
  00: 05: 47.20 было от нескольких сотен до тысячи ядрышек,
  00: 05: 50.25 этих круглых тел, показанных здесь, на этом конкретном слайде.
  00: 05: 55.08 Интересная вещь об этих ядрышках
  00: 06: 00.22, которую мы обнаружили, заключалась в том, что
  00:06:03.13 они содержали ДНК,
  00: 06: 05.23, и именно гены
  00: 06: 08.07, кодирующие рибосомную РНК
  00: 06: 10.19, находились в этих ядрышках.
  00: 06: 13.05 Это была самая необычная ситуация.
  00: 06: 14.23 — ДНК вне хромосом,
  00: 06: 17.06, но из работы
  00: 06: 19.09 было совершенно ясно, что она была проведена. в моей лаборатории
  00: 06: 21.09, а также в лаборатории Дона Брауна
  00: 06: 23.09 и Оскара Миллера
  00:06:25.21 что вне этих ядрышек была внехромосомная ДНК
  00: 06: 28.18.
  00: 06: 32.00 И я изучил происхождение этой ДНК
  00: 06: 35.04 и обнаружил, что
  00: 06: 38.18 на самом деле она была синтезирована в определенное время
  00: 06: 41.19 в ранней истории образования ооцита,
  00: 06: 47.15, и в этих ранних клетках можно было видеть
  00: 06: 52.11 — ранние ядра —
  00: 06: 54.11, что здесь была шапка ДНК …
  00 : 06: 57.18 и вот здесь шапка
  00:07:00.09 вы можете увидеть хромосомы здесь
  00: 07: 02.18 и здесь внизу вы можете увидеть хромосомы в этом ядре …
  00: 07: 06.10 итак, в этих двух ядрах
  00: 07: 08.09 у вас есть хромосомы,
  00: 07: 10.03, но тогда у вас есть огромный предел
  00: 07: 13.09 дополнительной ДНК, которая на самом деле
  00: 07: 16.21 была рибосомными генами
  00: 07: 19.26, которые каким-то образом были …
  00 : 07: 22.02 каким-то образом вышло из хромосомы
  00: 07: 23.24 и амплифицировалось, чтобы дать вам
  00: 07: 26.14 эту конкретную последовательность,
  00:07:28.14 очень большой объем этой конкретной последовательности.
  00: 07: 31.13 Итак, мне пришло в голову, что если бы была какая-то возможность
  00: 07: 33.18 провести гибридизацию in situ, то
  00: 07: 35.23 это был тот случай, который бы сработал.
  00: 07: 38.05 Итак, я взял радиоактивную рибосомную РНК
  00: 07: 42.04 и гибридизировал ее с клетками этого типа,
  00: 07: 46.18, и мне было очень приятно
  00: 07: 48.29 увидеть в Самые первые эксперименты
  00: 07: 51.22 показали, что мы получили хорошую гибридизацию in situ.
  00: 07: 54.02 Здесь эта ячейка черная
  00: 07: 56.09 из-за зерен серебра в фотоэмульсии
  00: 07: 59.19, подвергшихся радиоактивному облучению
  00: 08: 02.20 гибридизирующего зонда. .
  00: 08: 04.19 Итак, это случай, когда мы гибридизировали
  00: 08: 09.22 радиоактивную РНК — рибосомную РНК —
  00: 08: 12.26 с рибосомной ДНК в клетке.
  00: 08: 18.08 Итак, это сразу привело к публикации
  00: 08: 20.20 с моей студенткой Мэри Лу Пардью,
  00:08:23.05, который присоединился ко мне в этой работе,
  00: 08: 27.00, и это была первая успешная гибридизация in situ.
  00: 08: 30.28 Теперь мы хотели попробовать
  00: 08: 33.02 на какой-нибудь другой ткани или ДНК,
  00: 08: 35.20, но было очень мало примеров,
  00: 08: 38.05, потому что в то время это
  00: 08: 41.09 невозможно выделить конкретные последовательности ДНК или РНК.
  00: 08: 47.07 То, что позволило нам взглянуть на другую ситуацию,
  00: 08: 51.04 было получено в результате проведенных исследований
  00:08:54.15 на ДНК мыши,
  00: 08: 57.14, и исследователи обнаружили, что
  00: 09: 00.09, когда ДНК мыши была прядена
  00: 09: 02.19 в градиенте хлорида цезия (CsCl),
  00: 09: 04.02 отделилась на две фракции:
  00: 09: 05.29 — главный пик и пик спутника
  00: 09: 09.08 — называется спутниковым просто потому, что
  00: 09: 11.26 имеет немного другую плотность
  00: 09: 14.17 и отделен от большая часть ДНК.
  00: 09: 18.08 Мы взяли ДНК этого спутника,
  00: 09: 21.03 сделали его радиоактивным,
  00:09:23.07, и мы гибридизировали его с хромосомами мыши,
  00: 09: 26.01, совершенно не зная, будет ли он гибридизоваться,
  00: 09: 29.13 был ли он вообще в хромосомах, если на то пошло,
