Нурофен детский во время беременности: Нурофен при беременности и для кормящих женщин: можно ли принимать. Лекарства при беременности и грудном вскармливании: ответы врачей

Как безопасно вводить ибупрофен (для родителей)

Ибупрофен (eye-byoo-PRO-fen) — это лекарство, отпускаемое без рецепта, для облегчения болей и снижения температуры.При правильном применении это безопасный препарат. Но слишком большая доза может вызвать сильное заболевание ребенка. Слишком много может привести к проблемам с желудком, спутанности сознания и возможным проблемам с почками. Поэтому важно знать, как правильно давать ибупрофен.

Если у вас есть какие-либо вопросы о назначении ибупрофена вашему ребенку, обратитесь к врачу или фармацевту. Никогда не давайте это или какое-либо другое лекарство ребенку младше 2 лет без предварительного одобрения врача.

Как также называется ибупрофен?

Ибупрофен — это общее название этого препарата.Наиболее распространенными торговыми марками ибупрофена в США являются Advil® и Motrin®.

Какие типы ибупрофена доступны?

Для детей это лекарство доступно в виде суспензий для приема внутрь (жидкая форма), жевательных таблеток и таблеток. В некоторых странах ректальные свечи можно купить без рецепта под названием Нурофен®.

Advil® производит капли Advil® для младенцев и суспензию Advil® для детей, а также жевательные таблетки Jr. Strength Advil® и таблетки Jr. Strength Advil®.Motrin® производит капли Motrin® для младенцев и пероральную суспензию Motrin® для детей. Другие марки ибупрофена доступны в аналогичных формах.

с.

Как вводить ибупрофен

При назначении ибупрофена обратитесь к следующим таблицам дозировки для правильной дозировки.

Другая важная информация:

• Проверьте срок годности, чтобы убедиться, что он не истек. Если это так, выбросьте лекарство и купите новый продукт. Для правильной утилизации выньте лекарство из оригинального контейнера и поместите его в нежелательное вещество, которое дети или животные не захотят есть, например кофейную гущу или наполнитель для кошачьего туалета.Затем положите его в герметичный пакет в мусорное ведро.
• Убедитесь, что ваш ребенок не принимает другие лекарства, содержащие ибупрофен. Ибупрофен — очень распространенный ингредиент в лекарствах от кашля, простуды и аллергии. Если ваш ребенок принимает один, поговорите со своим врачом или фармацевтом, прежде чем давать ребенку еще ибупрофен. Передозировка ибупрофена может вызвать повреждение желудка или кишечника.
• Проверьте концентрацию и рекомендуемую дозировку. Дайте ребенку дозу из пипетки, шприца или чашки, прилагаемой к продукту. Это особенно важно при введении младенцу концентрированных капель, которые более эффективны, чем детские концентрированные капли. Это поможет убедиться, что ваш ребенок получает нужное количество миллилитров или мл (также называемых кубическими сантиметрами) и не передозирует. Никогда не используйте мерную ложку из кухни или чашку или пипетку из другого продукта. Жевательные таблетки или таблетки не рекомендуются детям младше 6 лет из-за риска удушья.
• Давая при лихорадке, учитывайте температуру и возраст ребенка. Если у вас есть ребенок 3 месяцев или младше с ректальной температурой 100,4 ° F (38 ° C) или выше, немедленно позвоните своему врачу или обратитесь в отделение неотложной помощи. Если вашему ребенку от 3 месяцев до 3 лет и у него температура 102,2 ° F (39 ° C) или выше, позвоните своему врачу, чтобы узнать, нужно ли ему видеться с вашим ребенком.
• Если ваш ребенок выплюнул дозу ибупрофена, не проглотив ее, дайте ему успокоиться, а затем дайте ту же дозу еще раз. Если ибупрофен проглотил, а затем его вырвало, не давайте ребенку еще одну дозу в течение как минимум 6 часов, если только доза не была в форме таблеток, и вы можете увидеть, что ваш ребенок вырвал всю таблетку.
• Давайте каждые 6-8 часов по мере необходимости , но никогда не давайте вашему ребенку более четырех доз за 24 часа.
• Если вашему ребенку не нравится вкус, вы можете попробовать продукт с другим вкусом.
• Если ваш ребенок чувствителен к красителям, используйте ибупрофен, не содержащий красителей.

п.

Дозировки ибупрофена по весу

Доктора рекомендуют использовать вес ребенка, а не возраст, когда выясняют, сколько лекарства нужно давать. Прежде чем давать ребенку дозу, проверьте этикетку, чтобы убедиться, что рекомендованная дозировка и концентрация соответствуют приведенным ниже цифрам.

Таблица составлена ​​на основе рекомендаций врачей и производителей. Он не заменяет совет врача. Если вашему ребенку 2 года или меньше, проконсультируйтесь с врачом, прежде чем давать лекарство. И всегда звоните, если у вас есть вопросы или опасения по поводу приема лекарств.

Ибупрофен вреден для развития яичников плода человека в первом триместре ex vivo | Репродукция человека

Аннотация

ВОПРОС ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияет ли использование ибупрофена в первом триместре беременности на развитие яичников плода человека?

КРАТКИЙ ОТВЕТ

У плодов человека воздействие ибупрофена вредно для половых клеток яичников.

ЧТО УЖЕ ИЗВЕСТНО

In utero стадия развития яичников определяет будущую репродуктивную способность женщины. У грызунов анальгетики могут нарушать развитие яичников плода, что приводит к раннему началу нарушения фертильности. Сообщается, что ибупрофен, который продается без рецепта, часто используется во время беременности, особенно в течение первого триместра, когда половые клетки яичников проходят важные этапы пролиферации и дифференцировки.

РАЗРАБОТКА ИССЛЕДОВАНИЯ, РАЗМЕР, ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ

Органотипические культуры яичников человека, полученные на сроках от 7 до 12 недель развития (DW), подвергались воздействию ибупрофена в дозе 1–100 мкМ в течение 2, 4 или 7 дней. Для каждого человека включали контрольную культуру (носитель) и сравнивали с ее обработанным аналогом. Всего было включено 185 индивидуальных образцов.

УЧАСТНИКИ / МАТЕРИАЛЫ, НАСТРОЙКА, МЕТОДЫ

Эксплантаты яичников анализировали с помощью проточной цитометрии, иммуногистохимии и количественной ПЦР.Конечные точки были сосредоточены на количестве клеток яичников, гибели клеток, пролиферации и комплементе зародышевых клеток. Чтобы проанализировать возможный диапазон воздействия, ибупрофен был измерен в пуповинной крови женщин, подвергшихся или не подвергавшихся воздействию ибупрофена до прерывания беременности.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И РОЛЬ ШАНСА

Эксплантаты яичников человека, подвергшиеся воздействию 10 и 100 мкМ ибупрофена, показали уменьшение количества клеток, меньшее количество пролиферирующих клеток, усиление апоптоза и резкую потерю количества половых клеток, независимо от срока беременности плода.Значительные эффекты наблюдались после 7 дней воздействия 10 мкМ ибупрофена. При этой концентрации апоптоз наблюдался уже через 2 дня лечения вместе с уменьшением количества M2A-положительных половых клеток. Эти пагубные эффекты ибупрофена не были полностью устранены после 5 дней отмены препарата.

ОГРАНИЧЕНИЯ, ПРИЧИНЫ ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЯ

Это исследование было проведено в экспериментальных условиях эксплантатов яичников человека, подвергшихся воздействию препарата в культуре, что может не полностью повторять сложность воздействия in vivo и развития органов.Также следует учитывать индивидуальную изменчивость.

РАСШИРЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В то время как ибупрофен в настоящее время противопоказан только после 24 недель беременности, наши результаты указывают на пагубное влияние этого препарата на яичники плода в первом триместре ex vivo . Эти результаты заслуживают рассмотрения в свете настоящих рекомендаций по потреблению ибупрофена во время беременности и показывают острую необходимость в дальнейших исследованиях клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе влияния ибупрофена на развитие яичников плода.

