Анализы в KDL. Кислая фосфатаза
Кислая фосфатаза – фермент, относящийся к группе фосфатаз – веществ, которые участвуют в метаболизме, отщепляя фосфатную группу органических соединений. Проявляет активность в кислой среде. Содержится в лизосомах клеток различных тканей организма. Наибольшее количество кислой фосфатазы сосредоточено в простате у мужчин, а также в печени, в костной ткани и клетках крови — эритроцитах и тромбоцитах.
Анализ на содержание кислой фосфатазы в крови имеет важное значение в диагностике и при мониторинге лечения рака предстательной железы; кроме того, ее существенное повышение может указывать на гемолитическую анемию, миеломную болезнь, дисфункцию паращитовидных желез, а также некоторые наследственные заболевания (например, болезнь Гоше).
При наличии карциномы простаты уровень кислой фосфатазы в крови повышается в десятки раз в сравнении с нормой за счет ее производства раковыми клетками. До открытия PSA этот тест был основным маркером рака предстательной железы, однако сейчас он используется как вспомогательный, поскольку кислая фосфатаза проявляет себя уже на поздних стадиях процесса.
В каких случаях обычно назначают исследование?
В основном анализ на кислую фосфатазу назначают в сочетании с другими тестами при подозрении на опухоль простаты. Также он используется как вспомогательный тест в диагностике заболеваний печени и почек, костной системы, нарушений кроветворения, рака молочной железы.
Что именно определяется в процессе анализа?
Измеряется концентрация кислой фосфатазы в сыворотке крови колориметрическим методом.
Что означают результаты теста?
Небольшое и умеренное повышение уровня кислой фосфатазы возможно при аденоме и доброкачественной гиперплазии предстательной железы, может указывать на простатит, инфаркт простаты, перенесенные хирургические и иные манипуляции с предстательной железой. Значительное повышение уровня кислой фосфатазы у мужчин в первую очередь наблюдается при раке простаты (карцинома) и его метастазах,
У женщин кислая фосфатаза может повышаться при онкологических заболеваниях, в том числе при метастазах, особенно в костную ткань.
У обоих полов концентрация фермента может расти при заболеваниях печени, почек, паращитовидных желез, кроветворной системы, остеопорозе, болезни Гоше, Нимана – Пика.
Сроки выполнения теста.
Обычно результат анализа можно получить через 1-2дня после сдачи крови.
Как подготовиться к анализу?
Следует придерживаться общих правил подготовки к взятию крови из вены. С подробной информацией можно ознакомиться в соответствующем разделе статьи.
Кислая фосфатаза
Кислая фосфатаза – фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты (К.Ф. 3.1.3.1). Присутствует во многих клетках и тканях, в условиях in vitro проявляет максимальную активность в кислой среде. У мужчин половина кислой фосфатазы, определяемой в сыворотке крови, вырабатывается в предстательной железе, фермент поступает в кровь также из клеток печени, разрушающихся тромбоцитов и эритроцитов – основных источников кислой фосфатазы в крови у женщин. Определение активности кислой фосфатазы в крови проводят в основном для диагностики рака предстательной железы.
Показания к исследованию. Заболевания предстательной железы (диагностика и мониторинг течения карциномы простаты, определение наличия метастазов в костной ткани).
Особенности взятия и хранения образцов. Взятие крови производится не менее чем через 48 ч после цистоскопии, ректальных исследований, диагностических и лечебных процедур, проведенных на предстательной железе.
Методы исследования.
Для определения активности кислой фосфатазы в сыворотке крови наиболее часто применяют колориметрический метод с использованием в качестве субстрата альфа-нафтилфосфата.
Повышенные значения
- Рак предстательной железы;
- простатит;
- последствия диагностических и лечебных манипуляций;
- болезнь Педжета;
- метастатические поражения костей;
- миеломная болезнь;
- болезнь Гоше;
- болезнь Нимана-Пика.
Фосфатаза кислая (КФ)
Фосфатаза кислая (КФ)Фосфатаза кислая (КФ) – это фермент, который ускоряет распад органических эфиров фосфорной кислоты. «Работает» фермент в кислой среде, откуда и происходит его название.
Обнаружить кислую фосфатазу можно практически в каждой ткани человеческого организма: в предстательной железе, в клетках крови – лейкоцитах, эритроцитах, тромбоцитах, в печени, селезёнке, костях, даже в грудном молоке.
Фермент представляет собой смесь трёх основных его изоферментов:
фосфомоноэстераза II содержится преимущественно в предстательной железе, оптимум рН для её функционирования – 4,6. Активность этого изофермента подавляется тартратом (солью винной кислоты), ионами железа и фтора. Фермент проявляет свою активность в организме только после полового созревания.
фосфомоноэстераза III локализуется в паренхиматозных органах – печени, селезёнке, оптимум рН – 3,4 – 4,4.
фосфомоноэстераза IV содержится в эритроцитах, оптимум рН — 5,2 – 6,2.
В крови взрослого мужчины кислая фосфатаза состоит из предстательной КФ (около 50%), печени, тромбоцитов и эритроцитов.
В крови женщин общую кислую фосфатазу формируют фракции КФ печени, эритроцитов и тромбоцитов.
Определение уровня кислой фосфатазы используют для диагностики рака предстательной железы. Если опухоль растёт только в пределах простаты, то кислая фосфата может оставаться в пределах нормы (повышается лишь у четверти пациентов), но появление метастазов сопровождается значительным повышением кислой фосфатазы практически во всех случаях (около 90). При больших размерах опухоли пальцевой осмотр предстательной железы сопровождается выделением КФ в кровь. Поэтому анализ не рекомендуют сдавать в течение двух дней после осмотра, массажа биопсии простаты, катетеризации мочевого пузыря, цистоскопии.
Оценка уровня КФ применяется и для дифференциальной диагностики патологии костей скелета. Если в крови повышена только щелочная фосфатаза, это указывает на заболевание костной системы, а если появляются метастазы в костях при раке предстательной железы, то в крови повышены и кислая фосфатаза, и щелочная.
Кислая фосфатаза повышена при усиленном разрушении клеток крови – тромбоцитов, эритроцитов при гемолитических анемиях.
Показания к выполнению анализа
Заболевания предстательной железы.
Дифференциальная диагностика метастазов рака простаты с патологией костной системы.
Подготовка к исследованию
После выполнения осмотра или инструментального исследования предстательной железы или уретры и мочевого пузыря должно пройти не менее 2 дней.
От последнего приёма пищи до взятия крови временной промежуток должен быть более восьми часов.
Накануне исключить из рациона питания жирные продукты, не принимать спиртные напитки.
За 1 час перед взятием крови на анализ нельзя курить.