  00: 09: 31.28 он мог иметь был вирусом или какой-либо другой инфекционной частицей,
  00: 09: 34.28, но мы были очень рады видеть, что
  00: 09: 38.19 сателлитная ДНК мыши гибридизируется
  00: 09: 41.04 конкретно с одной частью каждой хромосомы,
  00 : 09: 45.00 и вы можете увидеть на этом слайде
  00:09:47.26 видно, что каждая из хромосом
  00: 09: 50.15 имеет немного радиоактивности
  00: 09: 53.00 в самом конце хромосомы.
  00: 09: 55.04 Эта область хромосомы
  00: 09: 57.05 была известна как гетерохроматин,
  00: 09: 59.11 и была известна цитологически
  00: 10: 02.03 как специфическая область хромосомы
  00: 10: 05.06 в течение ряда лет.
  00: 10: 07.17 Это сразу же привело нас к мысли
  00: 10: 10.09, что мы можем попробовать ту же технику
  00:10:13.19 и получите аналогичные результаты
  00: 10: 15.29, глядя на хромосомы Drosophila,
  00: 10: 18.16 и хромосомы Drosophila
  00: 10: 20.26 были особенно интересны
  00: 10: 22.25, потому что это было известно из генетики.
  00: 10: 25.22, что все гены находятся в
  00: 10: 31.27, так называемых эухроматических областях хромосомы,
  00: 10: 35.04, а именно в этой области отсюда до отсюда или здесь …
  00 : 10: 41.14 эти более светлые окрашенные области …
  00: 10: 43.15 все гены были расположены в этих регионах,
  00:10:45.13, и из генетики
  00: 10: 47.20 было известно, что гетерохроматические области, такие как здесь и здесь,
  00: 10: 51.28, лишены генов.
  00: 10: 54.16 Итак, нам пришло в голову, что Drosophila
  00: 10: 57.18 должна иметь много ДНК
  00: 11: 00.15, аналогичную сателлитной ДНК мыши.
  00: 11: 03.23 Итак, мы центрифугировали эту ДНК
  00: 11: 07.05 в градиенте хлорида цезия,
  00: 11: 09.18, и действительно обнаружили
  00: 11: 11.25, что у дрозофилы было много спутниковой ДНК. .
  00:11:14.29 У этого вида Drosophila virilis
  00: 11: 17.06, над которым мы работали
  00: 11: 19.28, было три огромных спутниковых пика
  00: 11: 22.06 — здесь, здесь и здесь —
  00: 11: 25.15 и дополнительно к главному пику ДНК, показанному здесь.
  00: 11: 31.04 Итак, мы взяли сателлитную ДНК,
  00: 11: 33.27 мы сделали ее радиоактивной,
  00: 11: 35.27 мы гибридизировали ее с хромосомами,
  00: 11: 37.19 и, конечно же, она гибридизовалась как показано
  00: 11: 40.19 на этих изображениях здесь,
  00: 11: 42.01 для гетерохроматических областей.
  00: 11: 44.03 И это было особенно интересно,
  00: 11: 46.06, как я уже сказал,
  00: 11: 48.03, потому что он показал, что гетерохроматические области
  00: 11: 50.29, которые мы знали из генетики, не имели генов. ,
  00: 11: 53.14 состояла из ДНК сателлитного типа,
  00: 11: 57.22, которая, как показали наши более поздние исследования,
  00: 12: 00.16 состояла из очень простых последовательностей
  00: 12: 03.07, которые не могли кодировать genes,
  00: 12: 07.28, или были неспособны быть генами и кодировать белки.
  00: 12: 11.17 Итак, метод гибридизации in situ
  00: 12: 13.27 на этом этапе был ограничен
  00: 12: 16.09 в значительной степени последовательностями
  00: 12: 18.24, которые присутствовали в большом количестве в клетках.
  00: 12: 21.18 В конце концов,
  00: 12: 24.21 стало возможным благодаря появлению все более и более чувствительных зондов,
  00: 12: 27.17 в частности, были разработаны более поздние методы
  00: 12: 31.22 для изготовления флуоресцентных зондов
  00: 12: 34.04 для гибридизации in situ …
  00: 12: 36.24 Итак, гибридизация in situ,
  00:12:38.17 ISH или «ish»,
  00: 12: 40.09 превратились в флуоресцентную гибридизацию in situ,
  00: 12: 42.16 или «рыба», FISH,
  00: 12: 45.08, что обычно практикуется сейчас.
  00: 12: 48.22 И методы стали
  00: 12: 51.02 все более и более чувствительными,
  00: 12: 52.27 до такой степени, что в настоящее время
  00: 12: 54.13 можно обнаружить человека,
  00:12 : 56.22 одиночные молекулы ДНК и РНК в срезах тканей.

  Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

  Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

  ---

  Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

  Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

  ---

  Почему этому сайту требуются файлы cookie?

  Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

  ---

  Что сохраняется в файле cookie?

  Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

  Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

  Гибридизация на месте | Колледж ветеринарной медицины МГУ

  Гибридизация in situ (ISH) — это метод, в котором используются меченые ДНК или РНК-зонды для обнаружения молекул с достаточно похожими комплементарными последовательностями в срезах ткани.В VDL MSU ISH в основном используется для идентификации и локализации инфекционных агентов в очагах поражения, но его также можно использовать для локализации генов и их транскриптов. По сути, любая последовательность нуклеиновой кислоты может быть специфически обнаружена с помощью таких зондов. Мы также создаем зонды для исследовательских целей.

  Использование ISH в лаборатории

  Мы используем меченые дигоксигенином олигонуклеотидные зонды, которые стабильны, легко синтезируются и гибридизуются только со специфической целевой нуклеиновой кислотой.В первую очередь мы используем зонды для обнаружения вирусов, риккетсий и грибков. В то время как большинство наших зондов являются видоспецифичными, некоторые из них носят более общий характер. Путем первого скрининга тканей с помощью обычного зонда мы можем искать более широкий спектр агентов и использовать видоспецифические зонды на более позднем этапе, чтобы определить интересующий агент. ISH также можно использовать для локализации мРНК и определения уровней экспрессии конкретных транскриптов, таких как онкогены.

  Доступные в настоящее время зонды включают следующее:

  • Вирус алеутской болезни
  • Blastomyces dermatitidis
  • Вирус герпеса собак
  • Вирус герпеса собак
  • Coccidioides immitis
  • Вирус восточного конского энцефалита
  • Вирус герпеса кошек
  • Нитчатые грибковые организмы
  • Родовые Chlamydophila и Chlamydophila psittaci
  • Generic Leishmania и Leishmania infantum
  • Generic papillomavirus (также может обнаруживать вирус папилломы при саркоиде лошадей или плоскоклеточных пролиферативных поражениях у кошек)
  • Цирковирус свиней
  • Вирус вирусной геморрагической болезни
  • Вирус Западного Нила

  Преимущества для клиентов

  В целом ISH считается трудоемким и капризным методом, требующим больших затрат времени.Благодаря нашей современной автоматизированной технологии мы можем завершить весь протокол за один день, получая стабильные результаты. Тест может проводиться на стандартном фиксированном формалином материале, залитом парафином. Используя ISH, мы не зависимы от антител, которые могут перекрестно реагировать, и можем нацеливаться на любой инфекционный агент или ген, последовательность которых известна. Мы также можем разработать и утвердить анализ, который соответствует вашим конкретным потребностям, если вы предоставите нам последовательность конкретного инфекционного агента или интересующего гена и надлежащие контрольные ткани.

  Гибридизация in situ (ISH) и флуоресценция гибридизация in situ (FISH)

  Введение

  In situ Гибридизация (ISH) — это метод, который позволяет локализовать и обнаруживать последовательности нуклеиновых кислот в структурно интактных клетках или морфологически сохраненных участках тканей. Флуоресценция in situ гибридизация (FISH) — это разновидность ISH, в которой используются флуоресцентные зонды, связывающие части хромосомы, для демонстрации высокой степени комплементарности последовательностей.Основные принципы FISH и всех других методов гибридизации in situ и одинаковы, за исключением того, что в одном из них используется флуоресцентный зонд для обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей в клетках и тканях. Они отличаются от иммуногистохимии, которая обычно локализует белки в срезах тканей. In situ Гибридизация может выполняться на различных мишенях, включая РНК внутри клеток, ДНК в препаратах метафазных хромосом, полученных из митотических клеток, или ДНК в интерфазных ядрах из клеток в немитотических фазах клеточного цикла.Помимо преимуществ обнаружения в морфологическом контексте, гибридизация in situ и стала популярной также из-за ее высокой чувствительности при обнаружении нуклеиновых кислот. In situ Гибридизация широко использовалась для исследовательских приложений, включая клиническую цитогенетику, картирование генов, биологию опухолей и исследования эволюции хромосом.