Введение

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) являются одними из наиболее часто используемых безрецептурных препаратов для лечения боли, воспаления и лихорадки, при этом ибупрофен составляет значительную долю рынка (Kristensen et al. , 2016). В 2013 году до 28,3% беременных женщин сообщили об использовании ибупрофена на некоторых этапах беременности (Van Marter et al., , 2013), в результате чего ибупрофен занял второе место по популярности безрецептурный анальгетик после парацетамола (Thorpe et al., 2013). Хотя ибупрофен явно противопоказан с 24 недель беременности из-за хорошо известного риска пороков развития, до 24 недель рекомендации более неоднозначны. Более того, потребление ибупрофена на ранних сроках беременности также может происходить из-за незнания состояния беременной или из-за игнорирования состава используемых для самолечения лекарств.

Во время внутриутробной жизни популяция зародышевых клеток яичников проходит через ряд сложных процессов, начинающихся со спецификации зародышевых клеток и миграции в гонады, за которыми следует пролиферация и вступление в мейоз и завершается образованием примордиальных фолликулов (Edson et al. al., 2009 г.). Более конкретно, во время первого триместра беременности события динамического развития яичников регулируются нишей зародышевых клеток, которые регулируют баланс между пролиферацией, дифференцировкой и гибелью зародышевых клеток (Kerr et al. , 2013). Нормальное эмбриональное развитие яичника, то есть создание динамического, но конечного, резерва фолликулов, определяет будущую репродуктивную способность женщины (McGee and Hsueh, 2000). Плохо обеспеченный начальный резерв приведет к сокращению продолжительности репродуктивной жизни, ранней менопаузе или бесплодию (Nelson et al., 2013), события, происходящие спустя десятилетия.

Ибупрофен, как и все НПВП, блокирует циклооксигеназы (ЦОГ), ключевые ферменты, участвующие в первой лимитирующей стадии превращения арахидоновой кислоты в простагландины (PG) (Rainsford, 2009). В яичнике плода человека конститутивно экспрессируемый СОХ1 в основном обнаруживается в соматических клетках, тогда как индуцибельный СОХ2 ограничен периферией яичника, где расположены плюрипотентные зародышевые клетки, что предполагает участие СОХ2 в развитии яичников (Bayne et al., 2009 г.). Несмотря на доказательства того, что PG и COX являются критическими факторами репродуктивной функции взрослых женщин (Duffy, 2015; Sugimoto et al. , 2015), мало что известно об их точной функции в органогенезе яичников человека. Однако передача сигналов простагландина E2 (PGE2) была связана с повышенной экспрессией генов выживания зародышевых клеток в яичниках плода человека (Bayne et al. , 2009), и было обнаружено, что анальгетики вызывают гибель клеток в клеточных линиях рака яичников человека (Andrews ). и другие., 2008; Zerbini et al. , 2011; Дункан и др. , 2012; Лима и др. др. , 2015). Поэтому мы предположили, что воздействие ингибиторов ЦОГ на развивающийся яичник может оказывать токсическое действие на зародышевые и / или соматические клетки.

Научное сообщество вызывает все большую озабоченность по поводу воздействия химических веществ, содержащихся в окружающей среде и фармацевтических препаратов, на развитие плода. Сюда входят обезболивающие, которые вызывают эндокринные нарушения в семенниках человеческого плода (Mazaud-Guittot et al., 2013; Kristensen et al. , 2016; Бен Маамар и др. , 2017) и приводят к бесплодию и преждевременной недостаточности яичников у мышей и крыс (Dean et al. , 2016; Holm et al. , 2016; Johansson et al. , 2016). На сегодняшний день недостаточно данных о краткосрочных эффектах ибупрофена на органогенез плода и о прогнозировании долгосрочных побочных эффектов этого распространенного лекарства у взрослых. Таким образом, цель настоящего исследования заключалась в оценке возможного воздействия ибупрофена на яичник плода человека с акцентом на жизнеспособность клеток, окно чувствительности, целевую специфичность и обратимость на ключевых этапах развития зародышевых клеток плода у женщин на протяжении всего жизненного цикла. первый триместр.С этой целью мы использовали оригинальную модель ex vivo органотипической культуры плодных яичников человека, которую мы подвергали воздействию ряда концентраций ибупрофена в течение различных периодов времени. Наши результаты показывают, что в развивающемся яичнике человека половые клетки особенно чувствительны к повреждению ибупрофеном.

Материалы и методы

Заявление об этике

Плоды человека в первом триместре (7–12 недель развития (DW), n = 185) были получены в результате законного прерывания беременности, проведенного в больнице Реннского университета с октября 2013 года по июнь 2017 года.Прерывание беременности не было связано с аномалиями плода. Ткани собирали после письменного согласия женщин в соответствии с юридической процедурой, согласованной Национальным агентством по биомедицинским исследованиям (разрешение № PFS09-011; Agence de la Biomédecine) и с одобрения Местного этического комитета больницы Ренна (совет № 11- 48) одобрил всю процедуру.

Забор яичников человека

Прерывание беременности индуцировали с помощью стандартного комбинированного протокола Mifegyne® (мифепристон) и Cytotec® (мизопростол) с последующей аспирацией.Подгруппа женщин получала 400 или 800 мг ибупрофена для профилактического обезболивания или вообще не принимала. Потенциальный эффект от приема ибупрофена до прекращения приема был принят во внимание при анализе данных. Гестационный возраст определяли с помощью УЗИ и дополнительно подтверждали измерением длины стопы. Кровь собирали из пуповины плодов старше 8 DW, образцы центрифугировали и сыворотку хранили при -80 ° C. Яичники извлекали из продуктов аспирации с помощью бинокулярного микроскопа (Olympus SZX7, Лилль, Франция).Их немедленно помещали в ледяной фосфатно-солевой буфер (PBS).

Извлеченные яичники разрезали на ~ 1 мм ³ частей и эксплантаты культивировали во вставках для клеточных культур (поры 0,4 мкМ), помещенных в 24-луночные сопутствующие планшеты (Becton-Dickinson, Le Pont de Claix, Франция). Яичники плодов моложе 10 DW культивировали в двух отдельных лунках, один из которых подвергался воздействию носителя, а другой — ибупрофена.Яичники плодов старше 10 DW культивировали либо в одной лунке (для измерения гормонов), либо в четырех лунках для нескольких культур (т.е. в одном контроле и трех концентрациях ибупрофена). Яичники были разрезаны пополам по длине, и каждая половина делилась на 2–3 части. Каждую лунку заполняли 400 мкл среды 199 без фенола красного (Invitrogen Life Technologies, Cergy Pontoise, Франция) с добавлением 50 мкг / мл гентамицина, 2,5 мкг / мл фунгизона (Sigma Aldrich Chemicals, Saint-Quentin Fallavier, Франция) и инсулин (1 г / л), трансферрин (0.55 г / л) и селенит натрия (0,67 мг / л) (Sigma Aldrich Chemicals). Культуры инкубировали при 37 ° C в течение 7 дней в увлажненной атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% CO ₂ . Среду заменяли свежей средой через первые 24 часа, а затем каждые 48 часов, немедленно замораживали на сухом льду и хранили при -80 ° C. Эксплантаты немедленно подвергали обработке путем добавления к среде либо носителя в конечной концентрации 0,1% об. / Об. (Диметилсульфоксид; ДМСО), либо ибупрофена (Sigma Aldrich Chemicals).Поскольку терапевтические концентрации ибупрофена в плазме колеблются от 10 до 200 мкМ (Kallstrom et al. , 1988; Karttunen et al. , 1990), концентрации анальгетиков, используемых в текущем исследовании, составляли 10 мкМ для проверки общего лечебного эффекта. и 1–100 мкМ для оценки потенциальных эффектов доза-ответ.