Не рекомендуется сдавать кровь сразу после выполнения флюорографии, рентгенографии, УЗИ, физиотерапевтических процедур.
Кровь на исследование сдают утром натощак, исключается даже чай или кофе.
Допустимо пить обычную воду.
За 20-30 минут до исследования пациенту рекомендован эмоциональный и физический покой.
Материал для исследования
Венозная кровь.
Интерпретация результатов
Норма:
- дети до 14 лет — 5,5 Ед/л,
- женщины — 5,5 Ед/л,
- мужчины — 6,5 Ед/л.
Повышение:
- Рак предстательной железы.
- Метастазы рака предстательной железы.
- Состояние после осмотра или инструментального обследования простаты.
- Множественная миелома.
- Миелопролиферативные заболевания.
- Болезнь Гоше.
- Тромбоэмболия.
- Лихорадочное состояние.
Снижение:
- Тромбоцитопении.
— кислая фосфатаза — Биохимия
Кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2.) катализирует гидролиз органических эфиров фосфорной кислоты, содержится почти во всех органах и тканях человека, особенно богаты кислой фосфатазой предстательная железа, клетки крови (эритроциты, лейкоциты и тромбоциты), селезенка, печень, почки, кости, фермент обнаружен также в женском молоке. В предстательной железе активность фермента 100 раз выше, чем в других тканях.
Фермент представляет собой смесь трех основных разновидностей ферментов, обозначаемых римскими цифрами II, III, IV. В предстательной железе содержится, главным образом, фосфомоноэстераза II, ее оптимум pH 4,6, отличительным свойством является чувствительность к ингибированию тартратом (соль винной кислоты), ионами фтора и железа. В паренхиматозных органах локализуется фосфомоноэстераза III, оптимум pH 3,4‑4,4. Фосфомоноэстераза IV, с оптимумом pH=5,2‑6,2, обнаружена в эритроцитах. Методами электрофореза в каждой ткани выявляется до 7 изоферментных фракций.
Методы определения кислой фосфатазы те же, что и для щелочной фосфатазы, но различаются по используемым буферным системам и значению pH. Чаще всего применяется цитратный буфер, обладающий способностью активировать кислую фосфатазу предстательной железы.
Определение активности кислой фосфатазы
с субстратом п‑нитрофенилфосфатом
Принцип
Кислая фосфатаза расщепляет п‑нитрофенилфосфат с образованием нитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание. Активность изофермента предстательной железы ингибируется тартратом.
Нормальные величины
| Сыворотка (с п‑нитрофенилфосфатом) | 67‑167 нмоль/с·л |
| мужчины | 2,5‑11,7 МЕ |
| женщины | 0,3‑9,2 МЕ |
| Сыворотка (с п‑нитрофенилфосфатом) | 0-16,7 нмоль/с·л |
| мужчины | 0,2‑3,5 МЕ |
| женщины |
Клинико‑диагностическое значение
Определение активности кислой фосфатазы служит важным диагностическим критерием карциномы предстательной железы. При отсутствии метастазов повышенная активность обнаруживается у больных в 25% случаев, а при метастазировании опухоли в 80‑90%. Динамика активности фермента в крови зависит от эффективности проводимой терапии. Определение активности кислой фосфатазы может служить для дифференциальной диагностики заболеваний костной системы (повышение активности только щелочной фосфатазы) от метастазов рака предстательной железы в костную ткань (увеличение активности и щелочной, и кислой фосфатаз). Возрастание активности фермента выявляется также при повышенном разрушении тромбоцитов, гемолитических болезнях, некоторых случаях миеломной болезни.
Анализ на кислую фосфотазу. Норма значения.| CMDAUTO |
Тест на кислую фосфатазу рекомендуется сдавать для диагностики рака предстательной железы, а также при оценке метастазирования злокачественного процесса в кости. Хирургическое удаление опухоли автоматически снижает уровень фермента.
Биологическая роль кислой фосфатазы
Кислотная фосфатаза (КФ) представляет собой фермент, который присутствует у человека, животных и растений. Несмотря на «вездесущность», четкая роль этого вещества до конца не ясна: некоторые исследования показали, что уровень фермента может иметь диагностическое значение при различных заболеваниях.
Считается, что биологически активное вещество ускоряет отщепление фосфатных групп от молекул. Отличием от щелочной фосфатазы (ЩФ) служит предпочитаемая кислотность: ЩФ более активна к щелочной среде, в то время как КФ – в кислой.
Кислая фосфатаза содержится преимущественно в предстательной железе у мужчин. Также может присутствовать в селезенке, печени и костном мозге у представителей обоих полов. При неправильном функционировании какого-либо из перечисленных органов уровень фермента в крови резко повышается.
К примеру, при метастазировании опухоли в кости активность КФ повышается в 80-90% случаев, а потому показатель фосфатазы считается достаточно достоверным индикатором процесса.
Референсные значения исследования
Кислая фосфатаза в анализе крови может колебаться в зависимости от пола и возраста; нормой считается содержание менее 5,5-6,6 ЕД/л.
Повышенные уровни фермента свидетельствуют о следующих заболеваниях и состояниях:
- Рак предстательной железы, в том числе с метастазами в кости
- Болезни почек
- Болезнь Педжета, при которой кости размягчаются и деформируются
- Анемия, или малокровие; состояние характеризуется пониженным количеством эритроцитов и гемоглобина
- Тромбоцитопения и гемолитические заболевания
- Простатит – воспаление предстательной железы
- Тромбофлебит
- Болезнь Гоше, возникающая при нарушении липидного обмена
- Гиперпаратиреоз – повышенная активность паращитовидной железы
- Множественная миелома – злокачественная опухоль, поражающая плазматические клетки костного мозга
Кислая фосфатаза повышена при снижении притока крови к предстательной железе, но также может быть вызвана стимуляцией простаты при проведении пальцевого исследования, колоноскопии или постановки клизмы.
Заказать услугу можно >>> Здесь <<<
Анализ крови на кислую фосфатазу — цены от 130 руб. в Москве, 639 адресов
Определение кислой фосфатазы (энзимодиагностика) — биохимический метод исследования, который применяется для выявления активности фермента. Данный анализ имеет самостоятельную диагностическую ценность, но часто применяется в комплексе с определением щелочной фосфатазы. Исследование уровня кислой фосфатазы в крови назначают, чтобы подтвердить или опровергнуть наличие рака предстательной железы, метастазов в костную систему. Обычно для анализа используется сыворотка венозной крови. У здоровых детей и женщин в норме активность кислой фосфатазы колеблется от 0 до 5,5 Ед/л, а у мужчин от 0 до 6,5 Ед/л. Срок выполнения анализа — 1 сутки.