  Выбор датчика

  Зонд имеет решающее значение для гибридизации in situ с , и правильный зонд может помочь вам в достижении ваших целей.При выборе зонда для гибридизации in situ с вы должны учитывать не только типы зонда, но и его метку.

  По существу, существует четыре типа зондов, которые можно использовать для проведения гибридизации in situ и . Информация о типах датчиков приведена в таблице 1.

  Таблица1 Информация о типах датчиков

  Типы датчиков	Преимущества	Недостатки
  Двухцепочечные ДНК (дцДНК) зонды	Стабильный, доступный, доступный	Самогибридизация, менее чувствительная, перед гибридизацией требуется денатурация
  Одноцепочечные ДНК (оцДНК) зонды	Стабильный, с ним легче работать, более специфичный, устойчивый к РНКазам, лучше проникает в ткани, без самогибридизации	Отнимает много времени, дорого
  РНК-зонды (рибозонды)	Более высокая термическая стабильность, лучшее проникновение в ткани, более специфичный, низкий фоновый шум от РНКазы	Чувствительность к РНКазам
  Синтетические олигонуклеотиды	Экономичный, стабильный, доступный, более простой в работе, более специфичный, устойчивый к РНКазам, лучшее проникновение в ткани, лучшая воспроизводимость	Знайте информацию о нуклеотидной последовательности

  Чтобы «увидеть», где зонд связался в ваших клетках или срезе ткани, вы должны прикрепить метку к зонду перед гибридизацией.Наличие метки не должно мешать реакции гибридизации. Существует множество методов маркировки, которые можно разделить на два типа: радиоактивные изотопы и нерадиоактивные метки.

  Зонды с радиоактивной меткой, включая ³ H, ³⁵ S, ³² P, все еще широко используются из-за их высокой активности, которая позволяет обнаруживать транскрипты в небольших количествах. При использовании радиоактивной метки необходимо принимать во внимание меры по удалению отходов и локализации, и необходимо отметить, что полезный срок хранения вашего меченого зонда по своей природе зависит от периода полураспада радионуклеотида.

  С другой стороны, нерадиоактивные, успешно используемые с in situ гибридизацией , включают дигоксигенин (DIG), биотин и флуоресцентные метки. Зонд с нерадиоактивной меткой можно использовать немедленно или хранить при -20 ° C, поскольку эти нерадиоактивные метки не имеют собственной кинетики «распада».

  Процесс гибридизации in situ с можно разделить на следующие этапы:

  Рисунок 1.Процесс геномной гибридизации in situ и (С. П. Браммер, и др. , 2013)

  1. Подготовка слайда

  Для распространения хромосом достаточно слайдов, очищенных спиртом / эфиром (1: 1). Однако, поскольку срезы ткани могут быть потеряны во время процедуры, для этих срезов требуются слайды, активируемые полилизином или глутаровым альдегидом, желатин, хром, алюминий.

  2. Сбор и фиксация образцов

  Чтобы сохранить морфологию, свежую ткань следует как можно быстрее удалить и зафиксировать.С химической точки зрения обычные осаждающие фиксаторы (такие как уксусная кислота / этанол и фиксатор Карнуа) не рекомендуются из-за опасений, что такие фиксаторы сделают клеточный матрикс непроницаемым или изменят целевую нуклеиновую кислоту до такой степени, что гибридизация будет быть уменьшенным или предотвращенным.

  Для метафазного распространения хромосом обычно достаточно фиксации метанола / уксусной кислоты. Для срезов тканей, залитых парафином, всегда используется формалиновая фиксация. Секции криостата, зафиксированные на 30 мин 4% формальдегидом или фиксатором Буэна, успешно использовались, а также для фиксации паров параформальдегида.До сих пор не существует протокола фиксации, который можно было бы использовать для всех субстратов, и протоколы фиксации должны быть оптимизированы для различных приложений.

  3. Вложение и раздел

  После фиксации образец заливается парафином или ОКТ для длительного хранения и разделения для последующей процедуры. Залитые ткани можно разделить на тонкие срезы с помощью микротома или замораживающего микротома (15-20 мкм).