Диссоциация отдельных клеток и проточная цитометрия

Эксплантаты подвергали последовательной процедуре ферментативного расщепления, адаптированной из Le Bouffant et al. (2010) для получения суспензий единичных клеток. Вкратце, кусочки яичников сначала переваривали в 0,25% трипсине – 0,02% EDTA (мас. / Об.) (# T4049, Sigma-Aldrich) в течение 5 минут при 37 ° C. Расщепление трипсином останавливали добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в среду M199, и образцы центрифугировали при 350 g в течение 5 минут. Затем образцы дополнительно обрабатывали 2 мг / мл коллагеназы (# C0130, Sigma-Aldrich) и 0,05 мг / мл ДНКазы (# DN25, Sigma-Aldrich) в среде M199 в течение 5 минут при 37 ° C. Диспергированные клетки центрифугировали и ресуспендировали в PBS.Перед тем, как приступить к маркировке, подсчет клеток был выполнен на гемоцитометре Malassez (включая исключение живых клеток трипановым синим). Апоптотические клетки были помечены FITC Annexin-V (BD pharmingen # 556419) в соответствии с рекомендациями производителя в сочетании с окрашиванием некротических ядер с помощью 3 мкг / мл 7-аминоактиномицина D (7-AAD; FluoProbes, Interchim # 132303) в 100 мкл связывающего буфера. . На контурных графиках аннексина-V и 7-AAD с воротами квадрантов мертвые клетки включали апоптоз (ранний: AnnV + 7AAD– и поздний: AnnV + 7AAD +) плюс некроз (AnnV-7AAD +) (Дополнение.Рис. S1B). Для идентификации зародышевых клеток проводили мечение M2A плазматической мембраны с использованием мышиных моноклональных антител против D240 (abcam # 77854, разведенное 1: 200) в присутствии 10% FCS и инкубировали 30 минут при комнатной температуре (RT). Обнаружение было обеспечено с помощью связанного с R-фикоэритрином антимышиного IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch # 715-116-150). Для оценки гибели клеток и динамики зародышевых клеток было собрано не менее двадцати тысяч клеток и проанализировано проточной цитометрией с использованием FACSCalibur (BD Biosciences), оснащенного программным обеспечением CellQuest.

Иммуногистохимия и стереология

Иммуногистохимия выполнялась на 4% параформальдегид-PBS и фиксированных раствором Буэна и залитых парафином яичниках. Каждый пятый срез толщиной 5 мкм использовали для иммуногистохимии с маркировкой, специфичной для клеток. После депиляции и регидратации срезы блокировали в течение 20 минут при комнатной температуре с помощью 10% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS перед инкубацией в течение ночи при 4 ° C с первичным антителом, разведенным в разбавителе антител Dako (Dako Cytomation, Trappes, Франция).Апоптотические клетки окрашивали кроличьим антителом против расщепленной каспазы-3 (1: 150; Cell Signaling Tech. # 9661, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, Франция), пролиферирующие клетки — мышиным антителом против Ki67 (1: 100; Dako # M7240) и зародышевые клетки с мышиным антителом против M2A (1: 100, клон D2-40; Abcam # ab77854) или кроличьим анти-LIN28 (1: 300, Abcam # ab46020). Необходима стадия извлечения антигена при 80 ° C в течение 40 мин с 10 мМ Трис, 1 мМ буфера EDTA, pH 9 для расщепленной каспазы-3 или 10 мМ цитратного буфера, pH 6 для Ki67, M2A и LIN28.Вторичные антитела представляли собой биотинилированные козьи антикроличьи или кроличьи антимышиные антитела (1: 500; E0342 и E0464, соответственно, Dako). Срезы проявляли стрептавидин-пероксидазой хрена (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) и 3,3’-диаминобензидинтетрагидрохлорид (Sigma Aldrich Chemicals) и окрашивали гематоксилином. Окрашенные срезы исследовали и фотографировали под световым микроскопом (Olympus BX51). Снимки участков сделаны с помощью сканера NanoZoomer 2.0 RS (Хамамацу, Токио, Япония) при 40-кратном увеличении. Поверхности 5–10 срезов, покрывающих весь эксплант, рассчитывали с помощью программы NDPview (Хамамацу, Токио, Япония). Программное обеспечение ImageJ (Национальные институты здравоохранения США, Бетесда, Мэриленд, США) использовалось для подсчета клеток на основе стереологических принципов. Клетки подсчитывали, по меньшей мере, в пяти срезах, и количество апоптотических клеток сообщали как количество на единицу площади поверхности среза, в то время как пролиферирующие клетки указывали как процент Ki67-положительных клеток в популяции KI67-отрицательных клеток.

Измерение простагландина

простагландина E2 (PGE2) измеряли в культуральной среде эксплантатов яичников после 1 дня воздействия методом ELISA (CV внутри анализа 3,7–30,4% и CV между анализами 6,4–35%; набор PG E2 EIA — Monoclonal Cayman Химическая компания, Анн-Арбор, Мичиган, США). Каждый образец анализировали в двух экземплярах.

Анализ ибупрофена

Ибупрофен экстрагировали из плазмы человека твердофазной экстракцией с использованием картриджей 10 мг HLB Oasis (Waters, UK).Вкратце, 50 мкл плазмы обогащали 1 нг меченного дейтерием ацетаминофена (APAP-d4; Santa Cruz Biotechnology Inc.) в качестве внутреннего стандарта. Картриджи кондиционировали метанолом и водой, образец загружали и промывали водой — 5% метанолом, а затем элюировали 1 мл метанола. Элюат упаривали досуха в атмосфере азота при 40 ° C и восстанавливали в подвижной фазе (100 мкл вода / ацетонитрил (70:30, об. / Об.)). Хроматографическое разделение достигалось введением 20 мкл образца в систему Acquity UPLC с колонкой ACE Excel C18-AR (150 × 2.1 мм; 2 мкм), защищенный Kinetex KrudKatcher (Phenomenex) и работавший при 30 ° C. После разделения ибупрофен был обнаружен на тройном квадрупольном масс-спектрометре QTrap 5500 (Seiex, Warrington, UK), работающем в режиме электрораспыления положительных ионов (5,5 кВ, 550 ° C, газ-источник ионов 60/40). Контролируемые переходы составляли м / z 207,1 → 161,1 и м / z 156,1 → 114,1 для ибупрофена и APAP-d4 соответственно. Подвижная фаза состояла из 0,1% муравьиной кислоты (Sigma Aldrich) в воде и 0.1% муравьиная кислота в ацетонитриле (B) при скорости потока 0,5 мл / мин. Градиентное элюирование достигалось с общим временем пробега 9 мин от 30% до 100% B. Ибупрофен элюировался через 5,70 мин, а внутренний стандарт APAP-d4 элюировался за 1,1 мин.

Количественная ПЦР

РНК экстрагировали из эксплантатов яичников с использованием набора для экстракции РНК / ДНК / белков All Prep (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Суммарные РНК (250 нг) подвергали обратной транскрипции с помощью набора для синтеза кДНК iScript (Biorad) и количественную ПЦР проводили с использованием универсальной супермиксы iTaq © SYBR green (Biorad) в соответствии с инструкциями производителя в системе Cfx384 OneTouch Real-Time PCR (Biorad).Использовали следующую программу амплификации: начальная денатурация 3 мин при 95 ° C, 40 циклов 10-секундной денатурации при 95 ° C и 30 с при 62 ° C для отжига и удлинения. Кривые диссоциации получали с использованием профиля термического плавления, выполненного после последнего цикла ПЦР. Чтобы избежать амплификации загрязняющей геномной ДНК, пары праймеров были выбраны по обе стороны от интрона. МРНК RPLP0 и RPS20 использовали в качестве внутреннего контроля для нормализации (таблица I). Результаты были рассчитаны методом ΔΔCT как n -кратных различий в экспрессии целевого гена по сравнению с эталонным геном и образцом калибратора, который состоит из равной смеси всех образцов, протестированных конкретно в каждом тестируемом органе.

Праймеры, используемые для количественной ПЦР.

Праймеры, используемые для количественной ПЦР.

Статистический анализ

Для каждого многомерного анализа (гибель клеток, подсчет клеток) статистическая структура включала (i) глобальный анализ эффекта воздействия ибупрофена с помощью непараметрического критерия суммы Краскела-Уоллиса; (ii) каждый раз, когда прогнозировался глобальный значимый эффект, проводилось апостериорных непараметрических тестов между контрольными образцами и образцами, обработанными ибупрофеном, при различной дозе (от 1 до 100 мкМ) или возрасте (от 7 до 12 DW) ( Вилкоксона или Манна-Уитни) с поправкой на множественное тестирование с поправкой Бонферрони.Статистически значимые апостериорных тестов обозначены (*), если значение P , скорректированное для множественного тестирования, ниже 0,05, (**) ниже 0,01 и (***) ниже 0,001. Для выполнения вычислений использовалась бесплатная программная среда для статистических вычислений и графики R.

Результаты

Ибупрофен проникает через плацентарный барьер

Чтобы получить представление о диапазоне концентраций ибупрофена, воздействию которого может подвергаться плод, была измерена концентрация ибупрофена в пуповине 13 плодов в диапазоне от 8 до 12 DW (Таблица II).Концентрация ибупрофена составляла в среднем ± SEM 7,1 ± 5,02 мкМ (0,37–14,5 мкМ), когда беременные женщины принимали 800 мг ибупрофена за 2–5 ч до прерывания беременности. После приема однократной дозы 400 мг концентрация ибупрофена в сыворотке пуповины в среднем составляла ± SEM 2,09 ± 1,25 мкМ (0,83–6,95 мкМ). Ибупрофен не определялся, когда женщины не использовали анальгетик ( n = 5 образцов). Следовательно, для последующих экспериментов ex vivo были выбраны концентрации, охватывающие диапазон концентраций, обнаруженных в пуповинной крови.

Концентрация ибупрофена в сыворотке пуповинной крови первого триместра.

Концентрация ибупрофена в сыворотке из пуповинной крови первого триместра.

Ибупрофен подавляет выработку простагландина E2 яичниками

Один день воздействия ибупрофена в дозе 10 мкМ значительно снизил на 66,3% продукцию простагландина E2 (PGE2) эксплантами в возрасте 7–12 DW.Средний уровень (± SEM) PGE2 в контрольных образцах составлял 353 ± 73,9 пг / мл ( n = 21), в то время как уровни были снижены до 119 ± 10,6 пг / мл ( n = 16) в образцах ибупрофена ( P = 0,0062). Возрастного окна чувствительности для воздействия на продукцию PGE2 не наблюдалось.

Ибупрофен замедляет рост клеток яичников

Эксплантаты яичников плода (7–12 DW) подвергали воздействию различных концентраций ибупрофена (от 1 до 100 мкМ) в течение недели и оценивали общее количество клеток (рис.1А). В некультивируемых яичниках общее количество клеток на яичник увеличивалось экспоненциально с 2,6 × 10 ⁵ при 7 DW до 1,3 × 10 ⁶ при 12 DW (дополнительный рис. S1A). Это число дополнительно увеличивалось в течение 7 дней культивирования в контрольных условиях (дополнительный рис. S1A). Напротив, когда органы подвергались воздействию ибупрофена в концентрации 10 мкМ в течение 7 дней, общее количество клеток яичников было значительно снижено (в среднем на -50%) по сравнению с контрольными группами, не подвергавшимися воздействию, независимо от возраста развития эксплантата. (Инжир.1А). Хотя это не является значимым для каждой возрастной группы, уменьшение количества клеток также наблюдалось при дозах 1 мкМ (-20% в среднем) и 100 мкМ (-20% в среднем).

Рисунок 1

Ибупрофен снижает рост клеток яичника плода человека. ( A ) Количественное определение общего числа клеток в яичнике после 7 дней воздействия либо контрольного носителя (-, белые столбцы), либо ибупрофена в концентрации 1, 10 и 100 мкМ (столбцы от серого до черного). Подсчет клеток выполняли с помощью эксклюзионного окрашивания трипановым синим на суспензиях отдельных клеток от 7 до 12 недель развития (DW) плодных эксплантатов и выражали как 10 ⁶ клеток на яичник. P -значение теста Краскалла – Уоллиса (нулевая гипотеза: все данные получены из общей ненормально распределенной совокупности) указано вверху, а (*) над столбцами указывает на Mann — Тест Whitney post-hoc по сравнению с контролем имеет значение P <0,05. ( B ) Иммуногистохимия для KI67 после 7 дней воздействия в эксплантатах, подвергшихся воздействию носителя (Ctrl) или 10 мкМ ибупрофена (Ibu 10 мкМ). Масштабная линейка: 100 мкм.( C ) Процент KI67-положительных клеток среди общего количества клеток оценивали на иммуноокрашенных срезах через 7 дней после воздействия либо носителем (-, белые столбцы), либо ибупрофеном в концентрации 1, 10 и 100 мкМ (столбцы от серого до черного). . P -значение теста Краскалла-Уоллиса указано вверху, а * и *** над столбиками указывают, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем имеет P — значения <0,05 и 0,0001 соответственно.( n ) указывает количество людей на каждое состояние.

Рисунок 1

Ибупрофен снижает рост клеток яичника плода человека. ( A ) Количественное определение общего числа клеток в яичнике после 7 дней воздействия либо контрольного носителя (-, белые столбцы), либо ибупрофена в концентрации 1, 10 и 100 мкМ (столбцы от серого до черного). Подсчет клеток выполняли с помощью эксклюзионного окрашивания трипановым синим на суспензиях отдельных клеток от 7 до 12 недель развития (DW) плодных эксплантатов и выражали как 10 ⁶ клеток на яичник. P -значение теста Краскалла – Уоллиса (нулевая гипотеза: все данные получены из общей ненормально распределенной совокупности) указано вверху, а (*) над столбцами указывает на Mann — Тест Whitney post-hoc по сравнению с контролем имеет значение P <0,05. ( B ) Иммуногистохимия для KI67 после 7 дней воздействия в эксплантатах, подвергшихся воздействию носителя (Ctrl) или 10 мкМ ибупрофена (Ibu 10 мкМ). Масштабная линейка: 100 мкм.( C ) Процент KI67-положительных клеток среди общего количества клеток оценивали на иммуноокрашенных срезах через 7 дней после воздействия либо носителем (-, белые столбцы), либо ибупрофеном в концентрации 1, 10 и 100 мкМ (столбцы от серого до черного). . P -значение теста Краскалла-Уоллиса указано вверху, а * и *** над столбиками указывают, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем имеет P — значения <0,05 и 0,0001 соответственно.( n ) указывает количество людей на каждое состояние.

Чтобы определить, может ли вызванное ибупрофеном истощение клеток яичников быть результатом снижения пролиферации клеток, мы подсчитали процент KI67-положительных клеток, включая как соматические, так и половые клетки, в гистологических срезах после 7 дней культивирования (рис. 1В и C). До 8 DW ибупрофен во всех тестируемых концентрациях вызывал резкое снижение процента плотности KI67-положительных клеток. В эксплантах 8–12 DW пролиферация клеток также показала статистически значимое снижение плотности KI67-положительных клеток при 1 и 10 мкМ ибупрофена, но не при 100 мкМ (рис.1С).

Ибупрофен вызывает гибель клеток в яичнике плода человека

Чтобы определить, может ли индуцированное ибупрофеном снижение общего количества клеток яичников быть результатом потери жизнеспособности клеток, гибель клеток была определена количественно с использованием мечения аннексином-V на основе проточной цитометрии в сочетании с ядерным окрашиванием 7-AAD (рис. . S1B). Вкратце, на контурных графиках аннексина-V и 7-AAD с воротами квадрантов мертвые клетки включают апоптотические клетки, отображающие аннексин V на внешней мембране (ранний: AnnV + 7AAD– и поздний: AnnV + 7AAD +) и некротические клетки, в которых краситель 7AAD. мог войти в ядро ​​(AnnV – 7AAD +).Чтобы исключить потенциальное цитотоксическое воздействие самой органотипической культуры, мы оценивали гибель клеток до и в течение 7 дней культивирования в контрольных условиях (дополнительный рис. S1C). В целом, большинство (94–96%) клеток оказались жизнеспособными, общая гибель клеток достигла максимум 6%. Этот коэффициент гибели клеток оставался стабильным с дня 0 до дня 7 независимо от возраста эксплантата.

После воздействия ибупрофена процент глобальной гибели клеток, включая как апоптотическую, так и некротическую гибель, был постоянно выше по сравнению с эксплантатами, подвергшимися воздействию носителя, для обоих 7 плодов DW ( P = 0.0028) и 8–12 DW плодов ( P <0,001) (рис. 2A). В то время как 1 мкМ ибупрофен вызывал слабый цитотоксический эффект, статистически значимый только в группе 8-12 DW ( P = 0,098, + 42% при 7 DW и P = 0,028, + 45% при 8-12 DW) , Концентрация ибупрофена 10 мкМ вызвала заметное накопление мертвых клеток ( P = 0,007, + 85% при 7 DW и P <0,001, + 170% при 8-12 DW) (рис. 2A). Примечательно, что цитотоксический эффект 10 мкМ ибупрофена был усилен в самой старой группе эксплантов (10.47 ± 2,11 против 16,14 ± 1,88; Средние значения ± SEM 7 против 8–12 DW). Когда апоптоз отделен от некроза, только первый механизм гибели клеток значительно усиливается в обеих возрастных группах, подвергшихся воздействию (рис. 2А).

Рисунок 2

Ибупрофен вызывает апоптотическую гибель клеток в яичнике плода человека. ( A ) Процент апоптоза (простые столбцы) и некротической гибели клеток (заштрихованные столбцы) после 7 дней воздействия носителя (-, белые столбцы) или ибупрофена в концентрации 1, 10 и 100 мкМ (столбцы от серого до черного) составляли оценивали с помощью аннексина-V по сравнению с маркировкой 7-AAD на эксплантатах плода.Значение P — теста Краскалла-Уоллиса (нулевая гипотеза) указано вверху, а *, ** и *** над столбиками указывают на апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем. имеет значение P <0,05; <0,01 и <0,001 соответственно. ( B ) Иммуногистохимия расщепленной каспазы-3 на эксплантатах яичников, подвергнутых воздействию носителя (Ctrl) или 100 мкМ ибупрофена (Ibu 100 мкМ) в течение 7 дней. Стрелки указывают на апоптотические клетки большого размера.Масштабная линейка: 100 мкм. ( C ) Плотность расщепленных положительных по каспазе-3 клеток на мм ² в эксплантатах яичников, подвергнутых воздействию либо носителя (-, белые столбцы), либо ибупрофена в концентрации 1, 10 и 100 мкМ (столбцы от серого до черного). Сверху указано значение P теста Краскалла – Уоллиса, а *** над столбиками означает, что апостериорный тест Манна – Уитни по сравнению с контролем имеет значение P . <0,001. (n) указывает количество индивидуумов на каждое состояние.( D ) Количественная ОТ-ПЦР клеточного цикла и маркеров смерти. Каждая полоса представляет собой средний ± 25% доверительный интервал кратного изменения значения экспрессии целевого гена обработанного ибупрофеном эксплантата по сравнению с его собственным контрольным эксплантатом. Каждая полоса представляет собой среднее значение 9–13 доноров. Значения экспрессии генов были нормализованы с эталонными генами RPS20 , RPLP0 и BZW1 . Был проведен непараметрический знаковый ранговый критерий Вилкоксона для парных данных (* P <0.05). MKI67 , маркер пролиферации Ki67; CCNB1 , циклин B1; CCND1 , циклин D1; ЧЕК1 , киназа контрольной точки 1; CDKN1A , ингибитор циклинзависимой киназы 1A; TP53 , опухолевый птотеин p53.

Рисунок 2

Ибупрофен вызывает апоптотическую гибель клеток в яичнике плода человека. ( A ) Процент апоптоза (простые столбцы) и некротической гибели клеток (заштрихованные столбцы) после 7 дней воздействия носителя (-, белые столбцы) или ибупрофена в концентрации 1, 10 и 100 мкМ (столбцы от серого до черного) составляли оценивали с помощью аннексина-V по сравнению с маркировкой 7-AAD на эксплантатах плода.Значение P — теста Краскалла-Уоллиса (нулевая гипотеза) указано вверху, а *, ** и *** над столбиками указывают на апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем. имеет значение P <0,05; <0,01 и <0,001 соответственно. ( B ) Иммуногистохимия расщепленной каспазы-3 на эксплантатах яичников, подвергнутых воздействию носителя (Ctrl) или 100 мкМ ибупрофена (Ibu 100 мкМ) в течение 7 дней. Стрелки указывают на апоптотические клетки большого размера.Масштабная линейка: 100 мкм. ( C ) Плотность расщепленных положительных по каспазе-3 клеток на мм ² в эксплантатах яичников, подвергнутых воздействию либо носителя (-, белые столбцы), либо ибупрофена в концентрации 1, 10 и 100 мкМ (столбцы от серого до черного). Сверху указано значение P теста Краскалла – Уоллиса, а *** над столбиками означает, что апостериорный тест Манна – Уитни по сравнению с контролем имеет значение P . <0,001. (n) указывает количество индивидуумов на каждое состояние.( D ) Количественная ОТ-ПЦР клеточного цикла и маркеров смерти. Каждая полоса представляет собой средний ± 25% доверительный интервал кратного изменения значения экспрессии целевого гена обработанного ибупрофеном эксплантата по сравнению с его собственным контрольным эксплантатом. Каждая полоса представляет собой среднее значение 9–13 доноров. Значения экспрессии генов были нормализованы с эталонными генами RPS20 , RPLP0 и BZW1 . Был проведен непараметрический знаковый ранговый критерий Вилкоксона для парных данных (* P <0.05). MKI67 , маркер пролиферации Ki67; CCNB1 , циклин B1; CCND1 , циклин D1; ЧЕК1 , киназа контрольной точки 1; CDKN1A , ингибитор циклинзависимой киназы 1A; TP53 , опухолевый птотеин p53.

Для дальнейшего изучения влияния на гибель клеток был проведен гистологический анализ срезов эксплантата яичников с использованием окрашивания расщепленной каспазой-3 в качестве признака апоптоза (рис. 2B и C). В целом, воздействие ибупрофена в течение 7 дней привело к увеличению плотности расщепленных каспазо-3-положительных клеток как для 7, так и для 8–12 групп DW; однако это достигло статистической значимости только у 8–12 плодов DW ( P <0.001) по сравнению с 7 плодами DW ( P = 0,072) (рис. 2C). Ибупрофен в концентрации 10 и 100 мкМ вызывал резкое накопление апоптотических клеток ( P, <0,001, + 208% и + 182%, соответственно) у плодов 8-12 DW, тогда как дозозависимый эффект 1 мкМ не наблюдался. пройти порог значимости. Примечательно, что количественный анализ не мог быть проведен на нескольких срезах ткани, подвергнутых воздействию ибупрофена 10 и 100 мкМ (7 и 2 человека, соответственно) из-за массивной деградации и потери целостности самой ткани.Эти данные указывают на то, что ибупрофен цитотоксичен, что приводит к апоптозу в яичниках плода 7–12 DW с усилением эффекта при увеличении гестационного возраста плода. Количественный ПЦР-анализ пролиферации нескольких клеток (маркер пролиферации Ki67 MKI67 ), цикл (циклин B1, CCNB1 ; Cyclin D1, CCND1 ; ингибитор циклинзависимой киназы 1A, CDKN1A ; контрольная точка киназа 1, контрольная точка ) и маркеры смерти (опухолевый белок p53, TP53 ) показали значительное увеличение экспрессии TP53 и CDKN1A (рис.2D).

Зародышевые клетки плода яичников очень чувствительны к ибупрофену

Большой размер расщепленных каспазо-3-положительных клеток, выявленный нашим гистологическим исследованием (рис. 2В), позволяет предположить, что апоптотические клетки в эксплантатах, подвергшихся воздействию ибупрофена, скорее всего, были зародышевыми клетками. Чтобы проверить нашу гипотезу, мы использовали антитело, нацеленное на LIN28, маркер зародышевых клеток плода (Childs et al. , 2012), которое выявило снижение плотности LIN28-положительных клеток (рис.3A и Suppl. Рис. S2A-B). Другой маркер зародышевых клеток плода, M2A (Jin et al. , 2010), позволил идентифицировать две популяции зародышевых клеток (Suppl. Fig. S2C), что отражено двумя отдельными пиками на проточной цитометрии. (Дополнительный рис. S2D). В соответствии с неизменным профилем жизнеспособности, наблюдаемым в течение 7 дней культивирования в контрольной среде (Дополнение Рис. S1C), процент высокоположительных M2A клеток не изменился в течение недели ex vivo культура 7-12 DW эксплантаты (доп.Рис. S2E). Напротив, доля M2A-зародышевых клеток неуклонно увеличивалась между выделением органа (день 0) и концом 7 дней культивирования.

Рисунок 3

Ибупрофен нацелен на эмбриональные зародышевые клетки яичников. ( A ) Иммуногистохимический анализ LIN28 на эксплантатах яичников, подвергнутых воздействию либо носителя (контроль, Ctrl), либо 10 мкМ ибупрофена (Ibu 10 мкМ) в течение 7 дней. Масштабная линейка: 100 мкм. ( B ) Процент M2A-положительных зародышевых клеток оценивали с помощью проточной цитометрии через 7 дней после воздействия либо носителя (-, белая полоса), либо ибупрофена в концентрации 1, 10 и 100 мкМ (полоски от серого до черного).Значение P теста Краскалла-Уоллиса указано вверху, а *** над столбиками гистограммы указывает, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем имеет P -значение <0,001. ( C ) Количественная оценка общего числа M2A-зародышевых клеток на яичник, проведенная на суспензиях отдельных клеток, полученных из плодных яичников, обработанных, как указано выше, выражается как 10 ⁶ половых клеток на яичник. Значение P теста Краскалла-Уоллиса указано вверху, а * и ** над столбиками гистограммы указывают, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем имеет P -значение <0.05 и <0,01 соответственно. ( n ) указывает количество людей на каждое состояние.

Рисунок 3

Ибупрофен нацелен на эмбриональные зародышевые клетки яичников. ( A ) Иммуногистохимический анализ LIN28 на эксплантатах яичников, подвергнутых воздействию либо носителя (контроль, Ctrl), либо 10 мкМ ибупрофена (Ibu 10 мкМ) в течение 7 дней. Масштабная линейка: 100 мкм. ( B ) Процент M2A-положительных зародышевых клеток оценивали с помощью проточной цитометрии через 7 дней после воздействия либо носителя (-, белая полоса), либо ибупрофена в концентрации 1, 10 и 100 мкМ (полоски от серого до черного).Значение P теста Краскалла-Уоллиса указано вверху, а *** над столбиками гистограммы указывает, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем имеет P -значение <0,001. ( C ) Количественная оценка общего числа M2A-зародышевых клеток на яичник, проведенная на суспензиях отдельных клеток, полученных из плодных яичников, обработанных, как указано выше, выражается как 10 ⁶ половых клеток на яичник. Значение P теста Краскалла-Уоллиса указано вверху, а * и ** над столбиками гистограммы указывают, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем имеет P -значение <0.05 и <0,01 соответственно. ( n ) указывает количество людей на каждое состояние.

Согласно измерениям проточной цитометрии, популяция, экспрессирующая высокие уровни M2A (от 10 до> 15% от общего количества клеток яичников в зависимости от возраста плода, Suppl. Fig. S2E), значительно уменьшилась после воздействия ибупрофена ( P = 0,0038 и P <0,001, для 7 DW и 8–12 DW, соответственно), с большим уменьшением при воздействии 10 мкМ (рис. 3B). Что касается общего числа M2A-положительных клеток, популяция зародышевых клеток увеличивалась экспоненциально с 7 до 12 DW, увеличиваясь с 4 × 10 ⁴ до более 3 × 10 ⁵ M2A-положительных клеток на яичник в контрольных условиях (рис. .3С). После лечения ибупрофеном дозы 1 и 100 мкМ вызывали в среднем 30% -ное истощение количества зародышевых клеток, тогда как 10 мкМ ибупрофена приводили к значительной (50–75%) потере половых клеток, в зависимости от возраста плода (рис. 3С). Таким образом, однозначно, воздействие ибупрофена приводило к уменьшению количества M2A-положительных половых клеток.

Побочные эффекты, вызванные ибупрофеном, после 2 дней воздействия не были обратимы в течение 5-дневного периода отмены

Затем мы исследовали эффекты более короткого воздействия 10 мкМ ибупрофена, дозы, которая, как было показано, оказывает вредное воздействие на орган (рис.4). В то время как общая гибель клеток оставалась низкой во всех контрольных эксплантах независимо от возраста плода, процент апоптотических клеток прогрессивно увеличивался уже через 2 дня после начала лечения (фиг. 4A). Ибупрофен значительно вызывал гибель клеток через 4 дня воздействия в возрастной группе 7 DW ( P = 0,028 и 0,0079 через 4 и 7 дней соответственно) и уже через 2 дня воздействия в группе 8–12 DW ( P = 0,00058; 3,84 × 10 ^–7 и 3,03 × 10 ^–8 через 2, 4 и 7 дней соответственно) (рис.4А). Кроме того, в молодых эксплантатах 7 DW истощение M2A-положительных зародышевых клеток прогрессивно увеличивалось и становилось значительным после 7 дней воздействия ибупрофена (фиг. 4B). Вызывает беспокойство то, что истощение M2A-зародышевых клеток в эксплантатах 8–12 DW достигло максимума -66,7% всего через 2 дня после лечения ибупрофеном.

Рисунок 4

Цитотоксический эффект ибупрофена на половые клетки плода яичников обнаруживается уже через 2 дня после лечения. ( A ) Анализ гибели клеток с помощью проточной цитометрии после 2, 4 или 7 дней воздействия либо носителя (-, белые столбцы), либо 10 мкМ ибупрофена (серые столбцы).Простые столбцы представляют апоптоз, а заштрихованные столбики — некроз. ( B ) Количественная оценка M2A-экспрессирующих зародышевых клеток в яичниках плода, обработанных как в A. ** и *** над столбиками гистограммы показывают, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем имеет P -значение <0,01 и <0,001 соответственно. # Означает, что апостериорный тест Манна – Уитни по сравнению с тем же условием после 2 дней культивирования имеет значение P <0.05. ns означает незначительное. ( n ) указывает количество людей на каждое состояние.

Рисунок 4

Цитотоксический эффект ибупрофена на эмбриональные половые клетки яичников обнаруживается уже через 2 дня после лечения. ( A ) Анализ гибели клеток с помощью проточной цитометрии после 2, 4 или 7 дней воздействия либо носителя (-, белые столбцы), либо 10 мкМ ибупрофена (серые столбцы). Простые столбцы представляют апоптоз, а заштрихованные столбики — некроз. ( B ) Количественная оценка M2A-экспрессирующих половых клеток в яичниках плода, обработанных, как в A.** и *** над столбиками гистограммы указывают на то, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем имеет значение P <0,01 и <0,001, соответственно. Знак # указывает на то, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с тем же условием после 2 дней культивирования имеет значение P <0,05. ns означает незначительное. ( n ) указывает количество людей на каждое состояние.

Затем мы оценили способность этого органа к восстановлению после отмены ибупрофена.Эксплантаты (10-12 DW) подвергали воздействию 10 мкМ ибупрофена в течение 2 дней, а затем культивировали в контрольной среде без ибупрофена в течение следующих 5 дней (фиг. 5A). Не наблюдалось существенной разницы в общем проценте гибели клеток через 7 дней культивирования независимо от того, был ли разрешен 5-дневный период восстановления после первых 2 дней лечения ибупрофеном (15,98 ± 2,38 против 11,86 ± 1,31, среднее значение ± стандартная ошибка среднего P = 0,47). Аналогичным образом, скорость апоптоза, вызванная 2-дневным воздействием ибупрофена, не была значительно снижена после 5-дневного выздоровления (рис.5B; 13,50 ± 2,27 против 9,58 ± 1,52, среднее значение ± SEM, P = 0,43). Однако процент M2A-положительных половых клеток увеличивался вместе с 5-дневным восстановлением по сравнению с 2-дневным лечением ибупрофеном, возвращаясь к своему контрольному уровню (фиг. 5C). Эти данные наиболее вероятно указывают на то, что цитотоксический эффект, вызванный 2-дневным воздействием ибупрофена, не был полностью устранен 5-дневной отменой препарата, несмотря на улучшение процентного содержания зародышевых клеток.

Рисунок 5

Отмена ибупрофена после кратковременного воздействия не позволяет эффективно устранить цитотоксический эффект препарата.( A ) Протокол отмены лекарственного средства был установлен следующим образом: 10-12 эксплантатов DW подвергали воздействию ибупрофена 10 мкМ в течение 2 дней, затем выдерживали в культуре со свежей контрольной средой, лишенной ибупрофена, в течение еще 5 дней. Проточный цитометрический анализ гибели клеток ( B ) и M2A-положительных клеток ( C ) для этого лечения отмены (2 + / 5–; градация от серого к белому) сравнивали с 2-дневным или 7-дневным воздействием. на носитель (-, белые столбики) или ибупрофен в концентрации 10 мкМ (+, серые столбцы).** и *** над столбиками означает, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем имеет значение P <0,01 и <0,001, соответственно. ( n ) указывает количество людей на каждое состояние.

Рисунок 5

Отмена ибупрофена после кратковременного воздействия не позволяет эффективно устранить цитотоксический эффект препарата. ( A ) Протокол отмены лекарственного средства был установлен следующим образом: 10-12 эксплантатов DW подвергали воздействию ибупрофена 10 мкМ в течение 2 дней, затем выдерживали в культуре со свежей контрольной средой, лишенной ибупрофена, в течение еще 5 дней.Проточный цитометрический анализ гибели клеток ( B ) и M2A-положительных клеток ( C ) для этого лечения отмены (2 + / 5–; градация от серого к белому) сравнивали с 2-дневным или 7-дневным воздействием. на носитель (-, белые столбики) или ибупрофен в концентрации 10 мкМ (+, серые столбцы). ** и *** над столбиками означает, что апостериорный тест Манна-Уитни по сравнению с контролем имеет значение P <0,01 и <0,001, соответственно. ( n ) указывает количество людей на каждое состояние.

Обсуждение

Ибупрофен — одно из наиболее широко используемых безрецептурных обезболивающих, жаропонижающих и противовоспалительных препаратов. Он даже был представлен как «самый мягкий НПВП с наименьшим количеством побочных эффектов, который долгое время использовался в клинической практике» (Rainsford, 2009; Servey and Chang, 2014). В течение третьего триместра беременности все НПВП в настоящее время противопоказаны из-за риска тяжелой сердечно-легочной токсичности и почечной дисфункции у плода (Black and Hill, 2003; Servey and Chang, 2014).В нескольких исследованиях сообщалось о потреблении ибупрофена беременными женщинами, при этом процент подвергшихся воздействию женщин достигал 30% (Kristensen et al. , 2016; Van Marter et al. , 2013). В соответствии с текущими рекомендациями, большинство женщин, принимающих ибупрофен, делают это в течение первого триместра, после чего частота снижается (Glover et al. , 2003; Nezvalova-Henriksen et al. , 2013; Palmsten et al. , 2016 ; Stephansson et al., 2011; Wen et al. , 2008; Werler et al. , 2005). Здесь мы сообщаем, что ибупрофен, неселективный ингибитор ЦОГ, вызывает снижение пролиферации клеток и повышенную гибель клеток в яичниках плода человека в первом триместре, в основном из-за воздействия на зародышевые клетки плода. Это вызывает обеспокоенность по поводу потребления ибупрофена беременными женщинами в период органогенеза яичников плода и последующего риска для создания фолликулярного резерва.

Ибупрофен проникает через плацентарный барьер в первом триместре беременности

Парацетамол и ацетилсалициловая кислота могут проникать через плацентарный барьер человека (Jacobson et al., 1991; Леви и др. , 1975; Naga Rani et al. , 1989; Weigand et al. , 1984). У крыс и кроликов ибупрофен и его метаболиты также могут легко попасть в кровоток плода (Adams et al. , 1969). У человека ибупрофен был обнаружен в меконии новорожденных (Alano et al. , 2001). Однако, насколько нам известно, не было прямого измерения способности ибупрофена преодолевать плацентарный барьер и его последующие уровни в плазме у плодов человека.

Здесь мы воспользовались преимуществом использования ибупрофена для профилактического обезболивания женщинами, делающими аборт, для исследования уровней циркулирующего ибупрофена в пуповинной крови. Нам удалось выявить, что когда женщина принимала ибупрофен перед абортом, он обнаруживался в пуповинной крови в концентрациях от 0,4 до 14 мкМ. Примечательно, что диапазон циркулирующего ибупрофена больше зависел от задержки между приемом и сбором крови, чем от принятой дозы (400 против 800 мг), причем самые высокие уровни были обнаружены, когда эта задержка составляла от 3 до 6 часов.У взрослых максимальная терапевтическая концентрация ибупрофена в плазме была определена в диапазоне 100 мкМ для пероральных доз от 400 до 800 мг (Ceppi Monti et al. , 1992; Kallstrom et al. , 1988; Karttunen et al. , 1990; Regazzi et al. , 1986) и около 200 мкМ у детей (Scott et al. , 1999). Таким образом, наши результаты впервые показывают, что плацентарный перенос ибупрофена происходит уже в первом триместре и подвергает плод воздействию концентраций от 1 до 10 мкМ.

Ибупрофен влияет на рост яичников человеческого плода

Развитие яичников характеризуется пролиферацией как клонов соматических, так и зародышевых клеток (Fulton et al. , 2005). В течение первого триместра оогонии активно размножаются, а с конца первого триместра часть половых клеток совершает мейоз (Jorgensen and Rajpert-De Meyts, 2014). В соответствии с предыдущими гистологическими исследованиями (Mamsen et al. , 2011) мы сообщаем, что в некультивируемых яичниках общее количество клеток как минимум в четыре раза увеличивается с 7 до 12 DW (2.6 × 10 ⁵ ячеек на 7 DW по сравнению с 1,3 × 10 ⁶ ячеек на 12 DW). Важно отметить, что рост клеток продолжался в течение 7 дней в культуре (4,5 × 10 ⁵ клеток, т.е. +190 000 клеток для 7 DW и 2 × 10 ⁶ клеток, т.е. +700 000 клеток для 12 культивируемых эксплантатов DW). Об активной пролиферации половых клеток также свидетельствует ex vivo , где популяция M2A-положительных клеток пролиферирует пять раз с 7 до 12 DW через 7 дней культивирования (с 4.От 7 × 10 ⁴ до более 3 × 10 ⁵ половых клеток на один культивируемый яичник) и увеличивается в 1,5 раза после 7 дней культивирования (с 2,2 × 10 ⁵ в некультивируемых яичниках до 3 × 10 ⁵ половых клеток после 7 дней культивирования 12 завязей DW). Соответственно, иммуноокрашивание KI67 подтвердило пролиферацию как соматических, так и зародышевых клеток ex vivo . Развитие яичников в течение первого триместра также характеризовалось низким уровнем апоптоза, когда апоптозные клетки в основном идентифицировались как оогонии (Fulton et al., 2005). Соответственно, мы обнаружили одинаково низкую плотность расщепленных каспазо-3-положительных клеток после 7 дней контрольной культуры, и наши данные проточной цитометрии показали одинаково низкий уровень гибели клеток как в свежем органе, так и в культуре ex vivo (около 6%). В целом, эти данные позволяют предположить, что органотипическая культура сама по себе не влияла ни на высокую пролиферацию, ни на низкие скорости апоптоза, что позволяло развивать яичник. Напротив, после воздействия ибупрофена мы показали уменьшение общего количества клеток яичников, эффект, связанный с резким снижением пролиферации клеток и значительным усилением апоптоза, но не некроза.Это говорит о том, что ибупрофен нарушил как пролиферацию, так и жизнеспособность, что в конечном итоге привело к потере клеток яичников. На данном этапе мы не можем предположить, связаны ли оба события или просто сопутствуют друг другу.

Прошло более двух десятилетий с тех пор, как несколько исследований сообщили о роли ибупрофена и других НПВП в профилактике рака (Matos and Jordan, 2015). В линиях раковых клеток ибупрофен также влияет на пролиферацию и жизнеспособность клеток, в результате чего замедление роста клеток часто связано с остановкой клеточного цикла.Во многих случаях, таких как рак толстой кишки (Andrews et al. , 2008; Janssen et al. , 2006, 2008), рак простаты (Andrews et al. , 2002, 2008; Minnery and Getzenberg, 2005) , линии клеток рака полости рта (Kim et al. , 2004; Thurnher et al. , 2001) и линии клеток рака яичников (Andrews et al. , 2008; Duncan et al. , 2012; Lima et al. , 2015), ибупрофен также вызывает апоптоз. Подобно его механизму действия на раковые клетки, мы наблюдали, что ибупрофен изменяет как пролиферацию, так и гибель клеток в яичниках человеческого плода.На молекулярном уровне исследования нескольких клеточных линий предложили TP53-зависимый механизм токсичности ибупрофена, который также включает увеличение экспрессии CDKN1A (также известного как p21) (Bonelli et al. , 2011; Ikegaki et al., 2014; Janssen et al., 2008; Tsai et al. , 2004). Мы обнаружили аналогичное увеличение экспрессии TP53 и CDKN1A в яичнике плода человека после воздействия ибупрофена, что позволяет предположить, что токсичность ибупрофена в яичнике плода человека может использовать аналогичный сигнальный путь и может воздействовать на молекулярные мишени, расположенные на перекрестке пролиферация и гибель клеток.Потребуются дальнейшие эксперименты для изучения мелкомолекулярного механизма действия ибупрофена на яичник плода человека.

Интересно, что в четырех клеточных линиях рака яичников (SKOV-3, CAOV-3, 36M2 и SW626) (Duncan et al. , 2012) было показано, что только высокая концентрация ибупрофена 200 мкМ вызывает апоптоз, тогда как дозы диапазон от 20 до 100 мкМ не оказывал цитотоксического действия на те же клетки. Это предполагает, что ибупрофен может использовать разные сигнальные пути в зависимости от концентрации воздействия, а также от опухолевого / физиологического состояния клеточной мишени.В нашей модели ex vivo общее воздействие ибупрофена было наиболее выраженным при использовании в концентрации 10 мкМ и значительно более вариабельным при 100 мкМ. Немонотонные кривые доза-ответ были описаны в яичках, где некоторые соединения, разрушающие эндокринную систему, демонстрировали эти кривые (Gaudriault et al. , 2017). В яичнике только два исследования изучали несколько концентраций (либо бисфенола А, либо дексаметазона) и обнаружили линейные кривые доза-ответ (Brieno-Enriquez et al., 2011; Poulain et al. , 2012). Нелинейные эффекты «доза-ответ» часто связаны с различиями в механизме действия, такими как индукция пути детоксикации, изменение сигнальных путей или насыщение метаболических путей (Vandenberg et al. , 2012). Таким образом, механизм действия ибупрофена требует дальнейших исследований. Однако важно отметить, что в течение первого триместра развивающийся плод с большей вероятностью подвергнется воздействию активных концентраций 10 мкМ и ниже.

Ибупрофен нацелен на линию зародышевых клеток

Мы показали, что 10 мкМ ибупрофен эффективно ингибирует продукцию PGE2 яичниками плода человека, как было показано ранее в культуре семенников человеческого плода (Ben Maamar et al. , 2017; Mazaud-Guittot et al. , 2013), и in vivo, у крысы (Dean et al. , 2016). В яичнике плода человека COX1 экспрессируется соматическими клетками, тогда как COX2 и PTGES ограничены половыми клетками в течение первого и второго триместров (Bayne et al., 2009 г.). Кроме того, в предыдущих исследованиях сообщалось, что воздействие PGE2 на плодные яичники человека (8 часов воздействия при 0,1 мкМ) увеличивало уровни мРНК MLC1 и INHA , двух маркеров зрелых зародышевых клеток (Bayne et al. , 2009). ), что свидетельствует о благоприятном влиянии PGE2 на развитие половых клеток. У крыс in utero воздействие индометацина (0,8 мг / кг в день) или парацетамола (350 мг / кг в день) между 13,5 и 21,5 днями после зачатия (dpc) изменило экспрессию некоторых маркеров зародышевых клеток (Dean et al., 2016), тогда как воздействие ex vivo на яичники мышей 12,5 dpc 100 мкМ парацетамола в течение 3 дней не изменило экспрессию некоторых типичных маркеров зародышевых клеток (Holm et al. , 2016). В отношении яичников плода человека наши данные ex vivo показывают, что ибупрофен в значительной степени влияет на жизнеспособность линии зародышевых клеток. Таким образом, разумно предположить, что усиление эффектов ибупрофена в яичниках 8-12 DW (по сравнению с 7 органами DW) может быть связано с увеличением доли половых клеток и их продукции PGE2 на этой стадии.

Примечательно, что мы наблюдали, что отмена ибупрофена в течение 5 дней после непрерывного воздействия в течение 2 дней позволила восстановить процент M2A-положительных половых клеток, но со стойко высокой скоростью апоптоза. Мы предполагаем, что половые клетки, пережившие 2 дня воздействия ибупрофена, могут быстро пролиферировать после прекращения приема препарата, что приводит к полному потенциалу яичников через 5 дней после окончания воздействия. Следовательно, на клеточном уровне отрицательное влияние ибупрофена на жизнеспособность клонов зародышевых клеток может быть ограничено.Однако это не исключает потенциального повреждения на молекулярном уровне, такого как повреждение ДНК, о чем свидетельствует наследственное воздействие парацетамола и индометацина, другого НПВП, на половые клетки крысы (Dean et al. , 2016).

В то время как сверхэкспрессия COX2 и повышенный биосинтез простагландинов наблюдались во время канцерогенеза (Harris, 2007), противоопухолевый эффект НПВП в значительной степени объясняется их ингибированием ферментов COX (Matos and Jordan, 2015). Поскольку экспрессия COX2 ограничена зародышевыми клетками во время внутриутробного развития плода (Bayne et al., 2009), можно предположить, что ибупрофен будет предпочтительно нацеливаться на клетки, экспрессирующие высокие уровни COX2, такие как опухолевые и зародышевые клетки плода. Однако, если канонический механизм действия ибупрофена и других НПВП основан на ингибировании синтеза простагландинов, ибупрофен также может проявлять цитотоксические эффекты независимо от экспрессии или активности COX2 (Andrews et al. , 2008; Janssen et al. , 2008 г.). Конкретный механизм (ы) действия ибупрофена на овотоксичность и жизнеспособность зародышевых клеток, таким образом, требует дальнейших подробных исследований.

В целом, наши данные показывают, что 2-7-дневное воздействие неселективного ингибитора ЦОГ ибупрофена в концентрациях, соответствующих in utero , влияет на запасы половых клеток в яичниках человеческого плода в первом триместре беременности. Неполная способность спасать яичник плода от повреждений, вызванных ибупрофеном, предполагает, что длительное воздействие ибупрофена в течение внутриутробной жизни может привести к долгосрочному воздействию на репродуктивную функцию женщины. Это вызывает беспокойство по поводу потребления ибупрофена беременными женщинами в период органогенеза яичников плода и последующего риска для создания фолликулярного резерва.

Дополнительные данные

Дополнительные данные доступны на сайте Human Reproduction онлайн.

Роли авторов

S.L.P. и С.М.Г. спроектировал, провел и проанализировал эксперименты (культивирование, гистология, подсчет клеток и цитометрия для S.L.P; сбор органов, культивирование, гистология и QtPCR для S.M.G.). R.T.M. и N.H. разработали и провели измерения ибупрофена. M.B.M. проводили эксперименты (сбор органов и крови, посев).Л.Л. проводил эксперименты (посев, цитометрия). Э. выполнил статистический анализ и участвовал в написании соответствующего раздела. В.Л. руководил сбором образцов плодных яичников человека в первом триместре. S.M.G. концептуализировал проект, S.L.P. и С.М.Г. подготовил визуализацию данных и написал первоначальный черновик, N.D.R., D.M.K., F.C. и Б.Дж. участвовали в критических дискуссиях, рецензировали и редактировали рукопись, и все авторы одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Это исследование финансировалось Inserm, Университет Ренн 1, EHESP — Школа общественного здравоохранения, за счет грантов Национального агентства по безопасности и гигиене труда (ANSM; HAP-2014-073), Agence Nationale de la Recherche. (ANR-15-CE34-0001-01) и Датский совет по независимым исследованиям (медицинские науки), а также Wellcome Trust (номер гранта: 098522).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов, а спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовке рукописи.

Благодарности

Мы благодарим весь персонал отделения акушерства и гинекологии и отделения детской хирургии больницы Rennes Sud (Ренн, Франция), а также женщин-участниц, без которых это исследование было бы невозможно. Авторы благодарны Изабель Койффек за помощь в сборе органов и лаборатории гистологии h3P2 Университета Ренн-1. Мы также благодарим Edinburgh CRF Mass Spectrometry Core.

Список литературы

Adams

SS