Определение кислой фосфатазы (энзимодиагностика) — биохимический метод исследования, который применяется для выявления активности фермента. Данный анализ имеет самостоятельную диагностическую ценность, но часто применяется в комплексе с определением щелочной фосфатазы. Исследование уровня кислой фосфатазы в крови назначают, чтобы подтвердить или опровергнуть наличие рака предстательной железы, метастазов в костную систему. Обычно для анализа используется сыворотка венозной крови. У здоровых детей и женщин в норме активность кислой фосфатазы колеблется от 0 до 5,5 Ед/л, а у мужчин от 0 до 6,5 Ед/л. Срок выполнения анализа — 1 сутки.
Кислая фосфатаза (КФ) является ферментом, который катализирует реакцию ортофосфорных моноэфиров. Данная реакция происходит с отщеплением фосфатной группы, имеющей оптимальную активность в кислотной среде. Энзим включает в себя фосфатазы, которые проявляют оптимальную активность при рН меньше 7.0. Эти ферменты могут обнаруживаться в клетках разных тканей снаружи или внутри лизосом. Считается, что наиболее высокая концентрация кислых фосфатаз содержится в предстательной железе, поэтому ее называют простатическим изоферментом. Также кислая фосфатаза может находиться в клетках селезенки, гепатоцитах, красных кровяных тельцах, тромбоцитах или костном мозге.
КФ в кровеносном русле считается главным диагностическим маркером рака простаты. Показатели активности, которые выше нормы, обычно встречаются при онкологии без метастазов у 25% всех пациентов, страдающих данным заболеванием. Более 85% больных с метастазами имеют анализы, демонстрирующие значительное увеличение показателей. Поэтому в качестве единоразового анализа КФ в сыворотке исследуется для постановки диагноза на первом этапе обследования. Для определения динамики активности энзима и назначения правильного лечения необходимо проводить исследования периодически. Важное место данное исследование занимает не только в клинической медицине, но и в судебной практической экспертизе. Энзим очень активен в сперме, поэтому судмедэксперты применяют анализ для идентификации различных пятен.
Показания и противопоказания
Выявление активности КФ в кровеносном русле часто применяется для определения и оценки динамики роста злокачественной опухоли простаты у мужчин. Активность энзима в крови повышена более чем у 50% пациентов, имеющих рак простаты, особенно с метастазами в кости (фермент производят неопластические клетки). При метастазировании активность КФ увеличивается в 50-60 раз от верхней границы нормы. В случае, когда опухоль находится только в простате, активность фермента повышается незначительно или находится в пределах нормальных значений. Поэтому даже если активность КФ не выше референсных цифр, у пациента может быть обнаружена опухоль предстательной железы в доброкачественной форме.
Периодическая диагностика активности КФ в крови показана для определения гиперпаратиреоза, болезни Педжета, злокачественной опухоли молочной железы или ее метастазирования в кости. Анализ точно выявляет наличие костных метастазов, так как кислая фосфатаза содержится в остеокластах. Исследование рекомендуется проводить и для установки диагноза у пациентов с подозрением на болезнь Гоше, миелоцитарную лейкемию, заболевание Нимана-Пика и другие гематологические патологии.
Противопоказано проведение анализа в течение 15 дней после пальцевого ректального обследования при раке простаты. Если опухоль больших размеров, то осмотр предстательной железы обычно сопровождается выделением кислой фосфатазы в кровеносное русло. По этой же причине рекомендуется воздержаться от исследования в течение нескольких дней после цистоскопии, массажа или биопсии предстательной железы, катетеризации мочевого пузыря, рентгенографии, физиотерапии или УЗИ.
Подготовка к анализу и забор материала
Для исследования используется сыворотка крови. При заборе материала для анализа важно избегать гемолиза. Если произошло разрушение эритроцитов, то нужно сделать повторный забор крови. Срок проведения анализа — 1 рабочий день. Перед забором биохимического анализа пациент должен отказаться от пищи, не употреблять сладкие и газированные напитки, кофе. Последний прием еды должен быть не позднее 19.00. Пациенту важно не курить и не принимать спиртные напитки за день перед анализом, постараться избегать стрессовых ситуаций и чрезмерной физической нагрузки. Забор крови предпочтительно производить в утреннее время до приема лекарственных средств.
Метод определения энзима включает использование цитратного буфера и отличается от диагностики активности щелочной фосфатазы по значению pH. Определение активности фермента происходит по следующему принципу: активированная кислая фосфатаза расщепляет п-нитрофенилфосфат, образуя в щелочной среде фосфат и п-нитрофенол. В качестве субстрата используется бесцветный эфир фосфорной кислоты. В щелочной среде п-нитрофенол окрашен в желтый цвет. Активность фосфатазы оценивается по интенсивности окрашивания раствора. Данный биохимический метод достаточно быстрый (в течение суток) и точный. Результат выдают пациенту на следующий день после забора крови (время зависит от метода исследования и загруженности лаборантов).
Нормальные значения
Референсные значения показателей КФ: дети до 14 лет — от 0 до 5,5 Ед/л; пациенты женского пола (с 15 лет) — от 0 до 5,5 Ед/л; пациенты мужского пола (с 15 лет) — от 0 до 6,5 Ед/л.
Повышенная активность кислой фосфатазы обнаруживается в макрофагах или остеокластах. У мужчин активность КФ в сыворотке складывается из активности простатической формы фосфатазы и ферментов, локализующихся в гепатоцитах и разрушенных клетках (тромбоцитах и эритроцитах). У женщин фермент в сыворотке поступает только из эритроцитов, гепатоцитов и тромбоцитов. При доброкачественной природе опухоли простаты могут быть незначительные отклонения от референсных значений, поэтому в этом случае исследование не имеет диагностической ценности.
Изменение уровня КФ
Причины повышения кислой фосфатазы в крови — злокачественная опухоль предстательной железы, возникновение метастазов и проникновение их в кости, аденома простаты, остеопороз, ручные и инструментальные методы обследования железы, болезни Гоше и Нимана-Пика, патологии гепатобилиарной и ретикулоэндотелиальной системы или тромбоэмболии. В некоторых ситуациях причины повышения кислой фосфатазы в крови могут остаться неизвестными, в этом случае важно провести тщательное обследование организма и сдать дополнительные анализы.
Причиной снижения кислой фосфатазы в крови является тромбоцитопения, характеризующаяся понижением количества тромбоцитов и возникновением кровотечений. Также причиной снижения кислой фосфатазы в крови или ее полного отсутствия может стать удаление предстательной железы.
Лечение отклонений от нормальных показателей
Исследование на определение кислой фосфатазы имеет огромное диагностическое значение в клинической практике, так как с его помощью можно отследить динамику роста опухоли и начало метастазирования в кости. Для установления причины отклонений от нормальных показателей следует обратиться к специалисту, который назначит инструментальные методы диагностики и установит точный диагноз. Обычно лечение прописывают не только на основании показателя активности КФ, а после полного обследования и определения роста фермента в динамике.
Если провести анализ вовремя, то лечащий врач — терапевт, уролог или онколог может назначить адекватную терапию, которая поспособствует повышению качества и продолжительности жизни. Врач должен помочь пациенту подобрать правильную диету, нормализовать питьевой режим (не менее 2 литров воды в сутки), определить дозирование и кратность физической нагрузки.
Биохимический анализ на фосфатазу кислую в Сочи (Адлер) в медицинской лаборатории Оптимум
Биохимический анализ на фосфатазу кислую
Фосфатазы – белки-ферменты, относящиеся к классу гидролаз. Они катализируют отщепление фосфатной группы от ортофосфорных органических эфиров. В зависимости от оптимального значения pH, необходимого для работы фермента, фосфатазы подразделяют на щелочные и кислые. Кислая фосфатаза активно действует в среде с pH
Фермент находится в лизосомах клеток, наибольшее количество – в тканях предстательной железы. Фосфатазу можно назвать специфичным для простаты белком. Кроме того, кислая фосфатаза содержится в гепатоцитах, остеокластах, тромбоцитах, клетках селезенки и костного мозга, эритроцитах. В крови мужчин 50% активности фосфатазы составляет простатическая и 50% — фермент печени и кровяных клеток. У женщин вся кислая фосфатаза сыворотки крови происходит из печени, селезенки и кровяных телец.
Для чего проводят анализ на кислую фосфатазу?
Кислая фосфатаза важна в клинической диагностике: это основной маркер онкологического заболевания предстательной железы. При злокачественной опухоли простаты, особенно при метастазировании, показатель повышается в 60% случаев. Доброкачественные опухоли на концентрацию фосфатазы в крови, как правило, не влияют.
Анализ на кислую фосфатазу проводят при диагностике рака простаты и для дальнейшего мониторинга динамики показателя: это позволит установить, насколько эффективна проводимая терапия.
Для точной диагностики карциномы простаты определения в сыворотке крови кислой фосфатазы недостаточно, требуется сдать также общий анализ мочи, взять на исследование секрет предстательной железы и провести лабораторный тест на простатический антиген (общий и свободный).
Подготовка к анализу на кислую фосфатазу
Кровь рекомендуется сдавать утром (в период с 8 до 11 часов) натощак (не менее 8 и не более 14 часов голодания). Забор крови проводится из вены (исследуется сыворотка крови).
Референтные значения фосфатазы кислой в анализе крови
У мужчин: 0,5–11,7 ЕД/л.
У женщин: 0,3–9,2 ЕД/л.
У детей: 0,2–5,5 ЕД/л.
Интерпретация результатов анализа крови на фосфатазу кислую
Нормальные значения кислой фосфатазы не исключают наличие онкологического заболевания. Если опухоль локализована строго в предстательной железе, концентрация фосфатазы может увеличиваться незначительно или не увеличиваться вовсе. Это следует учитывать при диагностике заболеваний простаты.
Если активность фермента повышена, специалист может предположить наличие опухолевого процесса в предстательной железе.
Однако высокая концентрация фосфатазы в крови не обязательно свидетельствует о наличии опухоли простаты. Показатель повышается после физикального исследования предстательной железы или цистоскопии. Поэтому анализ можно проводить по истечении 48 часов после данных процедур. Исказить данные также могут анемия, инфекции, тромбоцитопения, недавний приступ стенокардии и заболевания печени.
Другие причины повышенного уровня фосфатазы связаны с заболеваниями кровеносной, костной и ряда других систем:
- тромбоэмболия;
- болезнь Гоше;
- гемолитическая болезнь;
- болезнь Педжета;
- миелоцитарная лейкемия;
- болезнь Нимана-Пика;
- остеопороз;
- метастазы в костной ткани;
- множественная миелома;
- гиперпаратиреоидизм.
Кислая фосфатаза — PubMed
Кислая фосфатаза — это распространенный лизосомальный фермент, который гидролизует органические фосфаты при кислом pH. Хотя постпубертеральные эпителиальные клетки предстательной железы содержат исключительно высокую концентрацию кислой фосфатазы, клеточные компоненты костей, селезенки, почек, печени, кишечника и крови также содержат этот фермент. Открытие того факта, что клетки карциномы предстательной железы часто сохраняют высокую концентрацию кислой фосфатазы, характерную для нормальной постпубертатной железы, привело к признанию первого клинически полезного онкомаркера.Признание того, что сыворотка пациентов со злокачественными новообразованиями предстательной железы часто содержит повышенную концентрацию этого фермента, привело к настойчивым усилиям по идентификации источника, точному количественному определению уровня кислой фосфатазы в сыворотке и определению клинической значимости этих уровней. Для измерения кислой фосфатазы использовались различные ферментативные и иммунологические методы. В прошлом для повышения специфичности и чувствительности использовали различные субстраты и ингибиторы.В настоящее время акцент сместился на развитие радиоиммуноанализа и противоиммуноэлектрофореза в попытке улучшить эти параметры. Оценка их эффективности требует дальнейшего тестирования и оценки. Клиническое значение нормальной и аномальной кислой фосфатазы сыворотки постоянно переоценивается. Чтобы максимизировать ценность лабораторных измерений, необходимо знать и учитывать клинический и патологический статус пациента, методы, используемые при получении и хранении образца крови, и процедуры, используемые при анализе.Традиционно считалось, что сывороточная кислотная фосфатаза простаты происходит из клеток рака простаты и используется для определения стадии заболевания. До недавнего времени повышенные уровни сыворотки считались признаком экстрапростатического заболевания и исключали поражения, ограниченные простатой. Предполагается, что повышение уровня кислой фосфатазы у пациентов с диссеминированным заболеванием или неспособность вернуться к норме при лечении указывает на плохой прогноз.Однако однозначных подтверждений действительности этих утверждений нет. Новые иммунологические методы измерения кислой фосфатазы могут значительно изменить наши нынешние представления о ее роли как маркера опухоли.
Уровень кислотной фосфатазы в крови — обзор
Это наследственное заболевание, характеризующееся множеством фенотипических отклонений, наиболее значительными из которых являются ломкость костей и переломы (рис. 19). Обычно он наследуется по аутосомно-доминантному типу, хотя задокументированы аутосомно-рецессивные паттерны (McKusick, 1972a).Клинически пациенты обычно делятся на две группы: «врожденные» и «поздние», первая определяется наличием переломов при рождении, синих склер, «червячных костей» и тяжелых деформаций скелета; последнее из-за отсутствия переломов при рождении с деформациями, возникающими в результате повторных переломов в более позднем возрасте. Хотя заболевание описывается в медицинской литературе почти 200 лет, патогенез до сих пор не определен. Нарушения молекулярной организации кожи (Pentinnen et al ., 1975; Stevenson et al. ., 1970) и костный (Teitelbaum et al ., 1974; Lindenfelser et al ., 1972) коллаген, а также изменения в метаболизме неколлагеновых костных белков (Dickson et al. ., 1975).
Рис. 19. Скелетные аномалии у 6-летнего ребенка (слева) с несовершенным остеогенезом врожденного и 30-летнего мужчины (справа) с поздним несовершенным остеогенезом. Пациент с «поздней» формой считался «идиопатическим остеопорозом позвоночника» до тех пор, пока специфическая аномалия скелета не была установлена путем сканирующего электронного микроскопического анализа биопсии гребня подвздошной кости.
Поражение скелета характеризуется накоплением окрашиваемых гликозоаминогликанов, аномальной ориентацией коллагеновых волокон (рис. 20) и увеличением резорбции кости (Ramser et al. ., 1966b; Jett et al. ., 1966. ; Робишон и Жермен, 1968). Изменения костного метаболизма при несовершенном остеогенезе часто приводят к повышению щелочной и кислой фосфатаз в плазме, а также гидроксипролина и гликозоаминогликанов в моче (Rosenberg et al ., 1977). «Врожденная» форма заболевания часто осложняется рецидивирующими переломами и длительными периодами иммобилизации, причем последние часто в наибольшей степени способствуют развитию остеопороза и повышенной хрупкости костей (рис. 19). Предлагаемые схемы лечения прогрессирующей остеопении, которая неизменно возникает у большинства молодых людей с этим расстройством, включают терапию фторидом натрия (Pierog et al ., 1969; Aeschlimann et al ., 1966) и андрогенами (Hernberg, 1952a; Малдауни и др. ., 1964) и оксид магния (Solomons and Styner, 1969), но клинический ответ на эти агенты был менее чем адекватным (Cattell and Clayton, 1968; Riley and Jowsey, 1973; Shoenfeld et al. ., 1975). Сообщалось о положительных ответах у сорта «tarda» на кальцитонин (Goldfield et al. ., 1972; Castells et al. ., 1972, 1974; Caniggia and Gennari, 1972b; Rosenberg et al. ., 1977). При «поздней» форме заболевания снижение частоты переломов также наблюдается после полового созревания (Bryan et al ., 1956), тогда как заболеваемость повышается после менопаузы. Заболевание можно спутать с «идиопатическим ювенильным остеопорозом». Однако при этом последнем скелетном заболевании склеры имеют нормальный цвет, остеопороз обычно локализуется в позвоночнике, а семейный анамнез переломов и возникающих в результате деформаций отрицательный. Несовершенный остеогенез у детей может также имитировать ювенильную форму «гипофосфатазии» (Rathbun, 1943), хотя низкий уровень циркулирующей щелочной фосфатазы, рахитические изменения скелета и фосфорилэтаноламинурия, сопровождающие синдром гипофосфатазии, должны сделать заболевание легко идентифицируемым (см. Том II). 7).Из-за чрезвычайно широкого диапазона фенотипической выраженности наследственного дефекта соединительной ткани при несовершенном остеогенезе заболевание у взрослых часто может быть неправильно диагностировано как обычный случай «постменопаузального» или «идиопатического» остеопороза (рис. 19). Подробный исторический семейный опрос и оценка биопсии кости часто могут оказаться весьма полезными для установления правильного диагноза.
Рис. 20. Изображение костного коллагена при биопсии гребня подвздошной кости здорового ребенка (слева) и человека того же возраста с несовершенным остеогенезом врожденного остеогенеза (справа) на сканирующем электронном микроскопе.В отличие от нормальных, коллагеновые фибриллы пациентов с несовершенным остеогенезом не уплотняются в волокна, а средняя ширина волокна составляет нормы (× 870).
(Перепечатано из Тейтельбаума и др. ., 1974; с разрешения авторов и издателя.) Copyright © 1974CRS0020060398.TIF
% PDF-1.4 % 48 0 объект > эндобдж 45 0 объект [/ CalGray>] эндобдж 46 0 объект [/ CalRGB>] эндобдж 78 0 объект > поток application / pdf
Кислая фосфатаза сыворотки
Изображения: Ссылки по теме на внешние сайты (из Bing)
Онтология: Кислая фосфатаза (C0001109)
| Определение (MSH) | Фермент, катализирующий превращение моноэфира ортофосфорной кислоты и воды в спирт и ортофосфат.EC 3.1.3.2. |
| Концепции | Аминокислота, пептид или белок ( T116 ) , Фермент ( T126 ) |
| MSH | D000135 |
| SnomedCT | 253 |
| LNC | LP15316-0, MTHU003553 |
| Английский | Кислая фосфатаза, ортофосфорно-моноэфирная фосфогидролаза (кислотный оптимум), кислая фосфатаза [химическое вещество / ингредиент], кислая фосфатаза, кислая фосфатаза, кислая фосфомоноэстераза, ACP — кислая фосфатаза, кислая фосфатаза (вещество) |
| Шведский | Сурт фосфатас |
| Чешский | кисела фосфатаса |
| Финский | Hapan fosfataasi |
| Русский | КИСЛАЯ ФОСФОМОНОЭСТЕРАЗА, КИСЛАЯ ФОСФАТАЗА, ФОСФАТАЗА КИСЛАЯ, КИСЛАЯ ФОСФАТАЗА, КИСЛАЯ ФОСФОМОНОЭСТЕРАЗА, ФОСФАТАЗА КИСЛАЯ |
| Хорватский | КИСЕЛА ФОСФАТАЗА |
| Польский | Фосфатаза квасна |
| Японский | 酸性 ホ ス フ ァ タ ー ゼ, 酸性 フ ォ フ ァ タ ー ゼ, 酸性 ホ ス モ ノ エ ス テ ラ ー ゼ, 酸 フ ォ ス フ ァ ー, 酸 ホ ス フ ァ 900 タ ー ゼ |
| Испанский | fosfatasa ácida (sustancia), fosfatasa ácida, fosfomonoesterasa ácida, Fosfatasa Ácida |
| Французский | Ацидная фосфатаза, Ацидфосфомоноэстераза, Кислая фосфатаза, Фосфатаза, ацид, Фосфомоноэстераза ацид |
| Немецкий | Фосфатаза, зауре, зауре фосфатаза |
| Итальянский | Fosfatasi acida |
| Португальский | Фосфатаза Ацида |
Кислая фосфатаза Артикул
Введение
Кислая фосфатаза (AP) — это фермент, катализирующий гидролиз сложных эфиров фосфорной кислоты в кислой среде.Эта химическая реакция важна для различных метаболических процессов. Следовательно, AP существует в нескольких биологических царствах, включая растения, животных, грибы и даже бактерии. Исследования показали, что AP играет ключевую роль в различных физиологических процессах у человека, включая резорбцию костей, иммунную защиту, удаление патогенов, регуляцию роста эпителия и транспорт железа, среди прочего. [1]
Патофизиология
Семейство кислой фосфатазы обычно делится на две основные группы в зависимости от наличия или отсутствия биядерного металлического центра.Первая группа (металлогидролазы) имеет характерный пурпурный цвет из-за переноса заряда с остатка тирозина на Fe (III), поэтому они называются пурпурными кислыми фосфатазами (PAP). Их также можно отличить от другой группы кислых фосфатаз по их нечувствительности к ингибированию тартратом, поэтому они были названы устойчивыми к тартрату кислыми фосфатазами (TRAP). [1] [2]
Клиническая значимость
В качестве маркера: Кислая фосфатаза обычно обнаруживается в крови на уровне ≤ 2 нг / мл.Из-за его секреции из разных тканей он является неспецифическим маркером и, следовательно, более ценен для мониторинга реакции на терапию и прогноза, чем для диагностики. Рак простаты — один из самых распространенных видов рака у мужчин во всем мире. Специфическая форма AP, чувствительная к ингибированию тартрата, называемая секреторной фосфатазой кислоты простаты, обычно секретируется тканью простаты. Однако злокачественная ткань предстательной железы имеет тенденцию к его избыточной экспрессии. Фактически, 95% пациентов с раком простаты имеют высокий уровень АД, особенно если он метастазирует в кости.Таким образом, он был основным сывороточным маркером рака простаты, используемым при скрининге и постановке диагноза, но недавно был заменен более специфическим маркером — простатоспецифическим антигеном (PSA). Тем не менее, измерение кислой фосфатазы простаты по-прежнему используется в судебных делах, поскольку она активно выделяется в семенной жидкости и может использоваться для определения семенной жидкости в делах правоохранительных органов. [3]
Костная ткань — это динамическая ткань, которая постоянно сбалансированным образом формируется и резорбируется.Остеокласты, клетки, ответственные за резорбцию кости, экспрессируют другую изоформу кислой фосфатазы. Действительно, несколько исследований показали, что кислая фосфатаза напрямую участвует в резорбции кости. Костный AP отличается от AP простаты тем, что является устойчивой к тартрату кислой фосфатазой (TRAP). При остеопорозе, наиболее распространенном заболевании костей у людей, баланс резорбции / образования нарушается в пользу резорбции. Было предложено несколько сывороточных маркеров резорбции костей, таких как гидроксипролин мочи, общий пиридинолин мочи и костный сиалопротеин.Было обнаружено, что TRAP является точным, устойчивым к гемолизу и имеет минимальную повседневную изменчивость. Поэтому было предложено контролировать реакцию на терапию, но она все еще находится в стадии разработки. Кроме того, было показано, что агенты, которые ингибируют TRAP, такие как фторид, улучшают и даже обращают вспять случаи остеопороза. [4] [5]
Кислая фосфатаза также прошла оценку при злокачественных новообразованиях. Волосатоклеточный лейкоз (HCL) — хроническое лимфопролиферативное заболевание, при котором неопластические В-клетки проникают в костный мозг, селезенку и кровь, что приводит к спленомегалии, анемии и рецидивирующим инфекциям.Лейкозные клетки в HCL содержат внутрицитоплазматический фермент TRAP. У большинства пациентов аспираты из крови или костного мозга можно проверить на наличие TRAP, который оказался весьма чувствительным и специфичным для HCL, что помогает в обнаружении и диагностике. [6] Кроме того, при метастазировании в кости несколько типов злокачественных новообразований могут вызвать резорбцию кости в несколько этапов, включая более высокую экспрессию AP. Таким образом, его можно использовать в качестве серологического и гистологического прогностического маркера, а также для мониторинга реакции на лечение.[7] [8] Еще одним клиническим проявлением, в котором может быть полезен АП, является болезнь Гоше (БГ), наиболее распространенная лизосомная болезнь накопления, наблюдаемая во всем мире. БГ обычно проявляется необъяснимой гепатоспленомегалией и панцитопенией. Это поддается лечению путем постоянной замены дефицитного фермента глюкоцереброзидазы. Производитель сыворотки, называемый «хитотриозидаза», обычно используется для мониторинга бремени болезни и реакции на замену ферментов. Однако, когда это нормально, вместо этого можно использовать TRAP в качестве маркера. [9]
В качестве терапевтической мишени: Как отмечалось выше, AP как маркер в значительной степени заменен более чувствительными и специфическими маркерами; однако в последнее десятилетие он вызвал больший интерес как мишень для иммунотерапии рака.Новая стратегия уничтожения раковых клеток заключается в использовании противораковых вакцин, которые стимулируют адаптивную иммунную систему (как и любая другая вакцина) к клеткам-мишеням с определенными антигенами, экспрессируемыми на раковых клетках. Эти антигены могут быть опухолеспецифичными, экспрессироваться исключительно на раковых клетках или неспецифическими антигенами, экспрессируемыми как на нормальных, так и на раковых клетках; однако они намного выше экспрессируются в раковых клетках, таких как фосфатаза кислоты простаты. [10]
Sipuleucel-T — иммунологическое средство, состоящее из слитого белка, сочетающего АП простаты с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором.Процесс включает извлечение аутологичных дендритных клеток пациента с помощью лейкафереза, которые затем загружаются Sipuleucel-T ex vivo и затем повторно вводятся пациенту. Дендритные клетки будут стимулировать Т-клетки к клеткам-мишеням, экспрессирующим АП простаты. Три ключевых плацебо-контролируемых клинических исследования фазы 3 показали, что введение сипулеуцела-Т каждые две недели в общей сложности 3 дозами у пациентов с андрогеннезависимым раком простаты увеличивало среднюю выживаемость на четыре месяца или более = 0.01) по сравнению с плацебо. Поэтому он был одобрен FDA для лечения гормонорезистентного метастатического рака простаты. [11] Более того, в настоящее время проводится несколько клинических испытаний для оценки эффективности сипулеуцел-Т на ранних стадиях рака простаты, а также его эффективности в сочетании с другими другими химиотерапевтическими агентами. Также разрабатываются другие иммунотерапевтические стратегии, нацеленные на кислую фосфатазу простаты, такие как использование плазмидных ДНК-вакцин, кодирующих АП простаты. Затем носители транспортируют эти ДНК-вакцины к месту назначения in vivo , антигенпрезентирующим клеткам, которые могут вызывать иммунный ответ.Джонсон и соавторы разработали ДНК-вакцину против АР и использовали в качестве носителей аттенуированные Listeria monocytogenes , которые избирательно инфицируют антигенпрезентирующие клетки. Два клинических испытания фазы I и доклинические исследования на моделях грызунов показали многообещающие результаты, и в настоящее время проводится рандомизированное плацебо-контролируемое клиническое испытание фазы II для оценки этой вакцины. [12]
Улучшение результатов команды здравоохранения
Для лечения препаратом Sipuleucel-T требуется многопрофильная бригада, состоящая из онколога, фармацевта, медсестер инфузионного отделения и медсестры клиники для координации лечения.Процесс начинается со сбора крови пациента с помощью лейкафереза. Затем образец крови поступает на производственный объект, где собранные антигенпрезентирующие клетки (APC) инкубируются с рекомбинантной кислой фосфатазой простаты и GM-CSF, что приводит к активации APC. Затем активированные APC упаковываются и возвращаются в инфузионный центр, где они вводятся пациенту. Утвержденная схема лечения включает в себя инфузии каждые две недели. Стоимость лечения сипулеуцел-Т в течение одного месяца составляет около 100 тысяч долларов, что делает его одним из самых дорогих методов лечения рака на рынке.Хотя Sipuleucel-T продемонстрировал более высокую эффективность по сравнению с доцетакселом, разница в стоимости едва ли может компенсировать увеличение средней продолжительности жизни; следовательно, финансирование станет препятствием. К счастью, Центры Medicare и Medicaid (CMS) покрывают лечение сипулеусел-Т. Тем не менее, привлечение финансового персонала и социальных работников к процессу может облегчить процесс финансирования. Кроме того, изучение столь же эффективных, но менее дорогих вариантов, безусловно, оправдано для уменьшения экономического бремени на общество.[11] [13]
Тест на кислотную фосфатазу| Encyclopedia.com
Определение
Кислая фосфатаза — это фермент, обнаруживаемый во всем организме, но в основном в предстательной железе. Как и все ферменты, он необходим для запуска определенных химических реакций. Тестирование на кислотную фосфатазу проводится для диагностики рака простаты , распространившегося на другие части тела (метастазирующего), и для проверки эффективности лечения. Этот тест был в значительной степени вытеснен тестом на простатоспецифический антиген (ПСА).
Назначение
Мужская предстательная железа содержит в 100 раз больше кислой фосфатазы, чем любая другая ткань тела. Когда рак простаты распространяется на другие части тела, уровень кислой фосфатазы повышается, особенно если рак распространяется на кости. От половины до трех четвертей людей с метастазирующим раком простаты имеют высокий уровень кислой фосфатазы. Уровни падают после удаления опухоли или ее уменьшения в результате лечения.
Ткани, отличные от простаты, содержат небольшое количество кислой фосфатазы, включая кости, печень, селезенку, почки, а также эритроциты и тромбоциты.Повреждение этих тканей вызывает умеренное повышение уровня кислой фосфатазы.
Кислая фосфатаза очень сконцентрирована в сперме. Изнасилование часто включает тестирование на наличие кислой фосфатазы во влагалищной жидкости.
Меры предосторожности
Это не скрининговый тест на рак простаты. Уровень кислой фосфатазы повышается только после метастазирования рака простаты.
Описание
Лабораторные исследования определяют количество кислой фосфатазы в крови человека и могут определить, из какой ткани поступает фермент.Например, важно знать, связана ли повышенная кислотная фосфатаза с простатой или эритроцитами. Кислая фосфатаза простаты, называемая кислой фосфатазой простаты (PAP), является наиболее значимым с медицинской точки зрения типом кислой фосфатазы.
Тонкие различия между кислой фосфатазой простаты и кислой фосфатазой из других тканей заставляют их по-разному реагировать в лаборатории при смешивании с определенными химическими веществами. Например, добавление химического тартрата к тестируемой смеси подавляет активность кислой фосфатазы простаты, но не кислой фосфатазы эритроцитов.Методы лабораторных тестов, основанные на этих различиях, показывают, какая часть общей кислой фосфатазы человека поступает из простаты. Результаты обычно доступны на следующий день.
КЛЮЧЕВЫЕ ТЕРМИНЫ
Фермент — Вещество, необходимое для запуска определенных химических реакций.
Метастазирование — Распространение в другие части тела; обычно относится к раку.
Предстательная железа — Железа мужской репродуктивной системы.
Препарат
Для этого теста требуется взять около 5–10 мл крови.Пациенту не следует делать ректальное обследование или массаж простаты в течение двух-трех дней до обследования.
Последующий уход
В месте прокола может появиться дискомфорт или синяк, человек может почувствовать головокружение или обморок. Если надавить на место прокола до остановки кровотечения, синяки уменьшатся. Теплые компрессы к месту прокола избавят от дискомфорта.
Нормальные результаты
Нормальные результаты зависят от лаборатории и используемого метода.
Отклонения от нормы
Самый высокий уровень кислой фосфатазы обнаруживается при метастазирующем раке простаты.Заболевания костей, такие как болезнь Педжета или гиперпаратиреоз ; заболевания клеток крови, такие как серповидно-клеточная анемия или множественная миелома ; или лизосомные расстройства, такие как болезнь Гоше, будут демонстрировать умеренно повышенные уровни.
Некоторые лекарства могут вызывать временное повышение или снижение уровня кислой фосфатазы. Манипуляции с предстательной железой с помощью массажа, биопсии или ректального исследования перед тестом могут повысить уровень.
Ресурсы
ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ДАННЫЕMoul, Judd W., и другие. «Современная ценность кислой фосфатазы простаты перед лечением для прогнозирования патологической стадии и рецидива в случаях радикальной простатэктомии». Урологический журнал (март 1998 г.): 935-940.
Медицинская энциклопедия Гейла, 3-е изд.
Повышенная экспрессия тартрат-устойчивой кислой фосфатазы (TRAP) в злокачественной ткани молочной железы, яичников и меланомы: исследовательское исследование | BMC Cancer
Этика
Экспериментальное исследование и сбор клеток, тканей и сыворотки пациентов для исследования были одобрены Комитетом по этике медицинского факультета Вюрцбургского университета, Германия, номер ссылки 139/00.Все пациенты, участвовавшие в исследовании, дали письменное информированное согласие.
1. Образцы сыворотки и тканей
Образцы сыворотки были взяты у пациентов с раком груди (n = 34) и яичников (n = 39) и у 37 контрольных пациентов, из которых 17 были в пременопаузе и 20 — в постменопаузе (Таблица 1). Наличие в анамнезе лекарств или состояний, которые могли повлиять на метаболизм костей (например, остеопороз, заболевание щитовидной железы, переломы, ревматоидный артрит, остеоартрит, лечение стероидами), привело к исключению из контрольной группы.Образцы биопсии молочной железы (n = 21), рака яичников (n = 8) и шейки матки (n = 7), злокачественной меланомы (n = 6), доброкачественной ткани молочной железы (n = 2), нормальной ткани яичников (n = 3) , и нормальная кожа (n = 3) были исследованы на экспрессию TRAP с помощью иммуногистохимии. У 13 из 34 пациентов с раком груди, но ни у одного из пациентов с раком яичников, не было метастатического поражения костей.
Таблица 1 Средние концентрации TRAP в сыворотке крови2. Клеточные культуры
Были выделены и культивированы первичные опухолевые клетки злокачественных плевральных выпотов и асцита, связанные с метастатическим раком груди (4 случая) и раком яичников (4 случая).Из-за клинических симптомов излияния были аспирированы. Аспираты (20–500 мл) центрифугировали, и полученные осадки клеток дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, Biochrom, Берлин, Германия). Клетки культивировали в среде HBCA [12] с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, PAA Laboratories, Cölbe, Германия) и гентамицина (50 мкг / мл, Biochrom) в количестве 2 × 10 5 клеток / мл в пластиковой ячейке. -колба для культивирования в увлажненном инкубаторе (атмосфера 5% CO 2 ).Загрязняющие фибробласты удаляли обработкой трипсином через день, а оставшийся монослой опухолевых клеток культивировали до тех пор, пока клетки не приобрели гомогенную морфологию (пассажи 3–4). Если опухолевые клетки делились должным образом, контаминирующие лейкоциты и фибробласты отсутствовали после этих нескольких пассажей.
Были также исследованы следующие коммерчески доступные клеточные линии: клеточные линии рака груди MCF7, MDA-MB-468, BT20 и HBL-100, клеточные линии рака яичников OAW42 и SKOV3 и клеточные линии рака шейки матки SiHa и CaSki.Клеточные линии рака груди и яичников были получены от Cell Line Services (Гейдельберг, Германия), а клеточные линии рака шейки матки — от Департамента акушерства и гинекологии Йенского университета, Германия. Все клеточные линии культивировали в среде RPMI1640 (Biochrom) с добавлением 10% FBS и гентамицина (Biochrom).
3. Иммуноферментный анализ (ELISA)
Образцы сыворотки анализировали с использованием набора TRAP-ELISA (Medac, Wedel, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.Диапазон ИФА составлял 1–10 Ед / л. В некоторых случаях концентрация TRAP была выше 10 Ед / л: эти образцы были разбавлены 1: 4 в буфере для разбавления образцов, входящем в комплект, и повторно проанализированы. Конечные концентрации в сыворотке затем вычисляли путем умножения полученного значения на четыре.
4. Иммуногистохимия и иммуноцитология
Иммуноцитологические исследования были выполнены на клетках, культивируемых из злокачественных плевральных выпотов и асцитов, и на коммерчески доступных установленных клеточных линиях.Клетки высевали на предметные стекла, покрытые APES- (3-аминопропилтриэтоксисилан; Roth, Карлсруэ, Германия), и выращивали в течение ночи. Затем их фиксировали 4% формалином и промывали PBS в течение 10 минут, затем дистиллированной водой в течение 2 минут и затем ацетон / метанол [1: 2 в течение 5 минут].
Для иммуногистохимии срезы обычно обработанной залитой парафином ткани разрезали на 2–3 мкм, помещали на предметные стекла, покрытые APES, депарафинизировали в ксилоле и регидратировали в градуированных этанолах и трис-буферном растворе (TBS; 25 мМ TRIS / HCl, pH 7.4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl). Для извлечения антигена срезы подвергали предварительной тепловой обработке путем кипячения в 0,01 М натрий цитратном буфере (pH 6,0) в течение 10 минут в микроволновой печи (600 Вт / сек).
Для специфического обнаружения антигена TRAP срезы и мазки клеток инкубировали с козьей сывороткой в течение 30 минут, а затем с моноклональным антителом TRAP в разбавлении 1: 100 в разбавителе антител (DAKO, Гамбург, Германия). Антитело TRAP направлено против N-концевой части TRAP человека (клон: 26E5, подтип: IgG2b; Novocastra Laboratories Ltd., Ньюкасл, Великобритания). После одной промывки в PBS наносили меченное пероксидазой хрена (HRP) кроличье специфическое вторичное антитело против мыши (DAKO, разведение 1: 100). Реакция обнаружения была разработана с использованием 3,3′-диаминобензидина (DAB; Sigma, Deisenhofen, Германия) или Vector VIP (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Срезы и мазки контрастировали гематоксилином (Mayers, Sigma), дегидратировали с помощью этанолов градации и заливали в Entelan (Merck, Дармштадт, Германия).
Иммунореактивность клеток и тканей оценивали путем сравнения с контрольными срезами, инкубированными с контрольным антителом IgG.Они были оценены как положительные [+], если в большинстве клеток была обнаружена четкая коричневая или пурпурная окраска, как слабоположительные [(+)], если было окрашено менее 50% клеток (большинство — слабо)), и как отрицательный [-], если окрашивание не было обнаружено.
5. RT-PCR
РНКэкстрагировали из клеточных линий, полученных от пациентов, и из коммерческих клеточных линий с использованием набора для экстракции РНК Quiagen (Quiagen, Гамбург, Германия). LPS-активированные дендритные клетки, которые, как было описано, экспрессируют TRAP [13], и клетки хориокарциномы JAR служили в качестве отрицательного контроля, соответственно.мРНК транскрибировали с помощью обратной транскриптазы и олиго Т-праймеров (оба от Promega, Mannheim, Germany). Для ПЦР использовали 5 мкг кДНК. Использовали два разных набора праймеров, которые были разработаны специально для амплификации мРНК человеческого TRAP 5b. Оба дали одинаковые результаты. Первый набор содержал следующие последовательности: праймер 3’CTTTCTACCGCCTGCACTTC5 ‘и расположенный ниже праймер 3’GCTGTTTCTTGAGCCAGGAC5’. Вторая пара праймеров состояла из вышестоящего праймера 3’AGGCTTTTCCTCCAACCTGT5 ‘и нижестоящего праймера: 3’GGAACTCAGCAAAGGTGAGC5’, полимеразу Taq (Promega) использовали в количестве 1 ед.