  4.Проницаемость

  Известно, что последовательности ДНК или РНК-мишени окружены белками, и обширное сшивание этих белков маскирует нуклеиновую кислоту-мишень, что создает препятствия для хорошей инфильтрации зонда. Следовательно, процедуры пермеабилизации имеют решающее значение для гибридизации in situ и . Три основных реагента, используемых для повышения проницаемости ткани, — это протеиназа, HCl и детергенты.

  Обработка протеазой служит для увеличения доступности мишени за счет переваривания белков, окружающих нуклеиновую кислоту-мишень.Для удаления этих белков обычно используется протеиназа К или проназа. Оптимальная концентрация должна быть определена, но нормальная начальная концентрация составляет 1 мкг / мл. Инкубацию необходимо тщательно контролировать, потому что, если пищеварение зайдет слишком далеко, вы можете в конечном итоге разрушить большую часть ткани или целостности клеток.

  В некоторых протоколах рекомендуется 20-30-минутная обработка 0,2 М HCl. Хотя точное действие кислоты неизвестно, экстракция белков и гидролиз целевой последовательности могут способствовать снижению уровня фонового окрашивания.

  Triton X-100, SDS и другие детергенты часто используются для повышения проницаемости мембран путем извлечения липидов мембраны. Обычно это не требуется для ткани, залитой воском, но критически важно для неповрежденных клеток или срезов криостата.

  5. Предварительная обработка / прегибридизация

  Предварительная обработка / прегибридизация обычно проводится для снижения фонового шума.

  • Инактивация эндогенных ферментов

  При использовании фермента (например, пероксидазы или щелочной фосфатазы) визуализируйте метку, эндогенные ферменты, которые могут привести к высокому фону, должны быть инактивированы.Этого можно достичь с помощью пероксидазы, обработав образец 1% метанолом H ₂ O ₂ в течение 30 минут. Что касается щелочной фосфатазы, к раствору субстрата можно добавить левамизол, однако в этом нет необходимости, поскольку остаточная активность щелочной фосфатазы обычно теряется во время гибридизации.

  • Лечение РНКазой (по желанию)

  Обработка РНКазой служит для удаления эндогенной РНК и уменьшения фона в реакции гибридизации.Его проводят путем инкубации препаратов в РНКазе, свободной от ДНКазы (100 мкг / мл), в 2xSSC (SSC = 150 мМ NaCl, 15 мМ цитрат натрия, pH 7,4) при 37 ° C в течение 60 мин.

  • Предгибридизация (необязательно)

  Предварительная гибридизация осуществляется путем инкубации ткани или среза в растворе, который содержит все компоненты гибридизационной смеси за вычетом зонда. Не все протоколы нуждаются в этом шаге.

  6.Гибридизация

  Гибридизация зависит от способности зонда отжигаться с дополнительной целевой цепью чуть ниже его точки плавления (Tm). Кроме того, состав раствора для гибридизации важен для контроля эффективности процесса гибридизации. Факторами, влияющими на гибридизацию зонда с целевой последовательностью, являются:

  • концентрация одновалентных катионов
  • температура
  • органические растворители
  • pH
  • другие компоненты, такие как оцДНК, тРНК, оцДНК и полиА

  7.Моет

  Несвязанные или неплотно связанные зонды удаляются путем промывки. Параметры раствора, такие как температура, концентрация соли и детергента, можно изменять для устранения неспецифических взаимодействий.

  8. Обнаружение

  Как упоминалось выше, радиоактивно меченные зонды обнаруживаются либо фотопленкой, либо фотографической эмульсией. Для зондов без радиоактивной метки существует два метода: прямой и непрямой:

  • Прямые методы : Детектируемый репортер связывается с зондом напрямую, так что гибриды зонд-мишень могут быть обнаружены под микроскопом сразу после промывок после гибридизации.
  • Непрямые методы: Если имеются антитела против репортерных молекул, рекомендуются непрямые процедуры. Косвенные методы требуют, чтобы зонд содержал репортерную молекулу, введенную ферментативно или химически, которую можно обнаружить с помощью аффинной цитохимии. Зонды, меченные биотином, DIG или FITC, обычно обнаруживаются специфическими антителами.

  Узнайте больше об услуге гибридизации in situ (ISH) и флуоресценции in situ гибридизации (FISH).

  Ссылка:

  1. Related Post Промывание носа физраствором грудничку: польза, техника и меры предосторожности Отпадение пупка у новорожденных: сроки, уход и возможные осложнения Как сшить пеленки для новорожденного своими руками: пошаговая инструкция Развитие мелкой моторики у дошкольников: эффективные упражнения и игры Размеры пеленок для новорожденных: как выбрать оптимальный вариант Лечение насморка у новорожденных: эффективные методы и рекомендации педиатров Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт